Información

17.3: Canales de voltaje y ligando en neurotransmisión - Biología

17.3: Canales de voltaje y ligando en neurotransmisión - Biología


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

A. Medición del flujo de iones y el potencial de la membrana

Cuando los neurotransmisores se unen a sus receptores, canales de iones en las neuronas que responden o las células musculares se abren. La afluencia resultante de Na+ iones interrumpe el potencial de reposo de la célula objetivo. El efecto solo es transitorio si el potencial de membrana permanece negativo. Sin embargo, si entran suficientes iones de Na + en la célula, la membrana se despolariza. Si la célula experimenta hiperpolarización, un localizado inversión de la polaridad normal de la membrana (digamos de –70 mV a + 65mV o más) generará un potencial de acción. Este potencial de acción viajará como una corriente a lo largo de la membrana de la célula neural o muscular, desencadenando finalmente una respuesta fisiológica, por ejemplo, la excitación de la siguiente célula nerviosa en una vía neuronal o la contracción de la célula muscular. los abrazadera de parche El dispositivo detecta un flujo de iones específico y cualquier cambio resultante en la diferencia de potencial a través de la membrana. Los principios de la medición de pinza de parche se ilustran a continuación.

En el ejemplo anterior, cerrar el interruptor de la fuente de alimentación envía una carga eléctrica a la celda, abriendo canal iónico controlado por voltaje. En este caso, un sensor de potasio en el dispositivo detecta el flujo de iones K + a través del canal y fuera de la celda. Al mismo tiempo, un voltímetro registra el cambio resultante en el potencial de membrana.

Además de los canales iónicos activados por voltaje, el dispositivo de pinza de parche puede medir el flujo de iones a través de canales iónicos activados por ligando y Canales iónicos con compuerta mecánica.

Los canales anteriores son puertas de iones receptores que se abren cuando se unen a una molécula efectora. Canales iónicos activados mecánicamente detectar fisico presión o estrés que resultan en una deformación local de la membrana, abriendo el canal.

Finalmente, las células mantienen una alta concentración intracelular de K+ iones, causando K+ iones para escapar lentamente de la célula, un fenómeno detectable por un parche-abrazadera. La presencia de iones negativos (Cliones, iones orgánicos) dentro de una celda limita la fuga. Esto crea el interior electronegativo de una célula en relación con el exterior de la célula, es decir, el potencial de reposo a través de su membrana plasmática. La técnica del parche-clamp se ha utilizado para correlacionar el flujo de iones y los cambios en el potencial de membrana cuando se activa una neurona, lo que provoca un potencial de acción en una célula que responde.

Esta correlación se describe en la página siguiente. En la ilustración, siga la apertura y el cierre de los canales iónicos y el flujo de iones. Un potencial de acción (de hecho, cualquier cambio del potencial de reposo) resulta de la difusión facilitada de iones específicos dentro o fuera de la célula a través de canales iónicos con compuerta (verde, arriba) que deben abrirse y cerrarse en secuencia. El comportamiento de dos diferentes canales iónicos activados por voltaje se ilustran en el gráfico. La estimulación eléctrica abre Na+ canales. N / A+ los iones se precipitan hacia la célula, reduciendo el potencial de membrana del estado de reposo a cero, o incluso haciendo que el citoplasma sea más positivo que el líquido extracelular. Si la inversión de polaridad es lo suficientemente alta, un K voltaje+ se abre y los iones de potasio se precipitan hacia la célula, restaurando el potencial de reposo de la célula.

Una célula puede continuar respondiendo a estímulos con potenciales de acción mientras haya suficiente Na + fuera de la célula y K+ dentro de la celda. Mientras que el transporte activo de Na+ y K+ no es necesario para restablecer el potencial de reposo, eventualmente será necesario restablecer el equilibrio de los dos iones en la célula. Si una célula nerviosa o muscular se dispara varias veces (o incluso si solo pierde iones), la [K+] dentro de la celda y el [Na+] fuera de la célula descendería a un punto en el que la célula no puede generar un potencial de acción cuando se estimula. En última instancia, es el papel del Na dependiente de ATP+/ K+ bombas para restaurar el Na apropiado+: K + equilibrio a través de la membrana celular que responde. Como hemos visto, cada ciclo de bombeo intercambia 3 Na+ iones del espacio intracelular para 2 K+ iones del espacio extracelular. La bomba tiene dos efectos:

  • Restaura Na+ concentraciones en el espacio extracelular en relación con el citoplasma.
  • Restaura K+ concentraciones en el citoplasma en relación con el espacio extracelular.

Junto con las mayores concentraciones de iones negativos en el citosol, el intercambio desigual de iones de Na + por K + mantiene el potencial de reposo de la célula a largo plazo y asegura que las células nerviosas y musculares permanezcan excitables. A continuación, analizaremos más de cerca el papel de ambos controlado por ligando y dependiente de voltaje canales iónicos en la neurotransmisión.

B. Canales de iones en la neurotransmisión

Los potenciales de acción dan como resultado una apertura y cierre ordenado y secuencial de Voltaje- y controlado por ligando canales a lo largo del axón neuronal. En el enlace a continuación, puede ver el ciclo secuencial de canales activados por voltaje que propaga un potencial de acción localizado (despolarización de la membrana) a lo largo de un axón hacia una sinapsis.

Cuando una despolarización propagada alcanza una sinapsis, los canales iónicos con compuerta se abren o se cierran en la neurona y la célula que responde. La cooperación de los canales activados por voltaje y ligando en una unión neuromuscular se ilustra a continuación.

Como puede ver en la ilustración, después de que se dispara una neurona, un impulso eléctrico (una región en movimiento de hiperpolarización) viaja por el axón hasta la terminación nerviosa. En la terminación nerviosa, la diferencia de carga viajera (potencial eléctrico) a través de la membrana celular estimula una concentración de Ca ++ específica. canal controlado por voltaje abrir. Los iones de Ca ++ luego fluyen hacia la célula porque se encuentran en concentraciones más altas en el hendidura sináptica que en el citoplasma.

La CA2+ Los iones en la célula hacen que las vesículas sinápticas se fusionen con la membrana en la terminación nerviosa, liberando neurotransmisores en la hendidura sináptica. Luego, los neurotransmisores se unen a un receptor en la membrana plasmática de la célula que responde. Este receptor es un canal controlado por ligando (también llamado canal con compuerta química). Tras la unión del ligando del neurotransmisor, el canal se abre. La rápida difusión de iones de Na + en la célula crea un potencial de acción que conduce a la respuesta celular, en este caso, la contracción muscular. Ya hemos visto que los canales de K + participan en la restauración del potencial de membrana después de un potencial de acción, y el papel de la bomba de sodio / potasio en la restauración del Na celular.+/ K+ equilibrio.


Fases del potencial de acción y papel # 038 de los canales iónicos cerrados

1. Todas las células tienen un potencial de membrana; sin embargo, solo ciertos tipos de células, incluidas las neuronas y las células musculares, tienen la capacidad de generar cambios en sus potenciales de membrana. En conjunto, estas células se denominan células excitables. El potencial de membrana de una célula excitable en un estado de reposo (no excitado) se llama potencial de reposo, y un cambio en el potencial de reposo puede resultar en un impulso eléctrico activo.

2 Las neuronas tienen canales iónicos especiales, llamados canales iónicos con compuerta, que

Espere a que la célula cambie su potencial de membrana en respuesta a los estímulos que recibe la célula. Si el estímulo abre un canal de potasio, se producirá un aumento en la salida de potasio y el potencial de membrana se volverá más negativo. Tal aumento en el gradiente eléctrico a través de la membrana se llama hiperpolarización. Si el canal abierto por el estímulo es un canal de sodio, se producirá un aumento de la afluencia de sodio y el potencial de membrana se volverá .menos negativo. Tal reducción en el gradiente eléctrico se llama despolarización. Los cambios de voltaje producidos por la estimulación de este tipo se denominan potenciales graduados porque la magnitud del cambio (ya sea hiperpolarización o despolarización) depende de la fuerza del estímulo: un estímulo más grande abrirá más canales y producirá un cambio mayor en la permeabilidad.

  1. En una célula excitable, como una neurona, la respuesta a una despolarización
    El estímulo se clasifica con la intensidad del estímulo solo hasta un nivel particular de despolarización, llamado potencial umbral. Si una despolarización alcanza el umbral, un tipo diferente de respuesta, llamado potencial de acción, se activará.
  2. El potencial de acción es el impulso nervioso. Es un no clasificado evento de todo o nada, lo que significa que la magnitud del potencial de acción es independiente de la fuerza del estímulo despolarizante que lo produjo, siempre que la despolarización sea lo suficientemente grande para alcanzar el umbral. Una vez que se activa un potencial de acción, el potencial de membrana pasa por una secuencia estereotipada de cambios.
  3. Durante la fase de despolarización, la polaridad de la membrana se invierte brevemente y el interior de la célula se vuelve positivo con respecto al exterior. A esto le sigue rápidamente un empinado fase repolarizante, durante el cual el potencial de membrana vuelve a su nivel de reposo. Figura 2.5.
  4. También puede haber una fase, llamada subimpulso, durante el cual el potencial de membrana es más negativo que el potencial de reposo normal. Por lo general, todo el evento termina en unos pocos milisegundos.

Papel de los canales de iones cerrados en el potencial de acción:

El potencial de acción surge porque las membranas plasmáticas de las células excitables tienen Canales dependientes de voltaje. Estos canales iónicos tienen compuertas que se abren y cierran en respuesta a cambios en el potencial de membrana. Figura 2.4, 2.5

Dos tipos de canales dependientes de voltaje contribuyen al potencial de acción: canales de potasio y canales de sodio.

Cada canal de potasio tiene, una sola puerta que es sensible al voltaje se cierra en reposo y se abre lentamente en respuesta a la despolarización.

Por el contrario, cada canal de sodio tiene dos puertas sensibles al voltaje

(i) una puerta de activación & # 8216, que se cierra en reposo y responde a la despolarización abriendo rápidamente, y

(ii) una puerta de inactivación, que se abre en reposo y responde a la despolarización por cerrando lentamente.

En el estado de reposo de la membrana, la puerta de inactivación está abierta pero la puerta de activación está cerrada, por lo que el canal no permite que el Na + entre en la neurona. Sobre

despolarización la puerta de activación se abre rápidamente, provocando un influjo de Na, que despolariza aún más la membrana, abriendo más canales de sodio dependientes de voltaje y provocando aún más despolarización. Este proceso intrínsecamente explosivo. ejemplo de retroalimentación positiva, continúa hasta que se abren todos los canales de sodio en el sitio estimulado de la membrana.

Dos factores subyacen a la fase de repolarización rápida del potencial de acción cuando el potencial de membrana vuelve al reposo. Primero, la puerta de inactivación del canal de sodio, que responde lentamente a los cambios de voltaje, tiene tiempo para responder a la despolarización cerrándose, devolviendo la permeabilidad al sodio a su bajo nivel de reposo. En segundo lugar, los canales de potasio cuyas puertas sensibles al voltaje responden relativamente lentamente a la despolarización, han tenido tiempo de abrirse. Como resultado, durante la repolarización, el K + fluye rápidamente fuera de la célula, ayudando a restaurar la negatividad interna de la neurona en reposo. Las puertas de los canales de potasio también son la principal causa de la suboscilación o hiperpolarización, que sigue a la fase de repolarización. En lugar de regresar inmediatamente a su posición de reposo, estas puertas de movimiento relativamente lento permanecen abiertas durante el suboscilación, lo que permite que el potasio siga fluyendo fuera de la neurona. El flujo continuo de potasio hace que el potencial de membrana sea más negativo. Durante el subimpulso, tanto la puerta de activación como la puerta de inactivación del canal de sodio están cerradas. Si llega un segundo estímulo despolarizante durante este período, no podrá desencadenar un potencial de acción porque las puertas de inactivación no han tenido tiempo de reabrirse después del potencial de acción anterior. Este período en el que la neurona es insensible a la despolarización se denomina periodo refractario, y establece el límite de las tasas máximas a las que se pueden generar potenciales de acción. Figura 2.6


Los canales de Ca 2+ activados por voltaje y ligando regulan de manera diferencial el modo de liberación de neuropéptidos vesiculares en las neuronas sensoriales de mamíferos

Los neuropéptidos liberados por las neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) desempeñan un papel esencial en la neurotransmisión de las entradas sensoriales, incluidas las nocicepciones subyacentes y el dolor patológico. Los neuropéptidos se liberan de las vesículas intracelulares a través de dos modos: un modo de liberación parcial llamado "besar y correr" (KAR) y un modo de liberación completa llamado "similar a una fusión completa" (FFL). Usando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), rastreamos la liberación de neuropéptido Y (pHluorin-NPY) etiquetado con proteína fluorescente verde sensible al pH de vesículas de núcleo denso individuales en el soma y axón de neuronas DRG individuales después de la afluencia de Ca 2+ a través de los canales de Ca 2+ dependientes de voltaje (VGCC) o de los canales de vainilloide 1 de potencial receptor transitorio activado por ligando (TRPV1). Encontramos que el influjo de Ca 2+ a través de VGCC estimulaba FFL y una mayor liberación única de neuropéptidos. Por el contrario, el influjo de Ca 2+ a través de los canales TRPV1 estimuló KAR y una liberación pulsada pero prolongada de neuropéptidos que fue parcialmente mediada por Dynamin 1, que limita la expansión de los poros de fusión. La supresión del gradiente de Ca 2+ en un grado similar al visto después de la activación de TRPV1 abolió la preferencia de VGCC por FFL. Los hallazgos sugieren que al generar un gradiente de Ca 2+ más pronunciado, los VGCC promueven una apertura de poros de fusión más robusta que facilita FFL. Por tanto, los modos de liberación de KAR y FFL están regulados diferencialmente por los dos tipos principales de canales permeables al Ca 2+ en las neuronas DRG.


17.3: Canales de voltaje y ligando en neurotransmisión - Biología

Los canales iónicos activados por ligando forman un poro a través de la membrana plasmática que se abre cuando una molécula de señalización se une, lo que permite que los iones entren o salgan de los canales iónicos activados por voltaje de la célula que se abren en respuesta a un cambio en Potencial de membrana.

Canales iónicos activados por ligando unir un ligando, como un neurotransmisory abre un canal a través de la membrana que permite el paso de iones específicos. Para formar un canal, este tipo de receptor de superficie celular tiene una extensa región que atraviesa la membrana. Para interactuar con las colas de fosfolípidos de ácidos grasos que forman el centro de la membrana de plasma, muchos de los aminoácidos en la región que atraviesa la membrana son hidrofóbico. Por el contrario, los aminoácidos que recubren el interior del canal son hidrofílico para permitir el paso de agua o iones. Cuando un ligando se une a la región extracelular del canal, hay un cambio conformacional en la estructura de la proteína que permite el paso de iones como sodio, calcio, magnesio e hidrógeno. La región de unión al ligando se conoce como sitio alostérico. Está ubicado lejos del canal de iones real, pero induce un cambio conformacional en el canal para hacer que se abra.

Un lugar común para encontrar canales iónicos con compuerta es en células eléctricamente excitables como las neuronas, que necesitan reaccionar muy rápidamente a un estímulo. Cuando se abre un canal de iones con compuerta, permite que los iones se muevan rápidamente a través del canal, ya sea dentro o fuera de la célula, dependiendo del gradiente de concentración de iones a través de la membrana plasmática (también conocido como potencial de membrana). Esto convierte a un extracelular señal de ligando en un intracelular señal eléctrica y provocará un cambio en las propiedades eléctricas de la celda.

Preguntas de práctica

academia Khan

Preparación oficial de MCAT (AAMC

Paquete de preguntas sobre biología, Vol 2. Pasaje 4 Pregunta 24

• Los canales iónicos con compuerta se unen a un ligando y abren un canal a través de la membrana que permite el paso de iones específicos.

• Una ubicación común para encontrar canales iónicos cerrados es en células eléctricamente excitables como las neuronas, donde permiten un cambio rápido en el potencial de membrana de la célula.

• Mientras que los canales iónicos activados por ligandos dependen de la unión del ligando a los canales iónicos abiertos, los canales iónicos activados por voltaje se abren en respuesta a un cambio en el potencial de membrana.

Potencial de membrana: la diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior de una célula, definida por el gradiente de concentración de iones cargados positiva y negativamente a través de la membrana plasmática.

Sitio alostérico: un sitio de unión al ligando en una proteína que se encuentra lejos del sitio activo (en el caso de una enzima) o del canal iónico (en el caso de un canal iónico cerrado).

Canales iónicos activados por ligando formar un poro a través de la membrana plasmática

Neurotransmisores: sustancias químicas que permiten la neurotransmisión

Membrana de plasma: separa el interior de la célula del ambiente exterior hecho de fosfolípidos

Hidrofóbico: evita el agua

Hidrofílico: le gusta el agua

Extracelular: fuera de la celda

Intracelular: dentro de la celda

Voltajecanales cerrados: una clase de proteínas transmembrana que forman canales iónicos que se activan por cambios en el potencial eléctrico de la membrana


Canal con compuerta mecánica:

Este tipo de canal se abre ante las alteraciones corporales mediante una simple sensación de tacto.

Los canales están ubicados en los estereocilios de la región interior del oído, donde las ondas sonoras son capaces de doblar los estereocilios y abrir el canal iónico que da como resultado el establecimiento de un impulso nervioso.

Por lo tanto, un estímulo en la disposición de la vibración o cualquier presión física o estiramiento.

Por tanto, la puerta representa una porción de la proteína del canal que abre o cubre los poros.

Los estados discretos de la puerta son de partes conductoras o no conductoras.

Un canal cerrado transporta proteínas que abren una puerta permitiendo así que una molécula o ión pase a través de su membrana.

Los canales con compuerta mecánica que se abren ante la distorsión física de un receptor.


MATERIALES Y MÉTODOS

Animales, cultivo celular, transfección y plásmidos

El uso y cuidado de los animales fue aprobado y dirigido por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pekín y la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. Los ratones TRPV1-KO fueron proporcionados por Z. Zhu (Tercera Universidad Médica Militar, Chongqing, China). Los ratones Dyn1-KO fueron regalados por P. De Camilli (Universidad de Yale, New Haven, CT). Ratas Sprague-Dawley (

7 días de edad) se sacrificaron mediante una inyección intraperitoneal de 0,15 ml de hidrato de cloral al 10% y se utilizó anestesia hipotérmica para ratones. Los GRD de todos los segmentos espinales se aislaron en medio L15 helado (Gibco) y se disociaron enzimáticamente en tripsina (0,2 mg / ml) y colagenasa tipo 1A (1 mg / ml) que contenían medio de Eagle modificado por Dulbecco / F12 durante 40 min a 37ºC. ° C. A continuación, las células se disociaron mediante trituración y se transfectaron con 3 μg de un plásmido que expresa NPY-pHluorina utilizando un sistema de electroporación Neon (sistema de 100 μl) (Invitrogen, MPK10096) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se sembraron en cubreobjetos recubiertos con polietilenimina y se cultivaron durante 18 a 28 horas en una incubadora humidificada (37 ° C, 5% CO2) en medio Neurobasal-A suplementado con B27 al 2% y GlutaMAX-I 0,5 mM (todos de Gibco). El plásmido NPY-pHluorina se construyó a partir de NPY-Venus (un regalo de N. Gamper, Universidad de Leeds) y sinapto-pHluorina (un regalo de G. Miesenböck, Universidad de Oxford). Todos los productos químicos eran de Sigma, a menos que se indique lo contrario.

Inmunofluorescencia

Las neuronas DRG transfectadas con NPY-pHluorina se fijaron en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 15 min a temperatura ambiente y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,3% durante 5 min. Las células se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 2% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios diluidos en PBS con BSA al 2% a 4ºC. Después de lavar los anticuerpos primarios con tampón de bloqueo, las células se incubaron con inmunoglobulina G (H + L) de cabra anticonejo conjugada con Alexa Fluor 594 (Invitrogen, A11037) diluida en PBS con BSA al 2% durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, los núcleos se tiñeron con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) y se montaron con DAKO. Se utilizaron anticuerpos contra CGRP (Peninsula, IHC6006) y secretogranin II (Abcam, ab12241). Las imágenes se capturaron en un microscopio confocal invertido LSM 710 (Carl Zeiss). Para el análisis de colocalización, todos los puntos intracelulares dentro de las secciones ópticas de 1 μm se seleccionaron y analizaron utilizando el complemento JACoP del software McMaster Biophotonics Facility ImageJ (Institutos Nacionales de Salud).

Imágenes, estimulación y análisis TIRF

Las imágenes TIRF se realizaron en un microscopio invertido con un objetivo TIRF de 100 × (apertura numérica, 1,45 Olympus IX-81). Las imágenes fueron capturadas por un dispositivo de carga acoplada de multiplicación de electrones de Andor utilizando el software Andor iQ con un tiempo de exposición de 50 ms. La solución de baño estándar contenía lo siguiente: NaCl 150 mM, KCl 5 mM, CaCl 2,5 mM2, MgCl 1 mM2, H-Hepes 10 mM y d-glucosa 10 mM (pH 7,4). La temperatura se mantuvo a

35 ° C en todos los experimentos TIRF utilizando un calentador de laboratorio. Los eventos exocitóticos se definieron como aumentos abruptos de la fluorescencia, seguidos inmediatamente por una disminución de la fluorescencia o la difusión de NPY-pHluorin puncta en las proximidades. Para el análisis de eventos de liberación única, cada evento fue seleccionado y marcado con áreas circulares de 1,92 μm de diámetro (centro) y 2,4 μm de diámetro (anillo). La intensidad de la fluorescencia se calculó y analizó utilizando ImageJ, los valores de intensidad durante la línea de base de 0,5 s antes de promediar el valor pico y usarlo como F0. En los eventos FFL (o propagación), se produjo un fuerte aumento de la fluorescencia tanto en el centro como en el área anular de NPY-pHluorin puncta, que representa la liberación y propagación de NPY-pHluorin. Los eventos KAR mostraron un breve aclaramiento de los puntos, pero ningún aumento de fluorescencia o solo un aumento muy limitado en el área anular, lo que representa una apertura y recierre transitorios de un poro de fusión restringido que limitó la liberación de NPY. Alto contenido de K + [NaCl 85 mM, KCl 70 mM, CaCl 2,5 mM2, MgCl 1 mM2, Se aplicaron H-Hepes 10 mM y d -glucosa 10 mM (pH 7,4)] y capsaicina (300 nM) usando un sistema de perfusión alimentado por gravedad. Se aplicó estimulación de campo eléctrico (1 ms, 15 V) a través de un par de cables de platino utilizando un estimulador electrónico (Nihon Kohden, SEN-3201) y se colocó el polo negativo en las proximidades de la célula bajo examen. Para las imágenes TIRF de dos colores, los canales de Ca 2+ se marcaron con mCherry (Cav2.2-mCherry y TRPV1-mCherry), y los eventos de fusión se visualizaron mediante NPY-pHluorin.

Mediciones de fluorescencia y Ca 2+ fraccional

Calcio intracelular ([Ca 2+]I) se midió utilizando un sistema de formación de imágenes de Ca 2+ (TILL Photonics). La sal de potasio Fura-2 (1,0 mM) se cargó en la célula mediante una pipeta de parche en la configuración de célula completa. La fluorescencia se muestreó a 2 o 10 Hz.

Corriente fraccional de Ca 2+, PAGF, se define como el porcentaje de corriente de Ca 2+ en la corriente total que pasa a través de un canal catiónico (Imetro en este caso). Según la definición original (40), P f = ∫ Yo Ca d t ∫ Yo m d t = Δ Fd F máx × ∫ Yo m d t (1) donde Imetro es la corriente total de celda completa y ICalifornia es la fracción propuesta Imetro corriente transportada por Ca 2+. ΔFd es el cambio de Fd, que es la "señal fura-2 sensible al Ca 2+ modificada" antes de (Fdt0) y después (Fdt1) el pulso de voltaje o la afluencia de Ca 2+ inducida por ligando. Fd = F340 − F380, ΔFd = Fdt1 - Fdt0, y Fmax es una constante, que se determinó midiendo el influjo de Ca 2+ a través de VGCC en las soluciones especificadas anteriormente. En condiciones fisiológicas, todos los iones que contribuyen a la corriente a través de los VGCC son Ca 2+, es decir, PAGF = 100%. De la ecuación. 1, Fmax = ΔFd / ∫ICaliforniadt, dónde ICalifornia = Imetro (que es la corriente a través de VGCC). Según Eq. 1, después de determinar el Fmax midiendo la señal fura-2 que se evoca después de la activación de TRPV1, la PAGF de cada canal se puede determinar.

Inmunoensayo CGRP

Las concentraciones basales y extracelulares de CGRP estimuladas se evaluaron en neuronas DRG recién aisladas utilizando un kit de ensayo inmunométrico enzimático (Bachem), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron tres veces con solución externa normal y luego se incubaron en la misma solución durante 30 sa temperatura ambiente, seguido de otra incubación de 30 s en esta solución que contenía KCl 70 mM o capsaicina 300 nM. Las soluciones de incubación se recogieron para el análisis posterior de los niveles de CGRP basales y acoplados a la estimulación. Todas las muestras se centrifugaron a 13.000 rpm durante 5 min y los sobrenadantes se procesaron para la medición de CGRP. Las muestras se analizaron a 450 nm utilizando un lector de microplacas (BioTek Synergy 4). Las concentraciones de CGRP (en picogramos por mililitro) se extrapolaron de una línea de mejor ajuste calculada a partir de diluciones en serie de un estándar de CGRP. Todos los puntos de datos se midieron por triplicado.

Grabaciones electrofisiológicas

Usamos un amplificador EPC10 / 2 con software Pulse (HEKA Elektronik) para obtener grabaciones de pinza de conexión de células completas como se describió anteriormente (41, 42). La resistencia de la pipeta se controló entre 3 y 4 megaohmios cuando se llenó con una solución interna que contenía CsCl 153 mM, MgCl 1 mM2, Hepes 10 mM y Mg-adenosina 5′-trifosfato 4 mM (pH 7,2). La solución externa normal contenía NaCl 150 mM, KCl 5 mM, CaCl 2,5 mM2, MgCl 1 mM2, Hepes 10 mM y glucosa 10 mM (pH 7,4). Se utilizó el software Igor (WaveMetrics) para todos los análisis de datos fuera de línea. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.

Imágenes de calcio

Cambios del [Ca 2+]I en las neuronas DRG se midieron como la relación de fluorescencia Fluo-4 / Fura-Red (43). Las células se cargaron con 2,5 μM de Fluo-4 AM y 5 μM de Fura-Red AM (Invitrogen) disuelto en 0,2% de dimetilsulfóxido y 0,04% de Pluronic F-127 en una solución de baño estándar a 37 ° C durante 20 min. A continuación, se lavaron las células y se obtuvieron imágenes en un microscopio confocal invertido (Zeiss LSM 710). Los indicadores fluorescentes de Ca 2+ se excitaron utilizando un láser de 488 nm, y la luz emitida por el Fluo-4 y Fura-Red se registró en canales separados a 500 a 540 nm y 600 a 680 nm, respectivamente. Las imágenes (512 × 512 píxeles) se adquirieron a 1 Hz bajo una lente de objetivo de aceite de 40 × (Zeiss). El nivel de Ca 2+ se determinó a partir de las ROI utilizando la relación de las trazas de intensidad registradas en los canales Fluo-4 y Fura-Red.

Estadísticas

Todos los experimentos se replicaron al menos tres veces. Los datos se analizaron fuera de línea utilizando el software ImageJ e Igor. Los datos son medias ± SEM. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando Student's no apareados de dos colas t prueba, prueba de Kolmogorov-Smirnov o Mann-Whitney U prueba, como se indica. Todas las pruebas se realizaron con SPSS 13.0 (paquete estadístico para las ciencias sociales). El umbral de significancia se fijó en PAG & lt 0,05.


Contenido

Canales iónicos controlados por voltaje Editar

Los canales iónicos activados por voltaje se abren y cierran en respuesta al potencial eléctrico a través de la membrana celular. Partes del dominio del canal actúan como sensores de voltaje. A medida que cambia el potencial de membrana, esto da como resultado cambios en las fuerzas electrostáticas, moviendo estos dominios de detección de voltaje. Esto cambia la conformación de otros elementos del canal a la posición abierta o cerrada. [8] Cuando se mueven de la posición cerrada a la posición abierta, esto se llama "activación". Los canales iónicos activados por voltaje subyacen a muchos de los comportamientos eléctricos de la célula, incluidos los potenciales de acción, los potenciales de membrana en reposo y la transmisión sináptica. [9]

Los canales iónicos activados por voltaje a menudo son específicos de los iones, incluidos Na +, K +, Ca 2+ y Cl -. Cada uno de estos iones juega un papel importante en el comportamiento eléctrico de la célula. [9] Las puertas también tienen propiedades únicas con importantes implicaciones fisiológicas. Por ejemplo, los canales de Na + se abren y cierran rápidamente, mientras que las compuertas de K + se abren y cierran mucho más lentamente. La diferencia de velocidad entre estos canales subyace en las fases de despolarización y repolarización del potencial de acción. [10]

Canales Na + Editar

Los canales de sodio regulados por voltaje (Na +) son importantes cuando se trata de propagar los potenciales de acción en neuronas y otras células excitables, y se utilizan principalmente para la propagación del potencial de acción en axones, fibras musculares y el compartimento somatodendrítico neural. [11] Los canales de sodio (Na +) son algunos de los principales canales iónicos responsables de los potenciales de acción. [9] Al ser complejos, están formados por subunidades α más grandes que luego se emparejan con dos subunidades β más pequeñas. [11] Contienen segmentos transmembrana conocidos como S1-6. Los segmentos S4 cargados son los sensores de voltaje de los canales. Cuando se exponen a una cierta diferencia de potencial mínima, los segmentos S4 se mueven a través de la membrana. [12] Esto provoca el movimiento del enlazador S4-S5, lo que hace que el enlazador S5-S6 se tuerza y ​​abra el canal. [13]

Canales K + Editar

Los canales de potasio (K +) juegan un papel importante en el establecimiento del potencial de membrana en reposo. [9] Cuando la membrana celular se despolariza, la parte intracelular del canal se carga positivamente, lo que hace que la configuración abierta del canal se convierta en un estado más estable que la configuración cerrada. Hay algunos modelos de activación de los canales de potasio:

  • los modelo de hélice deslizante postula que el canal de potasio se abre debido a un movimiento de atornillado de su hélice S4.
  • los modelo de paleta postula que las hélices S3 y S4 del canal forman "paletas" que se mueven a través de la membrana despolarizada y tiran de la hélice S5 lejos de la abertura del canal.
  • los modelo de transporte postula que un campo eléctrico enfocado hace que las partículas cargadas se muevan a través del canal con solo un pequeño movimiento de la hélice S4.
  • El modelo de movimiento coordinado de hélices postula que las hélices S4 y S5 giran, y el enlazador S4-S5 hace que la hélice S6 se mueva, abriendo el canal.
  • los modelo de consenso es un promedio de los modelos anteriores que ayuda a reconciliarlos con los datos experimentales. [14]
Ca 2+ Canales Editar

Los canales de calcio (Ca 2+) regulan la liberación de neurotransmisores en las sinapsis, controlan la forma de los potenciales de acción producidos por los canales de sodio y, en algunas neuronas, generan potenciales de acción. [9] Los canales de calcio constan de seis hélices transmembrana. S4 actúa como sensor de voltaje al girar cuando se expone a ciertos potenciales de membrana, abriendo así el canal. [15]

Los neurotransmisores se almacenan y sintetizan inicialmente en vesículas en la sinapsis de una neurona. Cuando ocurre un potencial de acción en una célula, la señal eléctrica llega a la terminal presináptica y la despolarización hace que los canales de calcio se abran, liberando calcio para viajar por su gradiente electroquímico. Este influjo de calcio posteriormente es lo que hace que las vesículas de neurotransmisores se fusionen con la membrana presináptica. [16] Los iones de calcio inician la interacción de las proteínas cofactor obligatorias con las proteínas SNARE para formar un complejo SNARE. [16] Estos complejos SNARE median en la fusión de vesículas al juntar las membranas, lo que hace que los neurotransmisores se filtren hacia la hendidura sináptica. Las moléculas de neurotransmisores pueden enviar señales a la siguiente célula a través de receptores en la membrana postsináptica. Estos receptores pueden actuar como canales iónicos o como GPCR (receptores acoplados a proteínas G). [17] En general, el neurotransmisor puede causar una respuesta excitadora o inhibitoria, según lo que ocurra en el receptor.

Los canales de cloruro son otro grupo de canales iónicos activados por voltaje, de los cuales se comprenden menos. Están involucrados en procesos como el músculo liso esquelético y cardíaco, la regulación del volumen celular, el ciclo celular y la apoptosis. [18] Una de las principales familias de proteínas de cloruro se denominan proteínas CLC: canales y transportadores comunes para los procesos fisiológicos básicos en los mamíferos. Los canales CLC actúan como canales lentos que los iones de hidrógeno se intercambian por un influjo de iones de cloruro, lo que permite que los aniones viajen a través de su gradiente electroquímico. [19] El canal de cloruro C1C-1 dependiente del voltaje es un dímero homólogo que pertenece a esta familia y se observa predominantemente en las fibras del músculo esquelético. [20] Con este canal, la correcta despolarización y repolarización a través de iones cloruro es esencial para la propagación de un potencial de acción. [18]

Canales iónicos activados por ligando Editar

Los canales iónicos activados por ligandos se encuentran en neuronas postsinápticas. Por defecto, asumen su conformación cerrada. Cuando la neurona presináptica libera neurotransmisores al final de un potencial de acción, se unen a canales iónicos activados por ligando. Esto hace que los canales asuman su conformación abierta, permitiendo que los iones fluyan a través de los canales por su gradiente de concentración. Los canales iónicos activados por ligandos son responsables de la transmisión sináptica rápida en el sistema nervioso y en la unión neuromuscular. [21] Cada canal iónico controlado por ligando tiene una amplia gama de receptores con diferentes propiedades biofísicas, así como patrones de expresión en el sistema nervioso. [22]

La inactivación es cuando el flujo de iones es bloqueado por un mecanismo que no es el cierre del canal. [8] Un canal en su estado abierto puede dejar de permitir que los iones fluyan, o un canal en su estado cerrado puede inactivarse preventivamente para evitar el flujo de iones. [23] La inactivación ocurre típicamente cuando la membrana celular se despolariza y termina cuando se restaura el potencial de reposo. [8]

En los canales de sodio, la inactivación parece ser el resultado de las acciones de las hélices III-VI, con III y IV actuando como una especie de tapa con bisagras que bloquea el canal. El mecanismo exacto es poco conocido, pero parece depender de una partícula que tiene una alta afinidad por el interior expuesto del canal abierto. [24] La inactivación rápida permite que el canal detenga el flujo de sodio muy poco después de asumir su conformación abierta. [25]

Inactivación de bolas y cadenas Editar

El modelo de bola y cadena, también conocido como inactivación de tipo N o inactivación de tapa con bisagras, es un mecanismo de activación para algunos canales iónicos activados por voltaje. Los canales iónicos activados por voltaje se componen de 4 [ dudoso - discutir ] α subunidades, una o más de las cuales tendrán un dominio de bola ubicado en su extremo N-terminal citoplasmático. [26] El dominio de la bola es atraído electrostáticamente al dominio del canal interno. Cuando se activa el canal de iones, el dominio del canal interno queda expuesto y, en milisegundos, la cadena se doblará y la bola entrará en el canal, ocluyendo la permeación de iones. [27] El canal vuelve a su estado cerrado, bloqueando el dominio del canal y la bola sale del poro. [28]

La desactivación es el retorno de un canal iónico a su conformación cerrada. Para los canales dependientes de voltaje, esto ocurre cuando el diferencial de voltaje que originalmente causó la apertura del canal vuelve a su valor de reposo. [29]

En los canales de sodio activados por voltaje, la desactivación es necesaria para recuperarse de la inactivación. [24]

En los canales de potasio activados por voltaje, ocurre lo contrario y la desactivación retrasa la recuperación del canal de la activación. [30] La conformación cerrada se asume por defecto e implica el enderezamiento parcial de la hélice VI por el enlazador IV-V. Los mecanismos que provocan la apertura y el cierre no se comprenden completamente. La conformación cerrada parece ser una conformación de mayor energía que la conformación abierta, lo que también puede ayudar a explicar cómo se activa el canal iónico. [31]

La carga de activación se puede calcular resolviendo la ecuación de Poisson. Estudios recientes han sugerido un método basado en simulación de dinámica molecular para determinar la carga de activación midiendo las propiedades de los condensadores eléctricos de las proteínas incrustadas en la membrana. [2] La actividad de los canales iónicos ubicados en la membrana plasmática se puede medir simplemente uniendo un electrodo capilar de vidrio de forma continua con la membrana. [32] Otros canales iónicos ubicados en las membranas de las mitocondrias, los lisosomas y el aparato de Golgi pueden medirse mediante una técnica emergente que implica el uso de una membrana lipídica bicapa artificial unida a un dispositivo de 16 electrodos que mide la actividad eléctrica. [32]


¿Qué son los canales de iones controlados por ligando?

Los canales iónicos regulados por ligando son el segundo tipo de canales iónicos regulados presentes en la membrana celular. El ligando es una pequeña molécula química que interactúa con los receptores de las proteínas del canal. Son un tipo específico de moléculas estimulantes. Una vez que el ligando se une al receptor, cambiará la forma o la conformación de la proteína del canal.

Figura 02: Canales de iones controlados por ligando

Los canales controlados por ligando se abrirán para que los iones puedan entrar o salir fácilmente a través de estos canales hacia o desde la célula. Los receptores pueden estar presentes en el lado extracelular o en el lado intracelular de la membrana. Los receptores de acetilcolina son uno de los canales iónicos activados por ligandos más estudiados.


Mecanismos conformacionales del sesgo de señalización de los canales iónicos

Superfamilia de canales de iones controlados por ligando

Los canales iónicos activados por ligando se unen a neurotransmisores y se abren en respuesta a la unión de ligando. Estos canales controlan la transmisión sináptica entre dos neuronas o entre una neurona y un músculo. Una subfamilia engloba los canales de bucle Cys, llamados así debido a un gran dominio extracelular que contiene bucles Cys. 9,10 Los miembros de esta familia incluyen los canales que unen acetilcolina (el receptor nicotínico de acetilcolina), GABA (el GABAA receptor), el receptor 5HT3 y los receptores de glicina. Cinco subunidades se ensamblan para formar el canal pentamérico funcional. La mayoría se componen de dos subunidades alfa y otras tres subunidades (beta, gamma o delta), pero algunas constan de cinco subunidades alfa. Cada subunidad contiene un gran dominio extracelular amino-terminal con un enlace disulfuro característico formado por un par de residuos de cisteína (el bucle Cys) y una región transmembrana formada por cuatro segmentos helicoidales (M1-M4). El poro del canal está formado principalmente por uno de los segmentos helicoidales (M4) de dos de las subunidades. El sitio de unión del ligando ortostérico está formado por el dominio extracelular en la interfaz entre las subunidades.

Otra clase de canal controlado por ligando comprende los receptores tetraméricos del glutamato. 11 El glutamato es el principal neurotransmisor en el cerebro de los mamíferos y es en gran parte responsable de la transmisión sináptica excitadora. El receptor de glutamato ionotrópico tiene tres dominios estructurales principales: un dominio extracelular amino terminal grande (ATD), un dominio de unión a ligando extracelular (LBD) y una región transmembrana que consta de dos segmentos helicoidales por subunidad. La unión del glutamato hace que la "cubierta de almeja", como el LBD, se cierre, lo que da como resultado la apertura del poro. Existen varios subtipos de receptores ionotrópicos de glutamato, y pueden segregarse ampliamente en función de su sensibilidad farmacológica a moléculas similares al glutamato como NMDA, kainato y AMPA. Como es típico de la farmacología de los canales iónicos, el perfil distintivo de estos agonistas sintéticos en las preparaciones neuronales presagió la identificación molecular de las tres subfamilias de receptores ionotrópicos de glutamato.

Otra clase más de canal controlado por ligando se caracteriza por una disposición de subunidades triméricas. Cada subunidad tiene un gran bucle extracelular y dos segmentos transmembrana. Los miembros de esta familia incluyen los canales iónicos sensibles al ácido (ASIC) que están activados por protones. 12,13 Los canales P2X, que son controlados por ATP extracelular, son otro ejemplo. 14,15


Los canales de sodio están activados principalmente por voltaje: estos son los canales responsables de los potenciales de acción.

Muchos otros receptores están activados por ligando, y estos son típicamente la señal que causa el cambio de voltaje inicial que abre los canales de sodio activados por voltaje; sin embargo, estos canales son canales de cationes menos selectivos y son permeables a iones como el potasio y el sodio. Aún así, su permeabilidad al sodio es bastante importante y, por lo tanto, a veces también se los puede considerar como canales de sodio.

Estos incluyen canales activados por neurotransmisores como los receptores nicotínicos de acetilcolina y receptores AMPA (glutamato), y canales potenciales de receptores transitorios como el receptor TRPV1 que es sensible al calor doloroso y la capsaicina química que hace que los chiles estén "picantes".


Ver el vídeo: Fisiología - Activación de canales protéicos - mediados por voltaje y ligando (Septiembre 2022).


Comentarios:

  1. Faris

    simplemente impresionante !!!!))

  2. Mausar

    Si, sonidos que es tentador

  3. Akker

    Excelente)))))))

  4. Masree

    Qué palabras necesarias ... super, una excelente frase

  5. Kagalrajas

    Pido disculpas por no poder ayudarte. Pero estoy seguro de que encontrará la solución correcta. No se desesperen.

  6. Nguyen

    Admites el error. Examinaremos esto.



Escribe un mensaje