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Columna de Sephadex para alfa-amilasa

Columna de Sephadex para alfa-amilasa


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Quiero purificar alfa-amilasa bruta con cromatografía en columna. Estoy usando un spehadex 75, pero por alguna razón no puedo encontrar ninguna información sobre cómo hacer la lechada.

Puedo encontrar rápidamente toneladas de información sobre cómo empacar y almacenar una columna, pero lo que realmente quiero saber es ¿cuánto polvo y tampón mezclo?


El '75' de Sephadex G-75 se refiere a la agua recuperar valor, que se define como los gramos de agua absorbidos tras la hidratación de 1 g de polvo seco, multiplicados por 10 (ver Reiland). Por lo tanto, el valor de recuperación de agua de Sephadex G-75 es de aproximadamente 7,5 ml. Este valor se refiere únicamente al agua contenida en las partículas de gel y no al agua atrapada fuera de las partículas en un gel compacto (Reiland). Como regla general, esta última cifra se puede estimar en un 50%.

Entonces ... 1 g de Sephadex seco proporcionará aproximadamente 15 ml de gel empaquetado

De aquí: 1 g se hincha a 12-15 ml de gel

Solo un pensamiento ... ¿La alfa-amilasa interactúa con Sephadex? ¿Quizás 'pensar' que se parece a un sustrato y (reversiblemente) unirse a él o interactuar de otra manera para causar efectos además de la filtración en gel?


Grado de ADN Sephadex G-25

Adecuado para su uso en la preparación de columnas de centrifugación para la purificación de ADN (≥ 10 bases de longitud) a partir de moléculas pequeñas mediante SEC.

Sephadex G-25 DNA Grade SF es adecuado para su uso en la preparación de columnas de centrifugación para la purificación de ADN.

  • Para la purificación de ADN (≥ 10 bases de longitud) a partir de moléculas pequeñas mediante SEC
  • Probado para garantizar una alta recuperación de ADN reproducible
  • Utilizado en columnas MicroSpin y columnas NAP
  • Adecuado para investigadores que prefieren preparar sus propias columnas para la purificación de ácidos nucleicos.

Sephadex G-25 es uno de los cinco tipos G diferentes que van desde G-10 para moléculas pequeñas hasta G-75 para moléculas más grandes. Sephadex G-25 tiene un límite de exclusión de aproximadamente Mr 5000, y cuando se empaqueta en columnas MicroSpin vacías, las columnas de desalinización resultantes se pueden utilizar en un protocolo de centrifugación para la purificación de ADN y oligo de cualquier ADN de más de 10 bases de longitud.

Sephadex G-50 es una resina de cromatografía de exclusión por tamaño bien establecida para desalar e intercambiar tampón de biomoléculas & gt 30 000 de peso molecular, y con un protocolo de giro se puede utilizar para la purificación de ADN y oligo de moléculas de más de 20 bases de longitud.

Alternativamente, se puede utilizar Sephadex G-100 DNA Grade. Sephadex G-100 DNA Grade tiene un límite de exclusión de 25 pb de ADN ds.

Por tanto, todos estos tipos de Sephadex son muy adecuados para la purificación de oligonucleótidos o pequeños fragmentos de ADN tras la síntesis o en aplicaciones de marcaje.


Murphy, B. E. P., Naturaleza, 201, 679 (1964).

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Ganjam, V. K., Currie, P. A. y Chan, T. H., J. Steroid Chem. (en la prensa).


Columnas MicroSpin G-50, purificación rápida de ADN que requiere limpieza

Se obtiene un buen rendimiento y pureza del producto con volúmenes de muestra de 12 a 50 µl. Son adecuados para cualquier ADN de más de 20 bases de longitud y no eliminarán ni desnaturalizarán las enzimas.

La resina utilizada en estas columnas, Sephadex G-50 DNA Grade, se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones, incluida la desalación de ADN, el intercambio de tampones y la eliminación de nucleótidos no incorporados de oligonucleótidos marcados en los extremos.

Sephadex G-50 es uno de los cinco tipos G diferentes que van desde G-10 para moléculas pequeñas hasta G-75 para moléculas más grandes. Sephadex G-50 es una resina de exclusión por tamaño bien establecida para la desalación y el intercambio de tampón de biomoléculas & gt 30 000 de peso molecular, y con un protocolo de giro se puede utilizar para la purificación de ADN y oligo de moléculas de más de 20 bases de longitud.

Alternativamente, se puede utilizar Sephadex G-25 o Sephadex G-100. Sephadex G-25 tiene un límite de exclusión de aproximadamente Mr 5000, y con un protocolo de giro, esto significa que puede usarse para cualquier ADN de más de 10 bases de longitud.

Sephadex G-100 DNA Grade tiene un límite de exclusión de 25 pb de ADN ds.

Por tanto, todos estos tipos de Sephadex son adecuados para la purificación de oligonucleótidos o pequeños fragmentos de ADN tras la síntesis o una reacción de marcado.


Columnas NICK

Se utiliza para la purificación de fragmentos de ADN traducidos por mellas y para la separación de cualquier sonda marcada de nucleótidos marcados no incorporados.

Seleccionar modelo

Las columnas NICK se utilizan para la purificación de fragmentos de ADN traducidos por mellas y para la separación de cualquier sonda marcada de los nucleótidos marcados no incorporados.

  • Para la purificación rápida de ADN marcado (≥ 20 bases de longitud) a partir de nucleótidos radiomarcados no incorporados mediante cromatografía de flujo por gravedad
  • Preenvasado con Sephadex G-50 DNA Grade (verSephadex G-50 DNA Grade y Sephadex G-100 DNA Grade) en agua destilada con un 0,15% de Kathon CG / ICP Biocida
  • Puede admitir volúmenes de muestra de hasta 100 μl

Las columnas NICK están listas para su uso inmediato y funcionan mediante flujo por gravedad. Las pruebas muestran que al menos el 97% de la radiactividad aplicada en una mezcla con traslación de muescas eluye en dos picos bien separados, correspondientes a moléculas de ADN marcadas y nucleótidos no incorporados, respectivamente. Se recupera al menos el 90% del ADN aplicado y luego se puede usar en protocolos de hibridación de ADN. El volumen máximo de muestra es 100 & muL.

La traducción de Nick es una técnica en la que la ADN polimerasa I se usa para reemplazar algunos de los nucleótidos de una secuencia de ADN con sus análogos marcados, creando una secuencia de ADN marcada que se puede usar como sonda en técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH) o transferencia. . También se puede utilizar para el marcaje radiactivo en técnicas como la transferencia Southern.

Este proceso se llama traducción de muescas porque el ADN que se marcará se trata con DNasa para producir `` muescas '' de una sola hebra. A esto le sigue el reemplazo en los sitios con muescas por ADN polimerasa I, que alarga el extremo 3 & # 39, eliminando los nucleótidos en 5 & # 39-3 & # 39 actividad exonucleasa, y reemplazándolos con dNTPs. Para marcar un fragmento de ADN para usar como sonda en la transferencia, uno de los nucleótidos incorporados proporcionados en la reacción se marca radiactivamente, o se puede unir un fluoróforo en su lugar para el marcaje fluorescente, o se usa como antígeno para inmunodetección.

Sephadex G-50 DNA Grade se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones, incluida la desalación de ADN, el intercambio de tampones y la eliminación de nucleótidos no incorporados de oligonucleótidos marcados en los extremos. Sephadex G-50 se puede empaquetar en columnas MicroSpin vacías para su uso en estas aplicaciones.

Sephadex G-50 es uno de los cinco tipos G diferentes que van desde G-10 para moléculas pequeñas hasta G-75 para moléculas más grandes. Sephadex G-50 es una resina de filtración en gel bien establecida para la desalación y el intercambio de tampón de biomoléculas de peso molecular & gt 30 000, y con un protocolo de giro se puede utilizar para la purificación de ADN y oligo de moléculas de más de 20 bases de longitud. Alternativamente, se puede utilizar Sephadex G-25. Sephadex G-25 tiene un límite de exclusión de aproximadamente Mr 5000, y con un protocolo de giro, esto significa que puede usarse para cualquier ADN de más de 10 bases de longitud.

Por tanto, ambos tipos de Sephadex son muy adecuados para la purificación de oligonucleótidos o fragmentos de ADN muy pequeños tras la síntesis o en el marcaje radiactivo.


Fisiología y biología molecular de la familia de péptidos de relaxina

Relajante

La filtración en gel de extractos de ovario de cerda proporcionó la primera indicación de que la relaxina se sintetiza originalmente en formas precursoras y que los supuestos precursores de la relaxina son más grandes que la preproinsulina y la proinsulina (146, 147). Posteriormente, Kwok et al. (147) informaron que una pequeña porción de la relaxina en un extracto ácido-acetona de ovarios porcinos estaba asociada con una fracción biológicamente activa que tenía un peso molecular aparente de 19.000 Da. En ambos estudios, el tratamiento de la gran fracción similar a la relaxina con la enzima proteolítica tripsina pareció convertir el precursor putativo en relaxina de 6.000 Da. Gast y colaboradores (148, 149) postularon que la preprorelaxina de 23.000 Da es el producto de traducción principal y que el primer paso en la biosíntesis de la relaxina es la escisión dependiente de la membrana de un péptido señal de 3.000 Da para formar la prorelaxina (148, 149) (Fig. .10). La clonación posterior de los genes de relaxina de rata, porcino y humano (8-11) confirmó este trabajo preliminar y demostró que la relaxina, como la insulina, se sintetiza inicialmente como una preprohormona de cadena sencilla con la siguiente estructura general: péptido señal / cadena B / conectando péptido / cadena A, como se muestra esquemáticamente en la Fig.10. La diferencia de tamaño entre los precursores de la relaxina y la insulina se atribuye en gran medida a las marcadas diferencias en las longitudes de los péptidos C de conexión. Los péptidos C en porcino (9) y relaxina de rata (8), por ejemplo, contienen 104 o 105 residuos, respectivamente en proinsulina porcina y de rata, sin embargo, contienen sólo aproximadamente 30 residuos (150). Se desconoce la función del péptido C en la relaxina. Una función presumiblemente es dirigir el plegamiento de los precursores para que se formen los enlaces disulfuro correctos entre las cadenas B y A. Sin embargo, los estudios que expresan una relaxina humana mutante en levadura (151) o Escherichia coli (152) con péptidos de conexión de solo 6 o 13 aminoácidos, respectivamente, se ha demostrado que producen péptidos de relaxina bioactivos plegados. Se ha postulado que el péptido C puede contener secuencias de péptidos con actividades hormonales (8, 90), pero no hay evidencia experimental que apoye esto.

HIGO. 10. Resumen esquemático del procesamiento de la preprorelaxina porcina en relaxina mediante la eliminación sucesiva del péptido señal (S) y el péptido conector (C) mediante digestión proteolítica.

(Modificado de Kemp, B. E. y Niall, H. D. [1984]. Relaxin. Vitam. Horm. 41, 79-115, con autorización.) Copyright © 1984

Aunque se ha demostrado que las proteínas prorelaxinas son bioactivas (153-156) y circulan en el plasma en algunas especies [p. Ej., Seres humanos (152)], no se sabe si tienen una función biológica. La generación de péptidos de relaxina maduros requiere la escisión del péptido C, y este proceso está menos definido para la prorelaxina y parece estar menos estrictamente controlado que con la proinsulina. Muchas relaxinas contienen residuos dibásicos en las uniones B / C o C / A que probablemente dirigen la escisión, aunque otras no. Algunas relaxinas en realidad contienen un motivo en sus uniones de cadena B / C o C / A que es un motivo de consenso para la proproteína convertasa furina (R-X-K / R-R) (157). En contraste, la escisión en el extremo C de la cadena B en la relaxina porcina y de rata parece requerir una enzima con especificidad similar a la quimotripsina que reconozca las cadenas laterales alifáticas neutras de la leucina en la posición 32 (32 Leu) en la prorelaxina (9). Si este es el caso de la relaxina porcina, debe ocurrir la posterior escisión de tres aminoácidos para dar la forma B29 predominante (65, 66). Hudson y col. (11) originalmente propusieron que la relaxina H2 también era procesada por una enzima similar a la quimotripsina a 32 Leu, pero la relaxina H2 aislada del cuerpo lúteo del embarazo es una forma B29 (158). Estudios posteriores que coexpresaron relaxina H2 con convertasa de prohormona 1 murina (PC1) demostraron la producción de relaxina B29 auténtica, mientras que la expresión sin PC1 dio como resultado solo la producción de prohormonas (159). Los autores postularon que podría existir una enzima similar en las células lúteas humanas y que los aminoácidos básicos resultantes Lys-Arg en el extremo C de la cadena B pueden ser escindidos posteriormente por una enzima carboxipeptidasa en las células lúteas. Por tanto, es probable que la escisión del péptido prorelaxina C sea diferente entre especies.


MATERIALES Y MÉTODOS

Al comienzo de este experimento de 3 semanas, una discusión previa al laboratorio cubre esencialmente todos los diversos aspectos del experimento. Usamos un manual de laboratorio interno, como la mayoría de los manuales de laboratorio publicados, contiene secciones separadas sobre espectroscopia, cromatografía y electroforesis. Además de requerir que los estudiantes revisen estas secciones, se les recuerda a los estudiantes que revisen las secciones de purificación y caracterización de proteínas que se encuentran en su libro de texto.

Periodo 1, aislamiento de Mb crudo e investigación de sus propiedades redox.

Período 2, purificación parcial de Mb bruto por intercambio iónico y cromatografía de permeación en gel.

Período 3, SDS-PAGE de muestras crudas y parcialmente purificadas.

Periodo 1-

En el primer período, el aislamiento inicial de Mb se realiza mediante el método de Bylkas y Anderson [9] en el que se suspenden 10,0 g de hamburguesa magra recién molida (preferiblemente la parte superior redonda, con su menor contenido de grasa) en 20,0 ml de 20 mm, pH 5,6, fosfato de potasio (KPi) 1 1 Las abreviaturas utilizadas son: KPi, fosfato de potasio RP, pureza relativa CMC, carboximetilcelulosa PM, peso molecular. buffer. Esta suspensión se centrifuga a 20,0 ° C durante 20 min a 10.000 × gramo (15.300 rpm con un rotor Beckman JA-14). A continuación, el sobrenadante se filtra a través de lana de vidrio y el filtrado resultante se pasa a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm. El volumen se mide con una precisión de 0,1 ml y los mg totales de contenido de proteína se determinan utilizando el coeficiente de extinción a 595 nm generado a partir de la reacción de la albúmina de suero bovino con el reactivo de Bradford [10]. El reactivo de Bradford se prepara disolviendo 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G en 100 ml de etanol al 95%, añadiendo 100 ml de ácido fosfórico al 85% (p / v), diluyendo a 1,0 litro con agua y filtrando. La curva estándar se prepara como se muestra en la Tabla I.

El total de mg de Mb se determina a 417 nm utilizando un coeficiente de extinción de K = 7,57 ml · mg −1 · cm −1 (a partir de cálculos basados ​​en la Ref. 9). Normalmente, el término actividad específica (unidades totales de actividad enzimática / mg de proteína total) se usa para seguir la purificación de una enzima. Como Mb no es una enzima, hemos adoptado el término "pureza relativa". La pureza relativa (P.R.) de la solución bruta de Mb (y las fracciones purificadas posteriores) se define como el total de mg de Mb dividido por el total de mg de proteína. Durante el resto del período, los estudiantes examinan las propiedades redox del Mb con el agente reductor ditionito de sodio y el ferricianuro de potasio como reactivo oxidante que ha sido ampliamente descrito por Bylkas y Anderson [9]. Básicamente, esto implica añadir a partes alícuotas separadas de 1,5 ml del sobrenadante bruto de Mb unos pocos cristales pequeños de ditionito de sodio o ferricianuro de potasio. La solución de Mb reducida se diluye luego de 1 a 8 y se escanea de 300 a 700 nm. Este procedimiento se diferencia del de Bylkas y Anderson [9] en que se elimina el paso de desalación ya que el agente reductor no interfiere con los espectros posteriores. Como el ferricianuro de potasio interfiere con las exploraciones espectrales, la solución de Mb oxidada se somete a una etapa de desalación en la que la solución de 1,5 ml se añade a una columna de desalación (10,0 ml de Sigma Sephadex G-25 desgasificado equilibrado con 20 mm, pH 5,6, tampón KPi en una columna Bio-Rad Econo-Pac de 12 cm x 1,5 cm de diámetro interno). Se recoge una alícuota de 0,5 ml de la banda de Mb de color amarillento principal, se diluye de 1 a 6 con el tampón KPi y se escanea de 300 a 700 nm. Las soluciones de Mb crudas sobrantes se etiquetan y congelan hasta el próximo período de laboratorio.

Período 2—

Las soluciones de Mb crudas congeladas se descongelan y se filtran 5,0 ml a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm. Se utilizarán 2,0 ml en las separaciones cromatográficas, y el resto se congelará para su uso en el Período 3. Un miembro del grupo equilibra aún más un pre-vertido, columna de carboximetilcelulosa (CMC) preequilibrada (10,0 ml de Sigma CMC definida en una columna Bio-Rad Econo-Pac de 12 cm x 1,5 cm de diámetro interno) con un tampón KPi de 20 mm, pH 5,6. Durante este paso de equilibrado, se determina el número de gotas para recoger 2,0 ml. Un segundo miembro del grupo equilibra una columna Sephadex G-75 pre-vertida, desgasificada y preequilibrada (∼38.0 ml de Sigma G-75-120 desgasificada en un Bio-Rad de 50.0 cm × 1.0 cm de diámetro interno Econo- Columna a una altura de 48,0 cm) con un tampón KPi de 20 mm, KCl 0,10 m, pH 5,6. La altura de la cabeza de este tampón se mantiene constante a 2,0 cm por encima del material de la columna G-75 para poder determinar el caudal. Además, se determina el número de gotas para recoger 1,0 ml.

Se pipetea Mb bruto (1,0 ml) en la CMC y se deja entrar en la matriz de CMC. A continuación, se añade un volumen de columna (~ 10,0 ml) del tampón KPi de 20 m m, pH 5,6, a la columna de CMC y se recogen fracciones de 2,0 ml. Una vez que todo el tampón KPi ha entrado en la columna, se añade un tampón Tris de 20 m m, pH 7,5, y se recogen fracciones de 2,0 ml hasta que se ha eluido todo el color rojo (Mb) que se mueve a través de la columna. A cada fracción recogida se le añaden 2,0 ml de agua destilada o de grado biológico molecular. La absorbancia a 417 y 280 nm se mide para cada fracción tres fracciones consecutivas con la mayor A417/A280 se combinan las proporciones y se determina el volumen combinado para estas fracciones combinadas (fracción de CMC marcada). El Mb total y la proteína total en la fracción de CMC combinada se determinan como se describió anteriormente. Además de determinar el R.P., una gráfica de doble Y de A417 y A280 versus se construye el número de fracción. La fracción de CMC combinada se congela durante el siguiente período.

Después de determinar la velocidad de flujo (típicamente 0.3-0.7 ml / min), se pipetea 1.0 ml del Mb crudo en la parte superior de la columna G-75 y se deja ingresar a la matriz de la columna 20 mm KPi, 0.10 m KCl, pH 5.6, se añade tampón a la columna hasta un nivel de 2,0 cm por encima de la matriz de gel. Mientras se mantiene una altura constante de la cabeza del tampón, se recogen fracciones de 1,0 ml hasta que se ha eluido todo el color rojo (Mb). A cada fracción recogida se le añaden 1,5 ml de agua destilada o de grado biológico molecular. Se mide la absorbancia a 417 y 280 nm para cada fracción, y las tres fracciones consecutivas con la mayor A417/A280 se combinan las proporciones y se determina el volumen combinado para estas fracciones combinadas (fracción etiquetada G-75). El Mb total y la proteína total en la fracción G-75 combinada se determinan como se describió anteriormente. Además de determinar el R.P., una gráfica de doble Y de A417 y A280 versus se construye el número de fracción. La fracción G-75 combinada se congela durante el período siguiente.

Período 3—

Se realizan cálculos para el Mb crudo, la fracción de CMC y las fracciones de G-75 para determinar el volumen de muestra necesario para dar 10 μg de proteína total (sin exceder un volumen de 25 μl). Por lo general, la fracción bruta de Mb debe diluirse 1:10 (con ∼ 3,3 μg añadidos al gel SDS-PAGE), y las fracciones de CMC y G-75 se utilizan sin dilución, ya que no se pueden obtener 10 μg y la cantidad real de proteína en los 25 µl. Todas las muestras se preparan a 25 µl y se añaden a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añaden 50 µl de diluyente de muestras Bio-Rad Laemmli (que contiene el tinte de seguimiento azul de bromofenol) a cada muestra. También se preparan de la misma manera un estándar de SDS de bajo peso molecular de Bio-Rad que contiene seis proteínas, un estándar de mioglobina de corazón de caballo puro y un blanco de agua. El blanco, los estándares y las muestras se colocan luego en un baño de agua hirviendo durante 5 min. Se preparan para su uso los geles Bio-Rad Ready (geles SDS con gradiente T de 10 pocillos al 4–15%) y el aparato de electroforesis. El uso de geles Bio-Rad prefabricados evita la exposición de los estudiantes a la acrilamida, que en forma no polimerizada es una neurotoxina. Se añaden al gel el blanco, la fracción Mb bruta, el estándar SDS MW y el estándar Mb (25 μl cada uno) y las fracciones CMC y G-75 (45 μl cada una); dos grupos pueden colocar sus muestras en un gel con un conjunto de estándares. La electroforesis se completa en ~ 30 min a 200 V constantes.Después de la electroforesis, el gel se retira y se tiñe con azul de Coomassie G-250 (0,04% (p / v) y 3,5% (p / v) de ácido perclórico) durante 30 min y se destiñó adicionalmente durante la noche en ácido acético al 5,0% (v / v). Se toman las medidas apropiadas de las bandas de proteínas en las imágenes de los geles capturados con un sistema de fotodocumentación Photodyne Visionary, y un log MW versus movilidad relativaRmetro) se construye la curva estándar.


Selección de resinas para cromatografía de intercambio iónico

Las resinas de cromatografía de intercambio iónico se componen de grupos funcionales cargados positiva o negativamente que se unen covalentemente a una matriz sólida. Las matrices comunes son celulosa, agarosa, polimetacrilato, poliestireno y poliacrilamida. Las últimas tres matrices permiten mayores caudales.

Varios factores informan la elección de la resina:

Decidir entre un intercambiador de aniones y un intercambiador de cationes

Para muchos flujos de trabajo de purificación de proteínas, el plegamiento y la estabilidad de las proteínas son una preocupación. En estos escenarios, la selección de un intercambiador de aniones o cationes depende de la proteína de interés y de la estabilidad del rsquos.

Algunas proteínas son estables tanto por encima como por debajo de su pI. Estas proteínas se pueden purificar con un intercambiador de aniones o cationes. Otras proteínas son estables solo por encima o por debajo de su pI. Para estas proteínas, la estabilidad dicta la elección de la resina si, por ejemplo, una proteína es estable sólo por encima de su pI, se debería elegir una resina de intercambio aniónico. Cuando la estabilidad de la proteína no es un problema, se puede usar un intercambiador de aniones o cationes.

Intercambiadores de iones débiles frente a fuertes

Las resinas de intercambio iónico vienen en dos tipos: fuertes y débiles.

El número de cargas en un intercambiador de iones fuerte permanece constante independientemente del pH del tampón. Estos tipos de resinas conservan su selectividad y capacidad en un amplio rango de pH. Ejemplos de intercambiadores de iones fuertes son las resinas de amonio cuaternario (Q), sulfonato (S) y sulfopropilo (SP).

Intercambiadores de iones débiles, por el contrario, muestran una función dependiente del pH y, por lo tanto, brindan un rendimiento óptimo en solo un pequeño rango de pH. Cuando el pH del tampón ya no coincide con la constante de disociación ácida (pKa) del grupo funcional de la resina, estas resinas sufren una pérdida de capacidad significativa. Los intercambiadores de aniones débiles funcionan mal por encima de un pH de 9 y los intercambiadores de cationes débiles comienzan a perder su ionización por debajo de pH 6. Cuando se trabaja con resinas de intercambio de iones débiles como las resinas de dietilaminoetilo (DEAE) o carboximetilo (CM), es importante trabajar dentro de la rango de pH de trabajo proporcionado por el proveedor.

Apoyo DEAE Alta Q CM Alto S
Tipo de intercambio Anión débil Anión fuerte Catión débil Catión fuerte
Grupo funcional -N + (C2H5)2 -N + (CH3)3 - COO - -ASI QUE 3 -
Rango de pH * 5 y ndash9 0 y ndash14 5 y ndash9 0 y ndash14

* Consulte las instrucciones del fabricante y rsquos para conocer el rango de pH de cada resina individual. Las proteínas de interés pueden no ser estables en todo el rango de pH.

Los intercambiadores de iones fuertes suelen ser resinas preferidas para muchas aplicaciones porque su rendimiento no se ve afectado por el pH. Sin embargo, los intercambiadores de iones débiles pueden ser herramientas de separación poderosas en los casos en que los intercambiadores de iones fuertes fallan porque las selectividades de los intercambiadores de iones fuertes y débiles a menudo difieren.

Forma iónica de la resina IEX

La forma iónica de un soporte se refiere al contraión que se adsorbe sobre los grupos funcionales de resina y rsquos. Este ion se puede cambiar intercambiando el tampón de equilibrio de la columna. Los contraiones comunes para los intercambiadores de aniones y cationes son Na + y Cl -, respectivamente.

La fuerza de la interacción con una resina dada varía para diferentes contraiones. Cuanto menor sea la selectividad de un contraión por el soporte, más fácilmente se puede intercambiar por otro ión de carga similar (por ejemplo, la proteína de interés). De manera similar, el tampón de elución que contiene un contraión con una selectividad relativamente menor para el soporte desplazará las proteínas de la resina de la columna con menos facilidad durante la elución. En algunos casos, esta diferencia se puede aprovechar y contraiones como Li +, Br - y SO4 2- se utilizan a menudo para mejorar la selectividad de la resina.

Tamaño de partícula de resina

El tamaño de partícula de resina se refiere al tamaño del soporte sólido de resina. El tamaño de las partículas no afecta la selectividad de la resina, pero sí afecta la resolución.

Fig. 6. Relación entre el tamaño de las partículas de resina, la presión y la resolución..

Partículas más pequeñas proporcionan una resolución más alta, pero normalmente también requieren tasas de flujo más bajas. Los medios de alta resolución se utilizan comúnmente para trabajos analíticos y a pequeña escala, así como para los pasos finales de pulido de la cromatografía preparativa. Muestras muy viscosas como aclaradas E. coli Los lisados ​​o las muestras que contienen glicerol a menudo no se pueden separar con resinas IEX de partículas pequeñas debido al aumento de la contrapresión de las resinas de partículas pequeñas, que pueden exceder el límite de presión de operación de la columna y rsquos.

Partículas más grandes permiten velocidades de flujo más altas pero producen una resolución más baja. Un método que produce picos nítidos y distintos utilizando una resina IEX de partículas pequeñas producirá picos más amplios y menos definidos cuando se utiliza una resina de partículas más grandes. Las resinas IEX de partículas grandes son una excelente opción para trabajos preparativos a gran escala. Los tamaños de partículas más grandes también son la mejor opción cuando las muestras son viscosas, como cuando se usa IEX como primer paso en un flujo de trabajo de purificación de proteínas.

Tasa de flujo

Tasa de flujo se refiere a la rapidez con la que se pasa el tampón sobre una resina. Por lo tanto, el caudal determina la cantidad de tiempo en el que las proteínas pueden interactuar con la resina de la columna, que se denomina tiempo de residencia de una columna en particular a un caudal determinado. A diferencia del tamaño de partícula, el caudal afecta tanto a la resolución como a la capacidad: los tiempos de residencia más largos aumentan tanto la capacidad como la resolución de una resina.

Fig. 7. Efecto del caudal en la resolución IEX. Separación de una muestra de 5 ml de mioglobina (pico 1), ribonucleasa A (pico 2) y citocromo c (pico 3) en una columna de intercambio catiónico Macro-Prep & reg High Q de 1 x 13 cm (8,7 ml).

Los caudales no solo están limitados por la pérdida de resolución y capacidad a caudales más altos, sino también por la propia resina. A medida que aumentan los índices de flujo, aumenta la presión sobre la resina. Si la contrapresión es demasiado alta, puede aplastar la resina de la columna. Por tanto, los fabricantes proporcionan un límite de presión para todas sus resinas.

Por lo general, se elige el caudal más rápido que aún ofrece la capacidad y resolución deseadas. Aunque velocidades de flujo más lentas pueden proporcionar una resolución y capacidad aún mejores, esto a menudo se produce a expensas de la actividad de las proteínas, ya que muchas proteínas pierden actividad con el tiempo en las condiciones del sistema de cromatografía.

Capacidad de unión dinámica de resina

La capacidad de unión dinámica de una resina se refiere a la cantidad de proteína que la resina puede unir a una velocidad de flujo determinada; generalmente se informa como mg / ml de proteína unida a una determinada velocidad de flujo. Este valor varía de una resina a otra y puede ser importante cuando se requieren velocidades de flujo rápidas para mantener la actividad de la proteína.


Columna Sephadex para alfa-amilasa - Biología

Cromatografía de filtración en gel (Sephadex)

Parte A: La columna se ha montado sobre un soporte de anillo. Se han añadido 50 ml de tampón Tris mientras la salida está cerrado. Ahora la columna está llena con una suspensión de Sephadex G-75 (tenga en cuenta que debe agitarse justo antes de verterla en la columna).

Parte B: El sephadex se ha asentado y la salida se pega con cinta justo debajo de la parte superior de la columna y se abre para que el tampón fluya a través de la columna. Observe que el efluente gotea lentamente por la salida. Durante la parte C, la salida se baja para ralentizar el goteo.

Parte C: Se agrega más lechada con frecuencia, manteniendo la superficie superior del gel 1-2 cm por debajo de la de la columna (nuestra columna de muestra es más baja para hacerla más visible). Observe una clara diferencia entre el material empacado y la lechada sin empacar. Se tomaron tomas de video en varios puntos durante el empaque.

Parte D: La parte superior de la columna está cerrada y el matraz Mariotte sobre la columna se conecta a la parte superior de la columna a través de un tubo. La columna se lava con aproximadamente 300 ml de tampón. Una vez que se completa el lavado, la configuración de la columna se lleva a la cámara fría y se hace funcionar durante la noche para equilibrar. Nota: es vital que la columna esté configurada correctamente para que no se seque, especialmente si se deja desatendida. El cabezal de presión (espacio entre el amortiguador y la salida) debe Nunca tener más de 20 cm.

Parte e: La salida se cierra y el matraz Mariotte se desconecta. Se quita la tapa y se retira el tampón sobre el gel con una pipeta.

Parte F: La muestra que se va a analizar se carga suavemente con una pipeta pasteur. La punta de la pipeta se sostiene contra la pared de la columna y se mueve con un movimiento circular para que la muestra se acumule lentamente en el lecho de gel. ¡NO rompa la pipeta pasteur!

Parte G: La muestra se introduce en el lecho de gel. Observe que la altura del líquido disminuye durante esta parte.

No mostrado: La columna se lava 2-3 veces con alícuotas de 2 ml de tampón. Una vez lavado, la salida se cierra y la columna se llena con tampón. Se adjunta el matraz Mariotte con 400-500 mL de tampón. Se utiliza una altura de presión de 15 cm. La salida está conectada a un colector automático de fracciones. La columna debe funcionar lentamente y debe configurarse de manera que NO se seque.


Inmunoprecipitación de proteínas individuales (IP) Editar

Implica el uso de un anticuerpo que es específico para una proteína conocida para aislar esa proteína en particular de una solución que contiene muchas proteínas diferentes. Estas soluciones estarán a menudo en forma de lisado crudo de un tejido vegetal o animal. Otros tipos de muestras pueden ser fluidos corporales u otras muestras de origen biológico.

Inmunoprecipitación de complejos de proteínas (Co-IP) Editar

La inmunoprecipitación de complejos proteicos intactos (es decir, el antígeno junto con cualquier proteína o ligando que esté unido a él) se conoce como co-inmunoprecipitación (Co-IP). Co-IP funciona seleccionando un anticuerpo que se dirige a una proteína conocida que se cree que es miembro de un complejo de proteínas más grande. Al apuntar a esto conocido miembro con un anticuerpo, puede ser posible extraer todo el complejo proteico de la solución y así identificar desconocido miembros del complejo.

Esto funciona cuando las proteínas involucradas en el complejo se unen entre sí estrechamente, lo que hace posible sacar varios miembros del complejo de la solución al adherirse a un miembro con un anticuerpo. Este concepto de extraer complejos de proteínas de la solución a veces se denomina "extracción". Co-IP es una técnica poderosa que los biólogos moleculares utilizan regularmente para analizar las interacciones proteína-proteína.

  • Un anticuerpo particular a menudo selecciona una subpoblación de su proteína diana que tiene el epítopo expuesto, por lo que no logra identificar ninguna proteína en los complejos que ocultan el epítopo. Esto se puede ver en que rara vez es posible precipitar incluso la mitad de una proteína dada de una muestra con un solo anticuerpo, incluso cuando se usa un gran exceso de anticuerpo.
  • A medida que tienen lugar rondas sucesivas de direccionamiento e inmunoprecipitaciones, el número de proteínas identificadas puede seguir creciendo. Es posible que las proteínas identificadas no existan nunca en un solo complejo en un momento dado, sino que pueden representar una red de proteínas que interactúan entre sí en diferentes momentos para diferentes propósitos.
  • Repetir el experimento apuntando a diferentes miembros del complejo de proteínas permite al investigador verificar el resultado. Cada ronda de pull-downs debería resultar en la recuperación tanto de la proteína conocida original como de otros miembros del complejo previamente identificados (e incluso nuevos miembros adicionales). Al repetir la inmunoprecipitación de esta manera, el investigador verifica que cada miembro identificado del complejo proteico sea una identificación válida. If a particular protein can only be recovered by targeting one of the known members but not by targeting other of the known members then that protein's status as a member of the complex may be subject to question.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) Edit

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a method used to determine the location of DNA binding sites on the genome for a particular protein of interest. This technique gives a picture of the protein–DNA interactions that occur inside the nucleus of living cells or tissues. los en vivo nature of this method is in contrast to other approaches traditionally employed to answer the same questions.

The principle underpinning this assay is that DNA-binding proteins (including transcription factors and histones) in living cells can be cross-linked to the DNA that they are binding. By using an antibody that is specific to a putative DNA binding protein, one can immunoprecipitate the protein–DNA complex out of cellular lysates. The crosslinking is often accomplished by applying formaldehyde to the cells (or tissue), although it is sometimes advantageous to use a more defined and consistent crosslinker such as di-tert-butyl peroxide (DTBP). Following crosslinking, the cells are lysed and the DNA is broken into pieces 0.2–1.0 kb in length by sonication. At this point the immunoprecipitation is performed resulting in the purification of protein–DNA complexes. The purified protein–DNA complexes are then heated to reverse the formaldehyde cross-linking of the protein and DNA complexes, allowing the DNA to be separated from the proteins. The identity and quantity of the DNA fragments isolated can then be determined by polymerase chain reaction (PCR). The limitation of performing PCR on the isolated fragments is that one must have an idea which genomic region is being targeted in order to generate the correct PCR primers. Sometimes this limitation is circumvented simply by cloning the isolated genomic DNA into a plasmid vector and then using primers that are specific to the cloning region of that vector. Alternatively, when one wants to find where the protein binds on a genome-wide scale, ChIP-sequencing is used and has recently emerged as a standard technology that can localize protein binding sites in a high-throughput, cost-effective fashion, allowing also for the characterization of the cistrome. Previously, DNA microarray was also used (ChIP-on-chip or ChIP-chip).

RNP immunoprecipitation (RIP) Edit

Similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP) outlined above, but rather than targeting DNA binding proteins as in ChIP, an RNP immunoprecipitation targets ribonucleoproteins (RNPs). [1] Live cells are first lysed and then the target protein and associated RNA are immunoprecipitated using an antibody targeting the protein of interest. The purified RNA-protein complexes can be separated by performing an RNA extraction and the identity of the RNA can be determined by cDNA sequencing [2] or RT-PCR. Some variants of RIP, such as PAR-CLIP include cross-linking steps, which then require less careful lysis conditions.

Tagged proteins Edit

One of the major technical hurdles with immunoprecipitation is the great difficulty in generating an antibody that specifically targets a single known protein. To get around this obstacle, many groups will engineer tags onto either the C- or N- terminal end of the protein of interest. The advantage here is that the same tag can be used time and again on many different proteins and the researcher can use the same antibody each time. The advantages with using tagged proteins are so great that this technique has become commonplace for all types of immunoprecipitation including all of the types of IP detailed above. Examples of tags in use are the green fluorescent protein (GFP) tag, glutathione-S-transferase (GST) tag and the FLAG-tag tag. While the use of a tag to enable pull-downs is convenient, it raises some concerns regarding biological relevance because the tag itself may either obscure native interactions or introduce new and unnatural interactions.

The two general methods for immunoprecipitation are the direct capture method and the indirect capture method.

Edición directa

Antibodies that are specific for a particular protein (or group of proteins) are immobilized on a solid-phase substrate such as superparamagnetic microbeads or on microscopic agarose (non-magnetic) beads. The beads with bound antibodies are then added to the protein mixture, and the proteins that are targeted by the antibodies are captured onto the beads via the antibodies in other words, they become immunoprecipitated.

Edición indirecta

Antibodies that are specific for a particular protein, or a group of proteins, are added directly to the mixture of protein. The antibodies have not been attached to a solid-phase support yet. The antibodies are free to float around the protein mixture and bind their targets. As time passes, beads coated in Protein A/G are added to the mixture of antibody and protein. At this point, the antibodies, which are now bound to their targets, will stick to the beads.

From this point on, the direct and indirect protocols converge because the samples now have the same ingredients. Both methods give the same end-result with the protein or protein complexes bound to the antibodies which themselves are immobilized onto the beads.

Selección Editar

An indirect approach is sometimes preferred when the concentration of the protein target is low or when the specific affinity of the antibody for the protein is weak. The indirect method is also used when the binding kinetics of the antibody to the protein is slow for a variety of reasons. In most situations, the direct method is the default, and the preferred, choice.

Agarose Edit

Historically the solid-phase support for immunoprecipitation used by the majority of scientists has been highly-porous agarose beads (also known as agarose resins or slurries). The advantage of this technology is a very high potential binding capacity, as virtually the entire sponge-like structure of the agarose particle (50 to 150μm in size) is available for binding antibodies (which will in turn bind the target proteins) and the use of standard laboratory equipment for all aspects of the IP protocol without the need for any specialized equipment. The advantage of an extremely high binding capacity must be carefully balanced with the quantity of antibody that the researcher is prepared to use to coat the agarose beads. Because antibodies can be a cost-limiting factor, it is best to calculate backward de the amount of protein that needs to be captured (depending upon the analysis to be performed downstream), para the amount of antibody that is required to bind that quantity of protein (with a small excess added in order to account for inefficiencies of the system), and back still further para the quantity of agarose that is needed to bind that particular quantity of antibody. In cases where antibody saturation is not required, this technology is unmatched in its ability to capture extremely large quantities of captured target proteins. The caveat here is that the "high capacity advantage" can become a "high capacity disadvantage" that is manifested when the enormous binding capacity of the sepharose/agarose beads is not completely saturated with antibodies. It often happens that the amount of antibody available to the researcher for their immunoprecipitation experiment is less than sufficient to saturate the agarose beads to be used in the immunoprecipitation. In these cases the researcher can end up with agarose particles that are only partially coated with antibodies, and the portion of the binding capacity of the agarose beads that is not coated with antibody is then free to bind anything that will stick, resulting in an elevated background signal due to non-specific binding of lysate components to the beads, which can make data interpretation difficult. While some may argue that for these reasons it is prudent to match the quantity of agarose (in terms of binding capacity) to the quantity of antibody that one wishes to be bound for the immunoprecipitation, a simple way to reduce the issue of non-specific binding to agarose beads and increase specificity is to preclear the lysate, which for any immunoprecipitation is highly recommended. [3] [4]

Preclearing Edit

Lysates are complex mixtures of proteins, lipids, carbohydrates and nucleic acids, and one must assume that some amount of non-specific binding to the IP antibody, Protein A/G or the beaded support will occur and negatively affect the detection of the immunoprecipitated target(s). In most cases, preclearing the lysate at the start of each immunoprecipitation experiment (see step 2 in the "protocol" section below) [5] is a way to remove potentially reactive components from the cell lysate prior to the immunoprecipitation to prevent the non-specific binding of these components to the IP beads or antibody. The basic preclearing procedure is described below, wherein the lysate is incubated with beads alone, which are then removed and discarded prior to the immunoprecipitation. [5] This approach, though, does not account for non-specific binding to the IP antibody, which can be considerable. Therefore, an alternative method of preclearing is to incubate the protein mixture with exactly the same components that will be used in the immunoprecipitation, except that a non-target, irrelevant antibody of the same antibody subclass as the IP antibody is used instead of the IP antibody itself. [4] This approach attempts to use as close to the exact IP conditions and components as the actual immunoprecipitation to remove any non-specific cell constituent without capturing the target protein (unless, of course, the target protein non-specifically binds to some other IP component, which should be properly controlled for by analyzing the discarded beads used to preclear the lysate). The target protein can then be immunoprecipitated with the reduced risk of non-specific binding interfering with data interpretation.

Superparamagnetic beads Edit

While the vast majority of immunoprecipitations are performed with agarose beads, the use of superparamagnetic beads for immunoprecipitation is a newer approach that is gaining in popularity as an alternative to agarose beads for IP applications. Unlike agarose, magnetic beads are solid and can be spherical, depending on the type of bead, and antibody binding is limited to the surface of each bead. While these beads do not have the advantage of a porous center to increase the binding capacity, magnetic beads are significantly smaller than agarose beads (1 to 4μm), and the greater number of magnetic beads per volume than agarose beads collectively gives magnetic beads an effective surface area-to-volume ratio for optimum antibody binding.

Commercially available magnetic beads can be separated based by size uniformity into monodisperse and polydisperse beads. Monodisperse beads, also called microbeads, exhibit exact uniformity, and therefore all beads exhibit identical physical characteristics, including the binding capacity and the level of attraction to magnets. Polydisperse beads, while similar in size to monodisperse beads, show a wide range in size variability (1 to 4μm) that can influence their binding capacity and magnetic capture. Although both types of beads are commercially available for immunoprecipitation applications, the higher quality monodisperse superparamagnetic beads are more ideal for automatic protocols because of their consistent size, shape and performance. Monodisperse and polydisperse superparamagnetic beads are offered by many companies, including Invitrogen, Thermo Scientific, and Millipore.

Agarose vs. magnetic beads Edit

Proponents of magnetic beads claim that the beads exhibit a faster rate of protein binding [6] [7] [8] over agarose beads for immunoprecipitation applications, although standard agarose bead-based immunoprecipitations have been performed in 1 hour. [4] Claims have also been made that magnetic beads are better for immunoprecipitating extremely large protein complexes because of the complete lack of an upper size limit for such complexes, [6] [7] [9] although there is no unbiased evidence stating this claim. The nature of magnetic bead technology does result in less sample handling [7] due to the reduced physical stress on samples of magnetic separation versus repeated centrifugation when using agarose, which may contribute greatly to increasing the yield of labile (fragile) protein complexes. [7] [8] [9] Additional factors, though, such as the binding capacity, cost of the reagent, the requirement of extra equipment and the capability to automate IP processes should be considered in the selection of an immunoprecipitation support.

Binding capacity Edit

Proponents of both agarose and magnetic beads can argue whether the vast difference in the binding capacities of the two beads favors one particular type of bead. In a bead-to-bead comparison, agarose beads have significantly greater surface area and therefore a greater binding capacity than magnetic beads due to the large bead size and sponge-like structure. But the variable pore size of the agarose causes a potential upper size limit that may affect the binding of extremely large proteins or protein complexes to internal binding sites, and therefore magnetic beads may be better suited for immunoprecipitating large proteins or protein complexes than agarose beads, although there is a lack of independent comparative evidence that proves either case.

Some argue that the significantly greater binding capacity of agarose beads may be a disadvantage because of the larger capacity of non-specific binding. Others may argue for the use of magnetic beads because of the greater quantity of antibody required to saturate the total binding capacity of agarose beads, which would obviously be an economical disadvantage of using agarose. While these arguments are correct outside the context of their practical use, these lines of reasoning ignore two key aspects of the principle of immunoprecipitation that demonstrates that the decision to use agarose or magnetic beads is not simply determined by binding capacity.

First, non-specific binding is not limited to the antibody-binding sites on the immobilized support any surface of the antibody or component of the immunoprecipitation reaction can bind to nonspecific lysate constituents, and therefore nonspecific binding will still occur even when completely saturated beads are used. This is why it is important to preclear the sample before the immunoprecipitation is performed.

Second, the ability to capture the target protein is directly dependent upon the amount of immobilized antibody used, and therefore, in a side-by-side comparison of agarose and magnetic bead immunoprecipitation, the most protein that either support can capture is limited by the amount of antibody added. So the decision to saturate any type of support depends on the amount of protein required, as described above in the Agarose section of this page.

Cost Edit

The price of using either type of support is a key determining factor in using agarose or magnetic beads for immunoprecipitation applications. A typical first-glance calculation on the cost of magnetic beads compared to sepharose beads may make the sepharose beads appear less expensive. But magnetic beads may be competitively priced compared to agarose for analytical-scale immunoprecipitations depending on the IP method used and the volume of beads required per IP reaction.

Using the traditional batch method of immunoprecipitation as listed below, where all components are added to a tube during the IP reaction, the physical handling characteristics of agarose beads necessitate a minimum quantity of beads for each IP experiment (typically in the range of 25 to 50μl beads per IP). This is because sepharose beads must be concentrated at the bottom of the tube by centrifugation and the supernatant removed after each incubation, wash, etc. This imposes absolute physical limitations on the process, as pellets of agarose beads less than 25 to 50μl are difficult if not impossible to visually identify at the bottom of the tube. With magnetic beads, there is no minimum quantity of beads required due to magnetic handling, and therefore, depending on the target antigen and IP antibody, it is possible to use considerably less magnetic beads.

Conversely, spin columns may be employed instead of normal microfuge tubes to significantly reduce the amount of agarose beads required per reaction. Spin columns contain a filter that allows all IP components except the beads to flow through using a brief centrifugation and therefore provide a method to use significantly less agarose beads with minimal loss.

Equipment Edit

As mentioned above, only standard laboratory equipment is required for the use of agarose beads in immunoprecipitation applications, while high-power magnets are required for magnetic bead-based IP reactions. While the magnetic capture equipment may be cost-prohibitive, the rapid completion of immunoprecipitations using magnetic beads may be a financially beneficial approach when grants are due, because a 30-minute protocol with magnetic beads compared to overnight incubation at 4 °C with agarose beads may result in more data generated in a shorter length of time. [6] [7] [8]

Automation Edit

An added benefit of using magnetic beads is that automated immunoprecipitation devices are becoming more readily available. These devices not only reduce the amount of work and time to perform an IP, but they can also be used for high-throughput applications.

Resumen Editar

While clear benefits of using magnetic beads include the increased reaction speed, more gentle sample handling and the potential for automation, the choice of using agarose or magnetic beads based on the binding capacity of the support medium and the cost of the product may depend on the protein of interest and the IP method used. As with all assays, empirical testing is required to determine which method is optimal for a given application.

Background Edit

Once the solid substrate bead technology has been chosen, antibodies are coupled to the beads and the antibody-coated-beads can be added to the heterogeneous protein sample (e.g. homogenized tissue). At this point, antibodies that are immobilized to the beads will bind to the proteins that they specifically recognize. Once this has occurred the immunoprecipitation portion of the protocol is actually complete, as the specific proteins of interest are bound to the antibodies that are themselves immobilized to the beads. Separation of the immunocomplexes from the lysate is an extremely important series of steps, because the protein(s) must remain bound to each other (in the case of co-IP) and bound to the antibody during the wash steps to remove non-bound proteins and reduce background.

When working with agarose beads, the beads must be pelleted out of the sample by briefly spinning in a centrifuge with forces between 600–3,000 x g (times the standard gravitational force). This step may be performed in a standard microcentrifuge tube, but for faster separation, greater consistency and higher recoveries, the process is often performed in small spin columns with a pore size that allows liquid, but not agarose beads, to pass through. After centrifugation, the agarose beads will form a very loose fluffy pellet at the bottom of the tube. The supernatant containing contaminants can be carefully removed so as not to disturb the beads. The wash buffer can then be added to the beads and after mixing, the beads are again separated by centrifugation.

With superparamagnetic beads, the sample is placed in a magnetic field so that the beads can collect on the side of the tube. This procedure is generally complete in approximately 30 seconds, and the remaining (unwanted) liquid is pipetted away. Washes are accomplished by resuspending the beads (off the magnet) with the washing solution and then concentrating the beads back on the tube wall (by placing the tube back on the magnet). The washing is generally repeated several times to ensure adequate removal of contaminants. If the superparamagnetic beads are homogeneous in size and the magnet has been designed properly, the beads will concentrate uniformly on the side of the tube and the washing solution can be easily and completely removed.

After washing, the precipitated protein(s) are eluted and analyzed by gel electrophoresis, mass spectrometry, western blotting, or any number of other methods for identifying constituents in the complex. Protocol times for immunoprecipitation vary greatly due to a variety of factors, with protocol times increasing with the number of washes necessary or with the slower reaction kinetics of porous agarose beads.


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