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¿Por qué los neutrófilos deben morir después de la fagocitosis de patógenos?

¿Por qué los neutrófilos deben morir después de la fagocitosis de patógenos?


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Del artículo mencionado a continuación, los neutrófilos deben eliminarse porque su contenido de gránulos y metabolitos de oxígeno (utilizados para matar patógenos fagocitados) son dañinos para el tejido circundante. Por lo tanto, el proceso utilizado para esto es que los neutrófilos se someten a apoptosis y luego son fagocitados por macrófagos.

Sin embargo, no veo por qué los neutrófilos necesitan morir primero para ser fagocitados por macrófagos. ¿Los macrófagos no fagocitan las células vivas?

Fuente: http://www.sciencebrainwaves.com/the-immune-cell-the-neutrophil-the-good-the-bad-or-the-ugly/

Una vez que se han tratado los patógenos, y para resolver completamente la inflamación, los neutrófilos deben eliminarse del tejido ... Para eliminarlos, los neutrófilos primero deben morir.


Los macrófagos ciertamente pueden fagocitar células vivas, como puede leer en "Cómo funciona el sistema inmunológico" de Sompayrac, capítulos 1 y 2, pero necesitan una señal de "cómeme" de algún tipo para hacerlo. Para una bacteria que podría ser lipopolisacárido y manosa. En el caso de las células endógenas, existe un equilibrio entre las señales de "cómeme" y "no me comas". La apoptosis, además de empaquetar cuidadosamente los componentes intracelulares potencialmente tóxicos, implica regular a la baja las señales de no comerme y regular al alza las señales de comerme. Los macrófagos pueden fagocitar células vivas que parecen tener algún tipo de problema (por ejemplo, células tumorales), pero son mucho más eficientes para fagocitar células apoptóticas.

En cuanto a por qué los neutrófilos tienen que morir, además de convertirlos en objetivos más eficientes para la fagocitosis, mueren bastante rápido de todos modos. Existe cierto debate sobre la duración exacta de su vida, pero desde el momento en que son liberados por la médula ósea, la vida media circulante es probablemente inferior a 24 horas, independientemente de si salen del torrente sanguíneo como parte de un proceso inflamatorio o no. La función exacta de esta corta vida es fuente de algunas especulaciones, pero sabemos que, después de ser reclutados en la respuesta inflamatoria, los neutrófilos apoptóticos ayudan a suprimir esa inflamación, desempeñando un papel importante en la regulación de los procesos que los enviaron al tejido. en primer lugar.

El libro de Sompayrac es una buena descripción general, pero si desea leer los detalles sangrientos, esta es una buena reseña.


Fagocitosis

Nuestros editores revisarán lo que ha enviado y determinarán si deben revisar el artículo.

Fagocitosis, proceso por el cual ciertas células vivas llamadas fagocitos ingieren o engullen otras células o partículas. El fagocito puede ser un organismo unicelular de vida libre, como una ameba, o una de las células del cuerpo, como un glóbulo blanco. En algunas formas de vida animal, como las amebas y las esponjas, la fagocitosis es un medio de alimentación. En animales superiores, la fagocitosis es principalmente una reacción defensiva contra la infección y la invasión del cuerpo por sustancias extrañas (antígenos).


Reconocimiento de patógenos

Cuando un patógeno ingresa al cuerpo, las células de la sangre y la linfa detectan los patrones moleculares asociados a patógenos específicos (PAMP) en la superficie del patógeno y rsquos. Los PAMP son carbohidratos, polipéptidos y ácidos nucleicos y ldquosignatures & rdquo que se expresan por virus, bacterias y parásitos, pero que difieren de las moléculas de las células huésped. Estos PAMP permiten que el sistema inmunológico se reconozca "a sí mismo" de "otro" para no destruir al huésped.

El sistema inmunológico tiene células específicas con receptores que reconocen estos PAMP. Un macrófago es una célula fagocítica grande que engulle partículas extrañas y patógenos. Los macrófagos reconocen los PAMP a través de receptores de reconocimiento de patrones complementarios (PRR). Los PRR son moléculas en macrófagos y células dendríticas que están en contacto con el entorno externo y, por lo tanto, pueden reconocer los PAMP cuando están presentes. Un monocito, un tipo de leucocito (glóbulo blanco) que circula en la sangre y la linfa, se diferencia en macrófagos después de pasar al tejido infectado. Las células dendríticas se unen a las firmas moleculares de los patógenos, lo que promueve la absorción y destrucción de los patógenos.

Figura ( PageIndex <1> ): Glóbulos relacionados con la respuesta inmune innata.: Las células de la sangre incluyen (1) monocitos, (2) linfocitos, (3) neutrófilos, (4) glóbulos rojos y (5) plaquetas. Los leucocitos (1, 2, 3) son glóbulos blancos que juegan un papel importante en el sistema inmunológico del cuerpo y rsquos. Figura ( PageIndex <1> ): Células involucradas en el sistema inmunológico innato.: El sistema inmunológico tiene células específicas cuyo trabajo es reconocer patrones moleculares asociados a patógenos. En este cuadro se describen las características y la ubicación de las células involucradas en el sistema inmunológico innato.

Una vez que se detecta un patógeno, el sistema inmunológico también debe rastrear si se está replicando intracelularmente (dentro de la célula, como con la mayoría de los virus y algunas bacterias) o extracelularmente (fuera de la célula, como con otras bacterias, pero no con los virus). El sistema inmunológico innato debe responder en consecuencia identificando el patógeno extracelular y / o identificando las células huésped que ya han sido infectadas.


¿Qué son los neutrófilos y qué hacen?

Los neutrófilos son un tipo de glóbulo blanco que ayuda a curar los tejidos dañados y a resolver las infecciones. Los niveles sanguíneos de neutrófilos aumentan naturalmente en respuesta a infecciones, lesiones y otros tipos de estrés. Pueden disminuir en respuesta a infecciones graves o crónicas, tratamientos farmacológicos y afecciones genéticas.

Los neutrófilos ayudan a prevenir infecciones al bloquear, inhabilitar, digerir o alejar partículas y microorganismos invasores. También se comunican con otras células para ayudarlas a reparar las células y montar una respuesta inmune adecuada.

El cuerpo produce neutrófilos en la médula ósea, que representan del 55 al 70 por ciento de todos los glóbulos blancos en el torrente sanguíneo. Un nivel normal de glóbulos blancos en el torrente sanguíneo de un adulto está entre 4.500 y 11.000 por milímetro cúbico (mm3).

Cuando hay una infección u otra fuente de inflamación en el cuerpo, sustancias químicas especiales alertan a los neutrófilos maduros, que luego abandonan la médula ósea y viajan a través del torrente sanguíneo hasta el lugar que lo necesita.

A diferencia de otras células o componentes sanguíneos, los neutrófilos pueden viajar a través de las uniones en las células que recubren las paredes de los vasos sanguíneos y entrar directamente en los tejidos.

En este artículo, analizamos las razones de los niveles altos o bajos de neutrófilos, cómo los médicos pueden evaluar estos niveles y cuáles son los niveles normales de neutrófilos para diferentes grupos.

Hay muchas razones diferentes por las que una persona puede tener niveles de neutrófilos en la sangre más altos o más bajos de lo normal.

Niveles altos

Share on Pinterest Los neutrófilos son un tipo de glóbulo blanco.

Tener un nivel anormalmente alto de neutrófilos en la sangre se conoce como leucocitosis neutrofílica, también conocida como neutrofilia.

Los aumentos en los niveles de neutrófilos generalmente ocurren de forma natural debido a infecciones o lesiones. Sin embargo, los niveles sanguíneos de neutrófilos también pueden aumentar en respuesta a:

  • algunos medicamentos, como corticosteroides, agonistas beta-2 y epinefrina
  • algunos cánceres
  • estrés físico o emocional
  • cirugía o accidentes
  • fumar tabaco
  • el embarazo
  • condiciones genéticas, como el síndrome de Down
  • extirpación quirúrgica del bazo

Algunas afecciones inflamatorias pueden aumentar los niveles de neutrófilos, incluida la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria intestinal, la hepatitis y la vasculitis.

Niveles bajos

Un nivel sanguíneo anormalmente bajo de neutrófilos es una condición llamada neutropenia.

Una caída en los niveles sanguíneos de neutrófilos ocurre típicamente cuando el cuerpo usa las células inmunes más rápido de lo que las produce o cuando la médula ósea no las produce correctamente.

Un bazo agrandado también puede causar una disminución en los niveles de neutrófilos porque el bazo atrapa y destruye los neutrófilos y otras células sanguíneas.

Algunas afecciones y procedimientos que hacen que el cuerpo use neutrófilos con demasiada rapidez incluyen:

  • infecciones bacterianas graves o crónicas
  • trastornos alérgicos
  • ciertos tratamientos farmacológicos
  • trastornos autoinmunes

Algunas afecciones, procedimientos y medicamentos específicos que interfieren con la producción de neutrófilos incluyen:

  • cáncer
  • infecciones virales, como influenza
  • infecciones por bacterias, como tuberculosis
  • mielofibrosis, un trastorno que involucra la deficiencia de B-12 cicatrizante de la médula ósea que involucra la médula ósea
  • medicamentos con fenitoína y sulfonamidas
  • toxinas, como bencenos e insecticidas
  • anemia aplásica, cuando la médula ósea deja de producir suficientes células sanguíneas
  • Neutropenia congénita grave, un grupo de trastornos en los que los neutrófilos no pueden madurar.
  • Neutropenia cíclica, que hace que los niveles celulares aumenten y disminuyan.
  • Neutropenia crónica benigna, que causa niveles bajos de células sin razón aparente.

Los médicos pueden identificar cambios en los niveles de neutrófilos a partir de un análisis de sangre llamado hemograma completo (CBC) con diferencial, que identifica grupos específicos de glóbulos blancos.

Un médico puede solicitar una prueba de hemograma completo cuando alguien experimenta una variedad de síntomas relacionados con una infección, una enfermedad crónica y una lesión, como fiebre, dolor y agotamiento. Una enfermera o un técnico extraerán una pequeña cantidad de sangre del brazo y la enviarán para su evaluación.

Si la prueba inicial muestra una cantidad mayor o menor de glóbulos blancos de lo normal, es probable que el médico repita la prueba para confirmar los resultados. Si se confirman los resultados iniciales, un médico realizará un examen físico, hará preguntas sobre el estilo de vida de la persona y revisará su historial médico.

Si no hay una razón aparente para los cambios en los niveles de glóbulos blancos, el médico ordenará una prueba más específica. Los especialistas de laboratorio buscarán glóbulos blancos específicos, como neutrófilos inmaduros llamados mieloblastos. Durante una infección o enfermedad crónica, estas células emergen de la médula ósea y maduran en la sangre en lugar de en la médula ósea.

Si los mieloblastos u otros glóbulos blancos aparecen en niveles significativos en la sangre, el médico solicitará una muestra de médula ósea.

La extracción de médula ósea implica insertar una aguja larga en una parte de la pelvis cerca de la parte posterior de la cadera. El procedimiento puede ser muy doloroso y, por lo general, un médico tomará la muestra en un hospital con al menos un anestésico local.

Los expertos examinarán la muestra de médula ósea para ver si los neutrófilos y otras células sanguíneas se están desarrollando correctamente y tienen un suministro regular.

Si la causa de los niveles altos o bajos de neutrófilos aún es incierta, el médico ordenará otras pruebas para tratar de identificar la causa de los cambios, como:

Los cambios en los niveles de neutrófilos suelen ser un signo de cambios más significativos en los niveles de glóbulos blancos.

La cantidad y proporción de glóbulos blancos en el torrente sanguíneo cambian con el tiempo con la edad y otros eventos, como el embarazo. Si bien el rango normal de todos es ligeramente diferente, algunos rangos de uso común incluyen:

  • Recién nacido: 13.000 a 38.000 por mm3
  • Bebé de 2 semanas de edad: 5.000 a 20.000 por mm3
  • Adulto: 4.500 a 11.000 por mm3
  • Mujer embarazada (tercer trimestre): De 5.800 a 13.200 por mm3

En las adultas no embarazadas, un recuento sanguíneo de glóbulos blancos superior a 11.000 por mm3 se conoce como leucocitosis, que es un recuento elevado de glóbulos blancos. La leucocitosis neutrofílica ocurre cuando una persona tiene más de 7,000 por mm3 de neutrófilos maduros en su torrente sanguíneo.

El límite inferior del nivel de neutrófilos en sangre humana es de 1.500 por mm3. Cuando los niveles de neutrófilos de una persona son bajos, se conoce como neutropenia. Cuanto menor sea el nivel de neutrófilos que circulan en la sangre, más grave será la neutropenia. Los niveles de neutropenia son:

  • Neutropenia leve: 1.000 a 1.500 por mm3
  • Neutropenia moderada: 500 a 999 por mm3
  • Neutropenia severa: 200-499 por mm3
  • Neutropenia muy grave.: por debajo de 200 por mm3

Los cambios menores en los niveles de neutrófilos o glóbulos blancos no suelen ser motivo de preocupación, siempre que sean temporales. Un recuento elevado de glóbulos blancos a menudo significa que el cuerpo está respondiendo a infecciones, lesiones o estrés.

Algunas personas tienen niveles naturalmente más bajos de glóbulos blancos y neutrófilos que otras personas debido a una variedad de factores, incluidas las afecciones congénitas.

Si los niveles de neutrófilos o glóbulos blancos se alteran significativamente sin razón aparente o permanecen elevados o reducidos, un médico ordenará más pruebas para determinar la causa.

Los niveles muy altos o bajos de glóbulos blancos a menudo requieren atención y control de emergencia. Las personas con neutropenia grave tendrán una defensa inadecuada contra las infecciones.

Las personas con neutrofilia grave suelen tener un tipo de infección potencialmente mortal u otra enfermedad inflamatoria que requiere tratamiento, como el cáncer.

La mejor manera de corregir los niveles anormales de neutrófilos es abordar y tratar la causa subyacente.

Los antibióticos pueden tratar las infecciones bacterianas, mientras que los medicamentos antimicóticos tratan las infecciones por hongos. Las personas pueden tratar ciertas infecciones virales con medicamentos que ralentizan la actividad viral. De lo contrario, las terapias de apoyo, como los líquidos y el descanso, pueden formar parte del plan de tratamiento.

Es posible que las personas con niveles alterados de neutrófilos causados ​​por medicamentos o procedimientos deban suspender o ajustar los tratamientos.

Las personas con afecciones crónicas que interrumpen la producción o maduración adecuada de neutrófilos pueden necesitar tomar medicamentos que permitan al cuerpo aumentar la producción de neutrófilos, como:

  • factores estimulantes de colonias
  • corticosteroides
  • globulina anti-timocitos
  • trasplante de médula ósea o de células madre

Las personas con niveles muy bajos de neutrófilos a menudo requieren vigilancia, terapia con antibióticos y hospitalización para reducir el riesgo de infección grave.

Este período de cuidados intensivos ayuda a mantener a las personas con el sistema inmunológico debilitado alejadas de microorganismos potencialmente dañinos. También apoya al cuerpo, dándole tiempo para producir más glóbulos blancos.

Una de las causas de los niveles bajos de neutrófilos en sangre es la deficiencia de vitamina B-12. Comer alimentos ricos en B-12 puede ayudar a mejorar los niveles bajos de neutrófilos en sangre. Ejemplos de alimentos ricos en vitamina B-12 incluyen:

  • huevos
  • leche y otros productos lácteos
  • carne
  • pez
  • aves de corral
  • muchos cereales de desayuno fortificados y productos de pan
  • productos de levadura nutricional fortificados

Para ayudar a reducir el riesgo de niveles altos o bajos de neutrófilos, es posible que las personas quieran probar los siguientes consejos:

  • Trate de no hacer ejercicio en exceso o hacer ejercicio más allá de los niveles de comodidad.
  • Reducir los niveles de estrés y tratar el estrés crónico o severo.
  • Busque atención médica en busca de signos de infección, como fiebre, debilidad, fatiga o dolor, y trate las infecciones exactamente como se lo recetaron.
  • Siga una dieta sana y equilibrada.
  • Come suficiente proteína.
  • Trate las afecciones crónicas, como las genéticas o inflamatorias, exactamente según lo prescrito.

Sin embargo, las personas con cambios leves o menores en sus niveles de neutrófilos en sangre a menudo no muestran síntomas y no requieren ningún tratamiento.


Resultados

Los macrófagos no son necesarios para el control de mi. coli infección en la notocorda

Anteriormente mostramos que K12 Escherichia coli las células inyectadas en la notocorda de los embriones de pez cebra no pueden ser alcanzadas por los fagocitos, pero mueren en un día [21]. Confirmamos la separación física de K12 recién inyectado de los fagocitos por la matriz de colágeno notocorda (Fig. S1A y S1B). Para verificar que esto no es un capricho de esta cepa de laboratorio, primero comparamos el invasivo adherente entérico mi. coli son, mi. coli AIEC LF82 y su mutante, LF82-ΔlpfA, mi. coli Cepa JM83-ΔmsbB y cepa K12 de laboratorio en nuestro modelo de infección por notocorda. Observamos que se comportaron de manera similar (S1C y S1D Fig). Por tanto, seguimos utilizando la cepa de laboratorio K12. Para investigar el papel de los macrófagos en el aclaramiento bacteriano observado, inyectamos clodronato encapsulado en liposomas (Lipo-clodronato) que mata a los macrófagos fagocíticos [22, 23]. 1 día después de la fertilización (dpf), embriones reporteros duales de macrófagos / neutrófilos, tg (mpeg1:mCherry-F) / tg (mpx:GFP), o embriones reporteros de macrófagos, tg (mpeg1:mCherry-F), fueron inyectados con 10 nl de Lipo-Clodronato en la vena caudal posterior (intravenoso, i.v.). Como se describió previamente [22] 24 h después de la inyección de lipo-clodronato, los macrófagos se eliminaron de manera eficiente sin afectar a la población de neutrófilos, ni inducir toxicidad inespecífica (Fig. 1A y 1B). Esto se correlacionó con la disminución de mpeg1 Expresión de ARNm en larvas tratadas con Lipo-Clodronato en comparación con controles Lipo-PBS, como se muestra por RT-qPCR (Fig. 1C). Para confirmar aún más la eficacia del lipo-clodronato para suprimir la población de macrófagos, generamos otra línea informadora de macrófagos con el promotor de la proteína 4 asociada a microfibrilares (mfap4) cuya expresión es fuerte y estable en macrófagos de pez cebra [24], es decir, el tg (mfap4:mCherry-F) línea. Inyección de Lipo-clodronato en tg (mfap4:mCherry-F) indujo una reducción drástica en el número de células mfap4 + (Fig. 1D y 1E), lo que demuestra la idoneidad de este enfoque para reducir los macrófagos. Se seleccionaron larvas empobrecidas en macrófagos y se inyectaron en la notocorda con fluorescencia mi. coli. Observamos que las bacterias se eliminaron dentro de las primeras 24 horas después de la infección (hpi) tanto en las larvas empobrecidas en macrófagos, como en las larvas de control inyectadas con Lipo-PBS, como lo revela la microscopía de fluorescencia y los recuentos de UFC (Fig.1F y 1G). Es importante destacar que tras la infección por notocorda, los neutrófilos se reclutaron normalmente alrededor de la notocorda infectada independientemente de la presencia o ausencia de macrófagos (Fig. 1H).

(A) Esquema experimental. Un dpf tg (mpeg1:mCherry-F / mpx:GFP) o tg (mfap4:mCherry-F) o tg (mpeg1:mCherry-F) los embriones fueron I.v. inyectado con Lipo-Clodronato (L-clo) o Lipo-PBS (L-PBS). Se seleccionaron larvas correctamente empobrecidas en función de la pérdida de macrófagos rojos fluorescentes y GFP o DsRed que expresan mi. coli se inyectaron dentro de su notocorda a 2 dpf. El resultado de la infección se analizó a 1 y 2 dpi usando microscopía de fluorescencia. (B) El lipo-clodronato agota eficazmente los macrófagos sin afectar a la población de neutrófilos. Los experimentos se realizaron como se describe en (A) en tg (mpeg1:mCherry-F / mpx:GFP). Se analizaron GFP (neutrófilos) y mCherry (macrófagos) mediante microscopía de fluorescencia a 2 dpf. (C) Medición de qRT-PCR de mpeg1 ARNm relativo a ef1a en condiciones de Lipo-PBS y Lipo-clodronato en larvas enteras a 3 dpf (grupo de 10 larvas, valores medios ± Error estándar de la media (SEM), tres experimentos, prueba de Mann Whitney, una cola, * P & lt0.05). (D) Tg (mfap4:mCherry-F) fueron tratados con Lipo-Clodronato o Lipo-PBS como se describe en (A). mCherry (macrófagos) se analizó mediante microscopía de fluorescencia a 2 dpf. La fluorescencia representativa superpuesta con imágenes de campo claro muestra el agotamiento de los macrófagos en las larvas tratadas con Lipo-Clodronato. (E) Recuentos de macrófagos (células mfap4 +) a 2 dpf en las condiciones indicadas (las líneas horizontales indican la media ± SEM, prueba de Student, de una cola, *** p & lt0.001). (F) mi. coli-Infecciones por GFP en la notocorda de tg (mpeg1:mCherry-F) los embriones se eliminan en embriones empobrecidos en macrófagos. GFP (mi. coli) y mCherry (macrófagos) se fotografiaron repetidamente en larvas individuales utilizando microscopía de fluorescencia a 6 hpi y 1 dpi. En condiciones de Lipo-PBS y Lipo-clodronato, mi. coli-GFP están presentes en la notocorda a 6 hpi (flechas blancas) pero se borran a 1 ppp (norteL-PBS = 5 y norteL-clo = 9). La punta de flecha muestra el reclutamiento de macrófagos en larvas inyectadas con Lipo-PBS. Los asteriscos muestran la autofluorescencia de la yema. (G) Recuentos de UFC a 1 dpi en notocorda infectada de larvas tratadas con Lipo-PBS y Lipo-Clodronato (número medio de UFC por larva ± SEM, norteL-PBS = 9 y norteL-clo = 5, Prueba de Mann Whitney, dos colas, p & gt0.05, ns = no significativo). (H) mi. coli infecciones en la notocorda de tg (mpx:GFP) embriones después del agotamiento de los macrófagos con Lipo-Clodronato. Se obtuvieron imágenes de GFP (neutrófilos) en larvas utilizando microscopía de fluorescencia a 2 dpi (norteL-PBS = 25 y norteL-clo = 24). Barras de escala: 400 μm.

Para confirmar que los macrófagos no son fundamentales para el aclaramiento bacteriano en el modelo de infección por notocorda, ablamos los macrófagos utilizando tg (mpeg1:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry) embriones en los que gen 1 de expresión de macrófagos promotor impulsa indirectamente la expresión de mi. coli Enzima nitroreductasa en macrófagos. Tratamiento de tg (mpeg1:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry) los embriones con el profármaco metronidazol (MTZ) a 30 hpf (horas después de la fertilización) disminuyeron específicamente el número de macrófagos 1 y 2 días después del tratamiento (dpT) (Fig. S2A y S2B). Tg (mpeg1:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry) luego fueron infectados con mi. coli-GFP a 2 dpf en la notocorda. El agotamiento de macrófagos mediado por MTZ no afectó la carga bacteriana a 1 dpi (día después de la infección) como se muestra en el recuento de píxeles fluorescentes (FPC) (figura S2C y S2D). En conjunto, estos datos muestran que los macrófagos no son necesarios para el aclaramiento bacteriano en este modelo.

Los neutrófilos son esenciales para el control de la infección por notocorda por mi. coli

Para investigar el papel de los neutrófilos en el aclaramiento bacteriano, eliminamos los neutrófilos mediante dos enfoques independientes. Primero, inhibimos específicamente el desarrollo y la función de los neutrófilos al anular la vía G-CSF / GCSFR utilizando un oligonucleótido morfolino (MO) que bloquea específicamente gcsfr / csf3r traducción (MO csf3r) [25,26]. Inyección de MO csf3r en los embriones reporteros de neutrófilos, tg (mpx:GFP), condujo a una reducción de aproximadamente un 70% en el número total de neutrófilos en comparación con las larvas inyectadas con un morfolino de control (MO CTRL) a 3 dpf (Fig. 2A, 2C y 2D). Infectamos estos morfantes con 2500 UFC fluorescentes. mi. coli. Las bacterias desaparecieron en las larvas de control (Fig. 2B y 2E) mientras que proliferaban en embriones empobrecidos en neutrófilos (Fig. 2B y 2F). La proliferación bacteriana se correlacionó con una reducción drástica adicional en el número de neutrófilos a 1 y 2 dpi (días después de la infección), lo que sugiere la muerte de los neutrófilos (Fig. 2D). Posteriormente, infectado csf3r los morfantes murieron entre 2 y 3 dpi (Fig. 2G) con una proliferación bacteriana abrumadora y neutropenia (Fig. S3B).

Tg (mpx:GFP) Los embriones fueron inyectados en la etapa de una célula con csf3r morfolino (MO csf3r) para inducir el agotamiento de los neutrófilos o un morfolino de control (MO CTRL). (A) Se obtuvieron imágenes de poblaciones de neutrófilos en estado estacionario repetidamente en morfantes individuales utilizando fluorescencia de GFP en ambos MO csf3r y condiciones de control entre 2 y 4 dpf. (B) Fluorescente mi. coli-DsRed fueron inyectados en la notocorda de csf3r y morfantes CTRL. GFP (neutrófilos) y DsRed (mi. coli) se obtuvieron imágenes de fluorescencia en los puntos de tiempo indicados. mi. coli-DsRed (rojo) desapareció de 1 dpi en los embriones de control (paneles izquierdos), mientras que aumentó en csf3r morfantes a 1 y 2 dpi (puntas de flecha blancas) con una disminución concomitante en el número de neutrófilos (verde). Barras de escala: 400 μm. (C, D) Cuantificación de neutrófilos totales en CTRL (C) y csf3r (D) morfantes en los puntos de tiempo indicados después de PBS (columnas gris claro) o mi. coli (columnas de color gris oscuro) inyecciones (número medio de células por larva ± SEM, prueba de Mann-Whitney, de dos colas, ** p & lt0.005, *** p & lt0.001, nortelarvas = 7-16 por condición, de dos experimentos independientes). (E, F) mi. coli recuentos de registros (CFU) en CTRL (E) y csf3r morfantes (F) (número medio de UFC por larva ± SEM, prueba de Mann-Whitney, de dos colas, *** p & lt0,001, nortelarvas = 3-4 por condición). (G) Curva de supervivencia de MO csf3r y MO CTRL larvas infectadas con mi. coli de 0 a 3 ppp (nortelarvas se indica en la figura, prueba de rango logarítmico, p & lt0.001, a partir de dos experimentos independientes).

También hicimos la ablación de neutrófilos, usando tg (mpx:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry) embriones en los que el mieloperoxidasa promotormpx) impulsa indirectamente la expresión de nitroreductasa en neutrófilos. Tratamiento de tg (mpx:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry) los embriones con metronidazol a 40 hpf agotaron específicamente los neutrófilos 1 y 2 días después del tratamiento (Fig. 3A). Dado que se requieren macrófagos para eliminar las células apoptóticas, preguntamos si la muerte de neutrófilos en el tratamiento con MTZ altera el número o la distribución de macrófagos en la línea triple transgénica. tg (mpx:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry / mpeg1:GFPcaax). A 1 dpT, el tratamiento con MTZ no afectó el número de macrófagos y se distribuyeron de manera similar a lo largo de la larva que el control (Fig. 3B y 3C). Luego, las larvas fueron infectadas con mi. coli-carmesí y 4 horas después mi. coli inyección, se reclutaron macrófagos para la notocorda infectada en condiciones de MTZ y DMSO, lo que demuestra que la ablación de neutrófilos utilizando nfsB/ El sistema MTZ no afecta la respuesta de los macrófagos (Fig. 3D). A continuación, se analizó el resultado de la infección en tg (mpx:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry) larvas infectadas con fluorescentes mi. coli-GFP. similar a csf3r morfantes, las bacterias se eliminaron en las larvas de control (nfsB + DMSO y nfsB - MTZ), mientras que las bacterias proliferaron en embriones con baja densidad de neutrófilos (nfsB + MTZ), como se muestra por microscopía fluorescente y por cuantificación de la carga bacteriana (Fig. 3E y 3F). Estos experimentos demuestran que los neutrófilos son esenciales para el control de la infección por notocorda por mi. coli.

(A B C D) Tg (mpx:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry / mpeg1:GFPcaax) los embriones se trataron con DMSO o MTZ a 40 hpf y se obtuvieron imágenes a los 0, 1 y 2 días después del tratamiento (dpT) con microscopía de fluorescencia. (A) Cuantificación del total de neutrófilos en larvas tratadas con DMSO y MTZ a 0, 1 y 2 dpT (número medio de neutrófilos por larva ± SEM, prueba de Student, de una cola, * p & lt0.05, *** p & lt0.001, NDMSO = 21, norteMTZ = 13-23). (B) Cuantificación del total de macrófagos en larvas tratadas con DMSO y MTZ a 1 dpT (las líneas horizontales indican valores medios ± SEM, dos experimentos independientes, prueba de Student, de dos colas, ns: no significativo, p & gt0.05, norteDMSO = 15, norteMTZ = 19). (C-D) Se infectaron embriones transgénicos con mi. coli- carmesí en la notocorda un día después del tratamiento con MTZ y se obtuvieron imágenes (C) antes de la infección y (D) a 4 hpi con microscopía confocal Spinning Disk. (C) La superposición representativa de proyecciones máximas de adquisiciones de montaje (mCherry y GFPcaax) con imágenes de luz transmitida muestran distribución de neutrófilos y macrófagos en larvas tratadas con DMSO y MTZ antes de la infección y (D) reclutamiento de macrófagos (puntas de flecha) a 4 hpi a la notocorda (n ). Los cuadros blancos son áreas ampliadas. Se obtuvieron resultados similares con MTZ 5 y 10 mM. (MI) Tg (mpx:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry) los embriones se trataron con MTZ a 40 hpf y, a 3 dpf, las larvas se inyectaron con PBS o mi. coli-GFP en la notocorda. El resultado de la infección se analizó mediante microscopía fluorescente. Las imágenes de larvas son superposiciones representativas de fluorescencia e imágenes de luz transmitida a 2 dpi. En ausencia de MTZ, los neutrófilos se reclutan masivamente a la notocorda y mi. coli se borra (puntas de flecha blancas). En larvas tratadas con MTZ, mi. coli (puntas de flecha verdes) crecen mucho. Barras de escala: 400 μm. (F) Cuantificación de carga bacteriana por recuento de píxeles fluorescentes (FPC) en MTZ tratado Tg (mpx:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry) (nfsB + MTZ) a 0, 1 y 2 dpi mostrando diferencias significativas en la carga bacteriana con los grupos de control (Tg (mpx:Gal4 / UAS:nfsB-mCherry) tratados con DMSO referido como nfsB + DMSO y los hermanos no transgénicos tratados con MTZ referidos como nfsB - MTZ) (las barras horizontales indican la mediana, prueba de Kruskall-Wallis con prueba posterior de Dunn, ** p & lt0.01, *** p & lt0.001 , nortenfsB + DMSO = 9–12, nortenfsB- MTZ = 8–9, nortenfsB + MTZ = 7–12).

Además, investigamos la relación entre el suministro de neutrófilos y la desaparición bacteriana en la notocorda. Los niveles normales de neutrófilos fueron capaces de eliminar pequeñas cantidades de bacterias (Fig. S3A), pero los embriones con poblaciones de neutrófilos deprimidos no sobrevivieron a cargas bacterianas bajas (Fig. S3B), mientras que un inóculo bacteriano más alto superó a las larvas con una población de neutrófilos normal (Fig. S3C). Sin embargo, al aumentar artificialmente la densidad de neutrófilos en el embrión en desarrollo a través de la sobreexpresión de gcsfa, observamos que el aumento de la densidad de neutrófilos permite al embrión hacer frente a cantidades aún mayores de bacterias inyectadas (Fig. S3D y Fig. S4A y S4C). Se observaron resultados similares al sobreexpresar gcsfb (Figura S4). Nuestros datos revelan que el equilibrio de neutrófilos frente a bacterias es fundamental para el resultado de la infección y que las poblaciones de neutrófilos son limitantes para combatir la infección. Para evaluar la muerte celular, se inyectó Sytox Green, un colorante vital que marca el ADN de las células moribundas, en la vena de las células infectadas. tg (lyz:DsRed) larvas. Mientras que PBS y dosis baja mi. coli indujo poca muerte celular alrededor de la notocorda, los embriones que experimentan neutropenia (es decir, infectados con dosis altas mi. coli) mostró un aumento de la muerte celular, incluidos los neutrófilos muertos (Fig. S5). Esto sugiere que cuando el equilibrio entre neutrófilos y bacterias no es correcto, los neutrófilos mueren por apoptosis. Es de destacar que, a diferencia de los neutrófilos, el número de macrófagos no disminuyó, sino que aumentó 2 días después de la infección por dosis altas (Fig. S6). Estos resultados recuerdan lo que ocurre en los mamíferos en los que la relación neutrófilos / bacterias es fundamental para la defensa del huésped [27].

No se requiere mieloperoxidasa de neutrófilos para controlar la infección por notocorda

Nuestro estudio anterior reveló que aproximadamente un tercio de los neutrófilos reclutados se degranulan alrededor de las notocordias infectadas [21]. Por lo tanto, investigamos el papel de la mieloperoxidasa específica de neutrófilos (Mpx) que está presente en los gránulos azurófilos en el aclaramiento bacteriano. Presentamos el mpx:GFP transgén en el mpx-nulo mutante "impecable" [28] para generar tg (mpx:GFP) / mpx - / - descendencia en la que los neutrófilos expresan la eGFP pero carecen de actividad de Mpx. El MPX activo en gránulos de neutrófilos se puede visualizar en embriones de pez cebra usando tinción negra de Sudán [29]. La tinción de Sudán Black confirmó que los neutrófilos no tenían actividad de Mpx en tg (mpx:GFP) / mpx - / - mientras en tg (mpx:GFP) / mpx +/- hermanos, los neutrófilos contenían Mpx activa en sus gránulos (Fig. 4A). Una dosis baja de fluorescente. mi. coli fue inyectado en la notocorda de 2 dpf tg (mpx:GFP) / mpx - / - Los neutrófilos de los embriones se reclutaron normalmente a lo largo de la notocorda, y la inyección mi. coli se aclararon a 1 dpi como en el tipo salvaje (Fig. 4B). Por lo tanto, no se requiere Mpx para la autorización de mi. coli en la notocorda.

(A) Tg (mpx:GFP) / mpx +/- (A1, A2) y tg (mpx:GFP) / mpx -/- (A3, A4) los embriones fueron infectados con mi. coli en la notocorda. La tinción con negro de Sudán y la inmunodetección de neutrófilos (anti-GFP) se realizaron en embriones completos a 1 dpi. El panel superior derecho muestra las regiones fotografiadas por microscopía confocal en las larvas en A1 y A3 (recuadro verde) y en A2 y A4 (recuadro rojo). Imágenes representativas de luz transmitida, superpuestas con una proyección máxima de imágenes de fluorescencia confocal muestran la presencia de gránulos negros en los neutrófilos (flechas blancas) de tg (mpx:GFP) / mpx +/- embriones. Los gránulos de MPX están ausentes en los neutrófilos (puntas de flecha blancas) de tg (mpx:GFP) / mpx -/- embriones. Barras de escala: 10 μm y líneas punteadas blancas delinean los neutrófilos. (B) Tg (mpx:GFP) / mpx -/- los embriones fueron infectados con mi. coli-DsRed en la notocorda. Neutrófilos (GFP) y mi. coli (DsRed) se obtuvieron imágenes repetidamente en larvas individuales usando microscopía fluorescente a 6 hpi y 1 dpi. Tiempo mi. coli se ubica en la notocorda a 6 hpi (puntas de flecha), desaparece a 1 ppp. (nortempx +/- = 9, nortempx - / - = 8 embriones por condición, de dos experimentos independientes). Barra de escala: 400 μm.

El superóxido se produce en neutrófilos de embriones infectados con notocorda.

Los neutrófilos utilizan diferentes moléculas difusibles para combatir infecciones, incluidos NO y ROS. Investigamos la producción de NO por los neutrófilos durante el curso de las infecciones por notocorda utilizando la sonda fluorescente informadora de NO DAF-FM-DA. Nosotros usamos Salmonela embriones infectados como controles positivos para detectar la producción de NO en los neutrófilos dentro de la Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) (S7A Fig) [30]. Como se describe [31], la notocorda en sí fue etiquetada por DAF-FM-DA en embriones no infectados, pero no pudimos observar ninguna evidencia de producción de NO por los neutrófilos en nuestro modelo de infección por notocorda (Fig. S7B). Anteriormente se demostró que L-NAME inhibe específicamente las NO sintasas en las larvas de pez cebra [30]. Para bloquear la producción de NO en nuestro sistema, tratamos las larvas con L-NAME e inyectamos mi. coli en la notocorda. No observamos ninguna diferencia en el resultado de la infección entre las larvas tratadas con L-NAME y los controles (DMSO) (Fig. S7C).

El fagocito NADPH oxidasa y la producción de ROS juegan un papel clave en la eliminación de bacterias engullidas [4]. Para detectar la acumulación de ROS intracelulares en forma de aniones superóxido en tg (mpx:GFP) embriones infectados con mi. coli, we used Dihydroethidium (DHE), a cell permeable probe that fluoresces in red after reacting with superoxide within the cell [32,33]. First, we imaged the injection site, where some bacteria initially leaked from the pierced notochord and got engulfed by neutrophils and observed that these phagocytosing leukocytes, abundantly produced superoxide in intracellular compartments harboring bacteria, which are most probably phagosomes (Fig 5A and 5B). Green fluorescent mi. coli were rapidly lysed within 20 minutes in the putative phagosome (Fig 5B and 5C and S1 Video). We then imaged the upstream region, where bacteria are separated from the recruited neutrophils by the notochord collagen sheath. Interestingly, these recruited neutrophils also produced large amounts of superoxide, even though they had not phagocytosed bacteria (Fig 5D). DHE was also detected at a basal level in notochord surrounding tissues (Fig 5E). To test the specificity of DHE staining in detecting superoxide anions we treated infected embryos with N-acetyl-cysteine (NAC), a broad-specificity ROS scavenger. We observed a general decrease of DHE staining within cells of the trunk and more particularly a decrease of DHE + recruited cells (Fig 5E and 5F) and of DHE + recruited neutrophils (Fig 5E and 5G) around the infected notochord while the number of recruited neutrophils was unchanged by the treatment (Fig 5E and 5H), confirming that DHE probe specifically detects ROS in this model.

(A-D) Two dpf tg(mpx:GFP) embryos were either injected with PBS (A) or infected with mi. coli-GFP in the notochord (B, C, D). At 6 hpi, superoxide was detected in living animals using Dihydroethidium (DHE, red) and neutrophils were visualized using GFP fluorescence (green). (A) Representative transmitted light images, overlaid with a maximal projection of confocal fluorescence images show that superoxide is lightly produced in the recruited neutrophil at the injection site. (B) White boxes in the larva image show the regions imaged by high resolution confocal microscopy and green arrowhead shows the injection site. (C) Representative time-lapse maximum projections starting 6 hpi during 16 min, show superoxide presence in phagosomes (white arrows) bearing bacteria (yellow stars: mi. coli-GFP, Green) in recruited neutrophils at the injection site. Time is in minutes. (D) Representative transmitted light images, overlaid with a maximum projection of confocal fluorescence images show superoxide in neutrophils (white arrowheads) over the mi. coli (yellow stars) infected notochord. Scale bars: 15 μm, dotted lines encase the notochord (NC). (MI) Tg(mpx:GFP) larvae were infected with mi. coli-GFP in the notochord and treated either with DMSO or NAC. Trunk images are representative maximum projections of single fluorescence (DHE and GFP) and merge channels using confocal microscopy. Scale bar = 50 μm. (F-H) Quantification of recruited DHE + cells (F), recruited DHE + MPX + cells (G), and recruited neutrophils (H) in indicated conditions (mean number of cell/larva ± SEM, ***p<0.001, ns: non significant, norteDMSO = 16–17 and norteNAC = 13–14, from three independent experiments). The diagrams represent the regions selected for the counting.

NADPH oxidase activity is essential for bacterial killing at a distance and larva survival to notochord infection

To investigate whether this superoxide production could be involved in bacterial killing, we used Apocynin, a NADPH oxidase (NOX) inhibitor [34,35]. Upon notochord infection, Apocynin-treated embryos had reduced number of superoxide producing cells, including recruited DHE + neutrophils at the inflammation site, as compared to DMSO-treated larvae (Fig 6A and 6B), showing the efficiency of Apocynin as a NOX inhibitor in zebrafish. To test whether Apocynin alters the steady state of neutrophils, tg(mpx:GFP) larvae were treated with this drug at 2 dpf. Apocynin treatment decreased the total number of neutrophils after 6 or 24 h of treatment, but by less than 15% (Fig 6C and 6D), showing that this approach is suitable to test the role of NOX in zebrafish neutrophils. Therefore, we infected tg(lyz:DsRed) embryos with a very low dose of mi. coli (<1000 CFUs) in the notochord. Even with the very low dose infection, 80% of Apocynin-treated embryos failed to clear the bacteria, while all bacteria were efficiently killed in DMSO-control embryos (Fig 6E). Apocynin-treated embryos displayed unrestricted bacterial growth in the notochord at 1 dpi, as demonstrated with fluorescence microscopy (Fig 6E and 6F). This was correlated with neutropenia and eventually death at 2–3 dpi (Fig 6F and 6G). The effect was specific to the clearance of bacteria in this notochord infection model since Apocynin treatment did not interfere with the clearance of bacteria injected in the muscle, where phagocytosis occurs (S8 Fig). Similar results were obtained using another NOX inhibitor [36], VAS2870 (VAS) (S9 Fig).

(A-B) mi. coli-GFP were injected in the notochord of 2 dpf tg(mpx:GFP) embryos in DMSO or Apocynin treatment conditions. (A) At 1 dpi, superoxide production was visualised using DHE (red), neutrophils and mi. coli were detected using GFP. Notochord images are representative maximum projection of fluorescence confocal images overlaid with transmitted light images. Pink arrowheads show DHE + neutrophils, white arrows show DHE - neutrophils and white arrowheads: mi. coli, scale bars: 30 μm. (B) Quantification of DHE-positive cells in DMSO and Apocynin treated larvae (mean ±SEM, nortelarvas = 5 per condition, Mann-Whitney test, one-tailed, * p<0.05). (C, D) Tg(mpx:GFP) embryos were treated with Apocynin (APO) or DMSO at 2 dpf. Neutrophils (GFP) were imaged using fluorescent microscopy at 6 hours post-treatment (hpT) and 24 hpT. (C) Representative fluorescent images of Apocynin or DMSO treated larvae at 24 hpT. Scale bar: 400 μm. (D) Corresponding counts of total neutrophil population in indicated conditions (mean ± SEM, norteDMSO = 31 and norteAPO = 29, Mann-Whitney test, two-tailed, * p<0.05, representative of 2 independent experiments). (E, F, G) Two dpf tg(lyz:DsRed) embryos were infected in the notochord with mi.coli-GFP and treated with Apocynin. (E) Neutrophils (DsRed) and mi. coli (GFP) were imaged repeatedly in individual larvae using fluorescent microscopy at 6 hpi and 1 dpi. Bacteria (white arrowheads) were present at 6 hpi in both DMSO- and Apocynin-treated embryos. At 1 dpi, bacteria disappeared in DMSO-treated embryos (arrows) while their number increased in Apocynin-treated embryos (white arrowheads). (F) Infection outcome of mi. coli infected embryos after in DMSO or Apocynin treatments were scored from 0 to 3 dpi (the number of larvae is indicated in the columns). (G) Survival curves of larvae uninfected and infected with mi. coli from 0 to 3 dpi in DMSO or Apocynin treatments. (nortelarvas is indicated in the figure, log rank test, p<0.001, from two independent experiments). (H) Two dpf mpx +/+ or mpx -/- embryos were infected in the notochord with mi. coli-GFP and treated either with DMSO or Apocynin (APO). Infection outcome of mi. coli infected embryos were scored from 0 to 2 dpi (the absolute number of larvae is indicated in the columns). (I) Survival curves of mpx +/+ or mpx -/- larvae infected with mi. coli from 0 to 2 dpi in DMSO or Apocynin treatments (nortelarvas is indicated in the figure, log rank test, p<0.01, from two independent experiments).

Interestingly, in mammals, Apocynin activity requires that target cells do express an active Mpx [35]. Therefore, we compared the results of Apocynin treatment in mpx -/- y mpx +/+ infected embryos, and observed that Apocynin increased susceptibility to notochord infection only in the presence of Mpx (Fig 6H and 6I). Thus, Apocynin action is also dependent on Mpx in zebrafish, and thus specifically acts on neutrophils. Overall, these data thus strongly suggest that inhibition of superoxide production in neutrophils increases susceptibility to notochord infection.

To further examine the role of phagocyte NOX, morpholino-mediated gene knockdown was used. Injection of p47 phox MO in tg(mpx:GFP) did not induce noticeable morphological defects, but, as expected, decreased superoxide production in neutrophils following infection compared to control morpholino (CTRL MO) (S10 Fig). To address the effect p47 phox MO on the development and the recruitment of neutrophil, we analyzed tg(mpx:GFP) p47 phox morphants before and after mi. coli infection in the notochord at 2 dpf. A pesar de que p47 phox morphants displayed 20% less neutrophils than in control morphants, (Fig 7A and 7B) these leukocytes were recruited in normal numbers to the notochord at 4 hpi and 1 dpi (Fig 7C), showing that p47 phox morphants can mobilize neutrophils properly during the infection. Luego, p47 phox morphants were infected in the notochord with mi. coli-GFP. P47 phox MO induced higher bacterial burden as evidenced by fluorescence microscopy (Fig 7D) and CFUs counts (Fig 7E). This was correlated with an increase in the severity of infection (Fig 7F).

(A-C) Tg(mpx:GFP) embryos were injected at the one cell stage with either p47 phox morpholino (MO p47 phox ) or a control morpholino (MO CTRL). Steady-state neutrophil populations were imaged in 2 dpf morphants using fluorescence microscopy. Scale bar: 400 μm. (B) Neutrophil counts in whole larvae (mean number of neutrophils per larva ± SEM, norteMO CTRL = 47 and norteMO P47 = 47, Mann-Whitney test, two-tailed, **p<0.005, from three independent experiments). (C) At 2 dpf, p47 phox and CTRL morphants were infected with mi. coli-GFP in the notochord and imaged using fluorescence microscopy at 4 hpi and 1 dpi. Graph represents mean number of recruited neutrophils per larva ± SEM in the notochord region (norteMO CTRL = 10–14 and norteMO P47 = 12–16, Mann-Whitney test, one-tailed, p>0.05 ns: non significant, from two independent experiments). (D) p47 phox and CTRL morphants were infected with mi. coli-GFP in the notochord at 2 dpf and GFP fluorescence (bacteria) was imaged repeatedly in individual larva, fluorescence was overlaid with transmitted light images at 1 hpi and 1 dpi. Black arrowheads indicate the infection site, scale bar: 400 μm (NMO CTRL = 19/21 and NMO p47 = 16/21). (E) The CFU counts at 1 dpi in notochord infected of p47 phox and CTRL morphants (mean number of CFU per larva ± SEM, norteMO CTRL = 13 and norteMO P47 = 8, Mann-Whitney test, one-tailed, **p<0.01, from three independent experiments). (F) Survival curves of p47 phox and CTRL morphants that have been injected with PBS or mi. coli in the notochord from 0 to 3 dpi (norte is indicated in the figure, log rank test, ***p<0.001, from 4 independent experiments).

As neutrophils are instrumental for larva survival and bacterial clearance during notochord infection and as pharmacological (apocynin and VAS2870) and genetic (p47 phox morpholino) inhibition caused a slight decrease of neutrophil numbers, we tested whether inducing high neutrophil number in the context of NADPH incompetence could restore survival of the infected larvae. One-cell stage tg(lyz:DsRed) embryos were thus injected with gcsfa expressing plasmid and 2 days later were treated either with DMSO or VAS2870 (Fig 8A). Beside the fact that gcsfa forced expression increased the number of neutrophils compared to controls (Fig 8B), it did not restore a better survival of the infected larvae in the presence of Nox inhibitor VAS2870 (Fig 8C).

(A) Diagram shows the experimental strategy to induce high neutrophil number during NOX inhibition in zebrafish larvae. To increase neutrophil density, tg(lyz:DsRed) embryos were injected with the gcsfa over-expressing plasmid at one cell stage. At 2 dpf, larvae were treated with VAS2870 to inhibit NOX enzyme. Then, NOX incompetent larvae were infected with mi. coli-GFP for monitoring of the survival. (B) Tg(lyz:DsRed) larvae were imaged 5 h after treatment with DMSO or VAS2870 using fluorescence microscopy. The plot shows quantification of total neutrophils in indicated conditions (horizontal lines indicate mean number of neutrophils ± SEM, from two independent experiments, ANOVA with Tukeys’ post-test, **p<0.01 and ***p<0.001). (C) One hour after treatment (at 2 dpf) larvae were infected in the notochord with mi. coli-GFP. Survival curves of larvae in indicated conditions from 0 to 3 dpi (nortelarvas is indicated in the figure, log rank test, *p>0.05, ns: not significant).

Altogether these data show that NOX-induced superoxide is necessary for bacteria elimination at a distance by neutrophils.


Intracellular Mediators of the Cell Death of Neutrophils

Free Radicals

In a normal process and under the appropriate stimuli, neutrophils are capable of releasing cytotoxic mediators, such as ROS and RNS, generating damage to pathogens but also to the host's tissues. After the elimination of the proinflammatory stimuli, repaiment of the damaged tissue is necessary to return the tissue to a homeostasis state. At this point, anti-inflammatory signals start to be released contributing to the resolution of inflammation, and neutrophils in the tissue should enter apoptosis and be ingested by macrophages in order to clean the inflamed area. Apoptosis of neutrophils is regulated by intracellular mediators and extracellular signals among the intracellular mediators are the ROS, mainly produced by the NADPH oxidase of the activated neutrophils (161, 162), although some reports show that ROS can be generated by mechanisms that are independent of the NADPH oxidase. Thus, it was reported that the production of superoxide and hydrogen peroxide can be mediated by low-conductance, calcium-activated potassium channels known as SK (small conductance) channels (163, 164). Another way of generating ROS in the neutrophil is through the accumulation of electrons of the respiratory chain, linked to a low activity of complex IV due to the low levels of cytochrome c (16, 165�). Decreasing intracellular ROS levels by reduced glutathione (GSH), as well as by catalase, inhibits the death of neutrophils (39, 168, 169).

ROS have the capacity to damage DNA generating cell death through direct or indirect activation of p53 (170). ROS can also induce activation of the inflammasome, formed by NLRs, an adaptor molecule, and caspase-1 (171, 172). However, ROS can directly alter the activity of the intracellular signaling pathways implicated in the death and survival of neutrophils, such as NF-㮫 and MAPK (mitogen-activated protein kinases) (173, 174). In fibroblasts, ROS cause oxidation and inhibition of JNK-inactivating phosphatases, promoting JNK activation, release of cytochrome c, and the subsequent activation of caspase-3 (175, 176). Similarly, it has been demonstrated that the accumulation of ROS results in the grouping of death receptors in lipid rafts and the activation of caspase-8, independently of the Fas ligand (29). The generation of intracellular (but not phagosomal) ROS, caused by neutrophil activation, triggers the process of apoptosis, while the production of intraphagosomal ROS during phagocytosis does not have this effect. This suggests that the location of the production of ROS is fundamental for inducing the death of neutrophils (177). Among the molecules involved in the regulation of ROS production after cell activation, is Bruton's tyrosine kinase (Btk). The absence of this kinase induces a greater production of ROS by hyper phosphorylation and activation of phosphatidylinositol-3-OH-kinase (PI3K) and protein tyrosine-kinases (TKPs) (178). In addition, the levels of free radicals can be elevated by nitric oxide synthase (NOS) through the production of nitric oxide (NO) (177, 179). In recent years, it has been demonstrated that NO has also the capacity to induce apoptosis in neutrophils (180). It has been shown that the derivative of oxatriazol-5-amine, PGE 3162, and SIN-1 increase the rate of apoptosis in human neutrophils, correlating with data of the greater DNA fragmentation and cell death in neutrophils treated with exogenous NO (181, 182). Interestingly, high levels of ROS or RNS in neutrophils inhibits the activity of the caspases, suggesting the existence of an alternative, caspase-independent cell-death pathway (177, 179, 183, 184).

Caspases and Calpains Involved in Apoptosis

Most stimuli that lead to apoptosis converge in the mitochondria inducing the permeabilization of their external membrane. With permeabilization, a series of proteins are released that activate the caspases (185), which carry out the majority of the proteolytic events of apoptosis and are considered as the ultimate responsible for cell death. Caspases are localized in the form of procaspases in the cytoplasm and the intermembrane space of the mitochondria. Procaspases are activated by cleavage and act as executors cleaving cellular survival molecules triggering processes that induce cell death. Caspases are regulated at the post-translational level and possess a classic structure consisting of a prodomain (N-terminal), a small subunit (p10) in the C-terminal, and a large subunit (p20) that contains the active center with cysteine within a QACXG-conserved motif (186, 187).

The initiator caspases possess prodomains larger than effector caspases. The latter contain caspase recruitment domains (CARD), as in the case of caspase-2 or caspase-9, or cell death effector domains (DED), as in the case of caspase-8 and caspase-10, which permits them to interact with other molecules that regulate their activation. The stimulus for cell death induces the grouping of the initiator caspases (Scaffold-Mediated Activation), allowing them to transactivate by cross-cleavage and, thus, proceed to activate the effector caspases. In all the studied cases, the mature enzyme is a heterotetramer that contains two p20/p10 heterodimers and two active centers (186). In neutrophils, caspases 3 and 10 play an important role in the induction of cell death (188). En Helicobacter pylori-infected neutrophils, the activity of caspase-1 is increased, promoting its association into inflammasomes to participate in the triggering of pyroptosis (189). In neutrophils, the activity of caspase-9 also increases drastically during apoptosis (167).

The calpains are calcium-dependent cysteine proteases that can be divided into two subfamilies according to the cation concentrations necessary for their activation: micromolar for the μ-calpains and millimolar for the m-calpains. They play an important role in cell proliferation, progression of the cell cycle, cell migration, and programmed cell death (190). Calpains are present in the cytosol as inactive enzymes that are activated in response to increases in the cellular concentration of Ca 2+ ions. Once activated, they can modify transcription factors, cytoskeletal proteins, kinases, and proapoptotic proteins, such as Bid and Bax, into fragments incapable of interacting with antiapoptotic proteins, inducing the release of cytochrome c and activation of caspase-3 leading to apoptosis (191, 192). In human neutrophils, calpains do not only play a role in apoptosis, but calpains are also involved in the adhesion of TNF-α-stimulated cells, and play a role in migration regulated by the cytosolic Ca ʲ concentration (193, 194).

Bcl2 and IAP (Apoptosis-Regulatory Proteins)

The process of apoptosis in human cells is regulated by a family of diverse pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins, with protein Bcl-2 as the prototype protein. Members of this family are grouped into three subfamilies as follows: the antiapoptotic proteins (Bcl-2, Bcl-Xl, Mcl-1, and others), the “multidomain”-type proapoptotic proteins (Bax and Bak), and the 𠇋H3-only”-type proapoptotic proteins (Bid, Bim, Bad, among others). The balance among these three groups determines susceptibility to cell death or survival as shown by the increased resistance to apoptosis of certain tumors related to the overexpression of the antiapoptotic proteins.

Another family of proteins with the ability to inhibit apoptosis (denominated IAPs) regulate the cytochrome c-caspase pathway. In humans, the following three members have been characterized: XIAP: c-IAP 1, and c-IAP 2, which bind to caspase-9 preventing its activation. In neutrophils, caspase-9 increases its activity during apoptosis, even though the levels of cytochrome c in these cells are very low (165�, 195). Data obtained by Murphy et al. (196) suggest that neutrophils possess a lower threshold of cytochrome c for the assembly of functional apoptosomes and their low content of cytochrome c can be compensated for by the elevated expression of apoptotic protease-activating factor 1 (Apaf-1). These further suggest that neutrophils retain a low expression of cytochrome c for the assembly of functional apoptosomes rather than for oxidative phosphorylation.

Neutrophils contain few mitochondria and these are found as tubular networks, and are grouped and depolarized under apoptotic conditions. Despite the relatively low levels of cytochrome c in these cells, the mitochondrial death pathway is functional (167, 197). In neutrophils, the expression of antiapoptotic molecules, such as Mcl-1 and Bcl-xl, is preferential in comparison with those of the proapoptotic protein family (198).

One of the mechanisms that regulate the transcription of the antiapoptotic proteins in neutrophils is stimulation with GM-CSF and TNF-α, which prevents the time-dependent nuclear localization of Mcl-1, and an increase in the transcription and translocation of Bcl-Xl, via stimulation of the NF-㮫 pathway. However, these cytokines also participate in the increase and maintenance of RNAm levels of BH3-only proapoptotic proteins. GM-CSF is a survival factor for neutrophils that promotes the transcription of Bim and the expression of BimeL (199). During neutrophil cell death by apoptosis, Mcl-1 levels diminish gradually, leading to the release of Bax and to its later translocation to the mitochondrial membrane (200). The amount of Mcl-1 can be regulated at the transcriptional level through NF-㮫 and PI3K (201). Another mechanism of regulation of the neutrophil mitochondrial integrity is the flow of potassium (K). A high concentration of extracellular K + promotes the survival of neutrophils through the prevention of mitochondrial dysfunction and the release of proapoptotic factors.


CONCLUSIÓN

ROS production in phagocytes serves multiple purposes, from cell signaling to microbial killing. Numerous reactive species over a wide range of concentrations are involved. Timing and location of ROS production, diffusion, and scavenging are critical for the outcome. To illustrate this complexity, we referred the reader to reviews that deal with fundamental aspects of phagocyte ROS production wherever possible, and we apologize to those whose work is not mentioned explicitly. The phagocyte community needs new probes for high-level (phagosomal) ROS detection, as well as low-level (signaling) detection. The recent interest in redox biology has pushed the development of new detection methods with improved specificity, better sensitivity, and new ways to localize the detector with cells. The harsh conditions of the phagosome (pH, proteases, level, and diversity of ROS) are particularly challenging to any detection method, and the specificity of any new dye should be tested under these conditions. Subcellular targeting of FPs and the SNAP-tag technology for organic dyes are good candidates to improve the spatial resolution of ROS detection. The end of ROS production may be addressed with nanoparticles. The spatiotemporal correlation of ROS production with signaling events will be addressed by combining dyes of different color that become available now. We are convinced that new organic compounds, as well as FPs, will increase our choice to explore in more detail the why, when, and where of phagocyte ROS production.


Why do neutrophils need to die after pathogen phagocytosis? - biología

Phagocytosis is the process by which a cell takes in particles such as bacteria, parasites, dead host cells, and cellular and foreign debris. It involves a chain of molecular processes. Phagocytosis occurs after the foreign body, a bacterial cell, for example, has bound to molecules called “receptors” that are on the surface of the phagocyte. The phagocyte then stretches itself around the bacterium and engulfs it. Phagocytosis of bacteria by human neutrophils takes on average nine minutes to occur. Once inside the phagocyte, the bacterium is trapped in a compartment called a phagosome. Within one minute the phagosome merges with either a lysosome or a granule, to form a phagolysosome. The bacterium is then subjected to an overwhelming array of killing mechanisms and is dead a few minutes later. Dendritic cells and macrophages, on the other hand, are not so fast, and phagocytosis can take many hours in these cells. Macrophages are slow and untidy eaters they engulf huge quantities of material and frequently release some undigested material back into the tissues. This debris serves as a signal to recruit more phagocytes from the blood. Phagocytes have voracious appetites scientists have even fed macrophages with iron filings and then used a small magnet to separate them from other cells.

All phagocytes, and especially macrophages, exist in degrees of readiness. Macrophages are usually relatively dormant in the tissues and proliferate slowly. In this semi-resting state, they clear away dead host cells and other non-infectious debris and rarely take part in antigen presentation. But, during an infection, they receive chemical signals—usually interferon gamma—which increases their production of MHC II molecules and which prepares them for presenting antigens. In this state, macrophages are good antigen presenters and killers. However, if they receive a signal directly from an invader, they become “hyperactivated”, stop proliferating, and concentrate on killing. Their size and rate of phagocytosis increases—some become large enough to engulf invading protozoa. In the blood, neutrophils are inactive but are swept along at high speed. When they receive signals from macrophages at the sites of inflammation, they slow down and leave the blood. In the tissues, they are activated by cytokines and arrive at the battle scene ready to kill.

Neutrófilos: Neutrophils move through the blood to the site of infection.

When an infection occurs, a chemical “SOS” signal is given off to attract phagocytes to the site. These chemical signals may include proteins from invading bacteria, clotting system peptides, complement products, and cytokines that have been given off by macrophages located in the tissue near the infection site. Another group of chemical attractants are cytokines that recruit neutrophils and monocytes from the blood. To reach the site of infection, phagocytes leave the bloodstream and enter the affected tissues. Signals from the infection cause the endothelial cells that line the blood vessels to make a protein called selectin, which neutrophils stick to when they pass by. Other signals called vasodilators loosen the junctions connecting endothelial cells, allowing the phagocytes to pass through the wall. Chemotaxis is the process by which phagocytes follow the cytokine “scent” to the infected spot. Neutrophils travel across epithelial cell-lined organs to sites of infection, and although this is an important component of fighting infection, the migration itself can result in disease-like symptoms. During an infection, millions of neutrophils are recruited from the blood, but they die after a few days.


Killer Skills of a Neutrophil

I'd like to tell you a secret. I am a superhero. I can devour my enemies whole, release my own chemical weapons and trap and kill my prey in nets spun from my own DNA. And I don’t even need to wear my pants on the outside.

I am a neutrophil, and several billion of me are made in your bone marrow every day.

Neutrophils are the most abundant white blood cell in the human body. They play a vital role in an ancient, rapid response called the innate immune system which is our first line of defense against disease-causing microbes. This system can mount a protective offense within minutes of the body being invaded, before the nature of the attack is known. This buys time for the body to produce a tailored response. The neutrophil is at the heart of the action, a killing machine that destroys unwanted intruders.

The neutrophil has many enemies. Perhaps you have a snot-filled toddler, a slobbery dog, or a propensity for paper cuts, but there will be something that exposes you to infection. Within minutes of infection invading your body the damaged tissue releases a chemical distress signal that attracts neutrophils out of the blood stream and activates them.

Activated neutrophils employ three key killing strategies. First, they can engulf and devour microbes. This process, called phagocytosis, was first described over one hundred years ago by Mechnikov who won the Nobel Prize for Medicine in 1908. In his Nobel lecture he described “white corpuscles of the blood. which absorb the microbes and destroy them” [1]. The process of cell devouring is directed by molecular tags called opsonins which are produced by the body and stick to microbes. Imagine the microbe is a cookie: opsonins are like chocolate chips which make the cookie that much more appealing to the hungry neutrophil. Once consumed, the microbe is exposed to enzymes which kill and digest it.

The neutrophil's second strategy, called degranulation, kills microbes occupying the local area. The neutrophil releases packets of enzymes which attack the outside of the microbe. This is like pouring boiling oil on invaders crude but effective. Unfortunately this can cause collateral damage to the very tissue the neutrophils are meant to protect. The damage is limited because the neutrophils are designed to die 24-48 hours after moving into the tissue. As the dead neutrophils accumulate we can see evidence of them in the form of pus.

Even in death the neutrophil works to bring down enemy forces through its third killer creation: Neutrophil Extracellular Traps (NETs). NETs are a relatively recent discovery, outlined in 2004 by Brinkmann and colleagues. NETs are created once the neutrophil's self-destruct programme has been engaged. DNA, proteins and hostile enzymes mingle within the cell which bursts open in a final kamikaze act that unleashes a web which can trap and kill bacteria. This works against an array of different bacteria, from Shigella, which causes dysentery, to Salmonella, which is responsible for typhoid fever.

Understanding this triad of killer skills is an important area of biomedical research. Neutrophils are designed to be part of a hard-and-fast response. If their assault is abnormally prolonged or excessive it can cause more harm than good. This process contributes to common autoimmune diseases including rheumatoid arthritis and emphysema. By understanding how neutrophils cause damage we hope to design new anti-inflammatory drugs to tone down the response and tackle these crippling conditions.

Yet we must not forget that we need neutrophils. Without their killer skills you couldn't go for a stroll in a park or kiss someone without risking death by infection. This is a reality for people on certain chemotherapy regimes which decimate neutrophil numbers. Doctors can try to protect patients by putting them in dedicated isolation rooms and using stringent hygiene controls. However these are short term measures and what patients really need are their neutrophils. We can stimulate recovery of neutrophil numbers using medications that promote their production and therefore give patients their freedom back.

We've all heard of the villains – superbugs, anthrax, flesh-eating bacteria. We've celebrated medicine's pharmacological victories like penicillin. It's time we recognise the remarkable feats happening inside each and everyone of us every day. To uncover these mysteries it is imperative that we keep funding research in this tough economic climate – it took almost 100 years between finding phagocytosis and NETs. There is so much more to be found, and to find it we have to keep looking. Forget space, forget the ocean floor, the human body is a veritable treasure trove for scientific explorers and the spoils – improved quality and quantity of life – can be enjoyed by all. So next time you see some pus, take a second to marvel at those millions of superheroes and the scientists helping us to understand them.

[1]. Ilya Mechnikov's Nobel Lecture (Accessed 23/4/12)

Image: Neutrophil engulfing anthrax bacteria, taken with a Leo 1550 scanning electron microscope. Scale bar is 5 micrometers.From "Neutrophil engulfing Bacillus anthracis". PLoS Pathogens 1 (3): Cover page. DOI:10.1371. November 2005.

Las opiniones expresadas son las del autor (es) y no son necesariamente las de Scientific American.


(NETs). A web of chromatin and granule proteins that are expelled from neutrophils during a unique form of cell death called ‘NETosis’ . The biological role of NETs is still debated.

The phenomenon of increased O2 consumption on neutrophil activation. It is primarily due to a non-mitochondrial mechanism through the activity of the neutrophil NADPH oxidase NOX2.

A subset of circulating granulocytes with unusually low density that appear in the mononuclear fraction during density gradient separation of leukocytes. Low-density granulocytes are abundant in certain autoimmune diseases, such as systemic lupus erythematosus. Their origin and functional importance in disease pathogenesis are poorly understood.

G protein-coupled receptors recognizing norte-formylated peptides of bacterial or mitochondrial origin during bacterial infection or tissue damage, respectively.

The phenomenon of massive focal accumulation of neutrophils at sites of infection or tissue injury. It is likely mediated by positive-feedback amplification of neutrophil recruitment signals.

A member of a family of transmembrane enzyme complexes leading to the generation of superoxide (O2 .– ) radicals. They are involved in reactive oxygen species generation by neutrophils (through NOX2), as well as several other redox signalling processes.

A member of a family of enzymes involved in the citrullination of proteins (that is, the conversion of arginine into citrulline residues). Besides a number of biological functions, citrullination is also thought to generate neoantigens during autoimmune diseases.

An adapter protein linking immune receptors to nuclear factor-κB activation in myeloid cells during fungal infection and other inflammatory processes.

An intracellular tyrosine kinase mediating immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-based signalling by B cell receptors, Fc receptors and certain C-type lectins. SYK has diverse roles in immunity and inflammation.

(JAK). A member of a family of intracellular tyrosine kinases mediating signalling by most (but not all) cytokine receptors through activation of signal transducer and activator of transcription (STAT)-family transcription factors. The JAK family consists of JAK1, JAK2, JAK3 and TYK2.

An antiapoptotic member of the BCL-2 family present in various immune cells and overexpressed in certain tumours. MCL1 blocks the intrinsic apoptotic programme of neutrophils, and therefore MCL1 deficiency leads to severe neutropenia.

Resolution of inflammation

An active process of restoring normal tissue structure and function after an acute inflammatory insult. Defective resolution is thought to lead to chronic inflammation.

Myeloid-derived suppressor cell

(MDSC). A diverse subset of myeloid cells that promote tumour development by suppressing antitumour immunity. MDSCs may phenotypically be similar to monocytes (monocytic MDSCs) or granulocytes (granulocytic or polymorphonuclear MDSCs).

Plasmacytoid dendritic cells

A unique circulating subset of dendritic cells capable of producing large amounts of type I interferons. Besides their role in antimicrobial host defence, they likely contribute to autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus.

Anti-citrullinated peptide autoantibodies

(ACPAs). Autoantibodies against various citrullinated autoantigens present in a subset of patients with rheumatoid arthritis. It is still unclear how ACPAs participate in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.

An immune signalling pathway whereby IL-23 leads to IL-17 production by T helper 17 cells. Besides its role in antimicrobial host defence, the IL-23–IL-17 axis also participates in the development of various autoimmune and inflammatory diseases, such as psoriasis, and serves as a regulator of granulopoiesis.

Neutrophils accumulating within the tumour tissue as one of the dominant tumour-infiltrating immune cell types in certain tumours. Tumour-associated neutrophils may exert either antitumoural (N1) or pro-tumoural (N2) effects.

Local environments in distant secondary organs that promote the engraftment and colonization by primary tumour cells, leading to metastasis formation. Preparation of premetastatic niches begins long before the actual translocation of primary tumour cells.

A process whereby immune cells extract membrane fragments and cytoplasm from target cells by mechanically tearing out parts of the target cell. Neutrophils use trogocytosis to kill cancer cells in a process called ‘trogoptosis’.

(AAV). Small-vessel vasculitis co-occurring with circulating antibodies against neutrophil components (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCAs)). It is generally believed that ANCAs and ANCA-mediated neutrophil activation play a pathogenetic role in AAV.

The acute exacerbation of gouty arthritis, characterized by massive inflammation caused by deposition of monosodium urate crystals. Neutrophils are believed to be involved in the inflammation process during gout flares.

Endoplasmic reticulum stress

The accumulation of misfolded or unfolded proteins in the endoplasmic reticulum, for example, during prion diseases or on mutations leading to folding defects. Endoplasmic reticulum stress triggers a process called ‘unfolded protein response’ and may lead to apoptosis of the cell.