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¿Existe alguna especie (¿subespecie?) Cuyo ADN o ARN contenga solo estructuras de tallo-bucle?

¿Existe alguna especie (¿subespecie?) Cuyo ADN o ARN contenga solo estructuras de tallo-bucle?


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Soy un informático que trabaja en ácidos nucleicos desde la perspectiva de la Teoría del Lenguaje Formal. Estoy tratando con varios artículos que analizan la estructura Stem-Loop del ADN.

Me gustaría alguna referencia sólida que confirme (o niegue):

1) La existencia de estas estructuras

2) La existencia de una (especie, subespecie,…) cuyo ADN o ARN se ha confirmado que tiene cadenas que son una estructura pura de tallo-bucle.


La existencia e importancia de las estructuras de bucle de tallo está bien documentada.

No estoy seguro de qué significa exactamente la segunda pregunta. Si te refieres a 'un organismo que tiene al menos un vástago, prueba el VIH'. El sistema MS2 también es una proteína de unión de bucle de tallo que se usa mucho como herramienta en biología, sugiero buscar en Google.


La genómica comparativa identifica miles de ARN estructurados candidatos en microbiomas humanos

Los ARN estructurados desempeñan diversas funciones biorreguladoras dentro de los microbios. Hasta la fecha, se han predicho cientos de ARN estructurados candidatos utilizando enfoques informáticos que buscan estructuras de motivos en datos de secuencias genómicas. El microbioma humano contiene miles de especies y cepas de microbios. Sin embargo, muchos de los datos metagenómicos del microbioma humano permanecen sin explotar en busca de motivos de ARN estructurado principalmente debido a limitaciones computacionales.

Resultados

Buscamos aplicar un enfoque genómico comparativo a gran escala a estos organismos para identificar ARN estructurados candidatos. Con un análisis automatizado cuidadosamente construido, aunque computacionalmente intensivo, identificamos 3161 ARN estructurados candidatos conservados en regiones intergénicas, así como 2022 ARN estructurados candidatos adicionales que pueden superponerse a regiones codificantes. Validamos la expresión de ARN de 177 de estas estructuras candidatas analizando pequeños fragmentos de datos de ARN-seq de cuatro muestras fecales humanas.

Conclusiones

Este enfoque identifica una amplia variedad de ARN estructurados candidatos, incluidos los ARNm, las antitoxinas y las proteínas líderes de los ribosomas probables, de una amplia variedad de taxones. En general, nuestra cartera permite predicciones conservadoras de miles de ARN estructurados candidatos novedosos de microbiomas humanos.


Bio ARN

3.
El ARN ribosómico (ARNr) se asocia con un conjunto de proteínas para formar ribosomas. Estas estructuras complejas, que se mueven físicamente a lo largo de una molécula de ARNm, catalizan el ensamblaje de aminoácidos en cadenas de proteínas. También se unen a los ARNt y a varias moléculas accesorias necesarias para la síntesis de proteínas. Los ribosomas están compuestos por una subunidad grande y una pequeña, cada una de las cuales contiene su propia molécula o moléculas de ARNr.

La traducción es el proceso completo mediante el cual se usa la secuencia de bases de un ARNm para ordenar y unir los aminoácidos en una proteína. Los tres tipos de ARN participan en esta ruta esencial de síntesis de proteínas en todas las células. De hecho, el desarrollo de las tres funciones distintas del ARN fue probablemente la clave molecular del origen de la vida. En esta sección se analiza cómo cada ARN realiza su tarea específica, mientras que los eventos bioquímicos en la síntesis de proteínas y los factores proteicos necesarios se describen en la sección final del capítulo.

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El ARN mensajero transporta información del ADN en un código genético de tres letras
El ARN contiene ribonucleótidos de adenina, citidina, guanina y uracilo. El ADN contiene desoxirribonucleótidos de adenina, citidina, guanina y timina. Debido a que 4 nucleótidos, tomados individualmente, podrían representar solo 4 de los 20 aminoácidos posibles en la codificación de la disposición lineal en proteínas, se requiere un grupo de nucleótidos para representar cada aminoácido. El código empleado debe poder especificar al menos 20 palabras (es decir, aminoácidos).

Si se usaran dos nucleótidos para codificar un aminoácido, solo se podrían formar 16 (o 42) palabras de código diferentes, lo que sería un número insuficiente. Sin embargo, si se usa un grupo de tres nucleótidos para cada palabra de código, entonces se pueden formar 64 (o 43) palabras de código. Cualquier código que utilice grupos de tres o más nucleótidos tendrá unidades más que suficientes para codificar 20 aminoácidos. Muchos de estos sistemas de codificación son matemáticamente posibles. Sin embargo, el código genético real usado por las células es un código triplete, con cada tres nucleótidos siendo "leídos" desde un punto de partida especificado en el ARNm. Cada triplete se llama codón. De los 64 posibles codones en el código genético, 61 especifican aminoácidos individuales y tres son codones de terminación. La Tabla 4-2 muestra que la mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón. Solo dos, la metionina y el triptófano, tienen un solo codón en el otro extremo, la leucina, la serina y la arginina están especificadas por seis codones diferentes. Se dice que los diferentes codones para un aminoácido dado son sinónimos. El código en sí se denomina degenerado, lo que significa que contiene redundancias.

Tabla 4-2. El código genético (ARN a aminoácidos) *.
Tabla 4-2
El código genético (ARN a aminoácidos) *.

La síntesis de todas las cadenas de proteínas en células procariotas y eucariotas comienza con el aminoácido metionina. En la mayoría de los ARNm, el codón de inicio (iniciador) que especifica esta metionina aminoterminal es AUG. En unos pocos ARNm bacterianos, GUG se usa como codón iniciador, y CUG ocasionalmente se usa como codón iniciador para metionina en eucariotas. Los tres codones UAA, UGA y UAG no especifican aminoácidos, pero constituyen señales de parada (terminadoras) que marcan el extremo carboxilo de las cadenas de proteínas en casi todas las células. La secuencia de codones que va desde un sitio de inicio específico hasta un codón de terminación se denomina marco de lectura. Esta matriz lineal precisa de ribonucleótidos en grupos de tres en el ARNm especifica la secuencia lineal precisa de aminoácidos en una proteína y también señala dónde comienza y termina la síntesis de la cadena de la proteína.

Debido a que el código genético es un código triplete superpuesto y sin comas, un ARNm particular teóricamente podría traducirse en tres marcos de lectura diferentes. De hecho, se ha demostrado que algunos ARNm contienen información superpuesta que puede traducirse en diferentes marcos de lectura, produciendo diferentes polipéptidos (Figura 4-21). Sin embargo, la gran mayoría de los ARNm se pueden leer en un solo marco porque los codones de parada que se encuentran en los otros dos posibles marcos de lectura terminan la traducción antes de que se produzca una proteína funcional. Otra disposición de codificación inusual ocurre debido al cambio de marco. En este caso, la maquinaria de síntesis de proteínas puede leer cuatro nucleótidos como un aminoácido y luego continuar leyendo tripletes, o puede respaldar una base y leer todos los tripletes sucesivos en el nuevo marco hasta que se produzca la terminación de la cadena. Estos cambios de marco no son eventos comunes, pero se conocen algunas docenas de casos de este tipo.

Figura 4-21. Ejemplo de cómo el código genético, un código triplete superpuesto sin comas, se puede leer en dos marcos diferentes.
Figura 4-21
Ejemplo de cómo el código genético, un código triplete superpuesto sin comas, se puede leer en dos marcos diferentes. Si la traducción de la secuencia de ARNm que se muestra comienza en dos sitios de inicio aguas arriba diferentes (no (más))

El significado de cada codón es el mismo en la mayoría de los organismos conocidos, un fuerte argumento de que la vida en la tierra evolucionó solo una vez. Recientemente, se ha descubierto que el código genético difiere para algunos codones en muchas mitocondrias, en protozoos ciliados y en Acetabularia, una planta unicelular. Como se muestra en la tabla 4-3, la mayoría de estos cambios implican la lectura de codones de terminación normales como aminoácidos, no un intercambio de un aminoácido por otro. Ahora se piensa que estas excepciones al código general son desarrollos evolutivos posteriores, es decir, en ningún momento el código fue fijo de manera inmutable, aunque no se toleraron cambios masivos una vez que un código general comenzó a funcionar al principio de la evolución.

Tabla 4-3. Uso inusual de codones en genes nucleares y mitocondriales.
Tabla 4-3
Uso inusual de codones en genes nucleares y mitocondriales.

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Los experimentos con ARNm sintéticos y trinucleótidos rompieron el código genético
Habiendo descrito el código genético, contamos brevemente cómo fue descifrado, uno de los grandes triunfos de la bioquímica moderna. El trabajo experimental subyacente se llevó a cabo en gran medida con extractos de bacterias libres de células que contienen todos los componentes necesarios para la síntesis de proteínas, excepto el ARNm (es decir, ARNt, ribosomas, aminoácidos y los nucleótidos ricos en energía ATP y GTP).

Inicialmente, los investigadores agregaron ARNm sintéticos que contenían un solo tipo de nucleótido a dichos extractos y luego determinaron el aminoácido incorporado en el polipéptido que se formó. En el primer experimento exitoso, el ARNm sintético compuesto solo por residuos U [poli (U)] produjo polipéptidos compuestos solo por fenilalanina. Por tanto, se llegó a la conclusión de que un codón de fenilalanina consistía en su totalidad en U's. Asimismo, los experimentos con poli (C) y poli (A) mostraron que un codón para prolina contenía solo C y un codón para lisina solo A (Figura 4-22). [Poly (G) no funcionó en este tipo de experimento porque asume una estructura apilada inutilizable que no se traduce bien]. A continuación, se utilizaron ARNm sintéticos compuestos de bases alternas. Los resultados de estos experimentos no solo revelaron más codones, sino que también demostraron que los codones tienen una longitud de tres bases. El ejemplo de este enfoque ilustrado en la Figura 4-23 condujo a la identificación de ACA como el codón de treonina y CAC de histidina. Experimentos similares con muchos de estos polinucleótidos mixtos revelaron una parte sustancial del código genético.

Figura 4-22. Asignación de codones utilizando ARNm sintéticos que contienen un solo ribonucleótido.
Figura 4-22
Asignación de codones utilizando ARNm sintéticos que contienen un solo ribonucleótido. La adición de dicho ARNm sintético a un extracto bacteriano que contenía todos los componentes necesarios para la síntesis de proteínas, excepto el ARNm, dio como resultado la síntesis de polipéptidos compuestos (más.)

Figura 4-23. Asignación de codones mediante polinucleótidos mixtos.
Figura 4-23
Asignación de codones mediante polinucleótidos mixtos. (a) Cuando se añadió un ARNm sintético con residuos A y C alternos a un extracto bacteriano sintetizador de proteínas, el polipéptido resultante contenía residuos alternos de treonina e histidina. Este hallazgo (más.)

El código genético completo fue finalmente elaborado por un segundo tipo de experimento realizado por Marshall Nirenberg y sus colaboradores. En este enfoque, se probaron todos los posibles trinucleótidos para determinar su capacidad para atraer ARNt unidos a los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en las proteínas naturales (Figura 4-24). En total, se encontró que 61 de los 64 posibles trinucleótidos codificaban un aminoácido específico; los trinucleótidos UAA, UGA y UAG no codificaban aminoácidos.

Figura 4-24. Romper todo el código genético mediante el uso de trinucleótidos sintetizados químicamente.
Figura 4-24
Romper todo el código genético mediante el uso de trinucleótidos sintetizados químicamente. Marshall Nirenberg y sus colaboradores prepararon 20 extractos bacterianos libres de ribosomas que contenían todos los posibles aminoacil-tRNA (tRNA con un aminoácido unido). En cada (más.)

Aunque los ARNm sintéticos fueron útiles para descifrar el código genético, la síntesis de proteínas in vitro a partir de estos ARNm es muy ineficaz y produce polipéptidos de tamaño variable. La síntesis in vitro exitosa de una proteína natural se logró primero cuando se agregó ARNm del bacteriófago F2 (un virus) a extractos bacterianos, lo que condujo a la formación de la proteína de la cubierta o cápside (la proteína de empaque que cubre la partícula del virus). Los estudios con ARNm naturales de este tipo establecieron que AUG codifica la metionina al comienzo de casi todas las proteínas y es necesaria para el inicio eficiente de la síntesis de proteínas, mientras que los tres trinucleótidos (UAA, UGA y UAG) que no codifican ningún aminoácido actúan como codones de parada. , necesario para la terminación precisa de la síntesis.

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La estructura plegada del ARNt promueve sus funciones de decodificación
El siguiente paso para comprender el flujo de información genética del ADN a la proteína fue determinar cómo la secuencia de nucleótidos del ARNm se convierte en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Este proceso de decodificación requiere dos tipos de moléculas adaptadoras: ARNt y enzimas llamadas aminoacil-ARNt sintetasas. Primero describimos el papel de los ARNt en la decodificación de los codones de ARNm y luego examinamos cómo las sintetasas reconocen los ARNt.

Todos los ARNt tienen dos funciones: unirse químicamente a un aminoácido particular y formar pares de bases con un codón en el ARNm para que el aminoácido se pueda agregar a una cadena de péptidos en crecimiento. Cada molécula de ARNt es reconocida por una y solo una de las 20 aminoacil-ARNt sintetasas. Asimismo, cada una de estas enzimas une uno y solo uno de los 20 aminoácidos a un tRNA particular, formando un aminoacil-tRNA. Una vez que se une su aminoácido correcto, un ARNt reconoce un codón en el ARNm, por lo que entrega su aminoácido al polipéptido en crecimiento (Figura 4-25).

Figura 4-25. La traducción de secuencias de ácido nucleico en ARNm en secuencias de aminoácidos en proteínas requiere un proceso de decodificación de dos pasos.
Figura 4-25
La traducción de secuencias de ácido nucleico en ARNm en secuencias de aminoácidos en proteínas requiere un proceso de decodificación de dos pasos. Primero, una aminoacil-tRNA sintetasa acopla un aminoácido específico a su correspondiente tRNA. En segundo lugar, una secuencia de tres bases en (más.)

A medida que avanzaban los estudios sobre el ARNt, se identificaron 30 - 40 ARNt diferentes en células bacterianas y hasta 50 - 100 en células animales y vegetales. Por lo tanto, el número de ARNt en la mayoría de las células es mayor que el número de aminoácidos que se encuentran en las proteínas (20) y también difiere del número de codones en el código genético (61). En consecuencia, muchos aminoácidos tienen más de un ARNt al que pueden unirse (lo que explica cómo puede haber más ARNt que aminoácidos), además, muchos ARNt pueden unirse a más de un codón (lo que explica cómo puede haber más codones que ARNt). . Como se señaló anteriormente, la mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón, lo que requiere que algunos ARNt reconozcan más de un codón.

La función de las moléculas de ARNt, que tienen entre 70 y 80 nucleótidos de longitud, depende de sus estructuras tridimensionales precisas. En solución, todas las moléculas de ARNt se pliegan en una disposición de tallo-bucle similar que se asemeja a una hoja de trébol cuando se dibuja en dos dimensiones (figura 4-26a). Los cuatro tallos son hélices dobles cortas estabilizadas por emparejamiento de bases Watson-Crick, tres de los cuatro tallos tienen bucles que contienen siete u ocho bases en sus extremos, mientras que el resto, sin bucle, contiene los extremos libres 3 'y 5' de la cadena. Tres nucleótidos denominados anticodón, ubicados en el centro de un bucle, pueden formar pares de bases con los tres nucleótidos complementarios formando un codón en el ARNm. Como se discutirá más adelante, las aminoacil-tRNA sintetasas específicas reconocen la estructura de superficie de cada tRNA para un aminoácido específico y unen covalentemente el aminoácido apropiado al tallo aceptor de aminoácidos sin bucle. El extremo 3 'de todos los ARNt tiene la secuencia CCA, que en la mayoría de los casos se agrega después de que se completa la síntesis y el procesamiento del ARNt. Vista en tres dimensiones, la molécula de ARNt plegada tiene forma de L con el bucle anticodón y el tallo aceptor formando los extremos de los dos brazos (figura 4-26b).

Figura 4-26. Estructura de los ARNt.
Figura 4-26
Estructura de los ARNt. (a) La estructura primaria del ARNt de alanina de levadura (ARNtAla), la primera secuencia determinada. Esta molécula se sintetiza a partir de los nucleótidos A, C, G y U, pero algunos de los nucleótidos, que se muestran en rojo, se modifican después de la síntesis: D = dihidrouridina, I = inosina, T = timina, Ψ = pseudouridina, (más. )

Además de la adición de CCA en el extremo 3 'después de que se sintetiza una molécula de ARNt, típicamente se modifican varias de sus bases de ácido nucleico. Por ejemplo, la mayoría de los ARNt se sintetizan con una secuencia de cuatro bases de UUCG cerca de la mitad de la molécula. El primer uridilato se metila para convertirse en un timidilato, el segundo se reordena en un pseudouridilato (abreviado Ψ), en el que la ribosa se une al carbono 5 en lugar de al nitrógeno 1 del uracilo. Estas modificaciones producen un bucle de TΨCG característico en una región no apareada en aproximadamente la misma posición en casi todos los ARNt (ver Figura 4-26a).

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El emparejamiento de bases no estándar a menudo ocurre entre codones y anticodones
Si se exigiera un apareamiento perfecto de bases de Watson-Crick entre codones y anticodones, las células tendrían que contener exactamente 61 especies de ARNt diferentes, una para cada codón que especifica un aminoácido. Sin embargo, como se señaló anteriormente, muchas células contienen menos de 61 tRNA. La explicación del número más pequeño radica en la capacidad de un único anticodón de ARNt para reconocer más de uno, pero no necesariamente todos, los codones correspondientes a un aminoácido dado. Este reconocimiento más amplio puede ocurrir debido al apareamiento no estándar entre bases en la posición denominada oscilación: la tercera base en un codón de ARNm y la primera base correspondiente en su anticodón de ARNt. Aunque la primera y segunda bases de un codón forman pares de bases estándar de Watson-Crick con la tercera y segunda bases del anticodón correspondiente, pueden ocurrir cuatro interacciones no estándar entre bases en la posición de oscilación. Particularmente importante es el par de bases G · U, que estructuralmente encaja casi tan bien como el par G · C estándar. Por tanto, un anticodón dado en el ARNt con G en la primera posición (oscilación) puede emparejarse con los dos codones correspondientes que tienen pirimidina (C o U) en la tercera posición (figura 4-27). Por ejemplo, los codones de fenilalanina UUU y UUC (5 '→ 3') son reconocidos por el ARNt que tiene GAA (5 '→ 3') como anticodón. De hecho, dos codones cualesquiera del tipo NNPyr (N = cualquier base Pyr = pirimidina) codifican un solo aminoácido y son decodificados por un solo ARNt con G en la primera posición (oscilación) del anticodón.

Figura 4-27. La primera y segunda bases en un codón de ARNm forman pares de bases de Watson-Crick con la tercera y segunda bases, respectivamente, de un anticodón de ARNt.
Figura 4-27
La primera y segunda bases en un codón de ARNm forman pares de bases de Watson-Crick con la tercera y segunda bases, respectivamente, de un anticodón de ARNt. Sin embargo, la base en la tercera posición (o oscilación) de un codón de ARNm a menudo forma un par de bases no estándar con (más).

Aunque la adenina rara vez se encuentra en la posición de oscilación del anticodón, muchos ARNt en plantas y animales contienen inosina (I), un producto desaminado de la adenina, en esta posición. La inosina puede formar pares de bases no estándar con A, C y U (figura 4-28). Por tanto, un ARNt con inosina en la posición de oscilación puede reconocer los codones de ARNm correspondientes con A, C o U en la tercera posición (oscilación) (véase la figura 4-27). Por esta razón, los ARNt que contienen inosina se emplean en gran medida en la traducción de los codones sinónimos que especifican un solo aminoácido.Por ejemplo, cuatro de los seis codones de leucina tienen un 3 ′ A, C o U (ver Tabla 4-2) estos cuatro codones son reconocidos por el mismo tRNA (3′-GAI-5 ′), que tiene inosina en la posición de oscilación del anticodón (y por lo tanto reconoce CUA, CUC y CUU), y usa un par G · U en la posición 1 para reconocer el codón UUA.

Figura 4-28. Los pares de bases oscilantes no estándar U · G, C · I, A · I y U · I.
Figura 4-28
Los pares de bases oscilantes no estándar U · G, C · I, A · I y U · I. Las líneas negras gruesas indican los enlaces mediante los cuales las bases nitrogenadas se unen al carbono 1 'de la ribosa (C1).

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Las sintetasas de aminoacil-tRNA activan los aminoácidos al vincularlos con los tRNA
El reconocimiento del codón o codones que especifican un aminoácido dado por un ARNt particular es en realidad el segundo paso en la decodificación del mensaje genético. El primer paso, la unión del aminoácido apropiado a un tRNA, es catalizado por una aminoacil-tRNA sintetasa específica (ver Figura 4-25). Cada una de las 20 sintetasas diferentes reconoce un aminoácido y todos sus ARNt compatibles o afines. Estas enzimas de acoplamiento unen un aminoácido al hidroxilo libre 2 'o 3' de la adenosina en el extremo 3 'de las moléculas de ARNt mediante una reacción de dos pasos que requiere ATP (figura 4-29). Aproximadamente la mitad de las aminoacil-tRNA sintetasas transfieren el grupo aminoacilo al hidroxilo 2 ′ de la adenosina terminal (clase I), y aproximadamente la mitad al hidroxilo 3 ′ (clase II). En esta reacción, el aminoácido se une al ARNt mediante un enlace de alta energía y, por lo tanto, se dice que está activado. La energía de este enlace impulsa posteriormente la formación de enlaces peptídicos entre aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica en crecimiento. El equilibrio de la reacción de aminoacilación se impulsa aún más hacia la activación del aminoácido mediante la hidrólisis del enlace fosfoanhídrido de alta energía en el pirofosfato. La reacción general es

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Figura 4-29. Aminoacilación de tRNA. Los aminoácidos están unidos covalentemente a los ARNt mediante sintetasas de aminoacil-ARNt.
Figura 4-29
Aminoacilación de tRNA. Los aminoácidos se unen covalentemente a los ARNt mediante aminoacil-ARNt sintetasas. Cada una de estas enzimas reconoce un tipo de aminoácido y todos los ARNt afines que reconocen codones para ese aminoácido. La aminoacilación en dos pasos (más.)

Actualmente se conocen las secuencias de aminoácidos de las aminoacil-tRNA sintetasas (ARS) de muchos organismos, y se han resuelto las estructuras tridimensionales de más de una docena de enzimas de ambas clases. Cada una de estas enzimas tiene un sitio de unión bastante preciso para ATP (no se admite GTP y CTP y UTP son demasiado pequeñas) y bolsas de unión para su aminoácido específico. Las enzimas de clase I y clase II se unen a caras opuestas de los ARNt entrantes. Las superficies de unión de las enzimas de clase I tienden a ser algo complementarias a las de las enzimas de clase II. Estas diferentes superficies de unión y la consecuente alineación de los ARNt unidos probablemente explican en parte la diferencia en el grupo hidroxilo al que se transfiere el grupo aminoacilo (Figura 4-30). Debido a que algunos aminoácidos son tan similares estructuralmente, las aminoacil-tRNA sintetasas a veces cometen errores. Sin embargo, estos son corregidos por las propias enzimas, que controlan el ajuste en los bolsillos de unión y facilitan la desacilación de cualquier ARNt misacilado. Esta función crucial ayuda a garantizar que un ARNt entregue el aminoácido correcto a la maquinaria de síntesis de proteínas.

Figura 4-30. Reconocimiento de un tRNA por aminoacil sintetasas. La aspartil-tRNA sintetasa (AspRS) es una enzima de clase II y la arginil-tRNA sintetasa (ArgRS) es una enzima de clase I.
Figura 4-30
Reconocimiento de un tRNA por aminoacil sintetasas. La aspartil-tRNA sintetasa (AspRS) es una enzima de clase II y la arginil-tRNA sintetasa (ArgRS) es una enzima de clase I. Aquí se muestran los contornos de las estructuras tridimensionales de las dos sintetasas. El (más.)

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Cada molécula de tRNA es reconocida por una sintetasa de aminoacil-tRNA específica
La capacidad de las aminoacil-ARNt sintetasas para reconocer sus ARNt afines correctos es tan importante para la traducción precisa del código genético como el apareamiento codón-anticodón. Una vez que un tRNA se carga con un aminoácido, el emparejamiento de codón-anticodón dirige el tRNA al sitio correcto del ribosoma si el aminoácido incorrecto se une al tRNA, se produce un error en la síntesis de proteínas.

Como ya se señaló, cada aminoacil-ARNt sintetasa puede aminoacilar todos los diferentes ARNt cuyos anticodones corresponden al mismo aminoácido. Por lo tanto, todos estos ARNt afines deben tener un sitio de unión similar, o elemento de identidad, que sea reconocido por la sintetasa. Un método para estudiar los elementos de identidad en los ARNt que son reconocidos por las aminoacil-ARNt sintetasas es producir genes sintéticos que codifiquen ARNt con secuencias normales y diversas mutantes mediante las técnicas que se describen en el Capítulo 7. Los ARNt normales y mutantes producidos a partir de tales genes sintéticos pueden entonces probar su capacidad para unirse a sintetasas purificadas.

Muy probablemente, ninguna estructura o secuencia única determina completamente una identidad de ARNt específica. Sin embargo, se conocen algunas características estructurales importantes de varios ARNt de E. coli que permiten que sus sintetasas afines los reconozcan. Quizás el elemento de identidad más lógico en una molécula de ARNt es el propio anticodón. Los experimentos en los que se intercambiaron los anticodón de tRNA de metionina (tRNAMet) y tRNA de valina (tRNAVal) mostraron que el anticodón es de gran importancia para determinar la identidad de estos dos tRNA. Además, el análisis cristalográfico de rayos X del complejo entre glutamina aminoacil-tRNA sintetasa (GlnRS) y glutamina tRNA (tRNAGln) mostró que cada una de las bases anticodón encaja perfectamente en un "bolsillo" específico separado en la estructura tridimensional de GlnRS. Por tanto, esta sintetasa reconoce específicamente el anticodón correcto.

Sin embargo, el anticodón puede no ser el principal elemento de identidad en otros ARNt (ver Figura 4-30). La figura 4-31 muestra el grado de conservación de la secuencia de bases en los ARNt de E. coli que se unen al mismo aminoácido. Los elementos de identidad se encuentran en varias regiones, particularmente en el extremo del brazo aceptor. El tRNAAla presenta un caso simple: un solo par de bases G · U (G3 · U70) en el tallo aceptor es necesario y suficiente para el reconocimiento de este tRNA por su sintetasa de aminoacil-tRNA afín. La solución de la estructura tridimensional de complejos adicionales entre aminoacil-tRNA sintetasas y sus tRNA afines debería proporcionar una comprensión clara de las reglas que gobiernan el reconocimiento de tRNAs por sintetasas específicas.

Figura 4-31. Elementos de identidad en tRNA implicados en el reconocimiento por aminoacil-tRNA sintetasas, como lo demuestran tanto la conservación como la experimentación.
Figura 4-31
Elementos de identidad en tRNA implicados en el reconocimiento por aminoacil-tRNA sintetasas, como lo demuestran tanto la conservación como la experimentación. Las 67 secuencias de ARNt conocidas en E. coli se compararon mediante análisis informático. Los nucleótidos conservados en diferentes (más.)

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Los ribosomas son máquinas sintetizadoras de proteínas
Si los muchos componentes que participan en la traducción del ARNm tuvieran que interactuar en solución libre, la probabilidad de que ocurrieran colisiones simultáneas sería tan baja que la velocidad de polimerización de aminoácidos sería muy lenta. La eficiencia de la traducción aumenta en gran medida por la unión del ARNm y los aminoacil-ARNt individuales al complejo ARN-proteína más abundante de la célula: el ribosoma. Esta máquina de dos partes dirige el alargamiento de un polipéptido a una velocidad de tres a cinco aminoácidos añadidos por segundo. Por lo tanto, se producen pequeñas proteínas de 100 a 200 aminoácidos en un minuto o menos. Por otro lado, se necesitan de 2 a 3 horas para producir la proteína más grande conocida, titina, que se encuentra en el músculo y contiene 30.000 residuos de aminoácidos. La máquina que realiza esta tarea debe ser precisa y persistente.

Con la ayuda del microscopio electrónico, los ribosomas se descubrieron por primera vez como estructuras redondeadas y discretas prominentes en los tejidos animales que secretaban grandes cantidades de proteínas inicialmente, sin embargo, no se sabía que desempeñaran un papel en la síntesis de proteínas. Una vez que se obtuvieron preparaciones de ribosomas razonablemente puras, los experimentos de radiomarcaje mostraron que los aminoácidos radiactivos se incorporaron primero en las cadenas polipeptídicas en crecimiento asociadas con los ribosomas antes de aparecer en las cadenas terminadas.

Un ribosoma está compuesto por varias moléculas diferentes de ARN ribosómico (ARNr) y más de 50 proteínas, organizadas en una subunidad grande y una subunidad pequeña. Las proteínas de las dos subunidades difieren, al igual que las moléculas de ARNr. La subunidad ribosómica pequeña contiene una sola molécula de ARNr, denominada ARNr pequeño; la subunidad grande contiene una molécula de ARNr grande y una molécula de cada uno de los dos ARNr mucho más pequeños en eucariotas (figura 4-32). Las subunidades ribosómicas y las moléculas de ARNr se designan comúnmente en svedbergs (S), una medida de la velocidad de sedimentación de las partículas en suspensión centrifugadas en condiciones estándar (capítulo 3). Las longitudes de las moléculas de ARNr, la cantidad de proteínas en cada subunidad y, en consecuencia, los tamaños de las subunidades difieren en las células procariotas y eucariotas. (Los ARNr pequeños y grandes tienen aproximadamente 1500 y 3000 nucleótidos de longitud en bacterias y aproximadamente 1800 y 5000 nucleótidos en humanos.) Quizás de más interés que estas diferencias son las grandes similitudes estructurales y funcionales entre los ribosomas de todas las especies. Esta consistencia es otro reflejo del origen evolutivo común de los componentes más básicos de las células vivas.

Figura 4-32. La estructura general de los ribosomas en procariotas y eucariotas.
Figura 4-32
La estructura general de los ribosomas en procariotas y eucariotas. En todas las células, cada ribosoma consta de una subunidad grande y una pequeña. Las dos subunidades contienen ARNr de diferentes longitudes, así como un conjunto diferente de proteínas. Todos los ribosomas contienen dos (más).

Ahora se conocen las secuencias de los ARNr pequeños y grandes de varios miles de organismos. Aunque las secuencias de nucleótidos primarios de estos ARNr varían considerablemente, teóricamente las mismas partes de cada tipo de ARNr pueden formar bucles de tallo de pares de bases, generando una estructura tridimensional similar para cada ARNr en todos los organismos. La evidencia de que tales bucles de tallo ocurren en el ARNr se obtuvo al tratar el ARNr con agentes químicos que reticulan las bases pareadas.Las muestras luego se digirieron con enzimas que destruyen el ARNr monocatenario, pero no las regiones reticuladas (pares de bases). Finalmente, se recogió y secuenció el ARNr reticulado intacto que quedaba, identificando así los bucles de tallo en el ARNr original. Los experimentos de este tipo han localizado alrededor de 45 bucles de tallo en posiciones similares en ARNr pequeños de muchos procariotas y eucariotas diferentes (figura 4-33). Se ha demostrado un número aún mayor de vástagos de tallo colocados regularmente en ARNr grandes. Se han identificado todas las proteínas ribosómicas y se han determinado sus secuencias, y se ha demostrado que muchas se unen a regiones específicas de ARNr. Parece claro que la maquinaria fundamental de síntesis de proteínas en todas las células actuales surgió solo una vez y se ha modificado sobre un plan común durante la evolución.

Figura 4-33. Mapa bidimensional de la estructura secundaria del ARNr pequeño (16S) de bacterias, que muestra la ubicación de los tallos y bucles de pares de bases.
Figura 4-33
Mapa bidimensional de la estructura secundaria del ARNr pequeño (16S) de bacterias, que muestra la ubicación de los tallos y bucles de pares de bases. En general, la longitud y la posición de los bucles del tallo son muy similares en todas las especies, aunque la secuencia exacta (más.)

Durante la síntesis de proteínas, un ribosoma se mueve a lo largo de una cadena de ARNm, interactuando con varios factores de proteínas y ARNt y muy probablemente incluso sufre cambios de forma. A pesar de la complejidad del ribosoma, se ha logrado un gran progreso en la determinación de la estructura general de los ribosomas bacterianos y en la identificación de sitios reactivos que se unen a proteínas específicas, ARNm y ARNt y que participan en pasos importantes en la síntesis de proteínas. Se han construido modelos bastante detallados de las subunidades ribosómicas grandes y pequeñas de E. coli basándose en estudios de microscopio crioelectrónico y de dispersión de neutrones (figura 4-34). Estos estudios no solo han determinado las dimensiones y la forma general de las subunidades ribosómicas, sino que también han localizado las posiciones de los ARNt unidos al ribosoma durante el alargamiento de la cadena de proteínas. Los poderosos experimentos químicos también han ayudado a desentrañar las complejas interacciones entre proteínas y ARN. En una técnica llamada huella, por ejemplo, los ribosomas se tratan con reactivos químicos que modifican el ARN monocatenario desprotegido al unirse a una proteína oa otro ARN. Si se conoce la secuencia total del ARN, entonces la ubicación de los nucleótidos modificados puede ubicarse dentro de la molécula. (Esta técnica, que también es útil para localizar sitios de unión a proteínas en el ADN, se describe en el capítulo 10.) Por tanto, la estructura y función generales de los ribosomas durante la síntesis de proteínas finalmente, después de 40 años, está cediendo a experimentos exitosos. En la siguiente sección se describe cómo estos resultados ayudan a comprender los pasos específicos en la síntesis de proteínas.

Figura 4-34. Estructura general del ribosoma de E. coli a una resolución de 25 Å inferida a partir de microscopía crioelectrónica y reconstrucción tridimensional basada en el análisis de 4300 proyecciones individuales.
Figura 4-34
Estructura general del ribosoma de E. coli a una resolución de 25 Å inferida a partir de microscopía crioelectrónica y reconstrucción tridimensional basada en el análisis de 4300 proyecciones individuales. (a) Este modelo muestra las formas del grande (azul) y (más).

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RESUMEN
La información genética se copia en ARNm en forma de un código triplete degenerado, superpuesto y sin comas. Cada aminoácido está codificado por una o más secuencias de tres bases, o codones, en el ARNm. Cada codón especifica un aminoácido, pero la mayoría de los aminoácidos están codificados por múltiples codones (véase el cuadro 4-2).
El codón AUG para la metionina es el codón de inicio más común, que especifica el aminoácido en el extremo NH2 de una cadena proteica. Tres codones funcionan como codones de terminación y no especifican aminoácidos.
Un marco de lectura, la secuencia ininterrumpida de codones en el ARNm desde un codón de inicio específico a un codón de terminación, se traduce en la secuencia lineal de aminoácidos en una proteína.
La decodificación de la secuencia de nucleótidos en el ARNm en la secuencia de aminoácidos de las proteínas depende de los ARN de transferencia y las sintetasas de aminoaciltARN (ver Figura 4-25).
Todos los ARNt tienen una estructura tridimensional similar que incluye un brazo aceptor para la unión de un aminoácido específico y un tallo-bucle con una secuencia de anticodón de tres bases en sus extremos (ver Figura 4-26). El anticodón puede formar pares de bases con su codón o codones correspondientes en el ARNm.
Debido a interacciones no estándar, un ARNt puede emparejarse con más de un codón de ARNm y, a la inversa, un codón particular puede emparejarse con múltiples ARNt.
Cada una de las 20 aminoacil-tRNA sintetasas reconoce un solo aminoácido y lo une covalentemente a un tRNA análogo, formando un aminoacil-tRNA (ver Figura 4-29). Esta reacción activa el aminoácido, por lo que puede participar en la formación de enlaces peptídicos.
La composición de los ribosomas, los grandes complejos de ribonucleoproteínas en los que se sintetizan las proteínas, es bastante similar en todos los organismos (véase la figura 4-32). Todos los ribosomas se componen de una subunidad pequeña y otra grande. Cada uno contiene numerosas proteínas diferentes y un ARNr (pequeño o grande). La subunidad grande también contiene un ARN accesorio (5S).
Los ARNr análogos de muchas especies diferentes se pliegan en estructuras tridimensionales bastante similares que contienen numerosos bucles de tallo y sitios de unión para proteínas, ARNm y ARNt. A medida que un ribosoma se mueve a lo largo de un ARNm, una región de la molécula de ARNr grande en cada ribosoma se une secuencialmente a los extremos aminoacilizados de los ARNt entrantes y probablemente cataliza la formación de enlaces peptídicos (ver Figura 4-34).
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1. INTRODUCCIÓN

La aparición de enfermedades virales representa una grave amenaza para la salud pública mundial. Las últimas décadas han sido testigos de varias epidemias virales que han surgido con una frecuencia creciente, incluido el virus corona del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV identificado en 2002/2003), la gripe porcina (influenza H1N1 identificada en 2009) y más tarde la enfermedad respiratoria de Oriente Medio. virus del síndrome corona (MERS-CoV identificado en 2012). El último brote de una nueva enfermedad por coronavirus conocida como COVID-19, causada por el síndrome respiratorio agudo severo corona virus 2 (SARS-CoV-2) es una infección viral altamente transmisible y patógena que se ha extendido por todo el mundo. Se sabe que los virus corona causan enfermedades en humanos, otros mamíferos y aves. Hasta ahora se han identificado muchas especies de virus corona, de las cuales solo se sabe que seis especies causan enfermedades en los seres humanos. Fueron nombrados como HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV y MERS-CoV. 1, 2 De las seis especies de virus corona identificadas anteriormente, las primeras cuatro son endémicas localmente y causan síntomas leves en humanos. Otros dos pueden causar una enfermedad grave. 3 A fines de diciembre de 2019, apareció una nueva enfermedad respiratoria viral que se extendió muy rápidamente por todo el mundo y ha sido el foco de atención mundial debido a una epidemia de neumonía de causa desconocida. Inicialmente, el virus fue nombrado provisionalmente como el nuevo virus corona de 2019 (2019-nCoV). Sin embargo, el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) ha nombrado al virus SARS-CoV-2. 4 Este nuevo virus, 2019-nCoV, pertenece al subgénero Sarbeco virus del género beta-corona virus de la familia Coronaviridae. Los virus pertenecen a la familia Coronaviridae y poseen un genoma de ácido ribonucleico (ARN) de sentido positivo de una sola hebra cuya longitud varía de 26 a 32 kb. El SARS-Cov-2 está genéticamente más relacionado con el SARS-CoV que con el MERS-CoV, pero ambos son virus beta-corona que se cree que se originan en los murciélagos. La secuenciación de próxima generación (NGS) y el análisis filogenético del genoma revelaron que 2019-nCoV estaba estrechamente relacionado (88% idéntico) con dos virus corona similares al SARS derivados de murciélagos y más distante del SARS-CoV (79%) y MERS-CoV (50%). A nivel de aminoácidos, el 2019-nCoV es bastante similar al del SARS-CoV, pero existen algunas diferencias notables. Por ejemplo, la proteína 8a presente en el SARS-CoV está ausente en 2019-nCoV, la proteína 8b tiene 84 aminoácidos en el SARS-CoV, pero más larga en 2019- nCoV, con 121 aminoácidos, la proteína 3b tiene 154 aminoácidos en el SARS- CoV, pero más corto en 2019-nCoV, con solo 22 aminoácidos. Al igual que el SARS-CoV y el MERS-CoV, el SARS-CoV-2 puede provocar una neumonía letal. También tiene una mayor capacidad de transmisión de persona a persona que el SARS-CoV y el MERS-CoV. 5, 6 La enfermedad COVID-19 se propaga principalmente a través del contacto cercano de gotitas respiratorias generadas por individuos infectados. 7 Las manifestaciones clínicas de COVID-19 exhiben una variedad de síntomas, desde una gripe leve hasta afecciones potencialmente mortales.La mayoría de los pacientes infectados han referido fiebre alta, mientras que algunos mostraron disnea y lesiones invasivas en ambos pulmones con radiografías de tórax. Sin embargo, los pacientes, en su mayoría las personas más jóvenes, son la mayoría de la fuerza laboral y tienen más probabilidades de ser socialmente activos que están infectados con el SARS-CoV-2, pueden ser leves o incluso asintomáticos y pueden transmitir el virus a otras personas. Esto podría ser crucial para una mayor propagación de la enfermedad. El reconocimiento temprano de una persona infectada y cortar la ruta de transmisión son puntos clave para controlar COVID-19. Sin embargo, la mayoría de las infecciones asintomáticas no buscan asistencia médica debido a la ausencia de signos clínicos obvios y la falta de conciencia sobre la prevención, lo que contribuye a la rápida propagación del COVID-19. Por lo tanto, es un gran desafío prevenir y controlar este tipo específico de pacientes a nivel mundial, que requiere más atención a nivel mundial.

COVID-19 se ha convertido en un importante problema de salud pública mundial que se ha extendido muy rápidamente con una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. A medida que la enfermedad se propagaba a muchos países, la OMS declaró que el brote era una emergencia de salud pública de importancia internacional el 30 de enero de 2020 y, posteriormente, el 11 de marzo de 2020 declaró que el brote del virus corona de rápida propagación era una pandemia. Según el informe de situación de COVID-19 de la OMS 147, a nivel mundial, al 22 de agosto de 2020, la enfermedad se extendió por 213 países del mundo con 22,812,491 casos confirmados y 795,132 muertes registradas en todo el mundo.

La detección temprana con análisis rápidos y sensibles y la intervención oportuna son cruciales para interrumpir la propagación del virus COVID-19 (SARS-CoV-2). 8 En ausencia de vacunas o medicamentos antivirales adecuados, un método de detección confiable de la infección por SARS-CoV-2 es fundamental no solo para la prevención y el control de la pandemia de COVID-19, sino también para el tratamiento clínico. Muchos países de todo el mundo estaban empleando combinaciones de estrategias de contención y mitigación para el diagnóstico temprano de COVID-19. Es necesario implementar estrategias efectivas en el momento adecuado para prevenir la propagación de enfermedades entre la población. Aparte de esto, el diagnóstico temprano es esencial para una pronta intervención para los pacientes que tienen un mayor riesgo y existe la posibilidad de desarrollar complicaciones graves mientras están infectados con COVID-19. En la actualidad se dispone de varios métodos de diagnóstico para la detección precoz del virus y la enfermedad con sus ventajas y desventajas (Tabla 1). Sin embargo, la detección exitosa de la enfermedad depende de varios factores, como el momento de la prueba desde el inicio de la enfermedad, la concentración de virus en la muestra, la calidad de la muestra recolectada de una persona, cómo se procesa y la formulación precisa. de los reactivos en los kits de prueba. 28

Tecnología de diagnóstico Detección Tipo de muestra Prueba de laboratorio / punto de atención Ventaja Desventaja Referencia
RT-PCR ARN viral Frotis nasofaríngeo, esputo, heces Basado en laboratorio Detección específica y ahorro de tiempo Los resultados falsos negativos también se detectan en la carga viral baja 5, 9-13
ddPCR ARN viral Frotis nasofaríngeo, esputo, heces Basado en laboratorio Puede detectar el SARS-Cov-2 con precisión en muestras de baja carga viral y minimizar los resultados falsos negativos Más caro y susceptible a la contaminación exógena 14, 15
RT-PCR anidado ARN viral Hisopo nasofaríngeo Basado en laboratorio Puede detectar el SARS-Cov-2 con precisión en muestras de baja carga viral y minimizar los resultados falsos negativos La apertura de la tapa después de la primera ronda de PCR anidada aumenta el riesgo de contaminación cruzada que puede dar lugar a resultados falsos positivos. 16
RT-LAMP ARN viral Frotis nasofaríngeo, esputo, heces Laboratorio / punto de atención Resultados sensibles y específicos en menos tiempo, resultado visualizado en el ojo, no necesita termociclador Es complicado optimizar los cebadores y las condiciones de reacción 87
Tecnología Penn-RAMP ARN viral Hisopo nasofaríngeo Laboratorio / punto de atención La sensibilidad de Penn-RAMP de un tubo es 10 veces mayor que la de LAMP y RT-PCR Los reactivos costosos como la polimerasa y los cebadores requerían más cantidad que la LAMP 17
CRISPR ARN viral Hisopo nasofaríngeo, líquido de lavado broncoalveolar Basado en laboratorio Fácil de realizar y de bajo costo. En la prueba STOP COVID ni siquiera se requiere la extracción de ARN A veces da un resultado falso 18
Microarray ARN viral Hisopo nasofaríngeo, líquido de lavado broncoalveolar Basado en laboratorio Puede identificar cualquier mutación asociada con el SARS-CoV y puede detectar SNP asociado con pico (S) gen del SARS-CoV-2 El alto costo de un solo experimento, la gran cantidad de diseños de sondas basados ​​en secuencias de baja especificidad, así como la falta de control sobre el conjunto de transcripciones analizadas 19
Secuenciación viral ARN viral Hisopo nasofaríngeo Basado en laboratorio Conveniente, de alta sensibilidad, adecuado para detectar muestras con baja carga viral Instrumentos sofisticados, aumento de costo, requiere. Persona capacitada 20
Serología Anticuerpo / antígeno Sangre Laboratorio / punto de atención Menos complejas que las pruebas moleculares Las pruebas de detección de anticuerpos dirigidas a COVID-19 también pueden tener una reacción cruzada con otros patógenos y también pueden producirse resultados falsos negativos con un nivel bajo de antígeno en la etapa temprana de la infección. 21
ELISA Anticuerpo Sangre Basado en laboratorio Técnica de laboratorio sencilla y económica, importante para el desarrollo de vacunas y la terapia con plasma de convalecencia. Las pruebas ELISA aún no están bien establecidas para las pruebas SARS-CoV-2 COVID-19 22
Tomografía computarizada Pulmones Imágenes de cofre Punto de atención Las tomografías computarizadas tienen una mayor sensibilidad (86 a 98%) y mejores tasas de falsos negativos en comparación con la RT-PCR La especificidad es baja (25%) porque las características de las imágenes se superponen con otras neumonía viral 23
Biosensor Proteína S del SARS-CoV-2 Frotis nasofaríngeo, esputo, heces Punto de atención Detección rápida sin ningún tratamiento previo de la muestra Económico 24
Biomarcador Proteína C reactiva, linfocitos y ARN del SARS-CoV-2 Hisopo nasofaríngeo y sangre Basado en laboratorio Pruebas rápidas no microbiológicas fáciles Los mismos biomarcadores también son anormales en otras enfermedades y no son lo suficientemente específicos como para establecer un diagnóstico de COVID-19. 25
Nanotecnología ARN del SARS-CoV-2 Hisopo nasofaríngeo Punto de atención Alta sensibilidad, adoptada en sistemas de extracción de ARN totalmente automatizados, excelentes rendimientos de unión de ARN Pasos de pretratamiento complejos, requiere habilidad, costoso que qRT-PCR, con el riesgo de fotoblanqueo 26
Cultura viral Virus vivo in vitro Líneas de células epiteliales humanas Basado en laboratorio Importante para la identificación, detección de mutaciones y desarrollo de vacunas. Baja sensibilidad ya que el aislamiento no es del 100%. 27
  • Abreviaturas: COVID-19, enfermedad por coronavirus CRISPR, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas CT, tomografía computarizada ddPCR, ELISA de reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas LAMP, amplificación isotérmica mediada por bucle qRT-PCR, cuantitativo en tiempo real PCR de transcripción inversa ARN, RT-PCR de ácido ribonucleico, PCR en tiempo real SARS-CoV-2, síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 SNP, polimorfismos de un solo nucleótido.

Hasta ahora, los métodos de diagnóstico disponibles para las pruebas de COVID-19 se clasifican ampliamente en dos tipos de pruebas moleculares y serológicas. La primera categoría, es decir, los ensayos moleculares para la detección del ARN viral del SARS-CoV-2, utiliza el método basado en la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Sin embargo, otros métodos, como los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos isotérmicos, que incluyen la amplificación mediada por transcripción y las metodologías basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), son algunas alternativas prometedoras. Según la estructura SARS-CoV-2 (Figura 1) varios genes como mi, norte, S, ORF, y RdRp están destinados a la detección molecular. Además, la secuenciación genómica viral, una técnica sofisticada se ha convertido en una herramienta esencial para determinar la tasa y el grado de variabilidad mutacional asociada con el SARS-CoV-2. Esta técnica también se puede emplear para identificar nuevas cepas emergentes del virus para un desarrollo de vacunas más eficaz.

La segunda categoría de método de diagnóstico incluye ensayos serológicos e inmunológicos. Estos ensayos serológicos se basan en gran medida en la detección de anticuerpos producidos por individuos como resultado de la exposición al virus, mientras que los métodos inmunológicos se basan en la detección de proteínas antigénicas en individuos infectados. La detección de anticuerpos en respuesta a la infección por el virus del SARS-CoV-2 mediante pruebas serológicas se puede realizar mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y un inmunoensayo de flujo lateral. Es importante que estas técnicas de diagnóstico puedan servir para la detección y el manejo de la pandemia de COVID-19. La prueba del ARN viral del SARS-CoV-2 mediante métodos moleculares identifica a las personas infectadas con el SARS-CoV-2 durante la fase aguda de la infección, así como para realizar un rastreo de contactos para el manejo de la enfermedad. Por otro lado, las pruebas serológicas basadas en anticuerpos identifican posteriormente a las personas que han desarrollado anticuerpos contra el virus y podrían ser donantes potenciales de plasma convaleciente. Además, esta prueba de base de anticuerpos puede ser útil para monitorear el estado inmunológico de individuos y grupos expuestos al virus a lo largo del tiempo. 29

En el escenario actual, continúa la carrera para desarrollar kits de prueba de punto de contacto rentables y técnicas de laboratorio eficientes para el diagnóstico rápido de la infección por SARS-CoV-2. En la presente revisión, se ha discutido una breve discusión sobre diferentes tecnologías de diagnóstico con sus alcances y limitaciones. Esta revisión también proporciona una descripción general del desarrollo actual en las técnicas y productos de diagnóstico de COVID-19 para facilitar la mejora y la innovación futuras.


Virología - Medio término 1

2. La investigación sobre la replicación de bacteriófagos y el ADN de virus animales sentó las bases para comprender las enzimas involucradas en la replicación del ADN celular.

3. El empalme de ARN en células eucariotas se descubrió por primera vez mediante el estudio del ARNm de virus de ADN.

Se añaden diluciones seriadas de suspensión de virus a una monocapa de células bacterianas. A medida que el virus se replica y se propaga, mata a su célula huésped bacteriana dejando una placa.

MOI = 1 cuando hay 1 virión por 1 célula huésped.

4. Replicación del genoma viral.

2. Los virus de las plantas penetran a través de una herida causada por insectos.

3. Los virus animales envueltos fusionan su envoltura lipídica directamente con la membrana plasmática y se liberan en la célula.

Los virus de ARN (excepto los retrovirus) deben sintetizar una ARN polimerasa dependiente de ARN para replicar sus genomas. Esta enzima no está presente en la célula huésped. Replica la hebra con sentido (+) de ARNm.

2. ¿Se dispone de la maquinaria celular adecuada para que el virus se replique? P.ej. Algunos virus de ADN solo pueden replicarse en células en división que tienen altos niveles de DNTP disponibles para la síntesis de ADN viral.

Las cápsides pueden ensamblarse espontáneamente.

Las cápsides simples tienen subunidades repetidas con interacciones idénticas.

Algunas cápsides virales tienen simetría icosaédrica.

Las cápsides más complejas tienen subunidades repetidas que interactúan de manera casi equivalente.

Muchas cápsides de virus están organizadas como tubos helicoidales que tienen simetría helicoidal.

Utilice TEM - & gt observe el virus. ¿Qué forma es?

Determina si el virus está envuelto o no.

La mayoría tienen cápsides icosaédricas.

Todos los virus dsDNA tienen genomas no fragmentados, es decir, todos los genes están contenidos en una sola molécula de ADN.

Todos los virus de ARN tienen genomas lineales.

La mayoría de los genomas son pequeños y las cápsides no están envueltas; sin embargo, las nucleocápsidas más grandes están envueltas, quizás para proteger contra la degradación.

Tienen nucleocápsidas helicoidales

Envuelto con genoma lineal.

Muchos tienen genomas fragmentados, por lo tanto tienen partículas psudovirales elevadas.

Cada segmento del genoma codifica un solo ARNm y una proteína.

Tiene que portar ARN polimerasa.

La cápside proporciona una estructura que posiciona cada molécula de ARN polimerasa y varios segmentos del genoma, lo que permite la transcripción de cada segmento y la transferencia direccional de cada ARNm al citoplasma.

Infecta y se replica en una amplia variedad de huéspedes, tal vez porque debe transportar su propia ARN polimerasa, por lo que depende menos del entorno celular específico.

2. Los viroides que no codifican proteínas pero que se replican independientemente de otros virus - & gt tienen actividades autoenzimáticas que apoyan la postulación de que los ARN alguna vez pudieron replicarse en ausencia de proteínas (se cree que involucra la acción de las ribozimas).

2. La hipótesis regresiva (o reductora).

Los organismos autónomos inicialmente desarrollaron una relación simbiótica, pero se volvieron parásitos a medida que se volvieron más dependientes del huésped debido a la pérdida de genes previamente esenciales. Finalmente, no pudo replicarse de forma independiente convirtiéndose en un parásito intracelular obligado (virus).

Propone que los virus pueden haber sido las primeras entidades replicantes, existiendo en un mundo precelular como unidades autorreplicantes que dieron origen a las células.

Los receptores del huésped tienen sus propias funciones pero han sido explotados por el virus.

Los receptores suelen estar muy conservados y, por lo tanto, es poco probable que sufran una mutación (por ejemplo, CD4, receptor de LDL, receptor de CXC (quimiocina)).

Muchos virus se unen a grupos de carbohidratos en glicoproteínas / lípidos. (Por ejemplo, la influenza se une a los residuos de ácido siálico en las glicoproteínas presentes en prácticamente todas las células).

Algunas glicoproteínas median la unión y la fusión (por ejemplo, la proteína HA de la influenza usa el dominio HA1 para unirse al ácido siálico y el dominio HA2 actúa como un factor de fusión de la membrana).

La penetración viral se puede realizar in vitro reduciendo artificialmente el pH.

2. Puede importarse después de un desmontaje parcial en el citoplasma.

3. Puede importarse después del desmontaje en el poro nuclear.

4. Los viriones intactos pueden transportarse a través del complejo de poros nucleares.
El virus de la hepatitis es tan pequeño que la cápside puede moverse a través del poro nuclear directamente al núcleo.

2. Puede inundar el espacio extracelular con un receptor soluble.

3. Puede bloquear el receptor celular.

4. Puede utilizar agentes lisomotrópicos, ionóforos carboxílicos y bafilomicina A1 que inhiben la acidificación del endosoma.

5. Puede inhibir el des-recubrimiento (usando amantadina o compuestos WIN).

La neuraminidasa ayuda al virus de la gripe a atravesar la membrana de la célula huésped.

Tamiflu es un inhibidor de la neuraminidasa de la influenza que se une al sitio activo de las enzimas, por lo que el virus no puede salir de la célula para infectar otras células (Tamiflu bloquea la salida del virus).

1º - Las fibras se unen al LPS. El fago exhibe un tropismo del hospedador muy específico. Si hay algún cambio en las fibras, no habrá unión.

2º - Las proteínas del núcleo se insertan a través de la cola del fago en la célula, formando el poro. Los genes de clase 1 ingresan primero a la célula (mediados por una señal celular).

Tercero: la gp16 puede comenzar a degradar el peptidoglicano.

4º - El ADN entra exponiendo 3-P que se une a la ARN polimerasa de E. coli.

Los genes de clase 1 son necesarios en primer lugar para las clases II y III, y para desactivar las funciones del huésped.

Se necesita la clase II para la replicación. Los genes de clase II codifican las enzimas implicadas en la replicación del ADN dependiente de T7. El uso de múltiples promotores conduce a un conjunto anidado de transcripciones superpuestas con un extremo 3 'común.

Se necesitan genes de clase II para el ensamblaje.

2. La clase II controla la actividad de la ARN polimerasa de T7 mediante la lisozima codificada que se une a la ARN polimerasa de T7 para reducir su actividad.

Los genes Lac expresan enzimas implicadas en la degradación de lactosa en presencia de lactosa (o IPTG, un análogo de lactosa). La unión de IPTG desencadena la transcripción de genes Lac.

Cópielo en números altos usando el vector pET.

Aísle su proteína de interés usando una etiqueta his que incorporó a su gen.

2. Comprender la evolución viral para evitar / infectar ciertos tejidos es importante para comprender la naturaleza de la adaptación viral dentro del hospedador y el equilibrio entre la adaptación para una transmisión máxima y la adaptación dentro del hospedador.

Tanto las bacterias como los fagos están asociados con este moco.

La fibra de la cola se une a la proteína de la membrana externa LamB (una porina inducible por maltosa).

Luego se inyecta ADN en el periplasma.

La diabetes Tipo 1 depende del equilibrio entre las células T efectoras autorreactivas y las células T reguladoras. Este equilibrio está influenciado por las células dendríticas (DC).

- La cápside de Picornavirus contiene 60 copias de cada una de las proteínas (VP1, VP2, VP3 y VP4.)

- El poliovirus se une al receptor de poliovirus en la célula huésped.

- Una vez unido a la célula huésped, el ARN genómico atraviesa los poros formados en la membrana celular por las proteínas de la cápside VP4 y VP1.

VPg es una proteína que está unida al extremo N-terminal del ssRNA.

Un determinante importante de la parálisis es el V de bucle escalonado en el IRES.

Este es un factor de traducción específico de las neuronas que tiene una interacción defectuosa con el ARN.

Una mutación puntual en el tallo-loop V es la responsable de la vacuna Sabin atenuada.

- Se elabora una hebra de ARN negativa de longitud completa y luego se utiliza como plantilla para la síntesis de la hebra (+).

- Primero se requiere la traducción para generar proteínas de replicación (la poliproteína se escinde).

- La síntesis de ARN está preparada por VPg unido covalentemente a residuos de uridina. La uridilación de VPg le permite hibridar con la cola de poli (A) y servir como cebador para la síntesis de cadenas (-).

- La síntesis de ARN se completa mediante la ARN polimerasa viral dependiente de ARN (traída con el virus).

- Cinco promotores se autoensamblan en pentámeros.

- Los pentámeros y el ARN se ensamblan en un provirion.

Los síntomas de una infección viral (dolor, fatiga, fiebre) provienen de la respuesta inmunitaria (no del virus en sí).

El primer caso de una epidemia se denomina caso índice.

La única diferencia es que el flavavirus sufre una traducción dependiente del casquete.

Todos los genes se traducen como una sola poliproteína seguida de escisión proteolítica (igual que Picornavirus).

Etapa inicial - & gt Fiebre alta y dolor muscular, dolor de cabeza y vómitos intensos.

Etapa de reposo - & gt La fiebre y los síntomas desaparecen

Etapa final - & gt La repetición de los síntomas originales es más grave. Puede provocar insuficiencia de órganos multisistémicos.

- Dengue
= Fiebre hemorrágica del dengue
- Síndrome de shock por dengue.

Conduce a la muerte en el 5% de los casos.

- El dengue se dirige a áreas con recuentos elevados de glóbulos blancos (hígado, bazo, ganglios linfáticos, médula ósea y glándulas).

- El dengue entra en los glóbulos blancos y los tejidos linfáticos.

- La proteína flavavirus E cubre toda la superficie y dirige tanto la unión a los receptores del huésped como la fusión de las membranas virales y celulares. La proteína E es inmunogénica. Actualmente se desconoce el receptor del favavirus del huésped.

Después de la unión, la entrada en la célula está mediada por endocitosis. La vesícula se fusiona con los endosomas tardíos, lo que produce una caída del pH. La acidificación da como resultado la reordenación del dímero de la proteína E en su estado trimérico activo de fusión.

- La secuencia señal se escinde en la luz del RE, liberando la poliproteína.

- La proteína C madura es escindida por NS1, liberando la proteína de la cápside madura.

- El período de incubación dura de 12 a 23 días.

- La replicación viral ocurre en la nasofaringe y los ganglios linfáticos regionales.

- La viremia ocurre dentro de 5-7 días.

- Tanto la placenta como el feto se infectan durante la viremia.

Una vez unido, el virus sufre una endocitosis mediada por receptores.

La caída del pH provoca un cambio conformacional en E1 y E2 que conduce a la fusión de la membrana y expone el péptido de fusión hidrofóbico.

Las proteínas no estructurales se traducen directamente del ARN genómico como una poliproteína que es escindida por proteasas virales.

En la fase inicial de la infección, P1234 se procesa proteolíticamente y P4 se escinde. P2 codifica para una proteasa y P4 codifica para ARN polimerasa. P4 se une a P123 y forma un complejo que permite la síntesis del (-) sentido del ARN anti-genoma.

El antigenoma sirve como molde para la síntesis de ARN subgenómico y de longitud completa.


Andamios de ARN citoplásmico

Recientemente han salido a la luz varios ejemplos de andamios y señuelos de ARN citoplásmico flexible, que involucran particularmente a lncRNA y mRNA citoplásmicos. Estos, junto con un andamio de ARN flexible asociado a ribosomas conocido desde hace mucho tiempo, se comentan ahora (Figura 2 y Tabla 1).

7SL & # x02013 un paradigma de andamiaje de ARN citoplásmico. (1) La traducción de proteínas con péptidos señal N-terminal (verde) están unidas por el complejo SRP, andamios por 7SL. (2) La unión del péptido señal induce un cambio conformacional de SRP y una unión más estrecha, por lo que bloquea el sitio A del ribosoma y detiene el alargamiento de la traducción. (3) La interacción SRP con el receptor SRP posiciona el péptido naciente para su entrada en el translocón ER. (4) La disociación de SRP alivia el estancamiento de elongación y el péptido naciente se extiende y se pliega dentro de la luz del RE.

Partícula de reconocimiento de señal de andamios 7SL

La partícula de reconocimiento de señales (SRP) es un complejo de RNP bien estudiado que está estructurado por un ARN derivado de la ARN polimerasa III (7SL Figura 2). SRP reconoce y se une a los péptidos señal N-terminales presentes en proteínas destinadas a la secreción o localización en la membrana a medida que emergen de un ribosoma. La unión de SRP a los péptidos señal causa un estancamiento en el alargamiento de la traducción y dirige el ribosoma a un poro translocón en la membrana del RE donde luego se reanuda la traducción, lo que da como resultado que el péptido naciente no estructurado se enhebre en el lumen del RE, donde finalmente puede ocurrir el plegamiento y el tráfico posterior. (Keenan et al., 2001).

El lncRNA 7SL humano es un ARN estructurado de & # x0223c300 nt de largo caracterizado por regiones helicoidales que forman 2 dominios separados por un enlazador flexible, un dominio más pequeño (Alu) y un dominio más grande (S), con cada parte reclutando proteínas específicas (6 en total ) que forman el SRP (Pool, 2005). El dominio Alu de 7SL se une preferentemente al heterodímero SRP14 / SRP9 cuya función implica unirse al ribosoma e inhibir el alargamiento de la traducción después del reconocimiento de la señal al oscurecer el acceso al sitio A del ribosoma, mientras que el dominio S se une al heterodímero SRP68 / SRP72, SRP19 y SRP54. y se une en las proximidades del túnel de péptidos nacientes (Siegel y Walter, 1988 Wild et al., 2001). Además de la unión del péptido señal (a través de SRP54), el dominio S también media las interacciones de SRP con el receptor de SRP en la membrana del ER (Gowda et al., 1997 Pool et al., 2002). Los análisis de la estructura cristalina sugieren que la unión del heterodímero SRP68 / SRP72 de 7SL impulsa un cambio de conformación inicial que permite la interacción adecuada de SRP con el ribosoma (Grotwinkel et al., 2014). Además, los estudios de Cryo-EM indican que SRP unido al ribosoma de alargamiento existe en al menos dos estados distintos. En el estado & # x0201cscanning & # x0201d, SRP muestrea péptidos nacientes en busca de secuencias de péptidos señal. Si no se detecta ninguno, la unión del factor de elongación desplaza fácilmente el dominio Alu lejos del sitio A ribosómico, mientras que en el estado & # x0201cengaged, & # x0201d con SRP54 unido al péptido naciente, el dominio Alu permanece fuertemente unido cerca del A- sitio, inhibiendo así la traducción (Voorhees y Hegde, 2015). Por lo tanto, la flexibilidad dinámica del andamio de ARN 7SL es fundamental para la función de SRP.

LncRNA citoplasmáticos como andamios y señuelos de ARN

Si bien la mayoría de los ARNnc exhiben un sesgo significativo hacia la localización nuclear, muchos también se localizan en el citoplasma y, por lo tanto, como era de esperar, están cada vez más vinculados a una serie de diversos roles de andamiaje y señuelo.

Los lncRNA pueden unirse al mRNA en transy complejos de andamios que afectan la función del ARNm. Por ejemplo, se identificaron numerosos lncRNA que albergan elementos Alu (& # x0201c1 / 2-sbsRNAs & # x0201d) que forman dúplex parcialmente complementarios en trans con elementos Alu presentes en varios ARNm 3 & # x02032UTR (Gong y Maquat, 2011 Figura 3). Tras la unión de lncRNA-mRNA, el RNA bicatenario resultante sirve como sitio de unión para el RBP Staufen, que a su vez recluta la ARN helicasa Upf1, lo que da como resultado la degradación de muchos mRNA diana mediante un proceso denominado desintegración mediada por Staufen (SMD) (Kim et al. al., 2005). La regulación de SMD por lncRNAs es compleja, dado que a) varios lncRNAs que contienen Alu diferentes pueden promover la desintegración del mismo mRNA b) un lncRNA que contiene Alu dado puede regular varios mRNAs yc) no todas las dianas de mRNA con complementariedad con un Alu dado que contienen lncRNA necesariamente se descomponen, posiblemente debido a otros aspectos estructurales del complejo mRNA-proteína (mRNP) (Gong y Maquat, 2011 Gong et al., 2012 Park y Maquat, 2013). En otro caso, p21, una diana transcripcional de lncRNA altamente estudiada de p53 con muchas funciones nucleares, también forma híbridos con mRNA citoplásmicos diana (Figura 3). Específicamente, p21 exhibe complementariedad de pares de bases parciales y se purifica por afinidad con ARNm de CTNNB1 y JUNB, que codifican proteínas oncogénicas & # x003b2-catenina y JunB (Yoon et al., 2012). Según los estudios de eliminación, p21 ejerce un efecto inhibidor sobre la traducción de estos ARNm, en lugar de la desintegración del ARNm. De acuerdo con esto, p21 también se purifica por afinidad con los represores de traducción RCK y FMRP, y se fracciona en polisomas, lo que sugiere que p21 se empareja y recluta represores de traducción a objetivos de ARNm (Yoon et al., 2012).

Ejemplos de andamios y señuelos de ARN citoplasmático. Los ARN de andamio y señuelo están representados en rosa (A) Traducción de ARNm: lncRNA-p21 parcialmente pares de bases con ARNm diana que conducen al reclutamiento de factores de represión de la traducción como RCK y FMRP, inhibiendo así la traducción de ARNm. (B) Decaimiento del ARNm: 1 / 2sbsRNA par de bases con ARNm diana, el ARNdc resultante recluta a Staufen, lo que lleva a la descomposición del ARNm mediada por staufen. (C) Secuestro de miARN: varios lncRNA (lineales y circulares) en múltiples especies, regulados en un tejido, de manera sensible al desarrollo o ambiental, pueden emparejarse y secuestrar miARN, previniendo su regulación de la traducción o desintegración del ARNm. (D) Degradación de proteínas: HOTAIR lncRNA se une a dos ubiquitin ligasas y sus sustratos provocando su ubiquitinación y degradación.

Un segundo ejemplo de ensamblaje de andamiaje co-traduccionalmente 3 & # x02032UTR de complejos de proteínas implica el gen de la proteína 3 que contiene la repetición IAP baculoviral (BIRC3). BIRC3 codifica una ubiquitina ligasa, y la escisión y poliadenilación alternativas genera isoformas de ARNm cortas (BIRC3-SU) y largas (BIRC3-LU) 3 & # x02032UTR, la última de las cuales está significativamente al alza en células de leucemia linfocítica crónica (LLC) (Lee y Mayr). , 2019). Si bien no afecta a la localización de ARNm o proteínas de BIRC3, ni a los niveles de proteínas, BIRC3-LU se une específicamente a HuR y Staufen, que a su vez recluta proteínas reguladoras del tráfico (motivo IQ que contiene GTPasa IQGAP1 y Ras GTPasa RALA) (Lee y Mayr, 2019). Estos interactúan con BIRC3 traducido nacientemente de manera que el 3 & # x02032UTR andamia la formación de un complejo BIRC3-RALA-IQGAP1. Este complejo, a su vez, se une y promueve el reciclaje de la membrana plasmática de una proteína receptora llamada CXCR-4, que promueve la progresión de la CLL al ayudar a la migración y supervivencia de las células B malignas dirigiéndose a nichos protectores de la médula ósea (Burger et al., 2005). Finalmente, el BIRC3-LU 3 & # x02032UTR, distinto de la isoforma BIRC3-SU, se une de forma única a las proteínas implicadas en la biología mitocondrial y la remodelación de la cromatina, lo que sugiere que este 3 & # x02032UTR particular puede estructurar múltiples complejos de proteínas funcionalmente distintos (Lee y Mayr, 2019).

Aunque es más conocido por su función nuclear, HOTAIR también se encuentra en el citoplasma, particularmente en condiciones celulares como la senescencia (Yoon et al., 2013). HOTAIR citoplasmático sirve como un sitio de unión para dos ubiquitina ligasas DZIP3 y MEX3B, y sus sustratos Snurportin 1 (SNUPN) y Ataxin-1 (ATXN1) esta unión conduce a un aumento de la ubiquitinación de SNUPN y ATXN1 y su degradación. La acumulación de HOTAIR es necesaria para provocar fenotipos de senescencia celular adecuados en respuesta a estímulos inductores, posiblemente en parte a través de la degradación de SNUPN y ATXN1 (Yoon et al., 2013). Tanto HOTAIR como p21 están regulados negativamente por la unión del RBP HuR, que normalmente estabiliza los mRNA, pero en el caso de estos lncRNA, estimula el ensamblaje y el reclutamiento de un complejo silenciador de miRNA (Let-7 / Ago2) para provocar su desintegración (Yoon et al. ., 2012). Por tanto, los lncRNA citoplásmicos pueden regular la traducción y los eventos de renovación de proteínas y pueden estar sujetos a la regulación de su estabilidad mediada por miRNA.

Por el contrario, un modo bien apreciado de función de lncRNA en el citoplasma es funcionar como señuelos para miRNA (también conocido como esponjas Figura 3). Descrito por primera vez en plantas donde el lncRNA IPS1 secuestra miR-399 como parte de la regulación de la homeostasis del fosfato (Franco-Zorrilla et al., 2007), ahora se conocen varios señuelos de lncRNA miRNA, algunos de los cuales albergan múltiples sitios para distintos miRNA y pueden existen como lncRNA circulares derivados del intermedio de empalme (Hansen et al., 2013 Memczak et al., 2013). Muchos señuelos de miARN parecen altamente regulados, con distintos patrones de expresión de tejido, desarrollo y respuesta ambiental, y tienen el potencial de exhibir efectos a gran escala sobre la traducción y desintegración del ARNm, debido a la diversidad de moléculas de miARN cuya función pueden impedir. Guiamos a los lectores a otras revisiones detalladas sobre estos temas (Ebert y Sharp, 2010a, b Yoon et al., 2014 Rong et al., 2017).

Ensamblaje co-traduccional de andamios de ARNm de complejos proteicos

La creciente evidencia indica que los ARNm sirven como plataformas de andamiaje para el ensamblaje de complejos de proteínas co-traduccionales (Natan et al., 2017). En los procariotas, las subunidades de un complejo proteico dado a menudo se codifican en operones (un grupo de genes de función común bajo un solo promotor), que se transcriben en ARNm policistrónicos. La traducción de los ARNm policistrónicos, a su vez, aumenta la probabilidad de que las subunidades del complejo de proteínas codificadas interactúen. Dichas interacciones pueden ocurrir en ARNm policistrónicos incluso cuando las proteínas sintetizadas de manera incipiente todavía están asociadas con los ribosomas, debido en parte a su proximidad espacial cercana a la síntesis (Shieh et al., 2015). De esta manera, el ARNm sirve como una molécula de andamiaje que facilita las interacciones de las proteínas nacientes. Además, los genes adyacentes en los operones tienden a exhibir interfaces de interacción de proteínas más grandes (Koonin y Mushegian, 1996 Dandekar et al., 1998 Shieh et al., 2015 Wells et al., 2016). Estos hallazgos, combinados con análisis bioinformáticos y estructurales adicionales del ensamblaje de complejos de proteínas, sugieren que el orden de los genes del operón a menudo coincide (y, por lo tanto, puede ayudar a dirigir) el orden en el que se ensamblan las subunidades de proteínas (Wells et al., 2016). Además de la proximidad espacial de las subunidades, una menor variación estequiométrica en la expresión de la subunidad del complejo de proteínas es una ventaja adicional del ensamblaje del complejo de proteínas en los ARNm policistrónicos (Swain, 2004 Sneppen et al., 2010 Shieh et al., 2015).

Los eucariotas carecen de operones, lo que significa que cualquier interacción co-traduccional debe involucrar un en trans evento como el reclutamiento de una proteína que interactúa en un mRNP traductor, o yuxtaposición de mRNP traductores. No obstante, se ha informado el ensamblaje co-traduccional de complejos de proteínas en eucariotas (Natan et al., 2017). En particular, estudios recientes de purificación por afinidad de complejos de proteínas bien caracterizados en levadura (Shiber et al., 2018) y células humanas (Kamenova et al., 2019) demuestran en muchos casos que las proteínas de traducción naciente interactúan fuertemente con proteínas con las que están destinadas a formar complejos con. Las interacciones de co-traducción se identificaron mediante un cuidadoso mapeo de dominios de interacción, microscopía de co-localización de ARNm-proteína y de manera crítica mediante la detección de ambos interactuantes de proteínas y sus moléculas de plantilla de ARNm, después de la purificación de una subunidad compleja de proteínas de interés. La combinación de la purificación de péptidos nacientes con el perfil de ribosomas (un método basado en secuenciación de ARN para mapear huellas de ARNm de ribosomas) permitió determinar con precisión dónde se ubicaban los ribosomas en un ARNm dado cuando sus péptidos nacientes interactuaban con una proteína de interés (Shiber et al., 2018). Las interacciones de proteínas cotraduccionales podrían ser unidireccionales (lo que significa que la proteína A y su ARNm se purifican mediante el aislamiento de la proteína B, pero no al revés) o bidireccionales. Esto dependía en gran medida de qué tan cerca estaba una proteína determinada y el dominio de interacción de la proteína C-terminal, ya que esto afecta el grado y el momento de exposición del dominio de interacción desde dentro del ribosoma de traducción (Shiber et al., 2018). El ensamblaje co-traduccional de complejos de proteínas fue importante para prevenir el plegamiento incorrecto de proteínas y aumentar la eficiencia del ensamblaje del complejo de proteínas (Shiber et al., 2018 Kamenova et al., 2019). Por tanto, el ensamblaje co-traduccional de proteínas en eucariotas puede ser un fenómeno común.

Generalmente se postulan dos modelos primarios para la interacción de proteínas co-traduccionales eucariotas. El primero establece que una proteína completamente sintetizada interactúa con una proteína de síntesis naciente, aunque no está claro si esto simplemente implica difusión aleatoria, co-localización o un proceso de reclutamiento impulsado por una chaperona activa. Un segundo modelo es que, particularmente en el caso de interacciones de proteínas cotraduccionales bidireccionales, la traducción de mRNP puede estar ligada entre sí. en trans por sus péptidos nacientes (Natan et al., 2017 Schwarz y Beck, 2019). Aunque los ejemplos discutidos anteriormente no distinguen entre estos modelos, los datos recientes, discutidos a continuación, agregan peso y una nueva perspectiva a ambas ideas y enfocan la atención en la importancia del ARNm como una molécula de andamiaje.

ARNm 3 & # x02032UTR Andamio de complejos proteicos

Los ARNm poseen tres dominios primarios: un 5 & # x02032 UTR, un marco de lectura abierto y un 3 & # x02032UTR. Si bien todos están implicados en la traducción, los ribosomas normalmente solo transitan a través de 5 & # x02032UTR y ORF, dejando 3 & # x02032UTR como regiones donde se pueden mantener interacciones más estables con proteínas y otras moléculas de ARN. Las secuencias 3 & # x02032UTR no están restringidas por la selección de una secuencia de proteína dada, son significativamente más largas que las 5 & # x02032UTR y aumentan de longitud con la complejidad del organismo (Pesole, 2002 Mayr, 2017). Por lo tanto, no es sorprendente que mientras las interacciones localizadas de 3 & # x02032UTR gobiernan claramente las funciones de ARNm individuales, tales como traducción, desintegración y localización (Wilkie et al., 2003 Andreassi y Riccio, 2009), se están descubriendo nuevas funciones para las 3 & # x02032UTR.

El trabajo pionero del laboratorio de Mayr demostró que los ARNm específicos 3 & # x02032UTR pueden anclar interacciones proteína-proteína en las que una proteína (o proteínas) unida a 3 & # x02032UTR interactúa con una proteína sintetizada naciente traducida en el propio ARNm, con importantes consecuencias fisiológicas (Figura 4) . El primer informe de este fenómeno (Berkovits y Mayr, 2015) se refería al gen CD47, que codifica una proteína capaz tanto de ER como de localización de la superficie celular en este último sitio, CD47 protege a las células de la fagocitosis por macrófagos (Oldenborg et al., 2000 Jaiswal et al., 2009). El uso alternativo de escisión y poliadenilación, un medio altamente regulado por el cual se generan isoformas alternativas de 3 & # x02032UTR (Sandberg et al., 2008 Mayr y Bartel, 2009 Lianoglou et al., 2013), da como resultado dos isoformas primarias de ARNm de CD47 3 & # x02032UTR: una isoforma corta (CD47-SU) y larga (CD47-LU). La eliminación de CD47-LU inhibe la localización de la superficie celular de la proteína CD47, independientemente de cualquier efecto de localización del ARNm, ya que los reporteros de ARNm de CD47 tanto cortos como largos se localizan en el RE. El análisis posterior de los sitios de unión de 3 & # x02032UTR, la eliminación de genes, la inmunoprecipitación de ARN y los enfoques de unión de ARNm-proteína determinaron que HuR probablemente se une al CD47-LU 3 & # x02032UTR en asociación con SET. A su vez, SET interactúa con la proteína CD47 recién traducida y la pequeña GTPasa RAC1 que localiza la membrana, que luego ayuda a la translocación de CD47 (y SET) a la membrana plasmática (Ten Klooster et al., 2007). Detrás de la importancia de este andamiaje 3 & # x02032UTR de un complejo de localización de proteínas, las células obligadas a expresar CD47-LU o CD47-SU de forma aislada mostraron diferencias significativas en la susceptibilidad fagocítica (células CD47-LU más resistentes) y la inducción de apoptosis después & # x003b3-irradiación (solo las células CD47-SU inducen la apoptosis) (Berkovits y Mayr, 2015).

ARNm como andamios de ARN citoplásmico. (A) Localización de proteínas: (1) La CD47-LU ARNm 3 & # x02032UTR recluta HuR y SET. (2) Dentro de los compartimentos de la membrana de TIS11B-ER (gránulos de TIS), se facilita la interacción de CD47 & # x02019s recién traducida con SET. (3) El reclutamiento de RAC1 por SET da como resultado la translocación posterior de CD47 a la membrana plasmática. (B) Conjunto de gránulos de mRNP: (1) El RPS28B Se presume que 3 & # x02032UTR recluta Edc3 antes de su interacción posterior, (2) con Rps28 recién traducido o recién traducido. (3) Dado que los ARNm de traducción se excluyen de los gránulos de ARNm, es probable que se requiera la escorrentía de ribosomas para una RPS28B-Complejo RNP de Edc3-Rps28 para ayudar a nuclear el ensamblaje del cuerpo P de la levadura.

El ensamblaje co-traduccional impulsado por 3 & # x02032UTR de complejos de proteínas probablemente ocurre en todos los eucariotas. Recientemente demostramos en levadura que un ARNm específico 3 & # x02032UTR actúa como un andamio de ARNm que promueve el ensamblaje de cuerpos P (Fernandes y Buchan, 2020), que son orgánulos citoplasmáticos sin membrana enriquecidos en ARNm que no se traducen. El ARNm en cuestión es RPS28B, uno de dos RPS28 paralogs (que codifican la proteína ribosómica S28) que tiene un 3 & # x02032UTR inusualmente largo (643 nts) y que alberga un elemento estructural de tallo-bucle que se une a Edc3 (He et al., 2014), una proteína involucrada en el ensamblaje del cuerpo P (Decker et al., 2007). Usando ensayos de interacción genética, microscopía e interacción de proteínas, demostramos que Edc3 reclutado por el RPS28B 3 & # x02032UTR se une a Rps28b recién traducido o recién traducido de una manera que depende de la RPS28 ORF y 3 & # x02032UTR están en cis ( Figura 4 ). La interacción resultante Edc3-Rps28, a su vez, es clave para el ensamblaje normal del cuerpo P.

Hasta donde sabemos, RPS28B es el primer caso de un ARNm específico implicado en el andamiaje de un gránulo de mRNP, y es probable que otras moléculas de ARN (como NEAT1 en paraspeckles) posean un potente potencial de andamiaje para los gránulos de RNP, en función de su valencia de interacción potencialmente alta (ya sea con proteínas o otras moléculas de ARN (Van Treeck y Parker, 2018 Van Treeck et al., 2018)) y la capacidad de existir en un estado no traductor. De hecho, datos recientes sostienen que los ARN largos mal traducidos se acumulan preferentemente dentro de los gránulos de RNP, como los cuerpos P y los gránulos de estrés (Khong et al., 2017). RPS28B también cumple con estos criterios (Ingolia, 2009), aunque quedan dudas sobre la naturaleza de la interacción de la proteína Rps28-Edc3 y si la regulación de RPS28B También pueden ocurrir tasas de traducción o abundancia que influyan en el ensamblaje del cuerpo P. Finalmente, nuestro trabajo demuestra que los ARNm de los parálogos de genes, además de las isoformas de transcripción de un solo gen, representan otro medio para permitir la regulación basada en ARNm del ensamblaje del complejo macromolecular. Dado que el 50 & # x0201380% de todos los genes humanos generan ARNm con 3 & # x02032UTR alternativos (Lianoglou et al., 2013), parece factible un papel amplio para los 3 & # x02032UTR en el ensamblaje del complejo proteico co-traduccional de andamiaje (Mayr, 2019).

La co-localización del ARNm puede ayudar a las interacciones de proteínas co-traduccionales

Si bien la localización de ARNm facilita claramente la localización de proteínas (Holt y Bullock, 2009), la colocalización de ARNm en compartimentos celulares específicos también puede ayudar a las interacciones de proteínas co-traduccionales y / o al ensamblaje de complejos de proteínas. Tal mecanismo es una explicación atractiva para los mecanismos de ensamblaje de proteínas de co-traducción discutidos anteriormente. Curiosamente, algunos estudios sugieren la existencia de & # x0201ctranslation factories, & # x0201d donde los ARNm funcionalmente relacionados se concentran espacialmente en compartimentos celulares.

En las células humanas, varios ARNm que codifican proteínas de membrana, incluido CD47-LU (pero no CD47-SU), albergan sitios de unión para una RBP llamada TIS11B. Estos ARNm, así como SET y HuR, se fusionan con TIS11B en una estructura reticular entrelazada con ER denominada gránulos de TIS, que se basan en la expresión de TIS11B para su ensamblaje (Ma y Mayr, 2018). Es importante destacar que la expresión de TIS11 y la formación de gránulos de TIS promueven la interacción de SET con CD47 y la localización de CD47 en la membrana plasmática. Esto puede reflejar una mayor retención de ARNm de CD47 y SET dentro del gránulo de TIS basado en la recuperación de fluorescencia después de los datos de fotoblanqueo, aumentando así la probabilidad de interacción de CD47 co-traduccional con SET (Ma y Mayr, 2018).

En la levadura, los ARNm glicolíticos específicos (Lui et al., 2014) y los ARNm de factores de traducción selectos (Pizzinga et al., 2019) se localizan conjuntamente en distintos gránulos traduccionalmente activos, al menos algunos de los cuales codifican proteínas que forman colectivamente complejos de múltiples subunidades. . Finalmente, varios ARNm que codifican componentes del complejo Arp2 / Arp3, un complejo regulador del citoesqueleto de actina, se colocalizan y al menos en algunos casos se traducen en el borde de ataque de los fibroblastos (Mingle et al., 2005 Willett et al., 2013 ). Sin embargo, la prueba directa de si la co-localización del ARNm sirve efectivamente como un análogo eucariota de un mecanismo de ensamblaje de complejo proteico basado en operones procariotas sigue siendo una pregunta para futuros estudios.


ARNs de emparejamiento de bases transcodificados

En contraste con el sRNA codificado en cis, los sRNA de emparejamiento de bases codificados en trans no están físicamente ligados a su objetivo de mRNA y la formación de dúplex de RNA está mediada por interacciones cortas de RNA imperfectas (Figura 1C). La función de muchos de los ARNs de emparejamiento de bases codificados en trans depende de la proteína de unión al ARN Hfq, que se cree que aumenta la probabilidad de una interacción productiva entre el ARNc y su objetivo (Waters y Storz, 2009). Esto contrasta con el ARNs de emparejamiento de bases codificado en cis que generalmente no requieren la participación de un acompañante de ARN (p. Ej., Hfq) para unirse a su ARNm diana (Brantl, 2007).

En patógenos bacterianos, la deleción del hfq gen a menudo conduce a una reducción de la virulencia, como se observó para E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, y Listeria (Revisado en Chao y Vogel, 2010). Por ejemplo, en E. coli, Se demostró que Hfq regula el locus de borramiento de enterocitos (LEE) que codifica un sistema de secreción de tipo III (TTSS Hansen y Kaper, 2009 Shakhnovich et al., 2009). En el patógeno intracelular Salmonella enterica serovar Typhimurium, Hfq es necesario para un crecimiento óptimo en células epiteliales y macrófagos (Sittka et al., 2007). Burkholderia cenocepacia codifica dos homólogos de Hfq y ambos son necesarios para una resistencia óptima al estrés y la virulencia (Ramos et al., 2011). Supresión del hfq gen de Staphylococcus aureus no tiene ningún efecto sobre el metabolismo pero reduce la virulencia (Bohn et al., 2007 Liu et al., 2010). Sin embargo, en Neisseria gonorrhoeae, eliminación de hfq conduce solo a una débil reducción de la virulencia (Dietrich et al., 2009). Además, en algunas bacterias, la Hfq es necesaria para la función de algunos ARNs, pero es prescindible para otras. Por ejemplo, en V. cholerae, Hfq es necesario para el control de los sistemas de detección de quórum por los sRNAs Qrr1 & # x02013Qrr4, pero prescindible para la represión de ompA por VrrA (Lenz et al., 2004 Song et al., 2008). Es de destacar que Helicobacter pylori no codifica un homólogo de Hfq pero aún expresa cientos de ARNs (Sharma et al., 2010). Esto sugiere que en algunas especies bacterianas, la función mediada por Hfq no es necesaria para la regulación génica mediada por sRNA o que una proteína aún desconocida podría llevar a cabo una función similar. Tras la identificación de todo el genoma de ARNs de unión a Hfq, se postuló que incluso en E. coli, es posible que algunos ARNs de emparejamiento de bases no se unan o no utilicen Hfq (Zhang et al., 2003). Una revisión cuidadosa de la literatura relacionada con Hfq condujo a Jousselin et al. (2009) para postular que la necesidad de Hfq en la interacción mRNA & # x02013sRNA está relacionada con varios factores. Primero, cuanto mayor es el contenido general de GC del genoma bacteriano, más probable es que se requiera Hfq y Hfq parece ser prescindible en bacterias cuyos genomas muestran un valor de GC bajo, como S. aureus (32% GC). En segundo lugar, la Hfq es prescindible cuando la interacción sRNA & # x02013mRNA está mediada por un emparejamiento largo (& # x0003E30) e ininterrumpido. En tercer lugar, observaron una correlación entre un requisito de Hfq y la longitud de extensión C-terminal de Hfq, que forma una superficie de interacción del ARNm. Las proteínas Hfq que tienen un extremo C-terminal corto tienden a encontrarse en bacterias en las que Hfq es prescindible.

En L. pneumophila, eliminación del hfq El gen afecta la duración de la fase de retraso después de la inoculación en caldo fresco (McNealy et al., 2005). Además, el L. pneumophila hfq mutante muestra una tasa de crecimiento reducida en medio químicamente definido que contiene bajas concentraciones de hierro y una reducción en la expresión del regulador de absorción férrico (piel). En E. coli, el RyhB sRNA regula negativamente la expresión de piel de forma dependiente de Hfq (Vecerek et al., 2007). además, el L. pneumophila hfq mutante muestra una pequeña reducción en el crecimiento intracelular (McNealy et al., 2005). El efecto algo limitado de eliminar el hfq gen en L. pneumophila fenotipos sugiere que Hfq no es crítico para las interacciones sRNA & # x02013mRNA en este organismo. El contenido de GC del L. pneumophila El genoma es bajo (38%) y la alineación de su secuencia de proteína Hfq con otros homólogos (Figura 2) revela que la región C-terminal es corta y comparable a la longitud de la V. cholerae Hfq que no es esencial para todas las interacciones de ARNm & # x02013sARN. Según los postulados de Jousselin et al. (2009), se podría plantear la hipótesis de que la Hfq no será necesaria para todas las interacciones sRNA & # x02013mRNA en L. pneumophila.

Figura 2. Alineación de proteínas Hfq de E. coli (Eco), V. cholerae (Vch), L. pneumophila (Lpn) y S. aureus (Sau) se realizó con ClustalW2 (Chenna et al., 2003).

No obstante, se puede especular que en L. pneumophila, los ARNs de apareamiento de bases que actúan a través de Hfq pueden regular la adquisición de hierro, las funciones relacionadas con la virulencia y posiblemente también otros sistemas, aunque la función de Hfq no sería esencial para estos. Perfiles de expresión de un hfq-deficiente L. pneumophila La cepa arrojaría luz sobre la importancia de la Hfq en la regulación genética y sería de gran ayuda para identificar los fenotipos que podrían verse afectados por ella. Se utilizó un enfoque similar para otras bacterias como E. coli (Zhang et al., 2003), Typhimurium (Sittka et al., 2008), B. cenocepacia (Ramos et al., 2011), Pseudomonas aeruginosa (Sonnleitner et al., 2006) y N. gonorrhoeae (Dietrich et al., 2009). Además, la inmunoprecipitación de Hfq con identificación posterior de ARNs unidos mediante secuenciación enzimática de ARN (Christiansen et al., 2006), microarreglos de mosaico (Zhang et al., 2003) o secuenciación profunda (Sittka et al., 2008) arrojar luz sobre las especies de ARNm afectadas por Hfq y sobre los ARNs potenciales cuyas funciones son al menos parcialmente dependientes de Hfq. Windbichler y col. (2008) han utilizado un procedimiento de cromatografía de afinidad para identificar proteínas de unión a ARN en E. coli. Brevemente, etiquetaron varios ARNs conocidos con un aptámero de ARN de unión a estreptomicina, lo que les permitió unirse a una columna recubierta de estreptomicina, que luego se utilizó para capturar proteínas de unión a ARN de extractos celulares. Descubrieron que tres proteínas se unían consistentemente a una variedad de secuencias de ARNs: Hfq, subunidad RNAP & # x003B2 y la subunidad ribosómica pequeña S1. Además, demostraron que proteínas específicas podrían interactuar con un ARNs específico, dependiendo de su secuencia y estructura secundaria. Por lo tanto, es necesaria una búsqueda de proteínas de unión de ARNs para completar el panorama regulador mediado por ARNs y para comprender completamente el alcance de su impacto en la regulación de las funciones celulares.

En L. pneumophila, se han identificado varios candidatos de ARNs de emparejamiento de bases transcodificados, pero se necesitan estudios mecanicistas para evaluar su modo de acción y validarlos como ARNs de emparejamiento de bases auténticos (Tabla 1). Se identificaron cinco ARN intergénicos en función de la predicción por computadora utilizando el software sRNA Predict (Faucher et al., 2010). Al buscar terminadores independientes de Rho en regiones intergénicas precedidas por una secuencia conservada en otras L. pneumophila cepas, se predijeron 143 moléculas de ARNc. Usando una micromatriz hecha a medida, se controló la expresión de 101 de estos ARNs predichos durante el crecimiento en una variedad de condiciones. Este enfoque de dos pasos condujo a la identificación de 12 moléculas de sRNA que se expresaron activamente, incluido el RNA 6S, seis 3 & # x02032UTR y cinco sRNA que se transcriben de forma independiente (Faucher et al., 2010 Tabla 1). En este punto, las funciones de los cinco ARNs identificados no están claras. Curiosamente, la expresión de LprA durante el crecimiento exponencial depende de OxyR pero depende de RpoS durante la fase post-exponencial (Figura 3). Dado que RpoS es un importante regulador de la virulencia, es tentador especular que LprA podría ser parte de su cascada reguladora y desempeña un papel en la expresión de factores de virulencia. Independientemente de la fase de crecimiento, la presencia de H2O2 induce su expresión, lo que sugiere que LprA responde al estrés oxidativo. Esto es similar al E. coli sRNA OxyS, que forma parte de la respuesta al estrés oxidativo y reduce sus efectos mutagénicos (Altuvia et al., 1997).

Figura 3. Modelo de las redes reguladoras que involucran ARNs en L. pneumophila. Las líneas muestran la interacción entre los jugadores: flecha, barra T de activación, línea punteada de represión, interacción putativa o predicha. Consulte el texto para obtener más detalles.

La secuenciación de RNA identificó 38 moléculas de sRNA codificadas en regiones intergénicas que podrían considerarse como potenciales sRNA codificados en trans (Weissenmayer et al., 2011 Tabla 1). De estos, se predijo que nueve serían funcionales basándose en la estabilidad de sus estructuras secundarias previstas a 37 & # x000B0C. La estructura predicha de un ARNs (Lpr0010) fue menos estable que 1000 secuencias permutadas aleatoriamente de la misma longitud y composición de base a 20 o 37 & # x000B0C, lo que sugiere que está bajo presión evolutiva para formar una estructura secundaria inestable. La relevancia biológica de esto no se exploró más a fondo, pero se puede plantear la hipótesis de que la estructura solo es estable a bajas temperaturas (menos de 20 & # x000B0C) y que podría ser parte de una respuesta celular a las bajas temperaturas. Curiosamente, se identificaron cinco pares de sRNA, para los cuales se transcriben dos sRNA distintos en antisentido entre sí (Weissenmayer et al., 2011). En E. coli, los ARNs RyeB y SraC están codificados opuestos entre sí y RyeB es completamente complementario al segmento SraC más largo (Vogel et al., 2003). El tamaño de SraC es & # x02248270 nt, pero cuando RyeB está presente, también se detecta una banda más corta (& # x02248150 nt). Esta reducción de tamaño parece depender de la RNasa III, lo que sugiere que RyeB media la degradación de SraC. Para los pares de sRNA identificados en Legionella, un ARNs puede actuar como un regulador negativo del otro, secuestrándolo de manera eficiente mediante el emparejamiento de bases extendido y potencialmente dirigiéndolo a la degradación. Además, el ARNm también puede regular los ARNs. Este mecanismo, denominado trampa-ARN, fue descrito para el ARNm de MicM que induce la degradación del ARNm de la porina YbfM. los chb El ARNm policistrónico contiene una secuencia complementaria a MicM y expresión de la chb El operón conduce a la hibridación y degradación de MicM, lo que resulta en la estabilización del ybfM ARNm (Figueroa-Bossi et al., 2009 Overgaard et al., 2009). Nuevamente, se necesita trabajo adicional para comprender las funciones reguladoras de Legionella ARNs de emparejamiento de bases transcodificado.

Hay varios ARNs de apareamiento de bases codificados en otros genomas bacterianos que se sabe que afectan la virulencia. A continuación se proporcionan algunos ejemplos que podrían ser relevantes en el contexto de L. pneumophila crecimiento intracelular. Un patógeno intracelular para el que se ha realizado y se está realizando una amplia identificación y caracterización de ARNs es Salmonela. En esta especie, la expresión de la proteína de la membrana externa (OMP) está regulada por una red de ARNs. Uno de ellos, InvR, está codificado en el Salmonela isla de patogenicidad-1, adquirida por transferencia horizontal de genes (HGT) y que codifica el TTSS responsable de la invasión de enterocitos (Pfeiffer et al., 2007). La expresión de este sRNA depende de HilD, un regulador clave de la expresión de TTSS. Cuando se expresa el TTSS, InvR actúa como un regulador negativo de la síntesis de OmpD, uno de los OMP más abundantes en Typhimurium. La evidencia indirecta sugiere que la represión de OmpD podría estabilizar la membrana en el contexto de la expresión de TTSS, permitiendo la translocación exitosa de efectores bacterianos (Vogel, 2009). Por lo tanto, se cree que InvR ayudó al establecimiento de las secuencias de TTSS después de HGT al reprimir la expresión de OMP que eran incompatibles con la ventaja de virulencia proporcionada por TTSS (Vogel, 2009). Por tanto, es tentador especular que existen mecanismos similares en L. pneumophila para reprimir OMP durante la expresión del sistema Icm / Dot, el sistema de secreción Tipo IVA (lvr / lvh) o el sistema conjugativo Tra. Sin embargo, hasta la fecha, no se han identificado ARNs codificados en trans en las proximidades de estos sistemas, pero, como se describió anteriormente, un ARNs codificado en cis es antisentido para lvrA (lpg1259).

El sRNA VrrA de V. cholerae es parte de la vía de respuesta al estrés de la membrana mediada por & # x003C3 E y los objetivos ompa ARNm, presumiblemente para limitar la síntesis de OMP (Song et al., 2008). Supresión de vrrA conduce a un aumento en la síntesis de vesículas de la membrana externa que se sabe que están involucradas en el suministro de factores de virulencia a las células huésped (Mashburn-Warren y Whiteley, 2006). Además, VrrA parece regular negativamente la expresión de la molécula de adhesión Tcp y, por tanto, afecta la colonización intestinal (Song et al., 2008). Existe una similitud estructural entre VrrA y LprD de L. pneumophila y es tentador especular sobre el papel de LprD en la regulación de la síntesis de OMP. Sin embargo, las comparaciones de estructuras de ARNs transcodificados han sido de ayuda limitada para predecir la función o los objetivos, y se debe tomar una estrategia experimental para determinar si LprD regula la síntesis de OMP.

El sistema de quórum de V. cholerae comprende cuatro ARNs redundantes denominados Qrr1 & # x02013Qrr4 y dos moléculas de señalización, el diéster de borato de furanosilo (AI-2) y los Cq de & # x003B1-hidroxicetona (Lenz et al., 2004). A baja densidad celular, el sistema regula positivamente la expresión de Qrr1 & # x02013Qrr4, que desestabilizan el ARNm de HapR, un regulador negativo de la virulencia. Por lo tanto, a baja densidad celular, HapR se degrada permitiendo la expresión de rasgos de virulencia. L. pneumophila también posee un supuesto sistema de quórum, basado únicamente en la presencia de & # x003B1-hidroxicetona Lqs y el sistema de dos componentes (TCS) LqsR / LqsS (Tiaden et al., 2007 Spirig et al., 2008). Además de la ausencia de señalización AI-2 en L. pneumophila la arquitectura del sistema de quórum de L. pneumophila y V. cholerae son bastante similares (Tiaden et al., 2010). Sin embargo, en L. pneumophila hasta ahora no se ha implicado ningún ARNs en este sistema regulador. Después de la secuenciación de ARN, se encontró que dos ARNs (Lpr0001 y Lpr0069) tenían una homología sustancial tanto en la secuencia como en los niveles de estructura secundaria, lo que recuerda a los ARNs de Qrr1 & # x02013Qrr4 (Weissenmayer et al., 2011). Una búsqueda de secuencias homólogas en todo el genoma reveló 20 copias más de estos ARNs, una (Lpr0049) siendo parcialmente antisentido para lpg2142, que codifica un ORF putativo. La estructura de consenso de estos ARNs es un vástago largo & # x02013 bucle con dos protuberancias centrales compuestas por & # x0223C25 nt y dos pequeñas horquillas que salen de cada lado del vástago central 20 nt antes del bucle (Weissenmayer et al., 2011). Muchas de estas secuencias se encontraron en otros Legionella cepas también, a menudo en la misma configuración, lo que indica que están conservadas evolutivamente y es probable que desempeñen un papel beneficioso. Además, tanto el sistema Lqs como las secuencias de sRNA homólogas están ausentes en L. longbeachae. Estas observaciones son solo sugerentes y se necesitan pruebas experimentales para vincular el sistema de detección de quórum Lqs con este grupo de secuencias de ARNc homólogas. Cabe señalar que se necesitaba la eliminación de los cuatro ARNs de Qrr para ver un fenotipo en el sistema de detección de quórum (Lenz et al., 2004). Dado que solo Lpr0001 y Lpr0069 parecen expresarse a buen nivel, podría ser informativo generar un doble lpr0001 / lpr0069 mutante y controlar su efecto sobre un fenotipo relacionado con la densidad de población.

Aunque la gran mayoría de ARNs de emparejamiento de bases no codifican proteínas, hay al menos dos ejemplos en los que lo hacen. En E. coli los sgrS El gen codifica un sRNA, SgrS, y una pequeña proteína, SgrT, que juntas regulan la captación de glucosa mediante diferentes estrategias (Wadler y Vanderpool, 2007). En S. aureus, el ARNs ARN III se dirige a los factores de virulencia y funciona como un regulador clave de la virulencia, pero también codifica una hemolisina de 26 aminoácidos de longitud (Boisset et al., 2007). Por lo tanto, se debe tener en cuenta que los ARNs no son necesariamente no codificantes. Recientemente identificamos dos pequeñas moléculas de ARN, LstA y LstB, que se prevé que codifiquen proteínas pequeñas con motivos transmembrana (Faucher et al., 2010). Debido a que las proteínas pequeñas son difíciles de predecir con precisión a partir de secuencias genómicas, la búsqueda de moléculas de ARN pequeñas también tiene el beneficio potencial de llenar los vacíos de la anotación genómica al identificar también proteínas pequeñas putativas y corregir errores en la anotación del genoma.


Caracterización del genoma mitocondrial de Diphyllobothrium latum (Cestoda: Pseudophyllidea) - implicaciones para la filogenia de eucestodes

Se determinó la secuencia completa de nucleótidos del genoma mitocondrial para la tenia del pez Diphyllobothrium latum. Este genoma tiene 13608 pb de longitud y codifica 12 genes que codifican proteínas (pero carece de atp8), 22 genes de ARN de transferencia (ARNt) y 2 ARN ribosómico (ARNr), correspondientes al complemento genético encontrado hasta ahora en otras mitocondrias de gusanos planos ( mt) ADN. La disposición de genes de este cestodo pseudofilidiano es la misma que la de los 6 cestodos ciclofilidianos caracterizados hasta la fecha, con solo una variación menor en la estructura entre estos otros genomas, la posición relativa de trnS2 y trnL1 se cambia en Hymenolepis diminuta. Los análisis filogenéticos de las secuencias de aminoácidos concatenados para 12 genes que codifican proteínas de todos los ADNmt de cestodos completos confirmaron evaluaciones taxonómicas y filogenéticas previas, siendo D. latum un taxón hermano de los ciclofilideos. El alto soporte nodal y la congruencia filogenética entre diferentes métodos sugieren que los genomas mt pueden ser útiles para resolver las relaciones ordinales dentro de los cestodos. Todas las especies de Diphyllobothrium infectan a los vertebrados que comen pescado, y D. latum comúnmente infecta a los humanos a través de la ingestión de pescado crudo, mal cocido o en escabeche. El genoma mitocondrial completo proporciona una gran cantidad de marcadores genéticos que podrían ser útiles para identificar diferentes etapas del ciclo de vida y para investigar la genética, ecología y epidemiología de su población.


C.Los ARN pequeños: miARN y ARNip en eucariotas

Los micro ARN (miARN) y los ARN de interferencia pequeños (ARNip) se encuentran en C. elegans, un pequeño nematodo (lombriz intestinal) que rápidamente se convirtió en modelo para estudios de biología y desarrollo celular y molecular. Las atracciones particulares C. elegans son que (a) su genoma tiene

21.700 genes, comparables a los

¡25.000 genes en un genoma humano! (b) utiliza los productos de estos genes para producir un gusano adulto que consta de solo 1031 células organizadas en todos los órganos principales que se encuentran en los organismos superiores (c) ¡Es posible rastrear los orígenes embrionarios de cada una de las células de su cuerpo! C. elegans se ilustra a continuación.

1. ARN interferente pequeño (ARNip)

ARNip se encontró por primera vez en plantas, así como en C. elegans. Sin embargo, los ARNip (y miARN) son comunes en muchos organismos superiores. Los ARNip fueron llamados así porque interferir con la función de otros ARN ajenos a la célula u organismo. Su acción fue apodada Interferencia de ARN (ARNi). Por su descubrimiento de los ARNip, A. Z. Fire y C. C. Mello compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2006. La acción del ARNip que se dirige al ADN extraño se ilustra a continuación.

Cuando las células reconocen los ARN extraños de doble hebra (p. Ej., Algunos genomas de ARN víricos) como extraños, el JUGADOR a nucleasa los hidroliza. Los productos de hidrólisis de doble hebra corta resultantes (el ARNip) combinar con RNAi Iinducido Sencubrimiento Complex, o RISC proteínas. los antisentido hebra de ARNip en el resultado ARNip-RISC El complejo se une a regiones complementarias de ARN extraños, dirigiéndolos a su degradación. El uso celular de RISC para controlar la expresión génica de esta manera puede derivarse del uso de proteínas RISC por miARN como parte de un mecanismo de defensa celular, que se discutirá a continuación.

Se han utilizado ARNip de diseño personalizado para deshabilitar la expresión de genes específicos con el fin de estudiar su función. en vivo y in vitro. Se están investigando tanto los ARNip como los miARN como posibles herramientas terapéuticas para interferir con los ARN cuya expresión conduce al cáncer u otras enfermedades.

Para ver un ejemplo, vea un video de Youtube de resultados inesperados de un experimento de RNAi en este enlace. En el experimento descrito, se utilizó ARNi para bloquear la expresión embrionaria de la ortodentícula (odt) gen que normalmente se requiere para el crecimiento de cuernos en un escarabajo pelotero. El efecto de esto mutación knock-out fue, como se esperaba, para evitar el crecimiento de los cuernos. Sin embargo, lo que fue inesperado fue el desarrollo de un ojo en el medio de la cabeza del escarabajo y rsquos (& lsquothird eye & rsquo en la micrografía).

El tercer ojo no solo parece un ojo, sino que también es funcional. Esto se demostró al prevenir el desarrollo normal de los ojos en odt-knockout mutantes. ¡El tercer ojo apareció y hellip, y respondió a la luz! Tenga en cuenta que se trataba de un escarabajo con un tercer ojo, no Drosophila! Para citar a Justin Kumar de la Universidad de Indiana, quien, aunque no participó en la investigación, afirmó que & ldquo & helliplessons aprendieron de Drosophila Puede que no sea tan aplicable en general como yo u otros Drosofilistas, me gustaría creer & hellip La capacidad de usar RNAi en sistemas de modelos no tradicionales es un gran avance que probablemente conducirá a una visión más equilibrada del desarrollo. & rdquo

2. Micro ARN (miARN)

los miARN se dirigen a elementos no deseados endógeno ARN celulares para degradación. Se transcriben a partir de genes que ahora se sabe que están ampliamente distribuidos en eucariotas. La ruta desde la transcripción del pre-miRNA a través del procesamiento y la degradación del mRNA objetivo se ilustra en la página siguiente.

A medida que se transcriben, los pre-miARN se pliegan en una estructura de tallo-bucle que se pierde durante el procesamiento citoplasmático. Al igual que los ARNsi, los miARN maduros se combinan con proteínas RISC. los RISC El complejo proteína-miRNA se dirige a mRNA viejos o que ya no se necesitan o mRNA dañados durante la transcripción.

Se estima que 250 miARN en humanos pueden ser suficientes para unir H a diversos ARN diana, solo los blancos con fuerte complementariedad con un complejo de proteína RISC-miARN se degradarán.


Métodos

Para buscar secuencias intergénicas conservadas, NCBI / BLAST BLAST Assembled Genomes http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi[56] y BLAST con genomas microbianos http: //www.ncbi.nlm.nih. Se utilizaron gov / sutils / genom_table.cgi [57]. Blast con genomas microbianos utilizó un valor de 10 para esperar y el filtro predeterminado. Las búsquedas de blastocitos de nucleótidos se optimizaron tanto para megablasto de secuencias muy similares como para megablasto no contiguo. Se utilizaron los parámetros predeterminados. Para megablast de secuencia similar, los parámetros fueron: secuencias diana máximas, 100 ajustadas automáticamente para secuencias cortas esperadas, tamaño de 10 palabras, 28. Puntuaciones de coincidencia / desajuste discontinuas, costos de brecha 1, -2, filtro lineal, regiones de baja complejidad. Megablast discontinuo: los mismos parámetros que los de megablast de secuencia similar con el tamaño de la palabra de excepción, 11 puntuaciones de coincidencia / desajuste, 2, costos de brecha -3, existencia: 5 extensión: 2.

El servidor suizo de Bioinformática SIB ExPASy Blast [46] se utilizó para encontrar homologías de proteínas. El programa de explosión y la base de datos utilizados fueron: blastp - consulta contra la base de conocimientos de UniProt (Swiss-Prot + TrEMBL) y se utilizaron los parámetros predeterminados que se muestran en "Opciones". La base de datos era la base de datos completa.

Las búsquedas iniciales de secuencias repetidas y motivos de ARN se realizaron "caminando" secuencias intergénicas del plásmido lp28 de B. afzelii Pko. Además, varias regiones que contienen secuelas intergénicas relativamente grandes de B. burgdorferi B31 y Borrelia garinii PB también se escanearon plásmidos.

Las regiones intergénicas se escanearon a 200 pb cada vez en busca de secuencias conservadas o parcialmente. Estas secuencias se modelaron luego para bucles de tallo de ARN conservados. Se hicieron cortes en las regiones 5 'y 3' de un determinado bucle (s) de tallo cuando las secuencias adicionales no proporcionaron bucles de tallo conservados. Las secuencias de transcripción inversa así como las secuencias superpuestas en las uniones de 200 pb también se modelaron por estructura. Se encontraron secuencias repetidas que mostraban estructuras de tallo-bucle, pero estas estructuras tampoco se encontraron conservadas en secuencias homólogas en otros Borrelia especies, o la identidad de secuencia nt era demasiado alta y, por tanto, las estructuras no mostraban cambios de pares de bases. Estos fueron descartados. Los criterios para la identificación potencial de ARN fueron los siguientes: 1) presencia de la secuencia en tres o más regiones plásmidas diferentes y / o dos o más Borrelia especies, 2) presencia de un bucle de tallo conservado con al menos 9 pares de bases contiguas, 3) dos o más cambios de base compensatorios que mantienen un tallo, 4) en algunos casos, la presencia de posiciones conservadas en bucle o abultadas.

El modelado de la estructura secundaria del ARN de las secuencias nt repetidas se realizó con el mfold de Zuker y Turner, versión 3.2 [28, 29]. Los parámetros utilizados fueron: parámetro de ventana predeterminado, tamaño máximo de bucle interior / abombado = 30, asimetría máxima de un bucle interior / abultado = 30 y sin límite en la distancia máxima entre bases emparejadas.


Ver el vídeo: ADN - ESTRUCTURA Y FUNCIÓN: DOCUMENTAL COMPLETO. Osgam (Noviembre 2022).