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¿Por qué hay dos secuencias maduras de microARN en las entradas de miRBasa?

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En la base de datos de miRBase, las entradas muestran generalmente una secuencia de tallo bucle y dos secuencias maduras. Por ejemplo, la entrada para hsa-mir-15a da tres secuencias: (1) la secuencia de Stem-loop hsa-mir-15a, (2) la secuencia madura hsa-miR-15a-5p y (3) la secuencia madura hsa-miR -15a-3p. ¿Cuál es la diferencia entre las dos secuencias maduras? ¿Se divide la estructura del bucle del tallo en dos especies de miARN diferentes?


No estoy seguro de si se aclara en el artículo de Wikipedia sobre microARN, pero sí, hay dos posibles especies de mir maduras que se pueden generar a partir del precursor del bucle de tallo, una de cada lado del tallo, aunque la mayoría de las veces una predomina mucho.

El diagrama en Wikipedia muestra la generación de un solo miARN:

Sin embargo, la entrada mencionada en la pregunta (hsa-mir-15a) muestra que aunque el componente del tallo 5 '(UAGCA ...) es más abundante en este caso, hay una pequeña cantidad del componente del tallo 3' (CAGGC ... ).

En Drosophila melanogaster predomina un solo componente del tallo (más a menudo del tallo 3 ', pero también del tallo 3'), pero personalmente he encontrado microARN en los que ambos componentes se encuentran en cantidades similares (no publicado).


MiRmat: Predicción de secuencia de microARN maduro

Afiliación Laboratorio estatal clave de biotecnología farmacéutica y Centro de investigación de ingeniería de Jiangsu para biología y biotecnología de microARN, Facultad de Ciencias de la vida, Universidad de Nanjing, Nanjing, China

Afiliaciones Laboratorio Nacional Clave para Tecnología de Software Novedoso, Universidad de Nanjing, Nanjing, China, Instituto de Visión e Inteligencia Artificial, Beijing Jingwei Textile Machinery New Technology Co., Ltd., Beijing, China

Afiliación El Laboratorio Estatal Clave de Biotecnología Farmacéutica y el Centro de Investigación de Ingeniería de Jiangsu para Biología y Biotecnología de MicroARN, Escuela de Ciencias de la Vida, Universidad de Nanjing, Nanjing, China

Afiliación Laboratorio estatal clave de biotecnología farmacéutica y Centro de investigación de ingeniería de Jiangsu para biología y biotecnología de microARN, Facultad de Ciencias de la vida, Universidad de Nanjing, Nanjing, China

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Afiliación Laboratorio estatal clave de biotecnología farmacéutica y Centro de investigación de ingeniería de Jiangsu para biología y biotecnología de microARN, Facultad de Ciencias de la vida, Universidad de Nanjing, Nanjing, China

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Laboratorio Nacional Clave de Afiliación para Tecnología de Software Novedoso, Universidad de Nanjing, Nanjing, China

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Contenido

El primer miARN se descubrió a principios de la década de 1990. [13] Sin embargo, los miARN no fueron reconocidos como una clase distinta de reguladores biológicos hasta principios de la década de 2000. [14] [15] [16] [17] [18] La investigación de miARN reveló diferentes conjuntos de miARN expresados ​​en diferentes tipos de células y tejidos [8] [19] y múltiples funciones de los miARN en el desarrollo de plantas y animales y en muchas otras Procesos. [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] La expresión aberrante de miARN está implicada en estados patológicos. Se están investigando terapias basadas en miARN. [27] [28] [29] [30]

El primer miARN fue descubierto en 1993 por un grupo liderado por Ambros y que incluía a Lee y Feinbaum. Sin embargo, la comprensión adicional de su modo de acción requirió un trabajo publicado simultáneamente por el equipo de Ruvkun, incluidos Wightman y Ha. [13] [31] Estos grupos publicaron artículos consecutivos sobre el lin-4 gen, que era conocido por controlar el tiempo de C. elegans desarrollo larvario reprimiendo el lin-14 gene. Cuando Lee et al. aislado el lin-4 miARN, encontraron que en lugar de producir un ARNm que codifica una proteína, producía ARN cortos no codificantes, uno de los cuales era un

ARN de 22 nucleótidos que contenía secuencias parcialmente complementarias a múltiples secuencias en el 3 'UTR del lin-14 ARNm. [13] Esta complementariedad se propuso para inhibir la traducción de la lin-14 ARNm en la proteína LIN-14. En ese momento, el lin-4 Se pensaba que el ARN pequeño era una idiosincrasia de nematodos.

En 2000, se caracterizó un segundo ARN pequeño: let-7 ARN, que reprime lin-41 para promover una transición de desarrollo posterior en C. elegans. [14] El let-7 Se encontró que el ARN se conservaba en muchas especies, lo que llevó a la sugerencia de que let-7 El ARN y los "ARN temporales pequeños" adicionales podrían regular el tiempo de desarrollo en diversos animales, incluidos los humanos. [15]

Un año después, el lin-4 y let-7 Se descubrió que los ARN forman parte de una gran clase de ARN pequeños presentes en C. elegans, Drosophila y células humanas. [16] [17] [18] Los muchos ARN de esta clase se parecían a los lin-4 y let-7 Los ARN, excepto sus patrones de expresión, generalmente eran incompatibles con un papel en la regulación del tiempo de desarrollo. Esto sugirió que la mayoría podría funcionar en otros tipos de vías reguladoras. En este punto, los investigadores comenzaron a usar el término "microARN" para referirse a esta clase de pequeños ARN reguladores. [16] [17] [18]

La primera enfermedad humana asociada con la desregulación de los miARN fue la leucemia linfocítica crónica. En este trastorno, los miARN tienen una función dual, actuando como supresores de tumores y como oncogenes. [32]

Bajo un sistema de nomenclatura estándar, los nombres se asignan a los miARN confirmados experimentalmente antes de su publicación. [33] [34] El prefijo "miR" va seguido de un guión y un número, este último a menudo indica el orden de denominación. Por ejemplo, miR-124 fue nombrado y probablemente descubierto antes que miR-456. Un "miR-" en mayúsculas se refiere a la forma madura del miRNA, mientras que "mir-" sin mayúsculas se refiere al pre-miRNA y al pri-miRNA. [35] Los miARN que codifican genes también se nombran utilizando el mismo prefijo de tres letras de acuerdo con las convenciones de la nomenclatura de genes del organismo. Por ejemplo, los nombres de genes oficiales de miARN en algunos organismos son "mir-1 en C. elegans y Drosophila, Mir-1 en Rattus norvegicus y MIR-25 en humanos.

Los miARN con secuencias casi idénticas a excepción de uno o dos nucleótidos se anotan con una letra minúscula adicional. Por ejemplo, miR-124a está estrechamente relacionado con miR-124b. Por ejemplo:

Los pre-miARN, pri-miARN y genes que conducen a miARN maduros 100% idénticos pero que se encuentran en diferentes lugares del genoma se indican con un sufijo adicional de número de guiones. Por ejemplo, los pre-miARN hsa-mir-194-1 y hsa-mir-194-2 conducen a un miARN maduro idéntico (hsa-miR-194) pero son de genes ubicados en diferentes regiones del genoma.

La especie de origen se designa con un prefijo de tres letras, por ejemplo, hsa-miR-124 es un humano (Homo sapiens) miRNA y oar-miR-124 es una oveja (Ovis aries) miARN. Otros prefijos comunes incluyen "v" para viral (miARN codificado por un genoma viral) y "d" para Drosophila miARN (una mosca de la fruta comúnmente estudiada en la investigación genética).

Cuando dos microARN maduros se originan a partir de brazos opuestos del mismo pre-miARN y se encuentran en cantidades aproximadamente similares, se indican con un sufijo -3p o -5p. (En el pasado, esta distinción también se hacía con "s" (sentido) y "as" (antisentido)). Sin embargo, el microARN maduro que se encuentra en un brazo de la horquilla suele ser mucho más abundante que el que se encuentra en el otro brazo, [4] en cuyo caso, un asterisco después del nombre indica la especie madura que se encuentra en niveles bajos en el brazo opuesto de una horquilla. Por ejemplo, miR-124 y miR-124 * comparten una horquilla pre-miRNA, pero se encuentra mucho más miR-124 en la célula.

Los miARN de plantas suelen tener un apareamiento casi perfecto con sus dianas de ARNm, lo que induce la represión génica a través de la escisión de las transcripciones diana. [20] Por el contrario, los miARN de animales pueden reconocer sus ARNm diana utilizando tan solo 6-8 nucleótidos (la región de la semilla) en el extremo 5 'del miARN, [11] [36] [37] que no es suficiente emparejamiento para inducir la escisión de los ARNm diana. [2] La regulación combinatoria es una característica de la regulación de miARN en animales. [2] [38] Un miARN dado puede tener cientos de objetivos de ARNm diferentes, y un objetivo determinado puede estar regulado por múltiples miARN. [12] [39]

Las estimaciones del número medio de ARN mensajeros únicos que son objetivos de la represión por un miRNA típico varían, dependiendo del método de estimación, [40] pero múltiples enfoques muestran que los miRNA de mamíferos pueden tener muchos objetivos únicos. Por ejemplo, un análisis de los miARN altamente conservados en vertebrados muestra que cada uno tiene, en promedio, aproximadamente 400 dianas conservadas. [12] Asimismo, los experimentos muestran que una sola especie de miARN puede reducir la estabilidad de cientos de ARN mensajeros únicos. [41] Otros experimentos muestran que una sola especie de miARN puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (mucho menos del doble). [42] [43] La primera enfermedad humana que se descubrió que estaba asociada con la desregulación de los miARN fue la leucemia linfocítica crónica. Le siguieron otras neoplasias malignas de células B.

Hasta el 40% de los genes de miARN pueden estar en los intrones o incluso en los exones de otros genes. [44] Por lo general, aunque no exclusivamente, se encuentran en una orientación de sentido, [45] [46] y, por lo tanto, generalmente se regulan junto con los genes del huésped. [44] [47] [48]

La plantilla de ADN no es la última palabra sobre la producción de miARN maduro: el 6% de los miARN humanos muestran edición de ARN (IsomiR), la modificación específica del sitio de las secuencias de ARN para producir productos diferentes de los codificados por su ADN. Esto aumenta la diversidad y el alcance de la acción de los miARN más allá de la implicada por el genoma solo.

Transcripción Editar

Los genes de miARN generalmente son transcritos por la ARN polimerasa II (Pol II). [49] [50] La polimerasa a menudo se une a un promotor que se encuentra cerca de la secuencia de ADN, codificando lo que se convertirá en el bucle de horquilla del pre-miARN. La transcripción resultante está cubierta con un nucleótido especialmente modificado en el extremo 5 ', poliadenilado con múltiples adenosinas (una cola poli (A)), [49] [45] y empalmado. Los miARN animales se transcriben inicialmente como parte de un brazo de un tallo-bucle de ARN de ~ 80 nucleótidos que a su vez forma parte de un precursor de miARN de varios cientos de nucleótidos de longitud denominado pri-miARN. [49] [45] Cuando se encuentra un precursor de tallo-bucle en el 3 'UTR, una transcripción puede servir como un pri-miRNA y un mRNA. [45] La ARN polimerasa III (Pol III) transcribe algunos miARN, especialmente aquellos con secuencias de Alu cadena arriba, ARN de transferencia (ARNt) y unidades promotoras de repetición intercalada amplia de mamíferos (MWIR). [51]

Procesamiento nuclear Editar

Un solo pri-miRNA puede contener de uno a seis precursores de miRNA. Estas estructuras de bucles en horquilla están compuestas por aproximadamente 70 nucleótidos cada una. Cada horquilla está flanqueada por secuencias necesarias para un procesamiento eficiente.

La estructura del ARN bicatenario (ARNdc) de las horquillas en un pri-miARN es reconocida por una proteína nuclear conocida como Región crítica del síndrome de DiGeorge 8 (DGCR8 o "Pasha" en invertebrados), llamada así por su asociación con el síndrome de DiGeorge. DGCR8 se asocia con la enzima Drosha, una proteína que corta el ARN, para formar el complejo Microprocesador. [52] [53] En este complejo, DGCR8 orienta el dominio catalítico de ARNasa III de Drosha para liberar horquillas de pri-miARN escindiendo el ARN alrededor de once nucleótidos de la base de la horquilla (un dsARN helicoidal se convierte en el tallo). [54] [55] El producto resultante tiene un saliente de dos nucleótidos en su extremo 3 ', tiene grupos 3' hidroxilo y 5 'fosfato. A menudo se denomina pre-miARN (precursor-miARN). Se han identificado motivos de secuencia aguas abajo del pre-miARN que son importantes para un procesamiento eficiente. [56] [57] [58]

Los pre-miARN que se empalman directamente de los intrones, sin pasar por el complejo del microprocesador, se conocen como "Mirtron". Originalmente se pensó que existía solo en Drosophila y C. elegans, ahora se han encontrado mirtrones en mamíferos. [59]

Hasta el 16% de los pre-miARN pueden modificarse mediante la edición de ARN nuclear. [60] [61] [62] Con mayor frecuencia, las enzimas conocidas como adenosina desaminasas que actúan sobre el ARN (ADAR) catalizan las transiciones de adenosina a inosina (A a I). La edición de ARN puede detener el procesamiento nuclear (por ejemplo, de pri-miR-142, que conduce a la degradación por la ribonucleasa Tudor-SN) y alterar los procesos posteriores, incluido el procesamiento de miARN citoplásmico y la especificidad de la diana (por ejemplo, al cambiar la región semilla de miR-376 en el sistema nervioso central). [60]

Exportación nuclear Editar

Las horquillas de pre-miARN se exportan desde el núcleo en un proceso que involucra al transportador nucleocitoplasmático Exportin-5. Esta proteína, un miembro de la familia de las carioferinas, reconoce un saliente de dos nucleótidos dejado por la enzima RNasa III Drosha en el extremo 3 'de la horquilla pre-miARN. El transporte mediado por exportina-5 al citoplasma depende de la energía, utilizando trifosfato de guanosina (GTP) unido a la proteína Ran. [63]

Procesamiento citoplásmico Editar

En el citoplasma, la horquilla de pre-miARN es escindida por la enzima Dicer de RNasa III. [64] Esta endoribonucleasa interactúa con los extremos 5 'y 3' de la horquilla [65] y corta el bucle que une los brazos 3 'y 5', produciendo un miARN: miARN * dúplex imperfecto de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. [64] La longitud total de la horquilla y el tamaño del bucle influyen en la eficiencia del procesamiento de Dicer. La naturaleza imperfecta del emparejamiento miARN: miARN * también afecta la escisión. [64] [66] Algunos de los pre-miRNA ricos en G pueden adoptar potencialmente la estructura G-quadruplex como una alternativa a la estructura canónica de tallo-bucle. Por ejemplo, el pre-miRNA 92b humano adopta una estructura G-quadruplex que es resistente a la escisión mediada por Dicer en el citoplasma. [67] Aunque cualquiera de las hebras del dúplex puede actuar potencialmente como un miARN funcional, solo una hebra se incorpora generalmente en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) donde interactúan el miARN y su ARNm diana.

Si bien la mayoría de los miARN se encuentran dentro de la célula, algunos miARN, comúnmente conocidos como miARN circulantes o miARN extracelulares, también se han encontrado en el ambiente extracelular, incluidos varios fluidos biológicos y medios de cultivo celular. [68] [69]

Biogénesis en plantas Editar

La biogénesis de miARN en plantas se diferencia de la biogénesis animal principalmente en los pasos de procesamiento nuclear y exportación. En lugar de ser escindidos por dos enzimas diferentes, una vez dentro y una vez fuera del núcleo, ambas escisiones del miARN de la planta son realizadas por un homólogo de Dicer, llamado Dicer-like1 (DL1). DL1 se expresa solo en el núcleo de las células vegetales, lo que indica que ambas reacciones tienen lugar dentro del núcleo. Antes de que el miARN vegetal: los dúplex de miARN * se transporten fuera del núcleo, sus salientes 3 'se metilan por una proteína de ARN metiltransferasa llamada Hua-Enhancer1 (HEN1). Luego, el dúplex es transportado fuera del núcleo al citoplasma por una proteína llamada Hasty (HST), un homólogo de Exportin 5, donde se desmontan y el miARN maduro se incorpora al RISC. [70]

El miARN maduro es parte de un complejo silenciador inducido por ARN activo (RISC) que contiene Dicer y muchas proteínas asociadas. [71] El RISC también se conoce como complejo de microARN ribonucleoproteico (miRNP). [72] Un RISC con miARN incorporado a veces se denomina "miRISC".

Se cree que el procesamiento en dicer del pre-miARN está acoplado con el desenrollado del dúplex. Generalmente, solo se incorpora una hebra en el miRISC, seleccionada sobre la base de su inestabilidad termodinámica y un apareamiento de bases más débil en el extremo 5 'en relación con la otra hebra. [73] [74] [75] La posición del tallo-bucle también puede influir en la elección de la hebra. [76] El otro segmento, llamado segmento de pasajeros debido a sus niveles más bajos en el estado estacionario, se indica con un asterisco (*) y normalmente está degradado. En algunos casos, ambas cadenas del dúplex son viables y se convierten en miARN funcionales que se dirigen a diferentes poblaciones de ARNm. [77]

Los miembros de la familia de proteínas Argonaute (Ago) son fundamentales para la función RISC. Los argonautos son necesarios para el silenciamiento inducido por miARN y contienen dos dominios de unión de ARN conservados: un dominio PAZ que puede unirse al extremo 3 'monocatenario del miARN maduro y un dominio PIWI que estructuralmente se asemeja a la ribonucleasa-H y funciona para interactuar con el 5' extremo de la hebra guía. Se unen al miARN maduro y lo orientan para interactuar con un ARNm diana. Algunos argonautes, por ejemplo Ago2 humano, escinden las transcripciones diana directamente. Los argonautes también pueden reclutar proteínas adicionales para lograr la represión traduccional. [78] El genoma humano codifica ocho proteínas argonauta divididas por similitudes de secuencia en dos familias: AGO (con cuatro miembros presentes en todas las células de mamíferos y llamados E1F2C / hAgo en humanos) y PIWI (que se encuentra en la línea germinal y en las células madre hematopoyéticas) . [72] [78]

Los componentes adicionales de RISC incluyen TRBP [proteína de unión al ARN de respuesta transactivante (TAR) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)], [79] PACT (proteína activadora de la proteína quinasa inducida por interferón), el complejo SMN, proteína de retraso mental X frágil (FMRP) , La proteína que contiene el dominio nucleasa estafilocócica de Tudor (Tudor-SN), la ADN helicasa putativa MOV10 y el motivo de reconocimiento de ARN que contiene la proteína TNRC6B. [63] [80] [81]

Modo de silenciamiento y bucles regulatorios Editar

El silenciamiento de genes puede ocurrir a través de la degradación del ARNm o evitando que el ARNm se traduzca. Por ejemplo, miR16 contiene una secuencia complementaria al elemento rico en AU que se encuentra en el 3'UTR de muchos ARNm inestables, como TNF alfa o GM-CSF. [82] Se ha demostrado que, dada la complementariedad completa entre el miARN y la secuencia de ARNm diana, Ago2 puede escindir el ARNm y conducir a la degradación directa del ARNm. En ausencia de complementariedad, el silenciamiento se logra evitando la traducción.[41] La relación de miRNA y su mRNA objetivo puede basarse en la simple regulación negativa de un mRNA objetivo, pero parece que un escenario común es el uso de un "ciclo de retroalimentación coherente", "ciclo de retroalimentación negativa mutua" (también denominado bucle negativo doble) y "bucle de retroalimentación positiva / retroalimentación". Algunos miARN funcionan como amortiguadores de cambios aleatorios en la expresión génica que surgen debido a eventos estocásticos en la transcripción, traducción y estabilidad de las proteínas. Tal regulación se logra típicamente en virtud de bucles de retroalimentación negativa o salida de proteína de desacoplamiento de bucle de alimentación hacia adelante incoherente de la transcripción de ARNm.

La rotación de miARN maduro es necesaria para cambios rápidos en los perfiles de expresión de miARN. Durante la maduración del miARN en el citoplasma, se cree que la captación de la proteína Argonaute estabiliza la hebra guía, mientras que la hebra opuesta (* o "pasajera") se destruye preferentemente. En lo que se ha llamado una estrategia de "Úselo o piérdalo", Argonaute puede retener preferentemente miARN con muchos objetivos sobre miARN con pocos o ningún objetivo, lo que lleva a la degradación de las moléculas no dirigidas. [83]

Decaimiento de miARN maduros en Caenorhabditis elegans está mediada por la exoribonucleasa XRN2 5 'a 3', también conocida como Rat1p. [84] En las plantas, los miembros de la familia SDN (nucleasa degradadora de ARN pequeño) degradan los miARN en la dirección opuesta (3 'a 5'). En los genomas animales se codifican enzimas similares, pero no se han descrito sus funciones. [83]

Varias modificaciones de miARN afectan la estabilidad de miARN. Como lo indica el trabajo en el organismo modelo. Arabidopsis thaliana (thale berro), los miARN de plantas maduras parecen estabilizarse mediante la adición de restos metilo en el extremo 3 '. Los grupos metilo conjugados con 2'-O bloquean la adición de residuos de uracilo (U) por las enzimas uridiltransferasas, una modificación que puede estar asociada con la degradación de miARN. Sin embargo, la uridilación también puede proteger algunos miARN; las consecuencias de esta modificación no se comprenden completamente. Se ha informado de la uridilación de algunos miARN animales. Los miARN tanto de plantas como de animales pueden alterarse mediante la adición de residuos de adenina (A) al extremo 3 'del miARN. Una A adicional añadida al final del miR-122 de mamíferos, un miARN enriquecido en hígado importante en la hepatitis C, estabiliza la molécula y los miARN de plantas que terminan con un residuo de adenina tienen tasas de descomposición más lentas. [83]

La función de los miARN parece estar en la regulación genética. Para ello, un miARN es complementario a una parte de uno o más ARN mensajeros (ARNm). Los miARN animales suelen ser complementarios a un sitio en la UTR 3 ', mientras que los miARN vegetales suelen ser complementarios a las regiones codificantes de los ARNm. [86] El emparejamiento de bases perfecto o casi perfecto con el ARN objetivo promueve la escisión del ARN. [87] Este es el modo principal de los miARN de plantas. [88] En los animales, los emparejamientos son imperfectos.

Para que los microARN parcialmente complementarios reconozcan sus objetivos, los nucleótidos 2-7 del miARN (su "región semilla" [11] [36]) deben ser perfectamente complementarios. [89] Los miARN animales inhiben la traducción de proteínas del ARNm diana [90] (esto está presente pero es menos común en las plantas). [88] Los microARN parcialmente complementarios también pueden acelerar la desadenilación, provocando que los ARNm se degraden antes. [91] Si bien la degradación del ARNm dirigido a miARN está bien documentada, se debate acaloradamente si la represión de la traducción se logra a través de la degradación del ARNm, la inhibición de la traducción o una combinación de ambas. Trabajo reciente sobre miR-430 en pez cebra, así como sobre bantam-miRNA y miR-9 en Drosophila células cultivadas, muestra que la represión de la traducción es causada por la interrupción del inicio de la traducción, independientemente de la desadenilación del ARNm. [92] [93]

Los miARN ocasionalmente también causan modificación de histonas y metilación del ADN de sitios promotores, lo que afecta la expresión de genes diana. [94] [95]

Se describen y ensamblan nueve mecanismos de acción de miARN en un modelo matemático unificado: [85]

  • Inhibición de la iniciación de Cap-40S
  • Inhibición de la unión de la unidad ribosómica 60S
  • Inhibición de alargamiento
  • Caída de ribosoma (terminación prematura)
  • Degradación de proteínas nacientes co-traduccionales
  • Secuestro en cuerpos P
  • Decaimiento del ARNm (desestabilización)
  • escisión de ARNm
  • Inhibición transcripcional a través de la reorganización de la cromatina mediada por microARN seguida de silenciamiento génico.

A menudo es imposible discernir estos mecanismos utilizando datos experimentales sobre velocidades de reacción estacionarias. Sin embargo, se diferencian en dinámicas y tienen diferentes firmas cinéticas. [85]

A diferencia de los microARN de plantas, los microARN de animales se dirigen a diversos genes. [36] Sin embargo, los genes involucrados en funciones comunes a todas las células, como la expresión génica, tienen relativamente menos sitios diana de microARN y parecen estar bajo selección para evitar la orientación de microARN. [96]

El dsRNA también puede activar la expresión génica, un mecanismo que se ha denominado "activación génica inducida por ARN pequeño" o ARNa. Los dsRNA que se dirigen a los promotores de genes pueden inducir una potente activación transcripcional de genes asociados. Esto se demostró en células humanas utilizando dsRNA sintéticos denominados RNA activadores pequeños (saRNA), [97] pero también se ha demostrado para microRNA endógenos. [98]

Se cree que las interacciones entre microARN y secuencias complementarias en genes e incluso pseudogenes que comparten homología de secuencia son un canal de retorno de comunicación que regula los niveles de expresión entre genes parálogos. Dado el nombre de "ARN endógenos competidores" (ARNc), estos microARN se unen a "elementos de respuesta de microARN" en genes y pseudogenes y pueden proporcionar otra explicación para la persistencia del ADN no codificante. [99]

Algunas investigaciones muestran que la carga de ARNm de los exosomas puede tener un papel en la implantación, pueden provocar una adhesión salvaje entre el trofoblasto y el endometrio o apoyar la adhesión regulando negativamente o regulando al alza la expresión de genes implicados en la adhesión / invasión. [100]

Además, el miARN como miR-183/96/182 parece jugar un papel clave en el ritmo circadiano. [101]

Los miARN están bien conservados tanto en plantas como en animales, y se cree que son un componente vital y evolutivamente antiguo de la regulación genética. [102] [103] [104] [105] [106] Si bien los componentes centrales de la vía del microARN se conservan entre plantas y animales, los repertorios de miARN en los dos reinos parecen haber surgido de forma independiente con diferentes modos de acción primarios. [107] [108]

Los microARN son marcadores filogenéticos útiles debido a su aparentemente baja tasa de evolución. [109] El origen de los microARN como mecanismo regulador desarrollado a partir de la maquinaria de ARNi anterior que se utilizó inicialmente como defensa contra material genético exógeno, como los virus. [110] Su origen puede haber permitido el desarrollo de la innovación morfológica y, al hacer que la expresión génica sea más específica y 'sintonizable', permitió la génesis de órganos complejos [111] y quizás, en última instancia, la vida compleja. [106] Las ráfagas rápidas de innovación morfológica generalmente se asocian con una alta tasa de acumulación de microARN. [109] [111]

Los nuevos microARN se crean de múltiples formas. Los nuevos microARN pueden originarse a partir de la formación aleatoria de horquillas en secciones "no codificantes" de ADN (es decir, intrones o regiones intergénicas), pero también mediante la duplicación y modificación de microARN existentes. [112] Los microARN también pueden formarse a partir de duplicaciones invertidas de secuencias codificantes de proteínas, lo que permite la creación de una estructura de horquilla plegable. [113] La tasa de evolución (es decir, la sustitución de nucleótidos) en los microARN de origen reciente es comparable a la de otras partes del ADN no codificante, lo que implica la evolución por deriva neutra; sin embargo, los microARN más antiguos tienen una tasa de cambio mucho menor (a menudo menos de una sustitución por cien millones de años), [106] sugiriendo que una vez que un microARN gana una función, se somete a una selección purificadora. [112] Las regiones individuales dentro de un gen de miARN enfrentan diferentes presiones evolutivas, donde las regiones que son vitales para el procesamiento y la función tienen niveles más altos de conservación. [114] En este punto, un microARN rara vez se pierde del genoma de un animal, [106] aunque los microARN más nuevos (por lo tanto, presumiblemente no funcionales) se pierden con frecuencia. [112] En Arabidopsis thaliana, se ha predicho que el flujo neto de genes de miARN está entre 1,2 y 3,3 genes por millón de años. [115] Esto los convierte en un valioso marcador filogenético, y se los está considerando como una posible solución a problemas filogenéticos sobresalientes, como las relaciones de los artrópodos. [116] Por otro lado, en varios casos, los microARN se correlacionan pobremente con la filogenia, y es posible que su concordancia filogenética refleje en gran medida una muestra limitada de microARN. [117]

Los microARN se encuentran en los genomas de la mayoría de los organismos eucariotas, desde las algas pardas [118] hasta los animales. Sin embargo, la diferencia en cómo funcionan estos microARN y la forma en que se procesan sugiere que los microARN surgieron de forma independiente en plantas y animales. [119]

Centrándonos en los animales, el genoma de Mnemiopsis leidyi [120] parece carecer de microARN reconocibles, así como de las proteínas nucleares Drosha y Pasha, que son fundamentales para la biogénesis de microARN canónicos. Es el único animal hasta el momento del que se ha informado que ha perdido a Drosha. Los microARN juegan un papel vital en la regulación de la expresión génica en todos los animales no ctenóforos investigados hasta ahora, excepto en Trichoplax adhaerens, el único miembro conocido del phylum Placozoa. [121]

En todas las especies, en marzo de 2010 se habían identificado más de 5000 miARN diferentes. [122] Mientras que en las bacterias se producen secuencias cortas de ARN (50 - cientos de pares de bases) de una función ampliamente comparable, las bacterias carecen de microARN verdaderos. [123]

Mientras que los investigadores se centraron en la expresión de miARN en procesos fisiológicos y patológicos, surgieron varias variables técnicas relacionadas con el aislamiento de microARN. Se ha cuestionado la estabilidad de las muestras de miARN almacenadas. [69] Los microARN se degradan mucho más fácilmente que los ARNm, en parte debido a su longitud, pero también debido a las ARNasas presentes en todas partes. Esto hace que sea necesario enfriar las muestras en hielo y utilizar equipos sin ARNasa. [124]

La expresión de microARN se puede cuantificar en un proceso de reacción en cadena de la polimerasa de dos pasos de RT-PCR modificada seguida de PCR cuantitativa. Las variaciones de este método logran una cuantificación absoluta o relativa. [125] Los miARN también se pueden hibridar con microarrays, portaobjetos o chips con sondas a cientos o miles de objetivos de miARN, de modo que los niveles relativos de miARN se pueden determinar en diferentes muestras. [126] Los microARN se pueden descubrir y perfilar mediante métodos de secuenciación de alto rendimiento (secuenciación de microARN). [127] La ​​actividad de un miARN puede inhibirse experimentalmente usando un oligo de ácido nucleico bloqueado (LNA), un oligo Morfolino [128] [129] o un oligo 2'-O-metil ARN. [130] Un miARN específico puede ser silenciado por un antagomir complementario. La maduración de microARN puede inhibirse en varios puntos mediante oligos de bloqueo estérico. [131] [132] El sitio objetivo de miARN de una transcripción de ARNm también puede bloquearse mediante un oligo de bloqueo estérico. [133] Para la detección "in situ" de miARN, se pueden utilizar sondas LNA [134] o Morpholino [135]. La conformación bloqueada de LNA da como resultado propiedades de hibridación mejoradas y aumenta la sensibilidad y la selectividad, lo que lo hace ideal para la detección de miARN cortos. [136]

La cuantificación de alto rendimiento de miARN es propensa a errores, debido a la mayor variación (en comparación con los ARNm) que conlleva problemas metodológicos. Por tanto, la expresión de ARNm se analiza a menudo para comprobar los efectos de los miARN en sus niveles (por ejemplo, en [137]). Las bases de datos se pueden utilizar para emparejar datos de ARNm y miARN que predicen objetivos de miARN en función de su secuencia de bases. [138] [139] Si bien esto generalmente se hace después de que se hayan detectado miARN de interés (por ejemplo, debido a altos niveles de expresión), se han propuesto ideas para herramientas de análisis que integran información de expresión de ARNm y miARN. [140] [141]

Así como el miARN participa en el funcionamiento normal de las células eucariotas, la desregulación del miARN se ha asociado con la enfermedad. Una base de datos disponible públicamente y curada manualmente, miR2Disease, documenta las relaciones conocidas entre la desregulación de miARN y las enfermedades humanas. [142]

Enfermedades hereditarias Editar

Una mutación en la región de la semilla de miR-96 causa pérdida auditiva progresiva hereditaria. [143]

Una mutación en la región de la semilla de miR-184 causa queratocono hereditario con catarata polar anterior. [144]

92 racimo causa defectos esqueléticos y de crecimiento. [145]

Cáncer Editar

La primera enfermedad humana que se sabe que está asociada con la desregulación de miARN fue la leucemia linfocítica crónica. Muchos otros miARN también tienen vínculos con el cáncer y, en consecuencia, a veces se denominan "oncomirs". En las células B malignas, los miARN participan en vías fundamentales para el desarrollo de las células B, como la señalización del receptor de células B (BCR), la migración / adhesión de células B, las interacciones célula-célula en nichos inmunes y la producción y cambio de clase de inmunoglobulinas. Los miARN influyen en la maduración de las células B, la generación de células B pre, zona marginal, folicular, B1, plasmática y de memoria.

Otro papel del miARN en los cánceres es utilizar su nivel de expresión para el pronóstico. En las muestras de NSCLC, los niveles bajos de miR-324a pueden servir como indicador de una supervivencia deficiente. [146] Los niveles altos de miR-185 o bajos de miR-133b pueden correlacionarse con metástasis y una supervivencia deficiente en el cáncer colorrectal. [147]

Además, los miARN específicos pueden estar asociados con ciertos subtipos histológicos de cáncer colorrectal. Por ejemplo, se ha demostrado que los niveles de expresión de miR-205 y miR-373 aumentan en cánceres colorrectales mucinosos y cánceres de colon asociados a colitis ulcerosa productores de mucina, pero no en adenocarcinomas de colon esporádicos que carecen de componentes mucinosos. [148] Los estudios in vitro sugirieron que miR-205 y miR-373 pueden inducir funcionalmente diferentes características de la progresión neoplásica asociada a mucinosas en las células epiteliales intestinales. [148]

La proliferación de células de carcinoma hepatocelular puede surgir de la interacción de miR-21 con MAP2K3, un gen represor de tumores. [149] El tratamiento óptimo para el cáncer implica identificar con precisión a los pacientes para la terapia estratificada por riesgo. Aquellos con una respuesta rápida al tratamiento inicial pueden beneficiarse de los regímenes de tratamiento truncados, lo que demuestra el valor de las medidas precisas de respuesta a la enfermedad. Los miARN circulantes libres de células (cimiARN) son muy estables en sangre, se sobreexpresan en el cáncer y son cuantificables en el laboratorio de diagnóstico. En el linfoma de Hodgkin clásico, miR-21, miR-494 y miR-1973 en plasma son biomarcadores de respuesta a la enfermedad prometedores. [150] Los miARN circulantes tienen el potencial de ayudar en la toma de decisiones clínicas y ayudar a interpretar la tomografía por emisión de positrones combinada con la tomografía computarizada. Se pueden realizar en cada consulta para evaluar la respuesta a la enfermedad y detectar recaídas.

Los microARN tienen el potencial de usarse como herramientas u objetivos para el tratamiento de diferentes cánceres. [151] En varios estudios se ha descubierto que el microARN específico, miR-506, actúa como antagonista tumoral. Se encontró que un número significativo de muestras de cáncer de cuello uterino tenían la expresión de miR-506 regulada negativamente. Además, miR-506 trabaja para promover la apoptosis de las células de cáncer de cuello uterino, a través de su factor de transcripción de la vía hedgehog objetivo directo, Gli3. [152] [153]

Reparación de ADN y cáncer Editar

El cáncer es causado por la acumulación de mutaciones por daño del ADN o errores no corregidos en la replicación del ADN. [154] Los defectos en la reparación del ADN provocan la acumulación de mutaciones, que pueden provocar cáncer. [155] Varios genes involucrados en la reparación del ADN están regulados por microARN. [156]

Las mutaciones de la línea germinal en los genes de reparación del ADN causan sólo 2 a 5% de los casos de cáncer de colon. [157] Sin embargo, la expresión alterada de microARN, que causa deficiencias en la reparación del ADN, se asocia con frecuencia con cánceres y puede ser un factor causal importante. Entre 68 cánceres de colon esporádicos con expresión reducida de la proteína MLH1 de reparación de desajustes de ADN, se encontró que la mayoría eran deficientes debido a la metilación epigenética de la isla CpG del gen MLH1. [158] Sin embargo, hasta el 15% de las deficiencias de MLH1 en cánceres de colon esporádicos parecían deberse a la sobreexpresión del microARN miR-155, que reprime la expresión de MLH1. [159]

En el 29-66% [160] [161] de los glioblastomas, la reparación del ADN es deficiente debido a la metilación epigenética del gen MGMT, que reduce la expresión proteica de MGMT. Sin embargo, para el 28% de los glioblastomas, la proteína MGMT es deficiente, pero el promotor MGMT no está metilado. [160] En los glioblastomas sin promotores de MGMT metilados, el nivel de microARN miR-181d se correlaciona inversamente con la expresión de proteínas de MGMT y el objetivo directo de miR-181d es el ARNm de MGMT 3'UTR (las tres regiones principales sin traducir del ARNm de MGMT) . [160] Por lo tanto, en 28% de los glioblastomas, el aumento de la expresión de miR-181d y la expresión reducida de la enzima de reparación del ADN MGMT pueden ser un factor causal.

Las proteínas HMGA (HMGA1a, HMGA1b y HMGA2) están implicadas en el cáncer y la expresión de estas proteínas está regulada por microARN. La expresión de HMGA es casi indetectable en tejidos adultos diferenciados, pero está elevada en muchos cánceres. Las proteínas HMGA son polipéptidos de

100 residuos de aminoácidos caracterizados por una organización de secuencia modular. Estas proteínas tienen tres regiones altamente cargadas positivamente, denominadas ganchos AT, que se unen al surco menor de tramos de ADN ricos en AT en regiones específicas de ADN. Las neoplasias humanas, incluidos los carcinomas tiroideo, prostático, cervical, colorrectal, pancreático y ovárico, muestran un fuerte aumento de las proteínas HMGA1a y HMGA1b. [162] Los ratones transgénicos con HMGA1 dirigido a células linfoides desarrollan linfoma agresivo, lo que demuestra que la expresión alta de HMGA1 está asociada con cánceres y que HMGA1 puede actuar como un oncogén. [163] La proteína HMGA2 se dirige específicamente al promotor de ERCC1, reduciendo así la expresión de este gen de reparación del ADN. [164] La expresión de la proteína ERCC1 fue deficiente en el 100% de los 47 cánceres de colon evaluados (aunque se desconoce el grado de participación de HGMA2). [165]

Los polimorfismos de nucleótido único (SNP) pueden alterar la unión de miARN en 3'UTR, por ejemplo, el caso de hsa-mir181a y hsa-mir181b en el gen supresor de tumores CDON. [166]

Enfermedad del corazón Editar

El papel global de la función de miARN en el corazón se ha abordado inhibiendo condicionalmente la maduración de miARN en el corazón murino. Esto reveló que los miARN juegan un papel fundamental durante su desarrollo. [167] [168] Los estudios de perfiles de expresión de miARN demuestran que los niveles de expresión de miARN específicos cambian en corazones humanos enfermos, lo que apunta a su participación en miocardiopatías.[169] [170] [171] Además, los estudios en animales sobre miARN específicos identificaron funciones distintas para los miARN tanto durante el desarrollo cardíaco como en condiciones patológicas, incluida la regulación de factores clave importantes para la cardiogénesis, la respuesta de crecimiento hipertrófico y la conductancia cardíaca. [168] [172] [173] [174] [175] [176] Otra función de los miARN en las enfermedades cardiovasculares es utilizar sus niveles de expresión para el diagnóstico, el pronóstico o la estratificación del riesgo. [177] Los miARN en modelos animales también se han relacionado con el metabolismo y la regulación del colesterol.

MiRNA-712 Editar

El microARN-712 murino es un biomarcador potencial (es decir, predictor) de la aterosclerosis, una enfermedad cardiovascular de la pared arterial asociada con la retención de lípidos y la inflamación. [178] El flujo sanguíneo no laminar también se correlaciona con el desarrollo de aterosclerosis, ya que los mecanosores de las células endoteliales responden a la fuerza cortante del flujo alterado (flujo d). [179] Varios genes proaterogénicos, incluidas las metaloproteinasas de matriz (MMP), están regulados positivamente por el flujo d, [179] que median señales proinflamatorias y proangiogénicas. Estos hallazgos se observaron en arterias carótidas ligadas de ratones para imitar los efectos del d-flow. En 24 horas, miR-712 inmaduro preexistente formó miR-712 maduro, lo que sugiere que el miR-712 es sensible al flujo. [179] Coincidiendo con estos resultados, miR-712 también se regula al alza en las células endoteliales expuestas al flujo d natural en la curvatura mayor del arco aórtico. [179]

Origen Editar

La secuencia de pre-ARNm de miR-712 se genera a partir del gen RN45s ribosómico murino en la región espaciadora interna transcrita 2 (ITS2). [179] XRN1 es una exonucleasa que degrada la región ITS2 durante el procesamiento de RN45. [179] Por tanto, la reducción de XRN1 en condiciones de d-flow conduce a la acumulación de miR-712. [179]

Mecanismo Editar

MiR-712 se dirige al inhibidor tisular de las metaloproteinasas 3 (TIMP3). [179] Los TIMP normalmente regulan la actividad de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) que degradan la matriz extracelular (MEC). La ECM arterial se compone principalmente de fibras de colágeno y elastina, que proporcionan el soporte estructural y las propiedades de retroceso de las arterias. [180] Estas fibras juegan un papel crítico en la regulación de la inflamación vascular y la permeabilidad, que son importantes en el desarrollo de la aterosclerosis. [181] Expresado por células endoteliales, TIMP3 es el único TIMP unido a ECM. [180] Una disminución en la expresión de TIMP3 da como resultado un aumento de la degradación de ECM en presencia de d-flow. De acuerdo con estos hallazgos, la inhibición de pre-miR712 aumenta la expresión de TIMP3 en las células, incluso cuando se exponen a un flujo turbulento. [179]

TIMP3 también disminuye la expresión de TNFα (un regulador proinflamatorio) durante el flujo turbulento. [179] La actividad de TNFα en flujo turbulento se midió mediante la expresión de la enzima convertidora de TNFα (TACE) en sangre. El TNFα disminuyó si se inhibía miR-712 o se sobreexpresaba TIMP3, [179] lo que sugiere que miR-712 y TIMP3 regulan la actividad de TACE en condiciones de flujo turbulento.

Anti-miR-712 suprime eficazmente la expresión de miR-712 inducida por d-flow y aumenta la expresión de TIMP3. [179] Anti-miR-712 también inhibe la hiperpermeabilidad vascular, lo que reduce significativamente el desarrollo de lesiones de aterosclerosis y la infiltración de células inmunitarias. [179]

MicroARN-205 homólogo humano Editar

El homólogo humano de miR-712 se encontró en el gen homólogo de RN45, que mantiene miARN similares a los de los ratones. [179] El MiR-205 de los seres humanos comparte secuencias similares con el miR-712 de los ratones y se conserva en la mayoría de los vertebrados. [179] MiR-205 y miR-712 también comparten más del 50% de los objetivos de señalización celular, incluido TIMP3. [179]

Cuando se probó, d-flow disminuyó la expresión de XRN1 en humanos como lo hizo en las células endoteliales de ratones, lo que indica un papel potencialmente común de XRN1 en humanos. [179]

Enfermedad renal Editar

La deleción dirigida de Dicer en las células progenitoras renales derivadas de FoxD1 en un modelo murino dio como resultado un fenotipo renal complejo que incluía expansión de los progenitores de nefrona, menos células de renina, arteriolas del músculo liso, pérdida mesangial progresiva y aneurismas glomerulares. [182] El perfil de transcriptoma completo de alto rendimiento del modelo de ratón knockout FoxD1-Dicer reveló una regulación positiva ectópica del gen proapoptótico, Bcl2L11 (Bim) y una desregulación de la vía p53 con un aumento en los genes efectores de p53, incluidos Bax, Trp53inp1, Jun, Cdkn1a, Mmp2 y Arid3a. Los niveles de proteína p53 permanecieron sin cambios, lo que sugiere que los miARN estromales de FoxD1 reprimen directamente los genes efectores de p53. Utilizando un enfoque de rastreo de linaje seguido de clasificación de células activadas por fluorescencia, el perfil de miARN de las células derivadas de FoxD1 no solo definió de manera integral el panorama transcripcional de los miARN que son críticos para el desarrollo vascular, sino que también identificó miARN clave que probablemente modularán el fenotipo renal. en su ausencia. Estos miARN incluyen miRs ‐ 10a, 18a, 19b, 24, 30c, 92a, 106a, 130a, 152, 181a, 214, 222, 302a, 370 y 381 que regulan Bcl2L11 (Bim) y miRs ‐ 15b, 18a, 21, 30c, 92a, 106a, 125b ‐ 5p, 145, 214, 222, 296‐5p y 302a que regulan los genes efectores de p53. De acuerdo con los resultados del perfil, se observó apoptosis ectópica en los derivados celulares del linaje progenitor derivado de FoxD1 y reitera la importancia de los miARN del estroma renal en la homeostasis celular. [182]

Sistema nervioso Editar

Los miARN parecen regular el desarrollo y la función del sistema nervioso. [183] ​​Los miARN neuronales están involucrados en varias etapas del desarrollo sináptico, incluida la dendritogénesis (que involucra miR-132, miR-134 y miR-124), la formación de sinapsis [184] y la maduración de sinapsis (donde se cree que miR-134 y miR-138 estar involucrado). [185] La eliminación de la formación de miARN en ratones mediante el silenciamiento experimental de Dicer ha dado lugar a resultados patológicos, como reducción del tamaño neuronal y anomalías motoras cuando se silencia en las neuronas estriatales [186] y neurodegeneración cuando se silencia en las neuronas del prosencéfalo. [187] Algunos estudios encuentran expresión alterada de miARN en la enfermedad de Alzheimer, [188] así como esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión mayor y trastornos de ansiedad. [189] [190] [191]

Trazo Editar

Según el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades, el accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad a largo plazo en Estados Unidos. El 87% de los casos son accidentes cerebrovasculares isquémicos, que resultan del bloqueo en la arteria del cerebro que transporta sangre rica en oxígeno. La obstrucción del flujo sanguíneo significa que el cerebro no puede recibir los nutrientes necesarios, como oxígeno y glucosa, y eliminar desechos, como el dióxido de carbono. [192] [193] Los miARN desempeñan un papel en el silenciamiento de genes postraduccionales al dirigirse a genes en la patogénesis de la isquemia cerebral, como las vías inflamatoria, angiogénesis y apoptótica. [194]

Alcoholismo Editar

El papel vital de los miARN en la expresión génica es importante para la adicción, específicamente el alcoholismo. [195] El abuso crónico de alcohol da como resultado cambios persistentes en la función cerebral mediados en parte por alteraciones en la expresión genética. [195] La regulación global de miARN de muchos genes posteriores se considera significativa con respecto a la reorganización o conexiones sinápticas o adaptaciones neuronales a largo plazo que implican el cambio de comportamiento desde el consumo de alcohol hasta la abstinencia y / o dependencia. [196] Se ha descubierto que hasta 35 miARN diferentes están alterados en el cerebro post-mortem alcohólico, todos ellos genes diana que incluyen la regulación del ciclo celular, la apoptosis, la adhesión celular, el desarrollo del sistema nervioso y la señalización celular. [195] Se encontraron niveles alterados de miARN en la corteza prefrontal medial de ratones dependientes del alcohol, lo que sugiere el papel del miARN en la orquestación de los desequilibrios traslacionales y la creación de proteínas expresadas diferencialmente dentro de un área del cerebro donde probablemente se originan el comportamiento cognitivo complejo y la toma de decisiones. . [197]

Los miARN se pueden regular hacia arriba o hacia abajo en respuesta al consumo crónico de alcohol. La expresión de miR-206 aumentó en la corteza prefrontal de ratas dependientes del alcohol, dirigiéndose al factor de transcripción del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y, en última instancia, reduciendo su expresión. El BDNF juega un papel fundamental en la formación y maduración de nuevas neuronas y sinapsis, lo que sugiere una posible implicación en el crecimiento de la sinapsis / plasticidad sináptica en los consumidores de alcohol. [198] Se encontró que miR-155, importante en la regulación de las respuestas de neuroinflamación inducidas por el alcohol, estaba regulado al alza, lo que sugiere el papel de la microglía y las citocinas inflamatorias en la fisiopatología del alcohol. [199] Se encontró una regulación a la baja de miR-382 en el núcleo accumbens, una estructura en el prosencéfalo basal importante en la regulación de los sentimientos de recompensa que potencia los hábitos motivacionales. miR-382 es el objetivo del receptor de dopamina D1 (DRD1), y su sobreexpresión da como resultado la regulación positiva de DRD1 y delta fosB, un factor de transcripción que activa una serie de eventos de transcripción en el núcleo accumbens que finalmente resultan en comportamientos adictivos. [200] Alternativamente, la sobreexpresión de miR-382 dio como resultado una bebida atenuada y la inhibición de la regulación al alza de DRD1 y delta fosB en modelos de alcoholismo en ratas, lo que demuestra la posibilidad de utilizar productos farmacéuticos dirigidos a miARN en los tratamientos. [200]

Obesidad editar

Los miARN juegan un papel crucial en la regulación de los progenitores de células madre que se diferencian en adipocitos. [201] Se examinaron estudios para determinar qué papel desempeñan las células madre pluripotentes en la adipogénesis en la línea de células estromales inmortalizadas derivadas de la médula ósea humana hMSC-Tert20. [202] Se encontró una expresión disminuida de miR-155, miR-221 y miR-222 durante la programación adipogénica de hMSC tanto inmortalizadas como primarias, lo que sugiere que actúan como reguladores negativos de la diferenciación. Por el contrario, la expresión ectópica de los miARN 155, 221 y 222 inhibió significativamente la adipogénesis y reprimió la inducción de los reguladores maestros PPARγ y CCAAT / proteína de unión a potenciador alfa (CEBPA). [203] Esto allana el camino para posibles tratamientos genéticos para la obesidad.

Otra clase de miARN que regula la resistencia a la insulina, la obesidad y la diabetes es la familia let-7. Let-7 se acumula en los tejidos humanos durante el transcurso del envejecimiento. [204] Cuando let-7 se sobreexpresó ectópicamente para imitar el envejecimiento acelerado, los ratones se volvieron resistentes a la insulina y, por lo tanto, más propensos a la obesidad y la diabetes inducidas por una dieta alta en grasas. [205] En contraste, cuando let-7 fue inhibido por inyecciones de antagonistas específicos de let-7, los ratones se vuelven más sensibles a la insulina y notablemente resistentes a la obesidad y la diabetes inducidas por una dieta alta en grasas. La inhibición de let-7 no solo podría prevenir la obesidad y la diabetes, sino que también podría revertir y curar la afección. [206] Estos hallazgos experimentales sugieren que la inhibición de let-7 podría representar una nueva terapia para la obesidad y la diabetes tipo 2.

Hemostasia Editar

Los miARN también juegan un papel crucial en la regulación de cascadas enzimáticas complejas, incluido el sistema hemostático de coagulación sanguínea. [207] Los estudios a gran escala sobre el direccionamiento funcional de miARN han descubierto recientemente dianas terapéuticas fundamentales en el sistema hemostático. [208] [209]

Cuando el proyecto del genoma humano cartografió su primer cromosoma en 1999, se predijo que el genoma contendría más de 100.000 genes codificadores de proteínas. Sin embargo, solo se identificaron alrededor de 20.000. [210] Desde entonces, el advenimiento de enfoques bioinformáticos combinados con estudios de ordenamiento genómico que examinan el transcriptoma, [211] secuenciación sistemática de bibliotecas de ADNc de longitud completa [212] y validación experimental [213] (incluida la creación de oligonucleótidos antisentido derivados de miARN llamados antagomir ) han revelado que muchas transcripciones son ARN que no codifican proteínas, incluidos varios ARNsno y miARN. [214]

Los microARN virales juegan un papel importante en la regulación de la expresión génica de genes virales y / o del huésped para beneficiar al virus. Por lo tanto, los miARN juegan un papel clave en las interacciones huésped-virus y en la patogenia de las enfermedades virales. [215] [216] La expresión de activadores de la transcripción por virus del herpes humano-6 Se cree que el ADN está regulado por miARN viral. [217]

Los miARN pueden unirse a transcripciones de ARN mensajero (ARNm) diana de genes que codifican proteínas y controlar negativamente su traducción o causar la degradación del ARNm. Es de vital importancia identificar con precisión los objetivos de miARN. [218] Una comparación del rendimiento predictivo de dieciocho en silico algoritmos está disponible. [219] Los estudios a gran escala sobre el direccionamiento funcional de miARN sugieren que los algoritmos de predicción de blancos pueden pasar por alto muchos miARN funcionales. [208]


Materiales y métodos

Cultivo de células

Las células CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-SEAP (Hayduk y Lee 2005) y CHO-tPA (ATCC CRL-9606) se mantuvieron como cultivos adherentes en Iscove & # x02019s Modified Dulbecco & # x02019s Medium (IMDM, HyClone, Logan, UT) suplementado con suero bovino fetal dializado al 10% (dFBS, Invitrogen, Carlsbad, CA) al 5% de CO2 y 37 & # x000b0C.

Secuenciación y análisis de ARN pequeño

Se recolectaron células CHO durante la fase estacionaria del cultivo celular y se extrajeron ARN pequeños de cada línea celular utilizando el kit de aislamiento de miARN mirVana (Ambion, Austin, TX) y se prepararon bibliotecas de ADNc como se describió anteriormente (Lu et al. 2007). Las bibliotecas se secuenciaron en un Illumina Genome Analyzer IIx y las lecturas se filtraron para eliminar las secuencias de baja calidad y se recortaron para eliminar las secuencias adaptadoras antes del análisis de miARN. El número total de lecturas filtradas y recortadas para cada línea celular se usó para normalizar la expresión de miARN.

Se analizaron pequeñas secuencias de ARN con un mínimo de 10 lecturas en las tres líneas celulares mediante la búsqueda BLASTn contra los miARN maduros humanos y de roedor de la liberación de miRBase 17 (Kozomara y Griffiths-Jones 2011) y por alineación con el roedor (Cricetulus griseus, Mus musculus, y Rattus norvegicus) y secuencias precursoras humanas en la liberación de miRBase 17 (en ese orden de prioridad de especies) utilizando CLC Genomics Workbench 4.7.2 (CLC bio, Aarhus, Dinamarca) para identificar miARN conservados. Los resultados de la alineación se utilizaron como evidencia para identificar los ARN pequeños como miARN conservados. La expresión normalizada (NE) de cada miARN se calculó normalizando los recuentos de lecturas de miARN por el número total de lecturas filtradas y recortadas en cada línea celular y multiplicando por 1.000.000. Se analizó la expresión diferencial para los miARN que mostraban un cambio de & # x02265 1,5 veces en NE en las líneas de células CHO recombinantes con respecto a NE en CHO-K1. Los ARN pequeños se alinearon con el genoma de CHO-K1 usando CLC Genomics Workbench y los alineamientos genómicos se visualizaron usando Tablet (Milne et al. 2010).


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MicroARN Metabolismo de los ácidos nucleicos

Los microARN son reguladores postranscripcionales que se unen a secuencias complementarias en las tres regiones primarias no traducidas (3 'UTR) de las transcripciones de ARN mensajero diana (ARNm), lo que generalmente da como resultado el silenciamiento génico.

Enzimas nucleares

Enzimas citoplasmáticas

Para examinar el efecto regulador de miARN en la expresión génica global en condiciones endógenas, realizamos un análisis de coeficiente de correlación por pares en los niveles de expresión de 366 miARN y 14.174 ARN mensajero (ARNm) en 90 líneas celulares linfoblastoides inmortalizadas, y observamos correlaciones significativas entre las dos especies. de transcripciones de ARN. Identificamos un total de 7,207 pares de miARN-ARNm significativamente correlacionados (tasa de descubrimiento falso q & lt0.01). De ellos, 4.085 pares mostraron correlaciones positivas, mientras que 3.122 pares mostraron correlaciones negativas. Los análisis de ontología genética en los genes correlacionados con miARN revelaron enriquecimientos significativos en varios procesos biológicos relacionados con el ciclo celular, la comunicación celular y la transducción de señales. Individualmente, cada uno de los tres miARN (miR-331, -98 y -33b) demostró una correlación significativa con los genes en los procesos biológicos relacionados con el ciclo celular, lo que es consistente con el papel importante de los miARN en la regulación del ciclo celular.

Envejecimiento y microARN

Los microARN son una clase de reguladores postranscripcionales. Son cortos

Secuencias de ARN de 22 nucleótidos que se unen a secuencias complementarias en el 3 ’UTR de múltiples ARNm diana, lo que generalmente resulta en su silenciamiento. Objetivo de microARN

El 60% de todos los genes están presentes en abundancia en todas las células humanas y son capaces de reprimir cientos de objetivos cada uno. Estas características, junto con su conservación en organismos que van desde las algas unicelulares chlamydomonas reinhardtii hasta las mitocondrias, sugieren que son una parte vital de la regulación genética con orígenes antiguos.
Los microARN fueron descubiertos por primera vez en 1993 por Victor Ambros, Rosalind Lee y Rhonda Feinbaum durante un estudio sobre el desarrollo del nematodo '' C. elegans '' con respecto al gen lin-14. Esta pantalla condujo al descubrimiento de que el lin-14 podía ser regulado por un producto de ARN corto de lin-4, un gen que transcribió un precursor de 61 nucleótidos que maduró a un ARN maduro de 22 nucleótidos que contenía secuencias parcialmente complementarias a múltiples secuencias. en el 3 'UTR del ARNm de lin-14. Esta complementariedad fue suficiente y necesaria para inhibir la traducción del ARNm de lin-14. Retrospectivamente, este fue el primer microARN que se identificó, aunque en ese momento Ambros et al especularon que se trataba de una idiosincrasia de nematodos.
Fue solo en 2000 cuando se descubrió que let-7 reprime el ARNm de lin-41, lin-14, lin28, lin42 y daf12 durante la transición en las etapas de desarrollo en c elegans y que esta función se conservó filogenéticamente en especies más allá de los nematodos, que se convirtió en Al parecer, el ARN corto no codificante identificado en 1993 era parte de un fenómeno más amplio.
Desde entonces, se han descubierto más de 4000 miARN en todos los eucariotas estudiados, incluidos mamíferos, hongos y plantas. Hasta ahora se han identificado más de 700 miARN en humanos y se prevé que existan más de 800.
La comparación de miARN entre especies puede incluso usarse para delinear la historia evolutiva molecular sobre la base de que la complejidad del fenotipo de un organismo puede reflejar la del microARN que se encuentra en el genotipo.
Cuando el proyecto del genoma humano cartografió su primer cromosoma en 1999, se predijo que contendría más de 100.000 genes codificadores de proteínas. Sin embargo, solo se identificaron alrededor de 20.000 (Consorcio Internacional de Secuenciación del Genoma Humano, 2004) y durante mucho tiempo gran parte del ADN que no codifica proteínas se consideró "basura", aunque la sabiduría convencional sostiene que gran parte del genoma, si no la mayor parte, es funcional. Desde entonces, el advenimiento de enfoques bioinformáticos sofisticados combinados con estudios de ordenamiento genómico que examinan el transcriptoma, la secuenciación sistemática de bibliotecas de ADNc de longitud completa y la validación experimental (incluida la creación de oligonucleótidos antisentido derivados de miARN llamados antagomir) han revelado que muchas transcripciones son para codificación no proteica. ARN del que se han deducido muchas clases nuevas, como snoRNA y miRNA. Desafortunadamente, la tasa de validación de objetivos de microARN consume mucho más tiempo que la de predecir secuencias y objetivos.
Debido a su abundante presencia y gran potencial, los miARN tienen todo tipo de funciones en fisiología, desde la diferenciación celular, la proliferación, la apoptosis al sistema endocrino, la hematopoyesis, el metabolismo de las grasas, la morfogénesis de las extremidades. Muestran diferentes perfiles de expresión de un tejido a otro, lo que refleja la diversidad de fenotipos celulares y, como tales, sugieren un papel en la diferenciación y el mantenimiento de los tejidos.

La mayoría de los genes de microARN se encuentran en regiones intergénicas o en orientación antisentido para ciertos genes y, como tales, contienen sus propias unidades promotoras y reguladoras de genes de miARN. Sin embargo, se dice que hasta un 40% se encuentra en los intrones de genes codificantes de proteínas y no proteínas o incluso raramente en exones. Por lo general, aunque no exclusivamente, se encuentran en una orientación de sentido y, por lo tanto, generalmente muestran un perfil de expresión de regulación y transcripción concurrente que se origina a partir de un promotor común con sus genes del huésped.
Otros genes de microARN que muestran un promotor común incluyen el 42-48% de todos los miARN que se originan a partir de unidades policistrónicas que contienen de 2 a 7 bucles discretos a partir de los cuales se procesan los miARN maduros, aunque esto no significa necesariamente que los miARN maduros de una familia tengan una estructura homóloga. y función.Se ha demostrado que los promotores mencionados tienen algunas similitudes en sus motivos con los promotores de otros genes de clase II (es decir, transcritos por POL II), como los genes que codifican proteínas.
La plantilla de ADN no es la última palabra sobre la producción de miARN maduro: el 6% de los miARN humanos muestran edición de ARN, la modificación específica del sitio de las secuencias de ARN para producir productos diferentes a los codificados por su ADN. Esto aumenta la diversidad y el alcance de la acción de los miARN más allá de la implicada por el genoma solo.
En el núcleo, la polimerasa II (POL II) se usa generalmente para transcribir microARN que codifican partes del genoma, a menudo mediante la unión a un promotor que se encuentra cerca de la secuencia destinada a ser el bucle de horquilla del pre-miARN. Esto produce una transcripción que está rematada en el extremo 5 ', poliadenilada para dar una cola (poli) A y empalmada para formar pri-miRNA de varios cientos a miles de pb de tamaño. Curiosamente, se ha demostrado que algunos pri-miRNA son capaces de expresar de forma coordinada tanto miRNA como mRNA, cuando el precursor del tallo bucle se encuentra en la UTR 3 'de un mRNA. Con poca frecuencia, se especula que la polimerasa III (POL III) se usará en lugar de POL II cuando se transcriban microARN que tienen unidades promotoras -Alu, -tRNA, de repetición intercalada amplia de mamíferos (MWIR) cadena arriba.
Los pri-miRNA son procesados ​​por el complejo microprocesador que consiste en drosha y su cofactor DGCR8 en pre-miRNAs.
Pri-miRNA contiene al menos 1 (hasta 6 cuando se transcribe a partir de unidades policistrónicas)

Con estructuras de bucle de horquilla de 70 nucleótidos, existe la posibilidad de que un único pri-miRNA albergue muchos miRNA. Los bucles de horquilla tienen secuencias de ARN flanqueantes de nucleótidos & gt40 necesarias para un procesamiento eficaz. Estos son reconocidos por la Región crítica del síndrome de Di George 8 (DGCR8), el cofactor de drosha. DGCR8 es una proteína nuclear de unión de dsRNA que reconoce el bucle en horquilla del pri-miRNA y orienta el dominio catalítico se III del RNA de drosha para la escisión. Esta escisión ocurre alrededor de 11 nucleótidos de su base (2 ARN helicoidales se convierten en el tallo) por Drosha, una endonucleasa específica de ARN dsARN de tipo se III, para formar pre-miARN. Juntos, drosha y DGCR8 (el invertebrado equivalente es Pasha) forman el complejo de microprocesadores. El complejo de microprocesador introduce cortes escalonados en los extremos de los brazos del bucle de horquilla, lo que da como resultado un exceso de 2 nucleótidos en el extremo 3 'y fosfato en el extremo 5' para producir un pre-miARN de

70 nt de longitud. En su mayoría, un brazo del bucle de horquilla está destinado a convertirse en el miARN maduro, aunque rara vez se puede producir un miARN maduro a partir de cualquier brazo, por ejemplo, Mir-458-3p / mir-458-5p y mir-202 / mir-202 * con el asterisco que se aplica a la transcripción menos predominantemente expresada.
Existe evidencia de que los pre-miRNA se pueden producir sin tener que someterse a la maquinaria del microprocesador si se empalman directamente de los intrones en los que residen. Estos miARN se denominan mirtrones y tradicionalmente se pensaba que solo existían en drosphila y c elegans. Sin embargo, recientemente se han descubierto mirtones de mamíferos que incluso muestran conservación entre especies.
Pri-miRNA también puede estar sujeto a edición de ARN en la que el procesamiento de miARN o la especificidad se altera a través de la adenosina desaminasa que actúa sobre las enzimas de ARN (ADAR) que catalizan las transiciones de adenosina a inosina, la forma más común de edición de ARN en metazoos. Se ha demostrado que la edición de ARN ocurre en el 6% de los miARN, incluso alterando la especificidad de los miARN cuando se observó en la región semilla de miR-376, aunque esto solo está presente en el SNC.
La edición de ARN de microARN también puede prevenir su procesamiento, como se ve en la edición de pri-miR-142 que conduce a la degradación por parte de la proteína tudor SN (un componente RISC) y, por lo tanto, evita la vía drosha. En general, esto ofrece muchas implicaciones en la expansión del papel ya complicado en la expresión genética que se cubren con más detalle de lo que este artículo tiene la oportunidad de hacer en una excelente revisión.
La proteína de la membrana nuclear exportina 5 reconoce el saliente de 2 nucleótidos en el extremo 3 del pre-miARN y luego lo transporta al citoplasma usando ran-guanina trifosfatasa (Ran-GTP).
Escisión de Dicer, unión de cofactor y formación de RISC
En el citoplasma, el pre-miRNA es escindido por otra endonucleasa bicatenaria de tipo RNA se III llamada Dicer. La escisión en dicer del pre-miARN da como resultado un miARN: miARN dúplex imperfecto de alrededor de 20-25 nucleótidos de tamaño que contiene la hebra de miARN madura y su hebra de miARN complementaria opuesta. Dicer está asociado con los cofactores del virus de inmunodeficiencia (VIH), la proteína de unión al ARN de respuesta transactivante (TRBP) y el activador de proteína de la proteína quinasa inducida por interferón PACT que físicamente ponen en contacto el complejo TRBP-PACT-dicer con Ago2 para formar el silenciamiento inducido por ARN ( RISC) aparato de carga. Se cree que el procesamiento en dicer del pre-miRNA está acoplado al desenrollado del dúplex para producir un miRNA maduro al que se une Ago2, formando el complejo miRISC activo. El miARN maduro luego guía al RISC a los sitios de destino para inducir el silenciamiento. La secuencia precisa de eventos es difícil de dilucidar y aún se debate.
En general, solo 1 hebra del dúplex de miARN se incorpora al miRISC y se selecciona sobre la base de que es menos estable termodinámicamente y capaz de un emparejamiento de bases más débil que la otra hebra, aunque la posición del tallo-bucle dentro de la pre Se ha implicado a miARN. La otra hebra, llamada hebra pasajera debido a sus niveles más bajos en el estado estacionario, se denota por miARN. En resumen, los ARN de interferencia (ARNip) a menudo es escindido y degradado por la proteína argonauta Ago2 en el RISC para integrar la hebra guía en el RISC, pero esto no es necesario en los miARN. La hebra pasajera normalmente se degrada y está presente en niveles más bajos en las células en el estado estacionario, aunque ha habido casos en los que ambas hebras del dúplex han sido viables y se vuelven miARN funcionales que se dirigen a diferentes poblaciones de ARNm. Sin embargo, también hay evidencia de que el dúplex como un todo está incorporado y opera en un sistema de intercambio de hebras mediado por Proteína de Retraso Mental X Frágil (FMRP) con el ARNm diana durante el ensamblaje de miARN: ARNm.
Homo sapiens tiene 8 proteínas argonauta divididas en 2 familias basadas en similitudes de secuencia: AGO (presente en todas las células de mamíferos y llamada E1F2C / hAgo en humanos) y PIWI (conservada en la línea germinal y células madre hematopoyéticas). En los seres humanos, RISC se compone de miembros 1-4 de la familia Ago, entre otras proteínas, que parecen afectar en última instancia el resultado de miRISC: unión a la diana. Las proteínas de Ago contienen 2 dominios de unión de ARN conservados: un dominio PAZ que puede unirse al extremo 3 'monocatenario del microARN y un dominio PIWI que se parece estructuralmente a la ribonucleasa-H y funciona para interactuar con el extremo 5' de la cadena guía. Es importante señalar que de las 4 proteínas argonauta de mamíferos, solo Ago2 tiene capacidad endonucleolítica (también conocida como rebanadora) y es la única argonauta necesaria para el silenciamiento del ARN, aunque las otras están involucradas en la represión traduccional.
Hay otras proteínas que se encuentran en el miRISC, también conocidas como el complejo miRNP, que están asociadas con los AGO pero aún no están completamente caracterizadas y se cree que modulan los efectos silenciadores del miRISC, es decir, el complejo SMN, retraso mental de X frágil. proteína (FMRP), proteína que contiene el dominio nucleasa estafilocócica tudor (tudor-SN).

Funciones celulares de microARN

La función de los miARN parece estar en la regulación genética. Para ese propósito, un miARN es complementario a una parte de uno o más ARN mensajeros (ARNm). Los miARN animales suelen ser complementarios a un sitio en la UTR 3 ', mientras que los miARN vegetales suelen ser complementarios a las regiones codificantes de los ARNm. El emparejamiento de bases perfecto o casi perfecto con el ARN objetivo promueve la escisión del ARN. Este es el modo principal de los microARN de plantas.
En los animales, los microARN son más a menudo pares de bases parciales e inhiben la traducción de la proteína del ARNm diana (esto también existe en las plantas, pero es menos común). Para que los microARN parcialmente complementarios reconozcan sus objetivos, los nucleótidos 2-7 del miARN ("región semilla"), todavía tienen que ser perfectamente complementarios.
Los miARN ocasionalmente también causan la metilación del ADN de los sitios promotores y, por lo tanto, afectan la expresión de genes diana. Los miRNA funcionan en asociación con un complemento de proteínas denominadas colectivamente miRNP. Los miRNP humanos contienen eIF2C2 (también conocido como Argonaute 2), DDX20, GEMIN4 y microARN.
Los microARN animales se dirigen en particular a genes de desarrollo. Por el contrario, los genes implicados en funciones comunes a todas las células, como la expresión génica, tienen muy pocos sitios diana de microARN y parecen estar bajo selección para evitar la orientación de microARN.
Este efecto se describió por primera vez para el gusano '' C. elegans '' en 1993 por Victor Ambros y compañeros de trabajo. A partir de 2002, se han confirmado miARN en varias plantas y animales, incluido '' C. elegans '', humanos y la planta '' Arabidopsis thaliana ''. El trabajo en la Universidad de Louisville ha dado como resultado la producción de microarrays denominados MMC caderas que contienen todos los miARN conocidos en ese momento para humanos, ratones, ratas, perros '', C. elegans '' y '' Drosophila ''.
Los mirtron son el tipo de microARN que se encuentran en los intrones de los genes del huésped que codifican el ARNm. Todos los miARN en plantas se derivan de las escisiones secuenciales de DCL1 de pri-miARN para dar pre-miARN (o precursor de miARN). Pero los mirtrones evitan la escisión de DCL1 y entran como pre-miRNA en la vía de maduración de miRNA.

Así como el miARN participa en el funcionamiento normal de las células eucariotas, la desregulación del miARN se ha asociado con la enfermedad. La asociación de enfermedades, a su vez, ha generado mayores oportunidades de financiamiento para la investigación académica e incentivos financieros para el desarrollo y comercialización de diagnósticos y terapéuticos basados ​​en miARN. Después de que se estableciera la comercialización temprana destinada al apoyo a la investigación académica, el enfoque de la investigación inicial basada en los productos y servicios solicitados fue la investigación del cáncer y las neurociencias. Durante 2007, los intereses señalados por productos y servicios solicitados se ampliaron para incluir investigación cardíaca, virología, biología celular en general y biología vegetal.
miARN y cáncer
Se ha encontrado que varios miARN tienen vínculos con algunos tipos de cáncer.
Un estudio de ratones alterados para producir un exceso de c-myc, una proteína implicada en varios cánceres, muestra que el miARN tiene un efecto sobre el desarrollo del cáncer. Los ratones que fueron diseñados para producir un exceso de tipos de miARN que se encuentran en las células del linfoma desarrollaron la enfermedad en 50 días y murieron dos semanas después. Por el contrario, los ratones sin el miARN excedente vivieron más de 100 días.
La leucemia puede ser causada por la inserción de un virus junto a la matriz 17-92 de microARN que conduce a una mayor expresión de este microARN.
Otro estudio encontró que dos tipos de miARN inhiben la proteína E2F1, que regula la proliferación celular. El miARN parece unirse al ARN mensajero antes de que pueda traducirse a proteínas que activan y desactivan genes.
Al medir la actividad entre 217 genes que codifican miARN, se pueden discernir patrones de actividad genética que pueden distinguir tipos de cánceres. Las firmas de miARN pueden permitir la clasificación del cáncer. Esto permitirá a los médicos determinar el tipo de tejido original que generó un cáncer y poder establecer un curso de tratamiento basado en el tipo de tejido original. El perfil de miARN ya ha podido determinar si los pacientes con leucemia linfocítica crónica tenían formas agresivas o de crecimiento lento del cáncer. En 2008, las empresas Asuragen y Exiqon estaban trabajando para comercializar este potencial de miARN para actuar como biomarcadores del cáncer.
miARN y enfermedades del corazón
El papel global de la función de miARN en el corazón se ha abordado inhibiendo condicionalmente la maduración de miARN en el corazón murino, y ha revelado que los miARN juegan un papel esencial durante su desarrollo. Los estudios de perfiles de expresión de miARN demuestran que los niveles de expresión de miARN específicos cambian en corazones humanos enfermos, lo que apunta a su participación en miocardiopatías. Además, los estudios sobre miARN específicos en modelos animales han identificado roles distintos para los miARN tanto durante el desarrollo del corazón como en condiciones patológicas, incluida la regulación de factores clave importantes para la cardiogénesis, la respuesta de crecimiento hipertrófico y la conductancia cardíaca. En 2008, el trabajo académico sobre la relación entre los miARN y las enfermedades cardíacas había avanzado lo suficiente como para dar lugar al establecimiento de una empresa, miRagen Therapeutics, con un enfoque principal en "la salud y la enfermedad cardiovasculares".

Para conocer más sobre los miARN y tener más información sobre los miARN ya conocidos, es posible consultar las siguientes bases de datos:

Ejemplo de base de datos mir2disease:
Los usuarios pueden buscar todas las entradas de tres formas: por ID de miARN, por nombre de enfermedad o gen objetivo verificado experimentalmente.
Información detallada que se muestra en los resultados de la búsqueda:
ID de miARN
Nombre de la enfermedad
patrón de expresión de miARN en el estado patológico
Método de detección de la expresión de miARN
Una breve descripción de la relación miARN-enfermedad
Título y año de publicación de la referencia de la que se extrajo la entrada
Gen o genes diana validados experimentalmente extraídos de la referencia original y genes diana derivados directamente de Tarbase
Si estoy buscando miARN y enfermedades relacionadas, por ejemplo, con BCL2, tengo que poner el término en la sección de genes diana y este será mi resultado:
BCL2

Ejemplo de base de datos mirbase:
miRBase proporciona los siguientes servicios:
La base de datos miRBase es una base de datos de búsqueda de secuencias y anotaciones de miARN publicadas. Cada entrada en la base de datos de secuencias de miRBase representa una porción de horquilla predicha de una transcripción de miARN (denominada mir en la base de datos), con información sobre la ubicación y secuencia de la secuencia de miARN madura (denominada miR). Tanto las secuencias de horquilla como las maduras están disponibles para buscar y navegar, y las entradas también se pueden recuperar por nombre, palabra clave, referencias y anotaciones. Todos los datos de secuencia y anotación también están disponibles para descargar.
El registro miRBase proporciona a los cazadores de genes de miARN nombres únicos para nuevos genes de miARN antes de la publicación de los resultados.
Si estoy buscando hsa-let-7a-3 miRNa, que está involucrado en la vía BCL2, solo tengo que poner ese término en el cuadro de búsqueda y encontraré la siguiente información:
hsa-let-7a-3

Ejemplo de base de datos de microrna:
El sitio web microRNA.org es un recurso completo de perfiles de expresión y predicciones de diana de microARN. Las predicciones de los objetivos se basan en el desarrollo del algoritmo miRanda, que incorpora el conocimiento biológico actual sobre las reglas del objetivo y en el uso de un compendio actualizado de microARN de mamíferos. Los sitios diana predichos por miRanda se puntúan para determinar la probabilidad de regulación a la baja del ARNm usando mirSVR, un modelo de regresión que se entrena en la secuencia y características contextuales del dúplex miARN :: ARNm predicho. Los perfiles de expresión se derivan de un proyecto de secuenciación integral de un gran conjunto de tejidos y líneas celulares de mamíferos de origen normal y de enfermedad. Este sitio web permite a los usuarios explorar:
El conjunto de genes que están potencialmente regulados por un microARN particular.
Co-ocurrencia de sitios diana predichos para múltiples microARN en un ARNm.
Perfiles de expresión de microARN en varios tejidos de mamíferos.
Si estoy buscando hsa-let-7a-3 miRNa, que está involucrado en la vía BCL2, solo tengo que poner el término "let-7" en el cuadro de búsqueda y encontraré la siguiente información:
hsa-let-7a-3

Ejemplo de base de datos Ambion:
La base de datos Ambion proporciona información general y productos relacionados con los miARN.


RESUMEN

En las abejas melíferas, se plantea la hipótesis de que la vitelogenina (Vg) es un factor importante que afecta la señalización hormonal, el comportamiento relacionado con los alimentos, la inmunidad, la resistencia al estrés y la vida útil. Los microARN, que desempeñan un papel importante en la regulación génica postranscripcional, también afectan a muchos procesos biológicos. Se sabe que las acciones de los microARN y Vg se cruzan en el contexto de la reproducción, sin embargo, se desconoce el papel de estas asociaciones en el comportamiento social. Los efectos fenotípicos de Vg Los derribos se establecen y estudian mejor en la etapa de forrajeo de los trabajadores. Por lo tanto, aprovechamos el protocolo bien establecido de interferencia de ARN (ARNi) para Vg derribo para investigar sus efectos posteriores en la población de microARN en el cerebro y el tejido adiposo de las abejas recolectoras. Para identificar los microARN que se expresan diferencialmente entre los tejidos en control y forrajeros knockdown, utilizamos microarrays de microARN de oligonucleótidos microfluídicos μParaflo. Nuestros resultados mostraron que 76 y 74 microARN se expresaron en el cerebro de los recolectores de control y derribados, mientras que 66 y 69 microARN se expresaron en el cuerpo graso de los recolectores de control y derribados, respectivamente. La predicción objetivo identificó posibles coincidencias de semillas para un subconjunto expresado diferencialmente de microARN afectados por Vg derribar. Estos genes candidatos están involucrados en una amplia gama de procesos biológicos que incluyen la señalización de la insulina, la hormona juvenil (JH) y la señalización de ecdiesteroides que previamente se ha demostrado que afectan el comportamiento de búsqueda de alimento. Por lo tanto, aquí demostramos un vínculo causal entre el Vg el fenotipo del forrajeador knockdown y la variación en la abundancia de microARN en diferentes tejidos, con posibles consecuencias para la regulación del comportamiento de forrajeo.


MiARN * - formas estelares de miARN - (18 / mayo / 2008)

Hola,
tal vez alguien pueda ayudarme a comprender esto ...

¿Qué son exactamente estos miARN *?
También se derivan de la misma estructura de horquilla que el miARN "normal". Por tanto, si el miARN "normal" se denomina posteriormente "miARN maduro" o "hebra guiada", el miARN * es la hebra pasajera. ¿En qué medida estos miARN * son complementarios del miARN "normal"? ¿Es posible que las formas estelares de miARN puedan actuar como antimir?
Y por qué solo se han descubierto o predicho unas pocas formas estelares.

Muchas gracias por cualquier respuesta & # 33

Alguien más me corrija si me equivoco, pero creo que se trata principalmente de porcentajes de clonación:

Las primeras estrategias de clonación solo tenían unos pocos clones por cada miARN descubierto. Estos se nombraron sin *, es decir, la hebra guía madura de miARN (miR-xx). Pero luego, más tarde, y más recientemente con la secuenciación de alto rendimiento, la gente también comenzó a clonar / secuenciar la hebra opuesta. Si la hebra opuesta se encuentra a baja frecuencia (menos del 15% de la hebra guía), se denomina miR-xx *. Sin embargo, si los dos & quotarms & quot del pre-miRNA son más iguales en su distribución, entonces no se nombran *, sino miR-xx-3p y miR-xx-5p, dependiendo de su ubicación en 5 & # 39 o 3 & # 39 de la molécula de miARN. Ambas especies podrían tener potencialmente un efecto biológico.

En cuanto a su segunda pregunta, por qué hay pocos miARN *, se ha planteado la hipótesis de que la hebra con mayor estabilidad en el extremo 5 & # 39 está degradada. Supongo que si se degradan rápidamente, no se clonarán con frecuencia. Pero aún podría predecirlos, pero creo que miRbase solo los coloca en su base de datos si hay evidencia de su existencia.

La hebra en estrella es en su mayoría complementaria a la hebra guía, pero por lo general hay voladizos monocatenarios en cada extremo, normalmente hay uno o varios pares erróneos y, a veces, hay bases extra o faltantes que provocan `` burbujas '' monocatenarias. Examinar los archivos en miRBase es una buena manera de tener una idea del grado de complementariedad de los hilos guía y estrella.

La hebra pasajera de un ARNip es análoga a la hebra estelar de un miARN.

Los oligonucleótidos sintéticos que están destinados a interferir con la maduración o la actividad de los miARN, como los antimiR o los morfolinos, están diseñados para ser completamente complementarios a sus objetivos. Dado que una hebra estelar no es completamente complementaria a una hebra guía, un oligo inhibidor no tendría una secuencia idéntica a la hebra estrella incluso si se unieran a la misma secuencia de hebra guía, el oligo artificial estaría perfectamente unido, mientras que la hebra estrella tendría ( al menos) contienen pares incorrectos.

Gracias por tus respuestas.
A mi siguiente problema: tratamos de sobreexpresar miARN mediante la transfección de los miARN que están codificados en un vector de expresión (ya sea clonado por nosotros mismos u ordenado) en células endoteliales humanas. Para la cuantificación del nivel de miARN utilizamos kits de tiempo real AB Taqman. Como resultado, tenemos un mayor nivel de miARN en las células transfectadas con el vector ctrl (vector vacío) que en las células transfectadas con el vector que codifica el miARN.
Entonces, ¿puede imaginar que es posible que después de la transfección, la forma de estrella / hebra pasajera se incorpore al complejo RISC en lugar de la hebra guiada? ¿Y con eso, se inhibe el nivel de miARN endógeno? Si es así, ¿en qué medida? 50% & quot; derribo & quot ... menos ... ¿más? ¿Y la frecuencia? No he leído sobre este problema en ningún periódico.
Tenemos este problema con al menos 4 miARN ... pero PODEMOS sobreexpresarlos al transfectarlos como miARN precursores (Ambion).

¿Exactamente cómo clonó en su plásmido? PCR u oligo? La mayoría de las personas amplifican por PCR el miARN maduro +/-

100 pb 5 & # 39 y 3 & # 39 para que clones el miARN precursor, que es procesado por drosha y dicer.


CZ, FF y LZ concibieron y diseñaron el estudio. CZ y FF realizaron los experimentos y escribieron el manuscrito. JZ y BP recolectaron los materiales vegetales. FF y XD analizaron y modificaron los datos. CL, HY, PW y WZ brindaron asesoramiento y asistencia. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola (CXGC2017JQ004) y el Programa de Desarrollo de Ciencia y Tecnología (20190101007JH) de la provincia de Jilin y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31971969).


RESULTADOS

MiARN derivados de elementos transponibles:

miRBase es una base de datos en línea de secuencias de genes de miARN y sitios objetivo predichos (G riffiths -J ones et al. 2006), la versión 8.2 de miRBase contenía 462 secuencias de genes de miARN humanos. De estos genes de miARN humanos, 379 se definen sobre la base de información experimental, clonación de secuencias de miARN maduras en su mayor parte, mientras que 83 son predicciones sobre la base de la similitud de secuencia con miARN que se han caracterizado experimentalmente en especies relacionadas. Asignamos estos genes de miARN humanos a la secuencia completa del genoma y comparamos sus ubicaciones con las ubicaciones de los ET anotados. Un total de 68 genes de miARN humanos comparten secuencias con ET, y todos menos 7 corresponden a miARN caracterizados experimentalmente a partir de muestras humanas. La ausencia de ab initio Las predicciones de genes de miARN en el conjunto de datos de miRBase aseguran que estamos descubriendo De buena fe Relaciones TE-miARN. De estos miARN relacionados con TE, 49 se encuentran en secuencias de intrones, mientras que 19 son intergénicos.

Los miARN relacionados con TE difieren en términos del grado de superposición con las secuencias de TE y el número de secuencias de TE distintas de las que se derivan. Para cada miRNA humano individual relacionado con TE, un esquema en la Figura 2 complementaria (en http://www.genetics.org/supplemental/) ilustra la identidad de todas las secuencias de TE colocadas junto con la extensión y posición de la superposición de TE-miRNA y la relación entre la orientación específica de la hebra del TE y el miARN. La mayoría (50 de 68) de los miARN relacionados con TE consisten en & gt50% de posiciones derivadas de TE (Figura 1A), y es probable que esta cifra sea una subestimación ya que se sabe que muchas secuencias de TE han divergido más allá de la capacidad de ser reconocidas por el software de anotación RepeatMasker. La distribución de superposición de TE-miARN para la región del gen de miARN que corresponde a la secuencia reguladora procesada (madura) es aún más bimodal (Figura 1B) 47 secuencias tienen & gt95% de posiciones de miARN maduras cubiertas por la secuencia de TE. Sin embargo, hay un puñado (7 de 68) de genes de miARN relacionados con TE que tienen & lt20% de sus secuencias colocadas con la secuencia de TE. Estos pueden representar casos espurios de superposición de TE-miARN. Se utilizó la inspección visual de las alineaciones TE-miARN (Figura 2 complementaria en http://www.genetics.org/supplemental/) para eliminar estos casos poco fiables. Solo los 55 casos con al menos 50% de cobertura de TE de la secuencia pre-miARN y / o 100% de cobertura de TE de la secuencia de miARN maduro se consideraron como miARN reales derivados de TE y se usaron para análisis adicionales (Tabla 1). Estos 55 miARN derivados de TE representan aproximadamente el 12% (55/462) de todos los miARN humanos informados en miRBase versión 8.2.

Porcentaje de residuos derivados de TE en genes de miARN. Las distribuciones de frecuencia se muestran para los porcentajes de residuos derivados de TE en relación con las secuencias de genes de miARN (A) y secuencias de miARN maduras (B).


Ver el vídeo: Silenciación de genes Micro ARN- Bioquímica 321 (Mayo 2022).