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Tripsina y cultivo celular

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Estoy haciendo un experimento en el que traté las células con un medicamento y calculé sus recuentos. Me gustaría saber si es malo tripsinizar las células en días consecutivos, es decir, dos veces en 48 horas. ¿Cuánto tiempo necesitan las células para volver a adherirse a la superficie del matraz? Quiero saber si puedo tratarlos con drogas el mismo día que agrego tripsina para contar.

Gracias.


Sería estresante para las células ser tripsinizadas 24 horas después de la siembra. Después de que las células se colocan en placa, hay un tiempo de retraso para comenzar a crecer. Quizás, durante el tiempo de retraso, se estabilice el estado fisiológico de las células. Tienen que expresar proteínas digeridas por tripsina y mostrarse en la superficie, etc. Entonces, podría alterar el estado nuevamente tripsinizando las células nuevamente si vuelve a colocar las células después de 24 horas. No negaría que la tripsina no afecta mucho a algunas células, pero debes tener cuidado.

si puedo tratarlos con drogas el mismo día, agrego tripsina para contar.

No es preferible, pero en algunos casos, de hecho, se toma esa forma. Si puede, quizás desee brindarnos más información sobre qué células y medicamentos va a usar.

PD

Si tripsiniza las células para contarlas y no las replantea, no necesita preocuparse por la condición de la célula, como dice WYSIWYG.


No es aconsejable tripsinizar las células con demasiada frecuencia cuando es necesario mantenerlas. Sin embargo, en tu caso la situación es diferente.

El tiempo requerido para adjuntar depende del tipo de celda. En cualquier caso, mientras realiza un experimento, sus células no deberían estar ya bajo estrés. Por lo tanto, debe sembrar los matraces / placas de cultivo con una concentración menor de células de modo que alcancen alrededor del 60% de confluencia en 24 horas. En general, se considera que 24 horas es suficiente para que las células se recuperen del estrés debido a la tripsinización. (Puede echar un vistazo a esta publicación para ver los tiempos de duplicación de algunas líneas celulares).

Después de realizar el tratamiento, puede contar las células siempre que crea que está bien; en realidad, esto depende de su experimento y puede tratar las células durante el tiempo que se adapte a la farmacocinética del fármaco. La tripsinización está bien ahora porque no volverá a usar estas células.

Sin embargo, existen métodos para calcular el número de células sin tripsinizar. Suponiendo que su matraz es homogéneo, puede elegir una sección y calcular el número de células manualmente usando un microscopio. También puede utilizar software como ImageJ para facilitar la tarea. Las células que expresan GFP también facilitarán la tarea.


Se podría considerar que "no responde a la pregunta", pero:

Opción 1: Dependiendo del tipo de células que esté utilizando, puede utilizar métodos más suaves para separar las células. Los ejemplos incluyen Versene, que es esencialmente PBS + EDTA. Aún más suave es usar PBS que no tenga Mg o Ca (sin quelación).

Opcion 2: Duplique su configuración, en lugar de dos platos, uno con fármaco y otro sin, prepara 4 platos (dispensados ​​de una fuente común, es decir, si su plato es un plato de 6 cm con 3 ml de medio, produce 4,5x3 ml de células en la dilución final que necesita). desea) cada placa obtiene 3 ml de la misma fuente para que sepa que tienen la misma cantidad de células. Dos platos a los que les agregas drogas, a dos no. El día que desee contar, tome las réplicas de placas y cuéntelas. De esta manera, obtienes el conteo sin tocar los platos finales en absoluto.

Como experimento paralelo, si vuelve a colocar esas células tripsinizadas en dos placas (y reemplaza el medio de fármaco en la réplica tratada con fármaco), y cuenta todas las placas el último día de su experimento, siempre que las células no estén al 100% de confluencia, cualquier diferencia que vea entre su tratamiento con tripsina y sin tratar puede verse como un error potencial que habría introducido si hubiera seguido su metodología original.


Efecto de la tripsina sobre el volumen y la masa celular

Las células NORMALES dejan de crecer en cultivo cuando alcanzan una cierta densidad de saturación 1-4 (inhibición del crecimiento por contacto). Las celdas están detenidas en el G1 fase del ciclo celular, durante la cual se reprime la síntesis de ADN y no se produce la división 5,6. Mientras que las células tumorales son menos sensibles o insensibles a la inhibición por contacto del crecimiento 4, las células normales pueden rescatarse de esta inhibición. El tratamiento con suero 1,7, factores derivados de células 8, bajas concentraciones de enzimas proteolíticas 8,9 y una serie de otros agentes 10 conduce, después de cierto tiempo, a la reanudación de la síntesis de ADN y la mitosis. En condiciones favorables para la síntesis y división del ADN, el tamaño de una célula, ya sea normal o transformada, aumenta considerablemente 11, pero solo las células tumorales forman colonias 12. Ahora informamos que tanto las células normales como las transformadas aumentan inmediatamente su volumen y peso seco (masa) cuando se exponen a una dosis baja de tripsina. Esto ocurre cuando se inhibe la síntesis de ADN, y no requiere una nueva transcripción, por lo que la tripsina está afectando directamente a la superficie celular.


Preguntas sobre la división del cultivo celular: ¿por qué centrifugar las células después de neutralizar la tripsina? Y tener problemas con las nuevas técnicas de laboratorio. ¿se trata sólo de mí?

Hola r / biology, soy nuevo aquí. Acabo de comenzar un puesto de asistente de investigación en un laboratorio de ciencias básicas sobre células y, por supuesto, es difícil sentirse inútil al principio porque todos los residentes de investigación y técnicos de amplificación están ocupados aprendiendo nuevas técnicas (transferencias, PCR, etc.) o ocupado con sus propios proyectos.

Sin embargo, mi mayor pregunta es la división celular: ¿por qué centrifugar después de tripsinizar las células? Siempre he aprendido en mi puesto de laboratorio anterior, que después de la tripsinización de las células, neutralizando tryspin w / media, tienes que centrifugarlo durante unos 4 minutos más o menos. Luego, deseche el sobrenadante, vuelva a mezclar el sedimento en 10 ml nuevos de medio y luego distribúyalo en placas. El laboratorio aquí no centrifuga, simplemente pipetean hacia arriba y hacia abajo durante 5 minutos y luego disparan la mezcla en las placas.

En cuanto a mí, anteriormente, trabajé 2 años en un laboratorio de células madre de ciencias básicas hace 3 años, y lo único que hice realmente bien fue dividir / plaquear / mantener cultivos celulares. Mi antiguo supervisor era súper anal acerca de ser estéril y limpio y limpiar todo con alcohol, siempre con guantes, siempre desechando las cosas correctamente, ya sea que estuvieras pipeteando medios o algo realmente biopeligroso. Especialmente en técnicas de cultivo celular.

En mi nuevo laboratorio, además de sentirme inútil, noté que hay grandes diferencias en la forma en que llevan a cabo los experimentos. Por ejemplo, cuando pipetean en la campana, descartan las puntas al azar en alguna esquina de la campana en lugar de en un tubo de 50 ml (como me enseñaron) o en un frasco de puntas. O cuando quitan los medios viejos de una placa, no usan una pipeta de vacío + pasteur (quemada para ser estéril), sino una pipeta. No rocían sus micropipetas con EtOH con tanta frecuencia cuando mueven cosas dentro y fuera del capó. No estoy seguro de si estoy experimentando problemas de ajuste o algo así ...

Es frustrante porque soy la persona más baja del laboratorio, no tengo habilidades más allá del cultivo de células, pero todavía no quiero estar a cargo de las células de otras personas. Y ellos (comprensivamente) no me creen cuando dije que solía centrifugar células. Hay más cosas, pero siento que cada vez que les pregunto, les resulta un poco molesto. Me gusta & quotoh, bueno, este es el atajo & quot y mi jefe de laboratorio anterior me enseñó a hacerlo de cierta manera hace dos años y medio, quien era extremadamente hábil.


Tripsina y cultivo celular - Biología

Subcultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)

1. Solución salina equilibrada de Hank sin Ca ++ y Mg ++ (HBSS), de Biowhittaker, nº de catálogo 10-543.

2. Mezcla de tripsina-verseno (0,5% de tripsina - 0,02% de EDTA), de Gibco, cat. # 610-5300 o Biowhittaker, Cat. # 17-161. Diluir 1: 1 con HBSS antes de usar.

3. Medio nutritivo, que consta de un 20% de suero de ternero fetal de Gibco, cat. # 200-6140, 80% Medio 199 (M199) tamponado con HEPES 25 mM de Biowhittaker, Cat. # 12-118, y complementado con L-glutamina 2 mM fresca (concentración final) de Biowhittaker, cat. # 17-605E, y con 100 U / ml de K-Penicilina G con 100 mcg / ml de Sulfato de Estreptomicina de Biowhittaker, Cat. # 17-719R o Gibco, Cat. # 600-5140. El día de uso, agregue 50 mcg / ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS) de Biomedical Technologies, Inc., cat. # BT-203, (Ver Protocolo # 2), y 100 mcg / ml de Heparina de Sigma Chem. Co., Cat. # H-3933 (Ver Protocolo # 3).

4. Gelatina al 0,1%, de Difco, cat. # 0143-02, disuelto en agua de grado de cultivo de tejidos libre de pirógenos y esterilizado en autoclave.

1. Recubrir los matraces de cultivo de tejidos vacíos (Corning o equivalente) con gelatina, escurrir y eliminar el exceso. Deje que los matraces se sequen (a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar).

2. Aspire el medio de un matraz de HUVEC primario (aislado de uno o más cordones umbilicales) en o cerca de la confluencia (ver refs. 1 y amp 2).

3. Lavar la monocapa con 5 ml de HBSS (los volúmenes se dan para un matraz de 75 cm 2 y usar 1/2 de la cantidad para matraces de 25 cm 2).

5. Muy rápidamente, enjuague la monocapa con 2 ml de tripsina-verseno diluido, dejando que la superficie permanezca cubierta durante 10-30 segundos.

7. Agregue otros 2 ml de tripsina-verseno al matraz.

8. Tape el matraz y agítelo brevemente.

9. Examine el matraz bajo un microscopio para determinar que las células se han desprendido, esto generalmente ocurre dentro de 1-3 minutos (N.B .: monitorear cuidadosamente en esta etapa para evitar una exposición excesiva a la tripsina).

10. Agregue medio nutriente directamente al matraz. El componente de suero apagará la actividad de la tripsina. El volumen añadido se determina según la siguiente escala.
Divida 1 matraz en 3 matraces (para que confluyan en

5-6 días)
(Nota: La relación 1: 6 es la más eficiente en términos de la cantidad de células producidas por número de tomas necesarias).

11. Distribuya la suspensión celular diluida en los matraces prerrecubiertos de gelatina.

12. Llevar el volumen final en cada matraz hasta 10-12 ml con medio nutriente.

13. Incubar los matraces a 37 ° C en 5% de CO 2 + 95% de aire y volver a alimentarlos cada 2-3 días.

  1. Este procedimiento permite la amplificación eficaz del número de células endoteliales de cultivos primarios de vena umbilical humana y otras fuentes vasculares humanas con un número de pases relativamente bajo. El paso continuo eventualmente resultará en cambios senescentes y pérdida de potencial replicativo útil.
  2. Este procedimiento es actualmente el método estándar utilizado en el Laboratorio Central de Cultivo Celular de la División de Investigación Vascular, Departamento de Patología, Hospital Brigham and Women's, Boston, MA.

1. Gimbrone MA Jr., Shefton EJ y Cruise SA: aislamiento y cultivo primario de células endoteliales de vasos umbilicales humanos. Manual de la Asociación de Cultivos de Tejidos 1978 4 (2): 813-818.

2. Gimbrone MA Jr: cultivo de endotelio vascular. Capítulo 1 en: Spaet T. (ed) Progreso en hemostasia y trombosis, vol. III, Grune & amp Stratton, Inc., 1976 págs. 1-28.

3. Maciag T, Hover GA, Stemerman MB y Weinstein: propagación en serie de células endoteliales humanas in vitro. J Cell Biol 1981 91: 420-428.

4. Thornton SC, Mueller SW y Levine EM: Células endoteliales humanas: uso de heparina en clonación y cultivo en serie a largo plazo. Science 1983 222: 623-625.


K. C./M. Gimbrone
7/1985 (5/19/00)
División de Investigación Vascular
Departamento de Patología
Hospital de mujeres Brigham & amp
Boston, MA

Preparación de la solución madre de suplemento de crecimiento de células endoteliales (5 mg / ml)

1. Mitógeno de células endoteliales (también conocido como ECGS), obtenido de Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, MA, cat. # BT-203

2. Solución salina equilibrada de Hank (HBSS), cat. # 10-543 de Biowhittaker

3. 1 jeringa de plástico desechable estéril (por ejemplo, 20 ml) con o sin una aguja de gran calibre (se prefiere sin ella por razones de seguridad)

4. Unidades de filtro de jeringa estériles Millex de 0.22 micrones (Millipore, Cat. # SLGS02505 o # SLGP033RB)

5. 2 tubos de cultivo estériles (plástico, desechables)

1. Utilice 50,0 mg de ECGS por litro de medio que planea utilizar en una semana (consulte los pasos 9 y 10). Continúe el procedimiento en una campana estéril.

2. Por cada litro de medio a preparar, coloque 5 ml de HBSS a 37 ° C en la botella estéril de ECGS.

3. Tape y haga girar la botella suavemente, evitando que burbujee.

4. Transfiera el líquido a uno de los tubos estériles.

5. Enjuague el frasco con un volumen adicional de 5 ml de HBSS y agréguelo al líquido del tubo.

6. Extraiga la solución con una jeringa.

7. Si se usa, reemplace la aguja con un filtro Millex estéril de 0.22 micrones y filtre la solución en el segundo tubo estéril.

8. Cambie el filtro cada 20 ml para evitar la sobrecarga del filtro.

9. Almacene esta solución madre a 4 ° C. (NO CONGELAR). También tenga en cuenta que la actividad de ECGS disminuye después de haber estado en solución durante 7 a 10 días.

10. Para alimentar células endoteliales de la vena umbilical humana subcultivadas, diluya esta solución madre de ECGS de 5 mg / ml 1: 100 en suero de ternero fetal al 20% en M199 con 100 microgramos / ml de heparina (consulte el Protocolo n. ° 3) en HBSS el día de la alimentación . (La actividad del ECGS en el medio nutritivo se deteriora después de aproximadamente 48 horas). No almacene el medio suplementado con ECGS y heparina durante más de dos días.

K. C./M. Gimbrone
7/1985 (5/19/00)

Preparación de una solución madre de heparina (10 mg / ml).

1. Sal sódica de heparina en polvo (grado 1, de la mucosa intestinal porcina), Sigma, cat. # H-3393.

2. Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) de Biowhittaker, cat. # 10-543.

3. 1 jeringa desechable de plástico estéril (por ejemplo, 20 cc) con o sin aguja de gran calibre (se prefiere sin aguja por razones de seguridad).

4. Unidades de filtro de jeringa estériles Millex de 0.22 micrones (Millipore, Cat. # SLGS02505 o # SLGP033RB).

5. 2 tubos de cultivo de plástico estériles con tapón (por ejemplo, 50 ml).

1. Pese 100 mg de heparina por litro de medio nutritivo que se preparará para su uso en los próximos 7 días.

2. En una campana estéril, agregue la heparina a HBSS a 37 ° C (10 ml de HBSS por litro de medio a preparar) en la tapa del tubo estéril y agite.

3. Si la heparina tarda en disolverse, agítela brevemente y déjela en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos.

4. Extraiga la heparina de forma estéril con una jeringa y una aguja.

5. Reemplace la aguja, si se utiliza, con un filtro de 0,22 micrones y recoja el filtrado en otro tubo estéril.

6. Consulte Métodos: Pasos 9 y 10 en el Protocolo n. ° 2. Es posible que la heparina no esté sujeta a la misma disminución de actividad con el tiempo en solución, pero se trata de forma rutinaria de la misma manera que el ECGS.

7. Diluir esta solución madre de heparina 1: 100 en suero de ternero fetal al 20% en M199 con 50 microgramos por ml de ECGS en HBSS para su uso en la alimentación de HUVEC subcultivadas.

En general, es más fácil preparar volúmenes mayores de FCS al 20% en M199 con L-Glutamina 2 mM, más 100 U / ml de K-Penicilina G y 100 mg / ml de Sulfato de estreptomicina por adelantado, ya que esto se puede almacenar para 10 días o más a 4 ° C, luego, simplemente diluya las soluciones madre de ECGS y heparina 1: 100 en el volumen de medio que se utilizará en un día determinado.


Activación proteolítica de la proteína de fusión del pico de coronavirus de diarrea epidémica porcina por tripsina en cultivo celular

El aislamiento del coronavirus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) a partir de material clínico en cultivo celular requiere la suplementación con tripsina. Esto puede estar relacionado con el confinamiento de la infección natural por PEDV en el intestino delgado rico en proteasas de los cerdos. Nuestro estudio se centró en el papel de la actividad de la proteasa en la infección mediante la investigación de la proteína de pico de un aislado de PEDV (wtPEDV) utilizando un sistema de genética inversa basado en la cepa DR13 (caPEDV) adaptada al cultivo celular independiente de tripsina. Demostramos que la tripsina actúa sobre la proteína de pico wtPEDV después de la unión al receptor. Mapeamos el determinante genético para la entrada de células dependientes de tripsina a la región N-terminal de la subunidad de fusión de esta proteína de fusión de clase I, revelando una arginina conservada justo corriente arriba del péptido de fusión putativo como el sitio de escisión potencial. Mientras que los coronavirus son procesados ​​típicamente por proteasas endógenas de la célula productora o diana, la activación de la proteína PEDV S requirió estrictamente la suplementación de una proteasa, lo que nos permite estudiar los detalles mecánicos del procesamiento proteolítico. Importancia: Las epidemias recurrentes de PEDV constituyen una grave amenaza para la salud animal y una carga económica, particularmente en Asia pero, recientemente, también en el subcontinente norteamericano. Comprender la biología de PEDV es fundamental para combatir la infección. Aquí, proporcionamos nueva información sobre la entrada de células dependientes de proteasas de PEDV.

Copyright © 2014, Sociedad Estadounidense de Microbiología. Reservados todos los derechos.

Cifras

Infección por el PEDV de tipo salvaje ...

Infección con el aislado de PEDV de tipo salvaje, pero no con los beneficios del PEDV adaptado al cultivo celular ...

La proteína S determina la tripsina ...

La proteína S determina la dependencia de la tripsina de la propagación del PEDV. (A) Representación esquemática de…

Caracterización de la activación de la proteína S.…

Caracterización de la activación de la proteína S. (A) Se realizó un ensayo de entrada como se describe ...

Mapeo del determinante genético para ...

Mapeo del determinante genético para la entrada de PEDV potenciada con tripsina. (A) Organización putativa de la clase ...

Sustitución de arginina en la posición ...

La sustitución de arginina en la posición 890 da como resultado una capacidad de formación de sincitio reducida de ...


Información detallada del producto

General

Manejo de la información

Cada tipo de célula o línea celular responde a la tripsina-EDTA para células primarias de una manera única. Para obtener resultados óptimos, observe continuamente las células durante el proceso de disociación para evitar daños. Para obtener información específica de las celdas, consulte la hoja de producto suministrada con las celdas o la línea de celdas.

  1. Lleve el DPBS, la tripsina-EDTA para células primarias y la solución neutralizante de tripsina a temperatura ambiente antes de usarlos. Caliente el medio de cultivo completo a 37 ° C antes de usarlo con las células.
  2. Para cada matraz, aspire cuidadosamente el medio gastado sin alterar la monocapa. Si el medio de cultivo celular contiene suero, cada matraz debe enjuagarse con DPBS dos veces antes de agregar la tripsina-EDTA para células primarias.
  3. Usando 1 a 2 mL por cada 25 cm 2, agregue el volumen apropiado de solución de tripsina-EDTA a cada matraz (por ejemplo, cada matraz T-25 se disociaría con 1 a 2 mL de tripsina-EDTA).
  4. Agite suavemente cada matraz para asegurar una cobertura completa de la solución de tripsina-EDTA sobre las células, y luego aspire el exceso de líquido de la monocapa, no aspire a sequedad.
  5. Observa las células bajo el microscopio. Cuando las células se separan entre sí y se redondean (por lo general, en aproximadamente 3 a 6 minutos), retire el matraz del microscopio y golpee suavemente el matraz de cultivo desde varios lados para promover el desprendimiento de las células del matraz. No sobre-tripsinice ya que esto dañará las células.
    1. Algunos tipos de células fuertemente adherentes, como los queratinocitos, pueden tardar mucho más y pueden requerir tripsinización a 37 ° C.
    2. Algunos tipos de células pueden requerir un golpeteo más vigoroso.
    1. No centrifugue demasiado las células, ya que esto puede dañarlas.
    2. Después de la centrifugación, las células deben formar un sedimento suelto y limpio.

    Especificaciones de control de calidad

    Descargo de responsabilidad legal

    El producto se proporciona 'TAL CUAL' y la viabilidad de los productos ATCC & reg está garantizada durante 30 días a partir de la fecha de envío, siempre que el cliente haya almacenado y manipulado el producto de acuerdo con la información incluida en la hoja de información del producto, el sitio web y Certificado de análisis. Para los cultivos vivos, la ATCC enumera la formulación de los medios y los reactivos que se ha encontrado que son efectivos para el producto. Si bien otros medios y reactivos no especificados también pueden producir resultados satisfactorios, un cambio en la ATCC y / o los protocolos recomendados por el depositante pueden afectar la recuperación, el crecimiento y / o la función del producto. Si se utiliza una formulación o un reactivo de medio alternativo, la garantía de viabilidad de la ATCC ya no es válida. Salvo que se establezca expresamente en este documento, no se proporcionan otras garantías de ningún tipo, expresas o implícitas, incluidas, entre otras, las garantías implícitas de comerciabilidad, idoneidad para un propósito particular, fabricación de acuerdo con los estándares cGMP, tipicidad, seguridad, precisión. y / o no infracción.

    Este producto está diseñado para uso exclusivo en investigación de laboratorio. No está destinado a ningún uso terapéutico animal o humano, ni al consumo humano o animal, ni a ningún uso diagnóstico. Cualquier uso comercial propuesto está prohibido sin una licencia de ATCC.

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    ¿Por qué agregar rojo de fenol a la tripsina? - (27 / Abr / 2005)

    ¿Alguien puede decirme que deberíamos usar rojo de fenol contenido en nuestra tripsina-EDTA al 0.05% con el propósito de tripsinizar mi línea celular de monocapa de queratinocitos?

    No tiene que usar rojo de fenol en la tripsina, solo ayuda a garantizar que tenga el pH correcto, ya que un pH demasiado alto o demasiado bajo dañará más las células cuando están en un estado de fragilidad, como cuando están siendo tripsinizados.

    o, veo ... el rojo de fenol como indicador de pH como lo que mencionaste. por tanto, da el color rojo de la tripsina-EDTA. Me pregunto por qué agregaron el rojo de fenol en la tripsina. es que solo le da el color rojo. y ajustar el pH de la tripsina-EDTA.

    Tiendo a pedir tripsina-EDTA de Gibco, pero contiene rojo fenol. ¿Le hará mucho problema a mi línea celular adherente monocapa?

    Hola
    de acuerdo con el hecho de que la mayoría de los medios utilizados en el cultivo celular también contienen rojo fenol, no creo que eso envenene las células.

    tienes razón. Esa es una información para ti también, como dijo Bob.

    Fred, quiso decir que no importa si tenemos rojo de fenol contenido en nuestra tripsina EDTA. ??

    Aún así, me pregunto por qué algunos fabricantes ponen rojo de fenol en medio y tripsina EDTA, ya que simplemente pueden descuidar la adición. Derecha. ¿¿porqué es eso??

    Estoy de acuerdo con el hecho de que no importa si hay fenol en la tripsina edta.
    Pero no estoy de acuerdo con el hecho de que el rojo de fenol (u otro indicador de ph) es insignificante en el medio. La mayoría de las veces, no merece nada especial excepto indicar el pH, pero para mí también lo uso para detectar clones de células en una placa de 96 pocillos y para comprobar parte de la salud de las células.
    Por cierto, creo que el indicador de ph es una información bastante esencial en el cultivo celular.

    El rojo feol se usa en la tripsina-EDTA y en el medio solo como indicador de pH (al menos que yo sepa), es realmente útil para una verificación visual rápida del pH de las soluciones, si son de color púrpura, el pH también lo es. alto y amarillo si el pH es demasiado bajo y en ambos casos debe desecharse.

    No todos los medios fabricados comercialmente contienen rojo fenol, incluso puede comprar DMEM sin él. El rojo de fenol es un análogo de estrógeno, que puede (y lo hace) imitar la acción de agregar estrógeno a una línea celular. Si está realizando un trabajo que implique un tratamiento con estrógenos, utilice medios y tripsina sin rojo de fenol.

    Si realmente le preocupa, puede comprar tripsina en polvo y preparar la solución usted mismo.

    Gracias Fred y Bob, supongo que debería ser muy útil básicamente para la observación visual de las condiciones de las células, al menos aumenta el color.

    El rojo de fenol contenido en el medio o en la tripsina debería ser lo suficientemente menor para no afectar el crecimiento de las células. por lo tanto, aquí se puede concluir que no es gran cosa usar rojo de fenol en pequeñas cantidades, ya sea en medio o tripsina, ya que actúa como indicador, y no daña el crecimiento de las células como principal.

    ¿La tripsina / EDTA es un detergente?

    La tripsina es una enzima que mordisquea el anclaje de la proteína celular al plato. El EDTA quela los iones de Mg, lo que hace que la célula se redondee. Ambos en conjunto hacen que una celda se detecte de la placa.


    ¿Por qué suero al 10% para cultivo celular? - (19 / Jun / 2008)

    por qué usamos suero al 10% en los medios. lo que pasa es que aumentamos o disminuimos el porcentaje de tripsina.

    El% del suero es medio depende del tipo de célula que cultives, a veces uso 5%, 20% para diferentes células.
    En mi opinión, cambiar la concentración de tripsina no debería hacer demasiado, pero si lo cambia, debe cambiar el tiempo de incubación para separar la célula para que no digiera su célula.

    La tripsina de alguna manera introducirá más estrés en las células. Es por eso que necesitamos desactivarlo agregando medio de suero.

    Se descubre que el 10% es la cantidad mínima requerida para ser bueno para la mayoría de las líneas celulares (el suero es caro y también cruel). Pero muchas líneas celulares requieren un suero más alto, y a muchas les va bien con un suero más bajo. Incluso puede escapar sin suero con ciertas líneas de células cancerosas usando algunos componentes sintéticos agregados al medio.

    El suero se usa simplemente como una mezcla de factores de supervivencia que aún no hemos identificado, pero necesarios para el crecimiento y la supervivencia celular.

    La tripsina daña la membrana citoplasmática, por lo que debe mantenerla al mínimo en concentración / incubación, apagándola inmediatamente con suero una vez que se cumpla su propósito.

    Suero al 10%. ¿Qué significa esto realmente?

    Por favor, ponga los siguientes sueros en orden de calidad.

    ¿Británico, europeo, neozelandés, australiano, norteamericano, sudamericano?

    Mi punto es que el suero al 10% de un país de origen VALE PROBABLEMENTE 70-100% de otro. esto está relacionado también con el precio: -

    £ 25, £ 45- £ 50, £ 250, £ 180, £ 120, £ 100. Por favor, ajuste el precio al país de origen anterior.

    Suero al 10%. ¿Qué significa esto realmente?

    Por favor, ponga los siguientes sueros en orden de calidad.

    ¿Británico, europeo, neozelandés, australiano, norteamericano, sudamericano?

    Mi punto es que el suero al 10% de un país de origen VALE PROBABLEMENTE 70-100% de otro. esto también está relacionado con el precio: -

    £ 25, £ 45- £ 50, £ 250, £ 180, £ 120, £ 100. Por favor, ajuste el precio al país de origen anterior.

    Creo que el precio tiene que ver con la ausencia GARANTIZADA de una determinada enfermedad en un país durante un período de tiempo determinado. Por lo general, 10% significa una parte de FCS agregada a 9 partes de medio. En cuanto a la pregunta de calidad: en mi opinión, es más importante tener un suministro constante de FCS con poca variación en calidad / componentes / fuente.

    Suero al 10%. ¿Qué significa esto realmente?

    Por favor, ponga los siguientes sueros en orden de calidad.

    ¿Británico, europeo, neozelandés, australiano, norteamericano, sudamericano?

    Mi punto es que el suero al 10% de un país de origen VALE PROBABLEMENTE 70-100% de otro. esto está relacionado también con el precio: -

    £ 25, £ 45- £ 50, £ 250, £ 180, £ 120, £ 100. Por favor, ajuste el precio al país de origen anterior.

    Creo que el precio tiene que ver con la ausencia GARANTIZADA de una determinada enfermedad en un país durante un período de tiempo determinado. Por lo general, 10% significa una parte de FCS agregada a 9 partes de medio. En cuanto a la pregunta de calidad: en mi opinión, es más importante tener un suministro constante de FCS con poca variación en calidad / componentes / fuente.

    Solo para información: tiene razón al decir que Nueva Zelanda es el único país libre de EEB en el mundo

    La calidad del suero NZ es la MEJOR DEL MUNDO. Hacemos las siguientes pruebas:

    Viabilidad
    Crecimiento
    Inducción de la enzima iNOS
    Consumo de oxigeno
    Contenido cGMP de RASMC
    Concentración de citocromo C dentro de J744 y Jurkats
    Estados de oxidación / reducción de complejos enzimáticos mitocondriales
    Expresión del canal de sodio en células HEK transfectadas

    EN TODO EL SUERO NZ ANTERIOR ES SUPERIOR A TODOS LOS DEMÁS SUEROS.

    es decir, mayor número de canales expresados, 80% más de inducción de iNOS, mayor consumo de oxígeno, etc., etc.

    Incluso hay diferencias entre los lotes de Nueva Zelanda. por lo tanto, HACEMOS PRUEBAS POR LOTES para asegurarnos de que los resultados que obtenemos sean consistentes con los que obtuvimos hace 5/10/15 años.


    Reactivos de disociación celular y tripsina

    Las soluciones de disociación celular y tripsina de Biological Industries se utilizan ampliamente para eliminar las células adherentes de la superficie de un cultivo. La elección del reactivo de disociación y la concentración adecuados depende del tipo de célula y de la edad de las células en cultivo. BI proporciona una amplia variedad de soluciones de tripsina, que se preparan a partir de materiales probados por parvovirus porcino y micoplasma, además de alternativas definidas químicamente.

    ¿Busca una alternativa sin animales? Soluciones de tripsina recombinante: el mejor sustituto de la tripsina.

    Las soluciones de tripsina recombinante de BI son enzimas de disociación celular definidas sin componentes animales que reemplazan la tripsina porcina y evitan la variabilidad y la contaminación relacionadas con los animales. Las soluciones de tripsina recombinante son ideales para disociar células dependientes de la unión tanto en condiciones que contienen suero como sin suero y pueden sustituirse directamente por tripsina sin cambios en el protocolo. Estas soluciones también están optimizadas para tipos de células sensibles, una característica fundamental para prevenir efectos adversos en el procesamiento posterior.


    Un protocolo para el aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea de ratón

    Explicamos un protocolo para el aislamiento y cultivo sencillos de células madre mesenquimales (MSC) de la médula ósea de ratón (BM) para proporcionar a los investigadores un método que se puede aplicar en biología celular e ingeniería de tejidos con requisitos mínimos. Nuestro protocolo se basa principalmente en el cambio de medio frecuente en el cultivo primario y la disminución del tiempo de tripsinización. Las células madre mesenquimales de ratón generalmente se aíslan de un aspirado de BM extraído de los compartimentos de la tibia y la médula femoral, luego se cultivan en un medio con medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y suero fetal bovino (FBS) durante 3 h en una temperatura de 37 grados C- Incubadora de CO (2) al 5%. Las células no adherentes se eliminan cuidadosamente después de 3 horas y se reemplaza el medio fresco. Cuando los cultivos primarios se vuelven casi confluentes, el cultivo se trata con 0,5 ml de tripsina al 0,25% que contiene ácido etilendiaminotetraacético al 0,02% durante 2 min a temperatura ambiente (25 grados C). Se puede obtener una población purificada de MSC 3 semanas después del inicio del cultivo.


    Ver el vídeo: Video 1: Cultivo celular: descongelamiento, mantenimiento y congelamiento (Febrero 2023).