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¿Puede reemplazar la glucosa con glicerol en los medios celulares?

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Para alimentar a un célula animal en proceso llamado Respiración, ¿puedo reemplazar la glucosa con glicerol?

La siguiente ecuación: glicerol + oxígeno -> agua + óxido de carbono


En la mayoría de los casos, no es una buena idea reemplazar la glucosa con glicerol en los medios de células animales. Los animales poseen la capacidad de metabolizar el glicerol a través de una vía que comienza con la enzima glicerol quinasa. Sin embargo, la glicerol quinasa solo se expresa en ciertos tipos de células, como las células hepáticas y las células renales.

Referencias:

http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=2.7.1.30 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22591/


Metabolismo de moléculas distintas a la glucosa.

Ha aprendido sobre el catabolismo de la glucosa, que proporciona energía a las células vivas. Pero los seres vivos consumen algo más que glucosa como alimento. ¿Cómo un sándwich de pavo, que contiene varios carbohidratos, lípidos y proteínas, proporciona energía a sus células?

Básicamente, todas estas moléculas de los alimentos se convierten en moléculas que pueden ingresar a la vía de respiración celular en algún lugar. Algunas moléculas entran en la glucólisis, mientras que otras entran en el ciclo del ácido cítrico. Esto significa que todas las vías catabólicas de los carbohidratos, proteínas y lípidos eventualmente se conectan a la glucólisis y a las vías del ciclo del ácido cítrico. Las vías metabólicas deben considerarse porosas, es decir, las sustancias entran por otras vías y otras sustancias salen por otras vías. Estas vías no son sistemas cerrados. Muchos de los productos en una vía particular son reactivos en otras vías.


Resumen

El alcohol es fundamental para el carácter del vino, pero demasiado puede desequilibrarlo. Se considera que un vino está bien equilibrado si su grado alcohólico, acidez, dulzor, frutosidad y estructura tánica se complementan, de modo que ningún componente domine en boca. Equilibrar los sabores frutales positivos de un vino con la concentración óptima absoluta y relativa de alcohol puede resultar sorprendentemente difícil. Durante las últimas tres décadas, los consumidores han demandado cada vez más vinos con perfiles de sabor a frutas más ricos y maduros. En respuesta, los productores de uva y vino han extendido los tiempos de cosecha para aumentar la madurez de la uva y mejorar el grado de sabores frutales y la intensidad del color. Sin embargo, un mayor grado de madurez de la uva da como resultado una mayor concentración de azúcar en la uva, lo que a su vez da como resultado vinos con una concentración elevada de alcohol. En promedio, el grado alcohólico de los vinos tintos de muchas regiones cálidas productoras de vino a nivel mundial aumentó aproximadamente un 2% (v / v) durante este período. A pesar de que muchos de estos vinos "con cuerpo y con sabor a fruta" están bien equilibrados y son buscados, también hay un segmento importante del mercado de consumidores que busca estilos más ligeros con menos "picor" derivado del etanol en el paladar. Los productores de vino enfocados en el consumidor están desarrollando e implementando varias estrategias en el viñedo y la bodega para reducir la concentración de alcohol en los vinos producidos a partir de uvas bien maduras. En este contexto, Saccharomyces cerevisiae Las levaduras enológicas han demostrado ser una estrategia fundamental para reducir la formación de etanol durante la fermentación de mostos de uva con alto contenido de azúcar (& gt 240 g l −1). Uno de los enfoques ha sido desarrollar cepas de levadura con "bajo contenido de alcohol" que funcionan redirigiendo su metabolismo de carbono desde la producción de etanol hacia otros metabolitos, como el glicerol. Este artículo revisa los desafíos actuales de producir glicerol a expensas del etanol. También arroja nueva luz sobre los programas de desarrollo de cepas de levadura que, reforzados por la genómica sintética, podrían potencialmente superar estos desafíos.


PpNrg1 es un represor transcripcional para la represión de glucosa y glicerol de AOX1 promotor en levadura metilotrófica Pichia pastoris

El regulador en la represión de glicerol de Pichia pastoris AOX1 promotor (P AOX1) aún no está claro.

Resultados

Un Cys2Su2 represor transcripcional de dedos de zinc PpNrg1 localizado en el núcleo y participó en la represión de P AOX1 en P. pastoris en glucosa y glicerol. La PCR cuantitativa en tiempo real reveló que PpNrg1 reprimió la expresión de numerosos genes implicados en la utilización del metanol y la biogénesis del peroxisoma en glucosa al 0,02% y glicerol al 1% (v / v). El ensayo de cambio de movilidad electroforética y el ensayo de huella de ADNasa I revelaron que PpNrg1 se unió a cinco sitios de P AOX1, incluidos dos sitios de unión de PpMxr1, que es un activador indispensable de P AOX1 en P. pastoris.

Conclusión

El represor transcripcional PpNrg1 suprime P AOX1 en glucosa y glicerol al unirse directamente a cinco sitios de P AOX1, incluidos dos sitios de unión del activador transcripcional PpMxr1.


Criopreservación de gametos y embriones de peces y mariscos

3.4 Selección de extensores y crioprotectores

Los extensores y crioprotectores se han estudiado muy bien porque la criopreservación es difícil sin ellos. Además del líquido seminal y el crioprotector universal, DMSO, se han utilizado otros crioprotectores únicos, crioprotectores combinados, crioprotectores con yema de huevo o sacarosa para criopreservar gametos, blastómeros, nauplios o embriones. Parece que existe una marcada especificidad de especie en los requisitos de diluyente.

La yema de huevo de gallina se ha probado como aditivo en el diluyente o crioprotector en muchos estudios de criopreservación. En peces marinos, la solución de Erdahl y Graham y la yema de huevo mostraron un efecto positivo en la lecha del lucio del norte, Esox lucius L., con una mayor tasa de fertilización (Babiak et al., 1995). En cobia, Rachycentron canadum, DMSO al 10% con glucosa 3 mM y yema de huevo al 10% dio aproximadamente un 100% de motilidad de los espermatozoides después del crioalmacenamiento a -80 ° C durante 1 año (Caylor et al., 1994). Chereguini y col. (1997) también mezclaron DMSO con yema de huevo en crioconservación de rodaballo (Scophthalmus maximus) esperma. Los espermatozoides de rodaballo también se pueden crioconservar con una alta tasa de éxito en una solución de sacarosa con 10% de DMSO y 10% de yema de huevo. En peces de agua dulce como el salmón del Danubio (Hucho hucho), DMSO al 10% + yema de huevo al 10% + glucosa 0,3 M + KCl 25 mM fue lo más adecuado para la crioconservación de la leche, lo que resultó en un 87,5% de huevos con ojos (Glogowski et al., 1997a). Ciereszko y col. (1993) compararon dos crioprotectores combinados y encontraron que el 8% de DMSO con el 10% de yema de huevo dio una tasa de fertilización significativamente mayor que el 20% de glicerol con 0,3 M de glucosa en la perca amarilla. Perea flavescenshile. Lahnsteiner y col. (1996b) señalaron además que la adición de yema de huevo (7%, 20% del volumen total de diluyente) y sacarosa (0,5%) aumentaba significativamente la calidad de la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) semen en comparación con el mismo diluyente de DMSO y glicerol o DMSO, glicerol y propanodiol sin estos aditivos. Aunque muchos estudios han demostrado el efecto positivo de usar la yema de huevo como diluyente, es posible que no sea aplicable a otras especies. Piironen (1993) encontró que la adición de yema de huevo como diluyente para la criopreservación de espermatozoides aumentaba las tasas de fertilización en la trucha marrón (Salmo trutta m. lacustres L.) pero no en Artie charr (Salvelinus alpinus L.). En asp, Aspius aspius, la presencia de yema de huevo en los extensores disminuyó significativamente el éxito de la crioconservación (Babiak et al., 1998). La acción protectora de la yema es aparentemente específica de la especie y puede depender de los componentes del diluyente y del procedimiento de crioconservación.

En algunos estudios recientes, norte,norte-dimetil acetamida (DMA) y norte, norte-dimetilformamida (DMF) se aplicó como crioprotectores alternativos. Wayman y col. (1996) evaluaron cuatro productos químicos como crioprotectores en la criopreservación de trucha marina manchada (Cynoscion nebulosus) esperma y descubrió que el DMA, el metanol y el glicerol eran inferiores al DMSO al 10%. De Baulny y col. (1997) también probaron DMA en la criopreservación de trucha arco iris (O. mykiss) esperma pero falló. En el caso de los espermatozoides medaka, Aoki et al. (1997) indicaron que los mejores resultados se obtuvieron utilizando 50 μl de suero fetal bovino suplementado con DMF al 10% como crioprotectores. Las pruebas de fertilización mostraron que se pueden obtener tasas de fertilización del 96% al 100% y tasas de eclosión del 84% al 100%. Su estudio proporciona, por primera vez, un método práctico para preservar los espermatozoides medaka.

En la criopreservación de esperma de ostra del Pacífico, C. gigas, se obtuvo una alta tasa de fertilización del 45,9% en un estudio utilizando una solución que contenía DMSO al 8%, sacarosa 50 mM y glutatión reducido 6 mM como crioprotector y congelando la mezcla de lecha en vapor de nitrógeno líquido (Usuki et al., 1997). El mismo informe indicó que los espermatozoides criopreservados durante 4 años mostraron una menor viabilidad que los espermatozoides criopreservados a corto plazo. La proporción de larvas normales en forma de D y la tasa de supervivencia a los 6 días después de la fertilización fue de 78,0% y 77,4%, respectivamente, utilizando espermatozoides criopreservados durante 4 años.

Harvey (1983a, b) informó sobre la eficacia del metanol como diluyente para el esperma de tilapia y pez cebra. Un diluyente con pH 7,35 y presión osmótica de esperma 375 mosM / 1, condiciones que previenen la motilidad de los espermatozoides, se utilizó con éxito para criopreservar la dorada (Spa. aurata) esperma a - 196 ° C (Chambeyron y Zohar, 1990).


Conclusiones

Se desarrolló con éxito un bioproceso alternativo para la producción de etanol a partir de biomasa utilizando una cepa diseñada genéticamente para activar o desactivar la utilización de glucosa en E. coli mediante un interruptor de temperatura, aliviando así el efecto inhibidor de la glucosa sobre la utilización de otros azúcares. Las células desactivadas para la utilización de glucosa pueden utilizar preferentemente xilosa y otros azúcares presentes en los hidrolizados lignocelulósicos para el crecimiento celular, mientras que las células activadas para la utilización de glucosa pueden convertir eficazmente la glucosa y otros azúcares en etanol durante la etapa anaeróbica para la fermentación del etanol. Significativamente, se mejoró la eficiencia de utilización de azúcares en hidrolizados lignocelulósicos y también la viabilidad económica de la producción de etanol a partir de biomasa.


Abstracto

Un alto grado de dependencia de los combustibles fósiles es uno de los principales problemas a los que se enfrentan las sociedades modernas. d -La glucosa y el glicerol han surgido en los últimos años como posibles sustitutos de los combustibles fósiles utilizados en la producción de productos químicos de alto valor, y se espera que las rutas de bioproducción sin células desempeñen un papel crucial en dichos procesos. Recientemente, se han descrito varias cascadas sintéticas utilizadas para las biotransformaciones libres de células de d -glucosa y glicerol en piruvato y más. Sin embargo, estos estaban limitados por el paso de deshidratación muy lento del d -glicerato a piruvato catalizado por una deshidratasa de Sulfolobus solfataricus (SsDHAD), lo que convierte este paso en el principal cuello de botella. Al combinar la gran cantidad de genomas disponibles con un enfoque de descubrimiento basado en secuencias, hemos identificado secuencias distintivas que conducen al descubrimiento de dos clases distintas de deshidratasas que exhiben una actividad prometedora y un número de recambio total (TTN) hacia el d -glicerato. En particular, la deshidratasa de Paralcaligenes ureilyticus (PuDHT) demostró una actividad & gt100 veces mayor y TTN para el d -glicerato en comparación con SsDHAD. Además, PuLa DHT mostró una actividad excepcionalmente alta y TTN hacia el d-gluconato. El reemplazo de SsDHAD por PuLa DHT en nuestra cascada modelo de d -glucosa a etanol mejoró la tasa de producción 10 veces, alcanzando un rendimiento teórico del 92% a 50 ° C. PuLa DHT también fue adecuada para la conversión de glicerol en piruvato a temperatura ambiente, lo que llevó a una mejora de & gt5 veces en la tasa de producción en comparación con el sistema que utiliza SsDHAD a 50 ° C y alcanzando el 97% del rendimiento teórico. PuLa DHT también fue compatible cuando se usó glicerol crudo como sustrato y ya no causó un cuello de botella en la cascada enzimática.


Ingeniería metabólica de Escherichia coli para mejorar la producción de acetol a partir de glicerol

El acetol, un cetoalcohol C3, es un intermedio importante que se utiliza para producir polioles y acroleína. Para mejorar la producción de acetol a partir de glicerol mediante Escherichia coli, se construyó un mutante (HJ02) reemplazando el nativo glpK gen con el alelo de E. coli Lin 43 y sobreexpresión de yqhD, que codifica la aldehído oxidorreductasa YqhD que convierte el metilglioxal en acetol. Comparado con la cepa de control sin el glpK reemplazo, HJ02 tuvo 5.5 veces mayor producción de acetol y una tasa de consumo de glicerol 53.4% ​​mayor. Luego, se agregó glucosa como cosustrato para mejorar la disponibilidad de NADPH y la ptsG El gen se eliminó en HJ02 (HJ04) para aliviar la represión del catabolito de carbono, lo que condujo a un aumento del 30% en el nivel de NADPH y NADPH / NADP +. En consecuencia, el HJ04 acumuló hasta 1,20 g / L de acetol, un 69,0% más que el HJ02. Además, el gapA El gen en HJ04 fue silenciado por ARN antisentido (HJ05) para mejorar aún más la producción de acetol. La concentración de acetol producida por HJ05 alcanzó 1,82 g / L, que fue 2,1 y 1,5 veces mayor que la de HJ02 y HJ04.

El análisis de PCR en tiempo real indica que el catabolismo de la glucosa se desvió de la glucólisis a la vía oxidativa de la pentosa fosfato en HJ05.

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Materiales y métodos

Cepas, medios y condiciones de crecimiento.

Las cepas y plásmidos utilizados se enumeran en la Tabla 2 y la Tabla S1. Las tablas S2, S3, S4 y S5 enumeran los oligonucleótidos utilizados. Los cultivos se hicieron crecer a 37 ° C en LB. La selección de mutantes involucró a los antibióticos ampicilina (100 μg ml -1), cloranfenicol (25 μg ml -1), kanamicina (50 μg ml -1 cuando los genes de resistencia estaban en los plásmidos y 25 μg ml -1 para los genes en los cromosomas), apramicina ( 50 μg ml -1) y nourseotricina (10–40 μg ml -1, obtenido de Jena Bioscience GmbH, Jena, Alemania). Medio mínimo M9 (Sambrook et al. 1989) se utilizó con 0,4% (p / v) de glucosa o glicerol. Se usó M9hP modificado (M9 alto o 100 mmol l-1 de fosfato) para la biotransformación: 500 ml 1 · 15x sales de M9hP, 0 · 5 ml 0 · 1 M CaCl2, 0 · 5 ml de MgSO 1 M4, 0 · 2 ml 10 mg ml -1 tiamina. La solución madre de sales de 1 · 15x M9hP consistía en 20 · 47 g de Na2HPO4· 2 H2O, 15 · 65 g KH2correos4, 1 · 15 g de NaCl, 2 · 30 g de NH4Cl y 2 l H2O.

Cepa o plásmido Genes / propiedades relevantesa a (Amp R), (Apr R), (Cml R), (Kan R) o (Nou R) = resistencia a ampicilina, apramicina, cloranfenicol, kanamicina o nourseotricina aac (3) IV = aminoglucósido-3-nortegen de la acetiltransferasa, bla = β-gen de la lactamasa, gato = gen de cloranfenicol acetiltransferasa, nat1 = gen nourseothricin acetiltransferasa.
Referencia o construcción
Son
BW25113 lacI q rrnBT14 ΔlacZWJ16 hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78 Datsenko y Wanner (2000)
WA66x BW25113 Lac + ΔxthA::FRT Wegerer, A., IIGb B IIG = Instituto de Genética Industrial, Universidad de Stuttgart
ss173 WA66x ΔLDHA::FRT-aac (3) IV-FRT ΔpoxB::FRT ΔpflB::FRT P1 (MW4) x (ss171) c C P1 (A) × (B) = P1-transducción de genes de la cepa A a la cepa B
ss195 WA66x ΔpykF::FRT ΔpykA::FRT-kan-FRT ΔLDHA::FRT ΔpoxB::FRT ΔpflB::FRT ΔtdcE::FRT-aac (3) IV-FRT P1 (ss145) x (ss182) c C P1 (A) × (B) = P1-transducción de genes de la cepa A a la cepa B
ss251 ss195 (seleccionado para un crecimiento más rápido en glicerol, transferencia n. ° 16) Pasajes en serie
ss271 ss251 ΔgldA::mrpS-nat1-mrpS P1 (ss262) x (ss251) c C P1 (A) × (B) = P1-transducción de genes de la cepa A a la cepa B
ss274 ss251 Δpps::mrpS-nat1-mrpS P1 (ss266) x (ss251) c C P1 (A) × (B) = P1-transducción de genes de la cepa A a la cepa B
ss279 ss251 ΔgldA::mrpS ss271 (pJOE5555 · 1) d D (pJOE5555 · 1) Eliminación del marcador de resistencia mediante recombinación específica de sitio entre dos mrpS sitios que utilizan la recombinasa MrpA codificada por plásmido.
ss281 ss251 ΔmgsA::mrpS-nat1-mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss231) x (ss279) c C P1 (A) × (B) = P1-transducción de genes de la cepa A a la cepa B
ss310 ss251 ΔmaeA::mrpS-nat1-mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss296) x (ss279) c C P1 (A) × (B) = P1-transducción de genes de la cepa A a la cepa B
ss374 ss251 Δppc::mrpS-nat1-mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss225) x (ss279) c C P1 (A) × (B) = P1-transducción de genes de la cepa A a la cepa B
ss431 ss251 ΔmaeB::mrpS-nat1-mrpS ΔmaeA::mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss415) x (ss430)
Plásmidos
pCP20 flp bla (Amplificador R) gato (Cml R) repA101 Cherepanov y Wackernagel (1995)
pIJ773 FRT-aac (3) IV-FRT (Abr R) bla (Amplificador R) Ráfaga et al. ( 2003 )
pIJ790 gato (Cml R) repA101 araC λ-ROJO (gam, apuesta, exo) Ráfaga et al. ( 2003 )
pJOE5555 · 1 Prha-mrpA gato (Cml R) repA101 Altenbuchner, J., IIGb B IIG = Instituto de Genética Industrial, Universidad de Stuttgart
pJOE6038 · 1 Adicional recA en el plásmido pIJ790 Altenbuchner, J., IIGb B IIG = Instituto de Genética Industrial, Universidad de Stuttgart
pWA38 · 4 bla (Amplificador R) mrpS-kan-mrpS (Kan R) Wegerer, A., IIGb B IIG = Instituto de Genética Industrial, Universidad de Stuttgart
pSS55 · 11 bla (Amplificador R) mrpS-nat1-mrpS (Nou R) Intercambio de genes de resistencia en pWA38 · 4
pSS57 · 2 bla (Amplificador R) mrpS-aac (3) IV-mrpS (Abr R) Intercambio de genes de resistencia en pSS55 · 11
  • a(Amp R), (Apr R), (Cml R), (Kan R) o (Nou R) = resistencia a ampicilina, apramicina, cloranfenicol, kanamicina o nourseotricina aac (3) IV = aminoglucósido-3-nortegen de la acetiltransferasa, bla = β-gen de la lactamasa, gato = gen de cloranfenicol acetiltransferasa, nat1 = gen nourseothricin acetiltransferasa.
  • B IIG = Instituto de Genética Industrial, Universidad de Stuttgart
  • C P1 (A) × (B) = P1-transducción de genes de la cepa A a la cepa B
  • D (pJOE5555 · 1) Eliminación del marcador de resistencia mediante recombinación específica de sitio entre dos mrpS sitios que utilizan la recombinasa MrpA codificada por plásmido.

Construcción de deleciones de genes con el sistema de recombinación λ-Red

Las deleciones de genes cromosómicos se construyeron utilizando el sistema de recombinación λ-Red (Baba et al. 2006) y el E. coli cepa WA66x pJOE6038 · 1. WA66x es un derivado Lac + de BW25113 obtenido por transducción P1 (no publicado). El plásmido pJOE6038 · 1 es un derivado del plásmido de recombinación pIJ790, que tiene la E. coli recA gen integrado además del λ-Red exo, apuesta y juego genes. Los casetes de genes de resistencia flanqueados por sitios de recombinación específicos de sitio para las recombinasas, FLP y MrpA, se amplificaron a partir de los siguientes plásmidos: pWA38 · 4 (mrpS-KmR-mrpS), pIJ773 (FRT-aac (3) IV-FRT), pSS55 · 11 (mrpS-nat1-mrpS) y pSS57 · 2 (mrpS-aac (3) IV-mrpS). Los oligonucleótidos usados ​​para la deleción de genes se resumen en la Tabla S3. La electroporación de WA66x pJOE6038 · 1 se llevó a cabo según lo descrito por Gust et al. (2003). Las regiones cromosómicas con los casetes de resistencia a antibióticos y las correspondientes deleciones genéticas diseñadas en E. coli WA66x pJOE6083 · 1 se transdujeron utilizando el bacteriófago P1kc como lo describe Lennox (1955). Para la verificación, una colonia bacteriana extraída de una placa de agar LB se resuspendió en 100 μl de agua y se centrifugó, y las células se resuspendieron en 100 μl de agua y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso posterior. Se amplificaron 5 µl de esta suspensión mediante PCR (volumen de reacción de 50 µl) de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando Taq ADN polimerasa. Análisis de las deleciones y reemplazos de genes de pykA, pykF y tdcE por PCR en las cepas ss195, ss251, ss279 y, como control, en ss173 se muestra en la Fig. S1.

Escisión de casetes de genes de resistencia a antibióticos

El plásmido pCP20, que contiene un replicón sensible a la temperatura que permite la inducción térmica de la síntesis de FLP, se utilizó para escindir casetes de genes de resistencia a antibióticos flanqueados por FRT sitios descritos por Cherepanov y Wackernagel (1995). Se aplicó el mismo procedimiento al plásmido pJOE5555 · 1 que porta el gen de la recombinasa mrpA y mrpS sitios que flanquean casetes de genes de resistencia a antibióticos (Warth et al. 2011). La expresión de mrpA se indujo suplementando las placas con 0,2% (p / v) de l-ramnosa. Se pueden encontrar más detalles sobre este y otros métodos utilizados en el estudio de Söllner (2012).

Determinación de la tasa de crecimiento.

Se usó un cultivo durante la noche en medio M9 para inocular cultivos en matraces Erlenmeyer de 100 ml llenos con 15 ml de medio de crecimiento que contenía glucosa o glicerol como fuentes de carbono. No se agregaron antibióticos. Los matraces se incubaron a 37 ° C [Gio Gyrotory® Shaker NBS (Edison, NJ, EE. UU.) A C. 200 rev min −1] la densidad celular inicial estaba entre 0,01 y 0,1 OD600. El parámetro resultante μ (h -1) indica la tasa máxima de crecimiento por hora a la base e.

Selección aeróbica para un crecimiento más rápido de glicerol.

Como una selección de crecimiento más rápido, el pykAF El mutante ss195 se cultivó repetidamente en medio M9 con glicerol. Partiendo de un precultivo en M9 con 0,4% de glucosa, se inocularon 100 ml de medio M9 con 0,4% de glicerol en un matraz de agitación de 500 ml a una DO.600 de 0,01 (transferencia n. ° 1) y se incubó aeróbicamente a 37 ° C. Cuando un OD600 de aproximadamente 1, las células se transfirieron de nuevo a un nuevo medio. El volumen del inóculo para el siguiente cultivo se ajustó en relación con la tasa de crecimiento de los cultivos para que los cultivos posteriores pudieran alcanzar una densidad celular de 1 DO.600 dentro de las 24 h.

Resecuenciación del genoma completo y análisis de datos

Cepa E. coli ss251 fue secuenciado por GATC Biotech AG (Konstanz, Alemania) en la plataforma Illumina / Solexa SBS. Las lecturas individuales (tanto en dirección directa como inversa) tenían una longitud de 51 pb. Los datos de la secuencia se analizaron con el paquete de software Geneious Pro trial 5.6.5 (Biomatters Ltd., Newark, NJ, EE. UU.). Las lecturas se asignaron al genoma de referencia de E. coli K12 MG1655 (números de acceso: NC_000913.2 / GI: 49175990), y luego, se realizó una búsqueda de intercambios y deleciones de nucleótidos.

Ensayo de biotransformación a pequeña escala en vasos de plástico de 1 · 5 ml

Se utilizó un cultivo nocturno de 5 ml en M9 con 0,4% de glucosa y el antibiótico correspondiente para inocular un precultivo de 15 ml en un matraz de 100 ml que contenía M9 suplementado con 0,4% de glicerol como fuente de carbono (en caso de cepas ss310 y ss431, el precultivo se complementó adicionalmente con 10 mmol l-1 de piruvato). El cultivo se incubó durante 4 ha 37 ° C hasta obtener una densidad celular de C. 0 · 6 DE600 fue alcanzado. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en 5 ml 1 · 15x M9hP sin ninguna fuente de carbono y se almacenaron en hielo. Se preparó una solución de biotransformación mezclando las células con una solución 1 · 15x M9hP, 150 μl de glicerol al 20% (p / v) y 600 μl de NaHCO 1 M3 hasta un volumen final de 6 ml (1x M9hP). La densidad celular de un ensayo de biotransformación estándar fue de 0,5 DO600. Se transfirieron alícuotas de 1 · 2 ml a vasos de plástico de 1 · 79 ml y las tapas se cerraron herméticamente (espacio de aire residual = 0 · 59 ml) para crear condiciones anaeróbicas o microaeróbicas. Los vasos de plástico se incubaron a 37 ° C (rotador, Neolab, C. 10 rev min -1, radio 10 cm) y solo se abrió una vez para determinar la densidad celular y analizar los metabolitos extracelulares mediante HPLC. Las células se sedimentaron y el sobrenadante se almacenó a -20 ° C para su análisis posterior.

Analítica

Las concentraciones de glicerol, lactato, acetato, formiato, succinato y etanol se determinaron utilizando un sistema HPLC Agilent serie 1200 equipado con una columna REZEX ROA (300 × 7,8 mm, Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) que permitió la detección de ácidos orgánicos. 5 mmol l −1 H2ASI QUE4 se utilizó como fase móvil. Las muestras se prepararon de la siguiente manera: 1 ml de muestra diluida se mezcló con 45 μl de NH 4 M3 (pH 10 · 2) y 100 μl 1 · 2 M de MgSO4 y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente para precipitar el fosfato como fosfato de amonio y magnesio hexahidratado. Después de 5 min de centrifugación, se mezclaron 500 μl del sobrenadante con 500 μl de 0 · 1 M H2ASI QUE4. Después de un período de incubación de 15 minutos y centrifugación de 15 minutos, el sobrenadante se utilizó para el análisis por HPLC.

13 análisis C

Para medir la fijación de dióxido de carbono, se realizaron las biotransformaciones a pequeña escala descritas anteriormente (1 · 5 ml) utilizando NaH 13 CO completamente etiquetado.3 (98% en átomos de 13 C, Isotec ™, Miamisburg, OH, EE. UU.) En lugar de su isótopo de hidrogenocarbonato marcado de forma natural (12 C). Los patrones de etiquetado de metabolitos resultantes se analizaron utilizando un sistema TurboMass GC-MS (PerkinElmer LAS, Rodgau, Alemania) como lo describe Vielhauer et al. (2011). El conjunto de datos de medición de MS resultante tuvo que revisarse más para separar las etiquetas de 13 C que ocurren naturalmente de las que se logran artificialmente mediante la aplicación del método de corrección de isótopos de masa basado en software (herramienta de software basada en MATLAB), descrito por Wahl et al. ( 2004 ).


¿Cómo se mueven los aminoácidos y la glucosa a través de la membrana celular?

Los aminoácidos, la glucosa y otros compuestos insolubles de membranas grandes se mueven a través de la membrana celular a través de un proceso conocido como difusión facilitada. Este proceso involucra proteínas transmembrana, que abren un pequeño canal lleno de agua a través del cual las moléculas pueden entrar o salir de la célula.

La glucosa experimenta una difusión facilitada al unirse a una proteína transportadora, que luego cambia su configuración para liberar glucosa en la célula. Este proceso está controlado por la insulina, que estimula la membrana para aumentar la cantidad de proteínas transportadoras de glucosa en la superficie. Cuando la célula necesita más glucosa, el mayor número de proteínas transportadoras conduce a una mayor difusión de la glucosa en la célula.

Cada uno de los diversos aminoácidos y otras moléculas insolubles en lípidos tiene su propia proteína transportadora específica a la que se une para difundirse en la célula. Estas proteínas transportadoras también son responsables de eliminar el exceso de moléculas de las células cuando sea necesario, ya que el proceso de difusión siempre es completamente reversible y controlado por la misma proteína transportadora. La difusión se considera transporte pasivo, ya que no requiere energía, mientras que otras moléculas deben ingresar a las células a través de un transporte activo que requiere energía. El agua es el único compuesto que puede atravesar la membrana celular sin requerir difusión o transporte activo.


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