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7.8: Genética de Archaeal - Biología

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7.8: Genética de Archaeal

La citidina conjugada con agmatina en un anticodón de ARNt es esencial para la decodificación de AUA en arqueas

Una base modificada en la primera posición (oscilación) de algunos anticodones de ARNt es fundamental para descifrar el código genético. En eucariotas y eubacterias, los codones AUA son decodificados por tRNAsIle con bases modificadas pseudouridina (y / o inosina) y lisidina, respectivamente. El mecanismo por el cual las especies de arqueas traducen los codones AUA no está claro. Describimos una base modificada conjugada con poliamina, 2-agmatinilcitidina (agm 2 C o agmatidina), en la posición de oscilación de archaeal tRNA Ile que decodifica codones AUA específicamente. Demostramos que las células arqueales usan agmatina para sintetizar agm 2 C de tRNA Ile. También identificamos una nueva enzima, tRNA Ile -agm 2 C sintetasa (TiaS), que cataliza la formación de agm 2 C en presencia de agmatina y ATP. Aunque agm 2 C es químicamente similar a la lisidina, TiaS constituye una clase distinta de enzima del ARNt Ile-lisidina sintetasa (TilS), lo que sugiere que los sistemas de decodificación evolucionaron de manera convergente a través de los dominios.


Métodos

Bioinformática

El análisis de la distribución filogenética y la agrupación física se realizó en la base de datos SEED (2) sobre los 58 genomas disponibles en el momento del análisis (Dic / 2011). Los resultados están disponibles en el subsistema & # x0201cPterin Biosynthesis Archaea & # x0201d en el servidor público de SEED (http://pubseed.theseed.org/SubsysEditor.cgi). Un subconjunto del análisis se resume en la Figura & # x200B Figura 2. 2. También usamos las herramientas y recursos BLAST en NCBI. 53 Se construyeron múltiples alineaciones de secuencia usando la herramienta ClustalW. Se realizaron 54 alineaciones basadas en estructuras utilizando la plataforma Espript (http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/). 55 La visualización y comparación de estructuras de proteínas y el acoplamiento manual de moléculas de ligando se realizaron usando PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Versión 1.4.1, Schr & # x000f6dinger, LLC).

Productos quimicos

7,8-Dihidroneopterina, 6-hidroximetilpterina-monofosfato (6-hidroximetilpterina-P), 6-hidroximetilpterina-PP, 6-hidroximetil-7,8-dihidropterina, 6-hidroximetil-7,8-dihidropterina-P, 6-hidroximetilo -7,8-dihidropterina-PP y D-neopterina fueron suministrados por Schircks Laboratories, Jona, Suiza. Sigma suministró ATP, GTP, CTP, UTP y 6-hidroximetilpterina. La NgFolE2 recombinante fue suministrada por Dirk Iwata-Reuyl, Departamento de Química, Universidad Estatal de Portland, Portland, Oregon.

E. coli Pruebas de complementación

los mj0408 (<"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_247382.1", "term_id": "15668584", "term_text": "NP_247382.1" >> NP_247382.1 ) y mj1634 (<"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_248644.1", "term_id": "15669830", "term_text": "NP_248644.1" >> NP_248644.1 ) los genes correspondientes fueron amplificados a partir de M. jannaschii ADN genómico por PCR y clonado en el Suboficialyo y SphI de pBAD24 (Amp R, ColE1) 44 después de la digestión con las enzimas correspondientes para dar los plásmidos pGPP528 (o pMJ0408) y pGPP541 (o pMJ1634), respectivamente. Los plásmidos resultantes se verificaron mediante secuenciación de Sanger en las instalaciones centrales de la Universidad de Florida. Los cebadores utilizados fueron MjfolB2_Fwd (5 & # x02032-CGTGACCATGGGAGTAGAAGAAACAGAAG-3 & # x02032) y MjfolB2_Rev (5 & # x02032-GGTCGGCATGCTTATTCCTCAAACTTTTTGACATAC-3) y # mj0408 clonación y MJ1634pBAD24_Fwdol1 (5 & # x02032-ATCGGCCATGGACATGAAGGAGTGGGA-3 & # x02032) y MJ1634pBAD24_Revol2 (5 & # x02032-GGTCGGCATGCTTATTTTACAA0CA32) para el mj1634 clonación. Los controles positivos se utilizaron como plásmidos que expresan el WT E. coli folB (pBAD24 ::folBCE, Amp R, ColE1) 31 y el WT Gente de E. coli gen (pgenteCE, ASKA clon JW0138 56). E. coli los derivados se cultivaron de forma rutinaria a 37 ° C en LB (BD Diagnostic System). Los medios de crecimiento se solidificaron con agar 15 g / L (BD Diagnostic System) para la preparación de placas. Transformaciones de E. coli se realizaron siguiendo procedimientos estándar. 57 Ampicilina (Amp, 100 & # x003bcg / mL), timidina (dT, 80 & # x003bcg / mL), cloranfenicol (20 & # x003bcg / mL), kanamicina (Kan, 50 & # x003bcg / mL) y l - Se utilizó arabinosa (0,02% a 0,2%) según fuera necesario.

Clonación y expresión del M. jannaschiimj0408 y mj1634 y expresión de sus productos genéticos

los M. jannaschii genes mj0408 y mj1634 fue ampliado de M. jannaschii ADN genómico por PCR. Los imprimadores utilizados para mj0408 fueron mj0408Fwd (5 & # x02032-GGTCATATGAGAGTAGAAGAAACAGAAG-3 & # x02032) y MJ0408Rev (5 & # x02032-GCTGGATCCTTATTCCTCAAACTTTTTGAC-3 & # x02032). Los imprimadores utilizados para mj1634 fueron mj1634Fwd (5 & # x02032-GGTCATATGGACA-TGAAGGAGTG-3 & # x02032) y mj1634Rev (5 & # x02032-GCTGGATCCTTATTTTAAAAATTCAATCTC-3 & # x02032). La amplificación por PCR se realizó usando una temperatura de hibridación de 55 & # x000b0C para mj0408 y 50 & # x000b0C para mj1634. El producto de la PCR se purificó, se digirió con Ndeyo y BamHI, y luego se ligaron en sitios compatibles en el plásmido pT7 & # x020137 para producir los plásmidos recombinantes pMJ0408 y pMJ1634. Las secuencias se verificaron mediante secuenciación en la instalación central de ADN de la Universidad de Iowa. Los plásmidos resultantes se transformaron en E. coli cepa BL21-Codon Plus (DE3) -RIL (Stratagene). Las células transformadas se cultivaron en medio LB (200 mL) suplementado con ampicilina 100 & # x003bcg / mL a 37 & # x000b0C con agitación hasta que alcanzaron una DO.600 de 1.0. La producción de proteína recombinante se indujo mediante la adición de lactosa hasta una concentración final de 28 mM. Después de 4 h adicionales de cultivo a 37 & # x000b0C, las células se recolectaron por centrifugación (4000 & # x000d7 gramo, 5 min) y congelado a & # x0221220 & # x000b0C. La electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) de las proteínas celulares totales confirmó la inducción de la proteína deseada a aproximadamente 14 kDa para MJ0408 y 27,6 kDa para MJ1634.

Purificación de productos genéticos recombinantes MJ0408 y MJ1634

Congelado E. coli Los sedimentos celulares (& # x0223c 0,4 g de peso húmedo de 200 ml de medio) se suspendieron en 3 ml de tampón de extracción (50 mM norte- Ácido [tris (hidroximetil) metil] -2-aminoetanosulfónico (TES), pH 7,0, MgCl 10 mM2, DTT 20 mM) y lisado por sonicación. Se encontró que ambos productos proteicos permanecían solubles después de calentar los extractos celulares resultantes durante 10 min a 70 & # x000b0C seguido de centrifugación (16 & # x02009000 & # x000d7 gramo durante 10 min). Este proceso permitió la purificación de las enzimas deseadas de la mayoría de E. coli proteínas, que se desnaturalizan y precipitan en estas condiciones. El siguiente paso de purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio aniónico de las fracciones solubles 70 & # x000b0C en una columna MonoQ HR (1 & # x000d7 8 cm Amersham Bioscience) usando un gradiente lineal de NaCl 0 a 1 M en tampón Tris 25 mM (pH 7,5), durante 55 min a un caudal de 1 ml / min. Se recogieron fracciones de 1 mL. Los diferentes pasos de purificación se muestran en la Figura 4 complementaria para MJ1634 como prototipo de la purificación de todas las proteínas descritas en este documento. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante análisis de Bradford.

Clonación del P. furiosuspf0930 y pf1278 Genes y expresión de sus productos genéticos

Los plásmidos recombinantes pPF0930 y pPF1278 se construyeron como se describe en Sugar et al. 58 Brevemente, los cebadores utilizados para pf0930 fueron PF0930For (5 & # x02032-CACCGGATCCAAGTGGGAGGAGTGGAAGCCATTC-3 & # x02032) y PF0930Rev (5 & # x02032-AAGCTCGAGCGGCCGCGATTTACGACTTGAGATAA x02032) & #. Los imprimadores utilizados para pf1278 eran PF1278For (5 & # x02032-CACCGGATCCAAGGCTAGGATTATCTATAGAGCT-3 & # x02032) y PF1278Rev (5 & # x02032-AAGCTCGAGCGGCCGCAGTGGTAAGGTCAAGGTGAGGTTGA-3). Estos cebadores se utilizaron para amplificar los genes mediante PCR y se clonaron en un vector pET24d modificado utilizando BamHola y NoYo enzimas de restricción. Las proteínas codificadas por estos plásmidos se expresaron y purificaron como se describe (58)

Ensayo enzimático de la actividad DHNA

El ensayo estándar utilizado para la medición de la actividad enzimática de DHNA se realizó en un volumen de reacción de 200 & # x003bcL e incluyó 7 ng de M. jannaschii MJ0408, tampón TES / KCl 40 mM pH 7,4, MgCl 8 mM2, TDT de 16 mM y 110 & # x003bcM H2Neo. Las muestras se sellaron bajo argón y se incubaron durante 10 min a 70 ° C. Después de la incubación, las reacciones se interrumpieron mediante la adición de 20 & # x003bcL de HCl 1 M. H2Neo y 6-HMD en la mezcla de incubación se oxidaron a neopterina fluorescente y 6-hidroximetilpterina mediante la adición de 8 & # x003bcL de una solución saturada de yodo en metanol y se incubaron a TA durante 30 min. Después de la oxidación, las muestras se neutralizaron mediante la adición de 20 & # x003bcL de NaOH 1 M y el exceso de yodo se eliminó mediante reducción con 8 & # x003bcL de NaHSO 1 M3. Después de la centrifugación, las muestras se combinaron con agua para un volumen final de 1 ml y se analizaron por HPLC como se describe a continuación.

Ensayo enzimático de actividad 6-HMDPK

El ensayo estándar utilizado para la medición de la actividad enzimática de 6-HMDPK se realizó en un volumen de reacción de 200 & # x003bcL e incluyó 3,5 ng de la enzima PF0930 (o MJ1634), tampón TES / KCl 40 mM pH 7,4, MgCl 8 mM2, DTT 16 mM, 6-HMD 100 & # x003bcM y ATP 1 mM. Las muestras se sellaron bajo argón y se incubaron durante 10 min a 70 ° C. Después de la incubación, las reacciones se interrumpieron mediante la adición de 20 & # x003bcL de HCl 1 M. Se oxidaron 6-HMD y 6-HMDP en la mezcla de incubación a pterinas fluorescentes mediante la adición de 8 & # x003bcL de una solución saturada de yodo en metanol y se incubaron a TA durante 30 min. Después de la oxidación, las muestras se neutralizaron mediante la adición de 20 & # x003bcL de NaOH 1 M y el exceso de yodo se eliminó mediante reducción con 8 & # x003bcL de NaHSO 1 M3. Después de la centrifugación, las muestras se combinaron con agua para un volumen final de 1 ml y se analizaron por HPLC como se describe a continuación.

Análisis HPLC de pterinas

La separación cromatográfica de pterinas se realizó en un sistema de HPLC Shimadzu con una columna de fase inversa C18 (Varian PursuitXRs 250 & # x000d7 4,6 mm, tamaño de partícula de 5 & # x003bcm). El perfil de elución consistió en 5 min en tampón de acetato de sodio al 95% (25 mM, pH 6,0, 0,02% de NaN3) y MeOH al 5% seguido de un gradiente lineal a tampón de acetato de sodio al 20% / MeOH al 80% durante 40 min a 0,5 ml / min. Las pterinas se detectaron por fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 356 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm. En estas condiciones, las pterinas se eluyeron en el siguiente orden (min): 6-hidroximetilpterina-PPP (4.982), 6-hidroximetilpterina-PP (5.243), 6-hidroximetilpterina-P (6.605), D-neopterina (10.10), monapterina (12.012) y 6-hidroximetilpterina (16.490). Alternativamente, las pterinas se separaron en una columna de polifluorofenilo (PFP) Varian Pursuit (tamaño de partícula de 250 & # x000d7 4,6 mm, 5 & # x003bcm). El perfil de elución fue isocrático con 95% de ácido fórmico en agua (0,1%) y 5% de MeOH. Las pterinas se detectaron por fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 356 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm.


Figura 1

Figura 1. Primeros pasos de las vías de tetrahidrofolato y tetrahidrometanopterina en bacterias y arqueas. La mayoría de las bacterias usan la ruta FolE (o FolE2) / FolB / FolK (en azul) a 6-HMDP incluso si algunas usan la derivación bacteriana PTPS-III (en verde). En Archaea se encuentran varias rutas al intermedio común 6-HMDP en tetrahidrofolato y tetrahidrometanopterina. Una vía común es la ruta FolE2 / MptD / MptE (en rojo) como en H. volcanii paralelamente a la vía bacteriana. Sin embargo, algunos metanógenos como M. jannaschii utilice la ruta MptA / MptB / MptD / MptE, mientras que P. furiosus utiliza la derivación archaeal PTPS-III. Las fosfatasas que aún no se han identificado se señalan con un signo de interrogación (?). FolE / FolE2, GTP ciclohidrolasa IA / IB (GCYH-IA / B) FolB, 7,8-dihidroneopterina aldolasa (DHNA) FolK, 7,8-dihidro-6-hidroximetilpterina difosfoquinasa (6-HMDPK) MptA, arqueal GTP ciclohidrolasa I (Enzima dependiente de Fe (II)) MptB, fosfodiesterasa cíclica dependiente de Fe (II) MptD, DHNA MptE específica de arqueas, 6-HMDPK PTPS-III / PTPS-V / PTPS-VI de arqueas específicas, parálogos de piruvoiltetrahidropterina sintasa involucrados en 6- Síntesis de HMDP.


Clase 8: Genética 3

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Tópicos cubiertos: Genética 3

Instructores: Prof. Eric Lander

Lección 10: Biología Molecular.

Clase 11: Biologo Molecular.

Lección 12: Biología Molecular.

Clase 13: Regulación genética

Clase 14: Protein Localiz.

Clase 15: ADN recombinante 1

Clase 16: ADN recombinante 2

Clase 17: ADN recombinante 3

Clase 18: ADN recombinante 4

Clase 19: Ciclo / Signo celular.

Clase 26: Sistema Nervioso 1

Clase 27: Sistema Nervioso 2

Clase 28: Sistema Nervioso 3

Conferencia 29: Células Madre / Clon.

Clase 30: Células Madre / Clon.

Clase 31: Médico Molecular.

Clase 32: Evolucion Molecular.

Clase 33: Médico Molecular.

Clase 34: Polimorfo humano.

Clase 35: Polimorfo humano.

Profundicemos hoy y veamos cómo los genetistas usan la genética. Les he hablado hasta ahora sobre algo de la historia de la genética y cómo dio lugar a nuestra comprensión sobre la transmisión genética en rasgos, sobre el mapeo genético, el análisis de ligamiento, cómo todo esto ayudó a confirmar la Teoría de los Cromosomas.

Y entretejimos una serie de conceptos sobre cómo se desarrollan las teorías científicas y se interpretan los datos y se hacen las intuiciones, y luego cómo se prueban realmente, qué tipo de evidencia se necesita para llegar a ser concienzudos en torno a las teorías.

Y eso a veces lleva años, muchas veces décadas antes de que se logre una disputa total sobre las cosas. Hoy quiero pasar un poco a los usos experimentales de la genética de una manera más cotidiana. Y recordarás este escudo de armas que puse aquí.

Función. Gene. Proteína. Bioquímica.

Genética. Y les conté cómo estas eran dos formas diferentes de estudiar la función biológica. Hoy quiero hablar un poco sobre cómo usamos la genética para estudiar la función biológica.

Y, en particular, voy a elegir algunos ejemplos de cómo usamos la genética para estudiar la función biológica que tiene que ver con las funciones biológicas de la bioquímica.

Así que ya estamos empezando a mirar hacia adelante a esta conexión entre gen y proteína, que la biología molecular establecerá para nosotros. Entonces, suponga que quiere hacer genética.

Tienes que estudiar algún organismo. Ya hablamos de la elección del organismo de Mendel, el guisante. Hablamos de algunas de sus ventajas y desventajas. Ventajas que podría obtener en el mercado variedades de reproducción pura, podría, cuando haya terminado con los experimentos, dárselo a los otros monjes. Había muchas cosas así, que eran ventajosas con el guisante, pero tenía problemas de generación. Ciertamente, en Europa solo obtendría una generación o más al año. En el norte de Europa, tal vez podría exprimir una segunda generación no tan bien.

Moscas de la fruta, un sistema muy atractivo en muchos aspectos porque podría cultivar muchas, muchas más cantidades.

El tiempo de generación es del orden de dos semanas más o menos para pasar de un embrión de mosca fertilizado, un huevo de mosca que se convierte en una mosca, que se convierte en un adulto maduro, capaz de tener descendencia.

Muy atractivo. Hay otros sistemas que la gente estudió.

Y, por supuesto, una de las razones por las que estudian este sistema es porque es interesante, lo siento, porque es manejable.

Y la otra razón es porque es interesante.

Entonces, la tratabilidad es muy importante para un genetista, ¿verdad?

El número de genetistas de ballenas es reducido, en su mayor parte.

Pero también queremos elegir nuestro sistema por lo que nos dirá sobre el sistema que queremos estudiar. Por ejemplo, si desea estudiar cosas distintivas sobre el sistema inmunológico, es posible que desee estudiarlas en ratones, o incluso podría estudiarlas en personas, aunque no puede establecer cruces en personas. Llegaremos a eso el lunes. Si quisiera estudiar cosas sobre los aspectos básicos del desarrollo, podría estudiarlas en las moscas de la fruta.

Y si quisiera estudiar bioquímica básica, el lugar para estudiar bioquímica básica podría ser mejor en organismos unicelulares, que también tienen que llevar a cabo vías bioquímicas como la glucólisis y la síntesis de aminoácidos y cosas por el estilo.

Van a ser, con mucho, los sistemas más manejables.

Y así, a la gente le gusta especialmente hacer cosas como estudiar bioquímica básica y muchos otros aspectos de la biología molecular básica para estudiar la levadura del organismo. La levadura es amiga de los seres humanos.

Ciertamente, la levadura ha sido un organismo intensamente estudiado debido a sus beneficios prácticos en la elaboración del pan, en la elaboración de la cerveza. Entonces, procesos de fermentación, aumento de masa y todo eso. Pero la levadura también es un organismo tremendamente importante para el genetista. Es un sistema experimental extremadamente elegante. La levadura es un hongo.

Es un eucariota unicelular. Ese es el verdadero núcleo. Tiene cromosomas que se emparejan. Son las células, a través de una aproximación de primer orden, que se parecen muchísimo a sus células en términos de tener todos los orgánulos eucariotas básicos importantes en el núcleo, las mitocondrias y otras cosas por el estilo.

Entonces, la levadura es un gran modelo para muchos propósitos. Y no vamos a hablar mucho sobre la biología celular de la levadura, pero sí quiero hablar sobre la cría de la levadura, cómo se cultiva la levadura. Entonces, la forma en que los genetistas cultivan levadura es tomando un medio de cultivo que tenga muchos nutrientes ricos.

Podrías tomar un caldo con muchos aminoácidos y todo tipo de cosas, ya sabes, un poco de sal, mucha agua por supuesto.

Y si tomas una sola célula de levadura y tiene muchos nutrientes ricos en este caldo aquí, pones tu célula de levadura en el caldo, así que lo haré. Aquí está mi frasco, aquí está mi pequeña varilla que tiene una célula de levadura o un par de células de levadura en el extremo. Lo pongo allí y lo cultivo a una temperatura adecuada.

Digamos que 30 grados, por ejemplo, sería una buena temperatura.

Podría hacer eso si quisiera. Luego una C, obviamente. Lo hago crecer y obtengo un cultivo de levadura allí. Y lo puedo decir porque este caldo claro y agradable ahora está todo turbio con la levadura que ha crecido en él.

Ahora quiero estudiar a estos tipos, así que lo que hago es verterlos en una placa de Petri. La placa de Petri tiene un medio, un medio sólido, un medio de agar que nuevamente tiene nutrientes.

Y si derramo esto, y derramo mucho, ¿qué pasará? Bueno, habrá levadura por todas partes y será muy suave. Habrá como células de levadura en todas partes y no está muy organizado. Entonces, lo que quiero hacer es tomar eso y quiero diluirlo.

Quiero tomar solo un poco de caldo y poner un poco de caldo en mi plato. Quizás lo haya diluido primero.

Y luego quiero esparcirlo con un pequeño esparcidor, aquí hay un pequeño esparcidor de vidrio tal vez o algo así, y empujarlo hacia adelante y hacia atrás, de modo que realmente solo haya celdas individuales individuales esparcidas al azar, esparcidas alrededor. Y entonces, esta célula comienza a crecer y dividirse y dividirse y dividirse y obtengo una colonia.

Una pequeña colina de celdas, todas las cuales descienden de una sola celda que se colocó en esa posición. Y la razón por la que sé que todos descienden de una sola celda es porque la mayoría de esta placa no tiene celdas. La mayor parte de la placa es escasa.

Solo tengo células, células, células, células esparcidas. Y por eso sé que estos han sido eventos individuales.

Estas cosas se llaman colonias. Ahora, cuando la levadura crece y se divide así, tomemos un momento y hablemos de su ciclo de vida.

Presentaremos su ciclo de vida aquí. Levadura propia de eucariota, por lo que tiene una etapa diploide. Crece como diploide. Y puede sufrir una mitosis en la que todos los cromosomas se alinean, como mencionamos. Ya se han replicado previamente para que estén listos para dividirse y dar uno a cada célula hija, y listo. La N de la levadura es 16. La levadura tiene 16 pares de cromosomas. Peas tenía siete. Los humanos tenemos 23 pares. Cada organismo tiene su propia levadura de 16. Ahora, lo que hacemos es someternos a la meiosis para producir células haploides, espermatozoides u óvulos en la población humana. La levadura también sufre meiosis para producir esporas.

Esporula y produce esporas. Y resulta que estas esporas, por supuesto, como era de esperar, tienen cromosomas N.

Se someten a la meiosis tal como la dibujamos en la pizarra.

Y estos pueden venir en dos sabores. Sucede que no vienen en machos y hembras, sino en A y alfa, ahí lo tienes. Las células A y alfa pueden aparearse para producir, nuevamente, un diploide. Fertilizan y pueden producir un diploide. Se fusionan para hacer eso. Y ahora regresa a un diploide de su haploide. Entonces, esto parece idéntico al ciclo genético humano aquí, pero hay una diferencia.

¿Cual es la diferencia? ¿Perdón? Tiempo. Sí, es verdad. La levadura se puede dividir mucho más rápidamente. La levadura puede tener descendencia extremadamente rápido en el transcurso de un día más o menos.

Y los humanos tardan algo más que eso. Ellos, por ejemplo, tienen que esperar hasta que terminen la universidad para poder reproducirse principalmente. ¿Qué otra cosa? Hay otra cosa importante. Resulta que la levadura también puede sufrir mitosis como haploide. En otras palabras, las células haploides de la levadura, cuando producen haploides individuales, pueden continuar creciendo indefinidamente. Por el contrario, tus gametos no pueden. No tienes una etapa humana independiente en la que seas haploide o tus gametos sean haploides.

Considerando que, la levadura puede permanecer como haploide durante mucho tiempo hasta que decide que quiere aparearse. Esto es muy conveniente para los genetistas. A los genetistas les gusta esto porque significa que podemos cultivarlo como diploide, podemos cultivarlo como haploide.

Cuando queremos aparearlos, podemos aparearlos juntos, pero también podemos estudiarlos solos. Y, se puede imaginar, esto va a ser muy bueno para estudiar rasgos recesivos, ¿verdad? Entonces, esa es una de las razones por las que a los genetistas les gusta la levadura. Hay muchas razones por las que a los genetistas les gusta la levadura.

Solo cultiva levadura, huele muy bien en el laboratorio.

Por ejemplo, intente cultivar E. coli en comparación. Entonces, ahora, resulta que la levadura está muy feliz si la cultivas en un medio rico.

Pero la levadura puede crecer en medios mínimos con muy pocas macromoléculas.

Necesita una fuente de carbono que es algo de azúcar que pueda fermentar.

Necesita nitrógeno. Necesita una fuente simple de nitrógeno.

Necesita una fuente simple de nitrógeno. Necesita una fuente de fósforo. Necesita otras sales traza y cosas así.

Y obviamente necesita un poco de agua. Eso es todo. Si piensas en lo que hay en una célula de levadura, como si tuviera bicapas de fosfolípidos.

Pero no le está dando fosfolípidos.

¿Por qué puede crecer? Los hace. ¿Y las proteínas?

Están formados por 20 aminoácidos. No le estás dando ningún aminoácido. ¿Por qué? Los hace. La levadura es extraordinariamente autosuficiente. Tú, por el contrario, no eres tan autosuficiente.

Hay una serie de aminoácidos que, si no te los doy, no puedes vivir porque en realidad no tienes la capacidad de producir esos aminoácidos. Pero la levadura puede producir la gran mayoría de las cosas. Básicamente, casi solo necesitabas darle los elementos. En cuanto a las fuentes de carbono y cosas por el estilo, está muy contento con una amplia variedad de azúcares fermentables.

Puedes darle glucosa. Puedes darle sacarosa.

Puedes darle galactosa. Puedes darle fructosa y se ocupará. Entonces, la levadura está muy bien configurada metabólicamente. Entonces, tiene todas estas vías del tipo de las que Bob ha hablado para poder desglosar las cosas que le das y poder sintetizar las cosas que necesita.

Ahora, la levadura, por supuesto, no es estúpida. Porque si le das aminoácidos los usará. Si le da todo tipo de otras cosas, lo usará. Entonces, la levadura puede usar medios ricos que tienen muchos nutrientes complejos y macromoléculas.

Entonces, tiene una habilidad, tiene todo lo que necesita para hacer estas cosas, pero tiene la habilidad de regular eso.

Por lo tanto, los procesos, las vías enzimáticas que producen macromoléculas complejas, aminoácidos, fosfolípidos, etcétera, se regularán negativamente, se apagarán o al menos se reducirán si se le proporcionan estas macromoléculas.

Esa es una pregunta interesante de cómo se las arregla para regular su bioquímica. ¿Por qué le importa? ¿Por qué no lo hace? ¿Por qué no tener esos caminos abiertos todo el tiempo? ¿Perdón? Lástima por el esfuerzo.

Necesita ATP. Cuesta dinero. Entonces, al principio probablemente estaban encendidos todo el tiempo, pero evoluciona alguna levadura, o evoluciona algún precursor de la levadura que es capaz de regularla.

Ese es capaz de ser más frugal con su energía.

Supera a los demás y luego a otro, dah, dah, dah. En cualquier lugar donde pueda producir algunos ATP aquí o allá, eventualmente el organismo que lo hace competirá con el organismo que no lo hace. Y así, un control bastante fino de esto, que es un tema al que llegaremos en un par de días, la regulación genética y otros tipos de regulación de la vía es muy importante. está bien. Entonces, queremos saber cómo lo hace. ¿Qué son las enzimas? ¿Cuáles son las vías? ¿Cómo produce realmente, oh, no sé, arginina? ¿Cómo produce arginina, aminoácido? ¿Cómo averiguaría cómo la levadura produce arginina? ¿Cómo puede la levadura sintetizar argininas?

Entonces, recuerde nuestra imagen de que el bioquímico quiere estudiar un problema triturando la célula y purificando un componente capaz de hacer algo. Entonces, un bioquímico podría querer triturar la célula y purificar una enzima que puede producir arginina.

¿Cuál es, por supuesto, una pregunta interesante?

Y luego lo que hizo lo que se usó para sustrato, etcétera, etcétera. ¿Qué haría un genetista?

¿Cómo aborda un genetista el problema de cómo la levadura produce arginina? Encuentre una levadura que no pueda producirla, eso es lo que hacemos. Es decir. Entonces, lo que necesitamos es un mutante.

Un genetista quiere una levadura que no pueda producirla.

Un genetista quiere mutantes. ¿Cómo encuentras al mutante? Encontrarás al mutante yendo a una cacería de mutantes.

Así es como lo llaman los genetistas. Y es algo muy emocionante.

Te vas, cargas las armas y te adentras en el monte en una cacería de mutantes.

Entonces, quiero hablar sobre la estrategia para una caza de mutantes.

¿Cómo buscamos una levadura que no pueda producir arginina?

¿Perdón? No poder. Tengo una levadura que puede producir arginina, porque la levadura de tipo salvaje normal puede crecer en un medio mínimo sin arginina suministrada. Y, cuando lo examino, tiene arginina. ¿Sí? Entonces, ¿a quién debo encontrar?

Proteínas que contienen arginina y luego no tiene las proteínas que no tienen arginina. Interesante. Ahora, el problema es que casi todas las proteínas tendrán una arginina, o la gran mayoría de ellas. Y una levadura que careciera de todas esas proteínas que no tuvieran arginina no sería una gran levadura. Creo que estaría bastante muerto. Entonces, es una buena idea si fuera una función más prescindible. Pero eso va a ser difícil.

O tal vez pueda usar el hecho de que está muerto. Ahora, en cierto sentido, ¿puedo encontrar la levadura? ¿Sí? Tuviste un pensamiento sobre esto.

¿Sí? Mata todas las levaduras que producen arginina, excelente.

Entonces, si tuviera un agente químico que pudiera matar la levadura que puede producir arginina, solo podría obtener la levadura que la produce. ¿Como podría hacerlo?

Esa es una idea muy interesante. Tienes razón. Podrías construir la molécula química en la vía de la arginina que cuando se descomponía enzimáticamente producía algún producto tóxico, y solo aquellas levaduras que no pudieran descomponerlo podrían crecer, etcétera, etcétera, y yo podría seleccionar. Esa es una idea muy ingeniosa.

Pero también tendría que saber mucho sobre el camino de antemano.

Entonces, supongamos que no conozco el camino. Supongamos que no supiera nada sobre cómo se produce la arginina. ¿Sí? Excelente. Supongo que me refiero a que los genetistas son gente ingenua y les gustan las soluciones simples. Tome el medio en el que le ha dado arginina a la levadura, déjela crecer y luego viértala en un plato que no tenga arginina. ¿Todos tienen esta idea? Entonces, vamos a tomar levadura. Lo vamos a cultivar en un medio que contiene arginina con arginina. Entonces, ahora las levaduras, esos mutantes que surgieron por casualidad y que no pueden producir su propia arginina, todavía pueden crecer aquí. Y luego lo tiramos en un plato que tiene medios mínimos sin arginina, sin arginina, y los que pueden crecer son los que no nos interesan. Y los que no aparecen son los que nosotros ' están interesados. Pero, espere un segundo, ese es el problema, ¿no ?, porque no están aquí.

¿Cómo los estudiamos si no están ahí? ¿Qué podemos hacer al respecto?

Si. Quiere ver si puede ayudarnos. Elimina los que crecieron. Entonces, entra allí, deséchalos, ahora ponte un poco de arginina. Estamos llegando a la idea.

Sin embargo, tal vez podamos configurar esto de manera más elegante.

¿Pensamientos? ¿Cómo podemos, sí? ¿Haz una apuesta? ¿Adivina?

Puedo hacer esa suposición, pero ¿cómo los encuentro?

Aquí tienes una idea simple, simple y simple.

Déjame probar una idea simple. ¿Qué tal si hago crecer estas levaduras y, en lugar de colocarlas en un medio mínimo, seamos buenos con ellas? Coloquémoslos en un medio mínimo.

Bueno. Eso es interesante. Coloquémoslos en un mínimo de medio más arginina. O, en realidad, si quisiéramos, incluso podríamos colocarlos en un medio rico. Seremos realmente buenos con ellos. De cualquier manera. Entonces, ahora, dejemos que cada uno crezca.

Y aquí estarán los que pueden crecer y los que no pueden crecer con arginina. Ahora permítanme tomar un plato que sea medio mínimo. Y ahora déjeme tomar un palillo, poner un palillo allí y llevar esta colonia hasta allí.

Déjame tomar un palillo y llevar a este tipo aquí y un palillo y llevar a este tipo aquí, y un palillo y un palillo y un palillo. Y todo lo que tengo que hacer es seguir transfiriendo, una a la vez, estas colonias.

Y ahora puedo ver que en algún lugar había una colonia que creció bien cuando le di, digamos, medio rico o arginina mínima más, y una colonia que no creció cuando la puse en medio mínimo. Eso al menos se mostraría, así que, por supuesto, el problema es que primero tengo que encontrarlos cultivándolos en algo donde les he dado la arginina y luego puedo ver que no pueden crecer. Está bien. Esto es lo que hacen básicamente los genetistas. ¿Qué sucede si los cultivé en un medio rico y los transfiero a un medio mínimo? ¿Por qué podría no crecer algo? Podría faltar la capacidad de producir triptófano. Podría faltar la capacidad de producir prolina. Puede que le falte la capacidad de hacer otra cosa.

Entonces, lo que puedo hacer es, si quisiera, hacer una búsqueda de mutantes muy amplia.

Primero podría cultivar en medio rico y luego sembrar en medio mínimo y cualquier levadura que haya perdido la capacidad de producir algún nutriente esencial será evidente por su ausencia en el plato de medio mínimo.

Entonces, tenemos para las levaduras. Las levaduras que pueden crecer en medios mínimos se denominan protótrofos. Son del tipo salvaje que pueden crecer en medios mínimos. Pueden hacer todo ellos mismos.

Las levaduras que necesitan ayuda, que no pueden crecer por sí solas, que necesitan ayuda, que necesitan un suplemento se llaman auxótrofos.

Auxo, obviamente, significa ayuda. Entonces, es un mutante que ha perdido la capacidad de crecer en un medio mínimo y que necesita algún tipo de suplemento. Entonces, si quisiera, primero podría recolectar montones y montones y montones de auxótrofos y luego averiguar qué necesitan. Entonces, podría recolectar una gran colección de auxótrofos. Y luego pruebe para ver si el suministro de arginina los rescata. También podría probar el triptófano.

Entonces, si solo, solo, solo me importara encontrar auxótrofos de arginina, podría cultivarlos con un mínimo de arginina y luego probarlos con un mínimo. Y luego lo sabría de antemano, todos estos tipos crecieron con arginina al mínimo y no crecieron sin arginina, y yo sabría que era arginina. O, si estuviera en un estado de ánimo expansivo, podría probarlos en un medio rico, recopilar a todos los que no pueden crecer en el mínimo y luego averiguar cuál es la razón. ¿Es arginina?

¿Es prolina? ¿Es lo que sea? Y depende de la cantidad de trabajo que le interese hacer y de qué tan completo sea el estudio que desee realizar.

De cualquier manera, podríamos terminar con una colección de auxótrofos de arginina.

Organismos que son mutantes por la capacidad de producir su propia arginina y requieren que se les suministre en el medio.

Está bien. Podría obtener, dependiendo de cuánto trabajo esté dispuesto a hacer, docenas de colonias independientes que no pueden crecer sin arginina. Podría obtener cientos si estoy dispuesto a trabajar lo suficiente. Puedo conseguir tantos como quiera.

Nuestro objetivo ahora es estudiarlos y descubrir por qué no pueden hacer eso. ¿Tengo una pregunta rápida? Esas células de levadura que sembramos, ¿eran haploides o diploides? No lo dijimos, ¿verdad? Entonces, ¿deberían ser haploides o diploides? ¿Cuántos votan diploide?

¿Cuántos votan haploide? Mucha gente vota por ser haploide, pero no está dispuesta a expresar el motivo. ¿Por qué haploide?

Derecha. Excelente. Excelente, aunque los genes no son recesivos, pero están bien. Un pequeño detalle. Los fenotipos son recesivos. Cuéntame un poco más de lo que estás pensando. Lo sacaremos más adelante en este punto, sí. Entonces, supongamos que estamos buscando en un haploide.

Acepto su punto, incluso si en la nomenclatura quiero retroceder un poco. Entonces, supongamos que es un diploide y supongamos que ahora tenemos dos copias de este cromosoma aquí en el diploide. Y supongamos que aquí hay un gen que codifica una enzima que ahora es necesaria para producir arginina, o que alguien sabe que es necesaria para producir arginina.

Imaginemos que ese es el caso. Para obtener levadura haploide que no puede producir arginina debido a una mutación en este gen, es necesario tener algún tipo de mutación en esta copia.

¿Qué pasa con la levadura diploide? Para que esta levadura no pueda crecer sin arginina, ¿necesitamos una mutación en ambas copias?

Bueno, probablemente la respuesta sea. La verdad es un poco más complicada, pero supongamos que incluso una copia del gen funcional fuera suficiente para realizar el paso enzimático, entonces la respuesta sería sí, necesitaríamos una mutación de ambas copias.

¿Cuál es la probabilidad de encontrar una levadura que tenga una mutación en ambas copias? Obviamente, es mucho menor que la posibilidad de encontrar una levadura que tenga una mutación de una copia. Por lo tanto, es mucho mejor ir a buscar en el haploide donde el fenotipo se revelará mucho más fácilmente en virtud de una sola mutación en lugar de tener que, por casualidad, encontrar uno que tenga mutaciones en ambas copias.

Ahora, la razón por la que soy un poco cauteloso aquí es porque, a pesar de los libros de texto, no siempre es cierto que todo como esto sea un rasgo recesivo. Es posible que la auxotrofia de la arginina sea un rasgo dominante.

Entonces, ¿cómo podría ser eso? Bueno, la auxotrofia podría ser un rasgo recesivo. Supongamos que hay alguna vía enzimática, A va a B va a C va a D, y esto codifica una enzima que lleva a cabo un paso bioquímico particular.

Bueno, si el gen está roto, si falta el gen, si el gen no produce la proteína, como todos ustedes saben que eso es lo que sucede, entonces no tienen la enzima, no pueden seguir la vía. .

Y suele ocurrir que tener una sola copia es suficiente.

Debido a que al tener un poco de enzima, la vía puede funcionar más lentamente, aún funcionará bien y eventualmente obtendrá arginina.

Pero de vez en cuando es posible, como observo, como ustedes son sofisticados, que a veces un gen puede codificar una proteína que no solo no funciona, sino que estropea las otras copias funcionales de la proteína. Supongamos que la enzima que hizo esto fuera un tetrámero. Tenía varias subunidades que se habían unido. Una copia mutante de una enzima, cuando se forma en un tetrámero, de alguna manera podría alterar todas las otras copias buenas que existen. Y eso sucede a veces.

Puede suceder que no puedas hacer que tu propia arginina sea un rasgo heredado de forma dominante. Entonces, en realidad tienes que probar si es recesivo o dominante. A menudo será recesivo. Entonces, generalmente la mayoría de estos auxótrofos simples son rasgos recesivos. De vez en cuando, algunos son dominantes.

Entonces, ahora, supongamos que obtenemos una colección completa de auxótrofos Arg, y les daremos un nombre. No sé. Aquí está mi colección.

Llamaremos a la primera, a falta de algo terriblemente creativo, Arg 1, Arg 2, Arg 3, etcétera, cada una de las cuales es una cepa individual de crecer originalmente para una sola colonia que es incapaz de producir su propia arginina.

Ahora queremos tomar esta colección y caracterizarla.

¿A cuántos genes distintos afecta esto? ¿Es posible que estos mutantes estén todos en el mismo gen? ¿Están en cien genes diferentes? ¿Cómo podríamos saberlo? Ahora, por supuesto, si eres bioquímico, ya conoces la proteína que puedes ver y dah, dah, dah. Pero, si conoces la respuesta, bueno, ¿por qué preguntas entonces, verdad? Un genetista sale a hacer esta pregunta porque quiere saber todas las formas posibles en las que puede alterar la célula para que no produzca arginina. Y no sabemos de antemano cuáles son esas formas, entonces, ¿cómo vamos a poder saber si diferentes mutaciones afectan o no al mismo gen, la misma función en la levadura? Es una pregunta interesante.

Los genetistas realizan una variedad de pruebas. La primera prueba que hace un genetista para caracterizar a un mutante es mediante pruebas de recesividad o dominancia, como se quiera expresar.

Queremos tomar cada mutante y probar si es recesivo o dominante como fenotipo, si el fenotipo, la auxotrofia de la arginina es recesivo o dominante.

Entonces, aquí está el mutante número uno, la célula mutante que lleva esta mutación aquí. Conceptualmente afecta a algún gen.

Lo voy a etiquetar como Arg 1. No sabemos dónde está en el genoma.

Aquí también hay otros cromosomas. Aquí está mi célula mutante.

¿Cómo voy a saber si la auxotrofia de la arginina es recesiva o dominante? ¿Sí? ¿Con que?

Cruzarlo con un haploide que sea un protótrofo, o podría decir simplemente cruzarlo con un tipo salvaje, ¿verdad? Perfecto. Entonces, haga una cruz aquí, muy bien, con el tipo salvaje más allá.

¿Cómo sé que hay un plus? Este es de tipo salvaje. El tipo salvaje se define como la forma normal. Y así, como dije que esto es lo que estamos usando como tipo salvaje, es necesariamente un plus porque estamos midiendo mutaciones en relación con el tipo salvaje. Entonces, ¿qué pasa cuando llegamos aquí? Ahora, cuando cruzamos obtenemos un diploide, y Arg 1 más. Ahora bien, ¿cómo sabemos si ese fenotipo era recesivo o dominante? ¿Perdón? Es lo que aparece cuando intentamos cultivarlo. Entonces, cuando lo cruzamos, ¿en qué tipo de plato debemos cultivarlo primero? ¿Deberíamos cultivarlo en mínimo o rico? Será mejor que lo cultivemos rico porque en caso de que no lo haga, no puede producir su propia arginina, es mejor que primero lo dejemos crecer y luego lo probemos. Entonces, hagámoslo crecer en un medio rico. Los cruzaremos juntos, lo cultivaremos en un medio rico. Entonces, hazte rico, prueba lo mínimo. ¿OK? Y podremos comprobar el fenotipo para determinar si el fenotipo es de tipo salvaje o mutante.

Está bien. Entonces, podríamos hacer eso.

Y probaremos el primero y el segundo y el tercero y el cuarto. Y, para cada uno de estos, escribiremos si es recesivo o un auxótrofo dominante.

Ahora, déjeme suponer que todos los que estamos hablando son fenotipos recesivos. Porque todo lo que voy a decir es mucho más difícil si resulta que alguno de ellos es dominante.

Entonces, vamos a asumir. Supongamos ahora, pero no siempre es el caso, asumiremos que la colección, tal vez Arg 100, son todas auxotrofías recesivas, el fenotipo es recesivo. Ahora, ¿cómo puedo saber si están en el mismo gen o no? Entonces, ahora quiero caracterizar a mi mutante mediante alguna otra prueba que me diga si Arg 1 y Arg 2 están o no en el mismo gen. Suponga que Arg 1 y Arg 2 están en genes diferentes. Cruzarlos. ¿Lo que sucederá?

Derecha. Entonces, para repetir eso, si cruzo los dos mutantes y están en genes diferentes, cada uno tendrá al menos, cada uno contribuirá con una buena copia, una copia funcional, una copia de tipo salvaje de uno de los genes. Entonces, repasemos esto.

Interesante. Interesante. Entonces, supongamos que tomo una situación en la que tengo Arg 1, una mutación en un gen aquí, en este cromosoma, y ​​en el otro cromosoma tengo una copia de tipo salvaje.

Mi mutante Arg 1 está mutado en un gen aquí.

Tengo este otro gen aquí, que es normal. Y voy a cruzar eso ahora con la cepa que tiene una copia de tipo salvaje aquí para este primer gen, pero tiene una mutación en el segundo gen.

Cuando los cruzo, ahora obtengo una célula diploide aquí, que es Arg 1, una mutación allí, más allí, más una copia aquí y Arg 2. ¿Tener una copia, una copia de trabajo de este gen será suficiente para hacer la enzima?

¿No? En otras palabras, ¿es el fenotipo de tipo salvaje dominante a esta auxotrofia, o es la auxotrofia atribuible a este gen recesivo? Si. ¿Por qué? Porque lo asumimos.

¿Por qué lo asumimos? Entonces podría decir esto, ¿verdad? está bien. Si no fuera así, estaríamos en problemas. Pero asumiendo que estamos trabajando con un fenotipo recesivo, entonces sabemos que esto será suficiente para salvar la levadura. ¿Que tal aquí? Suficiente para salvar la levadura para que crezca sin arginina.

Por el contrario, supongamos que fuera el caso de que esta célula aquí, Arg 1, y supongamos que nuestro otro mutante que habíamos aislado en nuestra búsqueda de mutantes fuera una mutación Arg 2 en el mismo gen. Supongamos que estos fueran el mismo gen. Cuando los cruzo, ahora tengo una célula que es Arg 1, Arg 2. En otras palabras, su genotipo es Arg 1 sobre Arg 2, nombre de la mutación. ¿Y puede crecer?

Sin crecimiento sin arginina. Por el contrario, el genotipo aquí es Arg 1 sobre plus, plus sobre Arg 2. Incluso podría escribir Arg 2 sobre plus, pero lo hice para indicar los cromosomas de los que proceden.

Está bien. A esto se le llama Prueba de Complementación porque estos dos genes pueden complementar el defecto del otro.

Si dos mutaciones complementan el defecto de la otra, entonces están en genes diferentes. ¿OK? Chico, eso es ruidoso.

Entonces, podemos hacer una tabla de complementación.

Supongamos que tomo un montón de levaduras, tipo salvaje, WT, mutante número uno, mutante número dos, mutante número tres, mutante número cuatro. Y supongamos que los cruzo entre sí en todas las combinaciones por pares. Supuse que todos estos auxótrofos de arginina tienen un fenotipo recesivo aquí.

Estos son todos mis mutantes Arg, y supongo que esto es recesivo. ¿Qué pasa cuando los cruzo y pruebo para ver si pueden crecer sin arginina? Si cruzo el tipo salvaje por el tipo salvaje, ¿puede crecer sin arginina? Sí. Fenotipo normal. Entonces, plus va a significar prototrófico. Menos significa auxótrofo para la arginina. ¿Qué sucede cuando cruzo el tipo salvaje con el mutante número uno?

Crece. ¿Por qué? Por supuesto, todos estos eran recesivos.

Solo estoy probando los recesivos. Dos. Tres. Cuatro. Cuando cruzo en esta dirección, tipo salvaje por estos tipos.

Esta será una matriz simétrica, por supuesto, ¿verdad? está bien. Ahora bien, ¿qué pasa cuando cruzo un mutante por otro mutante?

Ahora tengo un diploide. ¿Podrá crecer sin arginina? ¿No por qué no? No tiene copias funcionales de ese gen, así que voy a poner un signo menos allí. ¿Qué pasa con el mutante dos con el mutante dos? Menos. ¿Qué pasa con el mutante tres con el mutante tres? Menos. ¿Qué pasa con el mutante cuatro con el mutante cuatro? Menos. Ahora bien, ¿qué sucede cuando cruzo el mutante uno por el mutante dos? Eso depende. Puede ser más o menos. Si están en el mismo gen, menos. Diferentes genes, podrían ser más. Entonces, aquí hay algunos datos.

Entonces, todo esto está obligado. Pero el tipo de datos, ooh, usaré un color. ¿No es divertido? Quieren que use colores allí. Aquí vamos. Suponga que los datos fueran menos, menos, más, más, más, más, menos, menos, más, más, más, más. ¿Qué podría ser?

¿Qué conclusión podríamos sacar? ¿El mutante uno y el mutante tres están en el mismo gen? ¿Se complementan?

No. ¿Pero hay uno en el mismo gen que dos? Si. De hecho, este recuadro y este recuadro de aquí definen los genes a la perfección.

Los grupos que no cumplieron definen mutaciones en el mismo gen.

Estos se llaman Grupos de Complementación porque no complementan, ¿de acuerdo? Es un poco complicado pero está bien.

Estos se denominan grupos de complementación porque todos los miembros del grupo de complementación, a saber, Arg 1 y Arg 2, no se complementaron entre sí. Podrían llamarse grupos de falta de cumplidos, pero sería demasiado largo.

¿OK? Ahí vas. Puede tomar cientos de mutantes y organizarlos en grupos de complementación y así saber cuáles van al mismo gen. Y ahora, si quiero estudiar los genes, solo tengo que estudiar los distintos grupos de complementación.

Lo último, que tendremos tiempo de hacer, son las llamadas pruebas de epistasis. Probablemente repasaremos un momento o dos sobre esto.

Supongamos que un bioquímico estuviera colaborando con un genetista y hubiera estudiado lo que él o ella pensaba que era la vía para producir arginina.

Algún precursor alfa pasa al precursor beta, pasa al precursor gamma, pasa a la arginina. Y supongamos que se necesitan genes específicos para codificar proteínas específicas.

Los llamaré Arg A, Arg B, Arg C para catalizar cada paso de esta reacción bioquímica. El genetista y el bioquímico podrían colaborar entre sí para estudiar si estos mutantes, estos genes particulares ahora identificados, afectaban cada paso de la vía. Y así es como podrían hacerlo.

Podrían tomar levadura de tipo salvaje, mutante, bueno, no sabrían de antemano si faltaba o no la capacidad de crecer en cada una de ellas, si faltaba cada una de estas enzimas, pero pensemos conceptualmente. Supongamos que tenemos un mutante que es, una cepa de tipo salvaje, Arg A menos, Arg B, menos, Arg C menos, incapaz de producir esta enzima, esta enzima, esta enzima. Y supongamos que lo ayudamos. Supongamos que le damos la arginina mutante. Supongamos que lo complementamos y lo cultivamos en medios con arginina. ¿Cuáles podrán crecer con arginina? ¿Puede crecer el tipo salvaje si se le administra arginina?

¿Qué pasa con Arg A menos? B menos? C menos? ¿Qué pasa si en cambio le ofrecemos precursor gamma? ¿Podrá crecer el tipo salvaje si se le administra un precursor gamma? Seguro. ¿Qué pasa con Arg A menos?

No, porque todavía está atascado en este paso.

No puede. ¿Qué pasa con Arg B menos? ¿Qué pasa con Arg C menos? ¿En serio?

No tiene esta enzima. ¿Qué va a hacer con gamma?

No tiene nada que ver con gamma, sin enzimas.

Supongamos que le di beta. Tipo salvaje, ¿puede crecer? ¿Qué pasa con Arg A menos? No, porque puede pasar de alfa a beta, pero no a gamma. No puede crecer.

¿Qué pasa con Arg B menos? Le he dado beta, pero no puede hacer nada con beta porque no tiene este gen.

¿Qué pasa con Arg C menos? Espera un segundo. ¿Qué acabo de hacer?

Estamos al revés. Perdón. Si le diéramos gamma, simplemente me perdí aquí. Si le dimos gamma, pudo crecer, bueno, estamos completamente equivocados, muchachos. Puede crecer aquí.

Gracias. Volvamos a eso. Deberías haberme atrapado antes.

Mi error. Si lo tenemos gamma, puede hacerlo, si es un mutante aquí, puede crecer porque evita este problema. Y tener gamma es suficiente.

Si le di beta, lo siento, si le di gamma y su mutación estaba aquí, puede crecer. Perdón.

Ahora, si le di aquí beta, y su mutación estaba aquí, todavía puede crecer, ¿verdad? Pero si su mutación está aquí, no puede y si su mutación está aquí, no puede. Eso es mejor.

Yo también me estaba preocupando allí por un tiempo. Supongamos que le di alfa. El tipo salvaje puede crecer. Si le doy alfa a este tipo, ¿ayudará eso si es un mutante en A? No. ¿Puede ayudar si es mutante en B? No. ¿Puede ayudar si es mutante en C?

No lo siento. Aquí vamos. Normalmente empiezo por el otro extremo de esta imagen. Entonces, lo que puedes ver es que estos mutantes tienen diferentes fenotipos con respecto a poder complementarlos con diferentes químicos. Ahora, déjeme preguntar en nuestros últimos dos minutos, correré dos minutos aquí. Suponga que le di un mutante que era un homocigoto doble. Supongamos que Arg B menos, Arg B menos, lo siento, Arg B menos y Arg C menos. Supongamos que fuera un mutante doble, carecía tanto de esto como de esto.

¿A qué línea de mi mesa se parecería? ¿Se vería como la primera línea, la segunda línea o la tercera línea de mi tabla?

Segunda linea. ¿Porque eso? Si me falta B, ya estoy en problemas aquí. Y también la falta de C no importa.

Entonces, me veré, como un mutante que carece de B.

Entonces, en otras palabras, puedo, si sé algo sobre la bioquímica de una vía y puedo dividir mis mutantes de arginina en diferentes tipos de fenotipos aquí por su respuesta a diferentes pasos en una vía, entonces puedo mirar combinaciones de mutantes.

Y puedo decir que si tengo un mutante doble al que le faltan B y C, ¿se parece a B o se ve como C cuando los pongo juntos?

Y resulta que si parece B, entonces B estaba más arriba en la vía. Entonces, resulta que los genetistas y bioquímicos pueden colaborar en función del fenotipo del organismo a veces para inferir aspectos de la vía bioquímica.

Este es el tipo de cosas que hace un genetista para poder caracterizar a los mutantes en una búsqueda de mutantes. La próxima vez lo que quiero hacer es hablar sobre la caracterización de mutantes en un tipo de organismo muy diferente, a saber, el ser humano.


La siguiente facultad tiene una afiliación secundaria con la división de Genética, Genómica y Desarrollo Amplio.

David Bilder
Catedrático de Biología Celular y del Desarrollo
Genética de la arquitectura celular y tisular

Michael Botchan
Decano de Ciencias Biológicas Profesor de Bioquímica, Biofísica y Biología Estructural
Replicación del ADN eucariota y control de la fase S

Gloria Brar
Profesor asociado de biología celular y del desarrollo
Regulación de la traducción meiótica, las funciones de los productos de traducción corta generalizados y la cooptación de las respuestas al estrés para la diferenciación celular a través de la meiosis.

Abby Dernburg
Investigador del Instituto Médico Howard Hughes y Profesor de Biología Celular y del Desarrollo
Organización y dinámica de los cromosomas durante la meiosis

David G. Drubin
Cátedra Ernette Comby de Microbiología Profesora de Biología Celular y del Desarrollo
Citoesqueletos de actina y microtúbulos en levaduras y células de mamíferos

Iswar Hariharan
Copresidente del Departamento y Profesor de Biología Celular y del Desarrollo
Mecanismos de control del crecimiento y proliferación celular. Regulación del crecimiento regenerativo.

Dirk Hockemeyer
Profesor asociado de biología celular y del desarrollo
Biología de los telómeros de las células madre humanas

Donald Rio
Catedrático de Bioquímica, Biofísica y Biología Estructural
Genética molecular elementos transponibles empalme de ARN

Robert Tjian
Presidente del Instituto Médico Howard Hughes y profesor de bioquímica, biofísica y biología estructural
Bioquímica de biología molecular eucariota


Posicionamiento del ARN del sustrato en el complejo de ribonucleoproteína archaeal H / ACA

Las pseudouridilasas de ARN más complejas son las partículas de ribonucleoproteína H / ACA, que utilizan un ARN guía para la captura del sustrato y cuatro proteínas (Cbf5, Nop10, Gar1 y L7Ae / NHP2) para la modificación del sustrato. Aquí presentamos la estructura tridimensional de un complejo de enzimas arqueales deficiente catalíticamente (incluido el ARN guía y tres de las cuatro proteínas esenciales) unido a un sustrato de ARN. Las interacciones extensas de Cbf5 con una hélice guía-sustrato y un tallo de ARN guía dan forma a la estructura del complejo de ARN guía-sustrato bifurcado y colocan el sustrato en las proximidades del centro catalítico de Cbf5. Nuestros análisis de fluorescencia estructural y complementaria también indican que la colocación precisa de la uridina diana en el sitio activo requiere una conformación del dúplex de ARN guía-sustrato que se produce por la interacción concurrente previamente identificada del ARN guía con L7Ae y un compuesto Cbf5- Nop10 en la superficie e identifique además un residuo que sea crítico en este proceso.


Contenido

Los aisladores tienen dos funciones principales: [3] [4]

  1. Los aisladores que bloquean el potenciador evitan que los potenciadores distales actúen sobre el promotor de genes vecinos.
  2. Los aisladores de barrera evitan el silenciamiento de la eucromatina por la propagación de la heterocromatina vecina

Mientras que el bloqueo del potenciador se clasifica como una interacción intercromosómica, actuar como barrera se clasifica como una interacción intracromosómica. La necesidad de aislantes surge cuando dos genes adyacentes en un cromosoma tienen patrones de transcripción muy diferentes, es fundamental que los mecanismos de inducción o represión de uno no interfieran con el gen vecino. [6] También se ha encontrado que los aislantes se agrupan en los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y pueden tener un papel en la partición del genoma en "vecindades cromosómicas", regiones genómicas dentro de las cuales se produce la regulación. [7] [8]

Algunos aislantes pueden actuar tanto como bloqueadores potenciadores como barreras, y algunos solo tienen una de las dos funciones. [3] Algunos ejemplos de diferentes aisladores son: [3]

  • Drosophila melanogaster aislantes gitano y scs scs son aislantes bloqueadores de potenciadores
  • Gallus gallus tener aisladores, Lys 5 'A que tienen actividad de barrera y de bloqueo del potenciador, así como HS4 que solo tienen actividad de bloqueo del potenciador
  • Saccharomyces cerevisiae aisladores STAR y UASrpg son aislantes de barrera
  • Homo sapiensHS5 el aislante actúa como un reforzador-bloqueador

Aisladores de bloqueo reforzador Editar

Mecanismo de acción similar para los aislantes que bloquean el potenciador. Los dominios de bucle de cromatina se forman en el núcleo que separa el potenciador y el promotor de un gen diana. Los dominios de bucle se forman a través de la interacción entre los elementos bloqueadores del potenciador que interactúan entre sí o aseguran la fibra de cromatina a los elementos estructurales dentro del núcleo. [4] La acción de estos aislantes depende de su posición entre el promotor del gen objetivo y el potenciador corriente arriba o corriente abajo. La forma específica en que los aisladores bloquean los potenciadores depende del modo de acción de los potenciadores. Los potenciadores pueden interactuar directamente con sus promotores diana a través del bucle [9] (modelo de contacto directo), en cuyo caso un aislante evita esta interacción mediante la formación de un dominio de bucle que separa los sitios potenciador y promotor y evita que el lazo promotor-potenciador formando. [4] Un potenciador también puede actuar sobre un promotor a través de una señal (modelo de seguimiento de la acción del potenciador). Esta señal puede ser bloqueada por un aislante mediante el direccionamiento de un complejo de nucleoproteína en la base de la formación del bucle. [4]

Aisladores de barrera Editar

La actividad de barrera se ha relacionado con la interrupción de procesos específicos en la vía de formación de heterocromatina. Estos tipos de aislantes modifican el sustrato nucleosómico en el ciclo de reacción que es fundamental para la formación de heterocromatina. [4] Las modificaciones se logran a través de varios mecanismos, incluida la eliminación de nucleosomas, en los que los elementos que excluyen los nucleosomas interrumpen la propagación y el silenciamiento de la heterocromatina (silenciamiento mediado por cromatina). La modificación también se puede realizar mediante el reclutamiento de histonas acetiltransferasas y complejos de remodelación de nucleosomas dependientes de ATP. [4]

El aislante CTCF parece tener actividad de bloqueo de potenciador a través de su estructura 3D [10] y no tiene conexión directa con la actividad de barrera. [11] Los vertebrados en particular parecen depender en gran medida del aislante CTCF, sin embargo, se han identificado muchas secuencias de aisladores diferentes. [2] Los vecindarios aislados formados por la interacción física entre dos loci de ADN unidos a CTCF contienen las interacciones entre los potenciadores y sus genes diana. [12]

Regulación Editar

Un mecanismo de regulación de CTCF es mediante la metilación de su secuencia de ADN. Se sabe que la proteína CTCF se une favorablemente a sitios no metilados, por lo que se deduce que la metilación de las islas CpG es un punto de regulación epigenética. [2] Un ejemplo de esto se ve en el Igf2-H19 locus impreso donde la metilación de la región de control impresa paterna (ICR) evita la unión de CTCF.[13] Un segundo mecanismo de regulación es a través de la regulación de proteínas que son necesarias para que los aislantes CTCF funcionen plenamente. Estas proteínas incluyen, pero no se limitan a, cohesina, ARN polimerasa y CP190. [2] [14]

El elemento aislante que se encuentra en el gitano retrotransposón de Drosophila es una de varias secuencias que se han estudiado en detalle. los gitano El aislante se puede encontrar en la región 5 'no traducida (UTR) del elemento retrotransposón. gitano afecta la expresión de genes adyacentes a la espera de la inserción en una nueva ubicación genómica, lo que provoca fenotipos mutantes que son específicos de tejido y están presentes en determinadas etapas del desarrollo. Es probable que el aislante tenga un efecto inhibidor sobre los potenciadores que controlan la expresión espacial y temporal del gen afectado. [15]

Los primeros ejemplos de aislantes en vertebrados se observaron en el locus de β-globina de pollo, cHS4. cHS4 marca el límite entre la eucromatina activa en el locus de la β-globina y la región de heterocromatina aguas arriba que está altamente condensada e inactiva. los cHS4 El aislante actúa como una barrera para el silenciamiento mediado por cromatina a través de la propagación de heterocromatina y bloquea las interacciones entre potenciadores y promotores. Una característica distintiva de cHS4 es que tiene una región heterocromática repetitiva en su extremo 5 '. [5]

El homólogo del locus de β-globina humana de cHS4 es HS5. A diferencia del locus de β-globina de pollo, el locus de β-globina humana tiene una estructura de cromatina abierta y no está flanqueado por una región heterocromática 5 '. Se cree que HS5 es un aislante genético en vivo ya que tiene tanto actividad de bloqueo del potenciador como actividades de barrera transgénica. [5]

El CTCF se caracterizó por primera vez por su papel en la regulación de la expresión del gen de la β-globina. En este locus, CTCF funciona como una proteína de unión a aislante que forma un límite cromosómico. [13] CTCF está presente tanto en el locus de β-globina de pollo como en el locus de β-globina humana. Dentro de cHS4 del locus de β-globina de pollo, CTCF se une a una región (FII) que es responsable de la actividad de bloqueo del potenciador. [5]

Pie de imprenta Editar

La capacidad de los potenciadores para activar genes impresos depende de la presencia de un aislante en el alelo no metilado entre los dos genes. Un ejemplo de esto es el Igf2-H19 locus impreso. En este locus, la proteína CTCF regula la expresión impresa uniéndose a la región de control impresa materna no metilada (ICR) pero no a la ICR paterna. Cuando se une a la secuencia materna no metilada, CTCF bloquea eficazmente los elementos potenciadores aguas abajo para que no interactúen con el Igf2 promotor del gen, dejando solo el H19 gen que se va a expresar. [13]

Transcripción Editar

Cuando las secuencias aislantes están ubicadas muy cerca del promotor de un gen, se ha sugerido que podrían servir para estabilizar las interacciones potenciador-promotor. Cuando se encuentran más lejos del promotor, los elementos aislantes competirían con el potenciador e interferirían con la activación de la transcripción. [3] La formación de bucles es común en eucariotas para acercar los elementos distales (potenciadores, promotores, regiones de control de locus) para la interacción durante la transcripción. [4] El mecanismo de los aisladores que bloquean el potenciador, entonces, si está en la posición correcta, podría desempeñar un papel en la regulación de la activación de la transcripción. [3]

Los aislantes CTCF afectan la expresión de genes implicados en los procesos de regulación del ciclo celular que son importantes para el crecimiento celular, la diferenciación celular y la muerte celular programada (apoptosis). Dos de estos genes de regulación del ciclo celular que se sabe que interactúan con CTCF son hTERT y C-MYC. En estos casos, una mutación de pérdida de función en el gen aislante CTCF cambia los patrones de expresión y puede afectar la interacción entre el crecimiento celular, la diferenciación y la apoptosis y conducir a la tumorigénesis u otros problemas. [2]

El CTCF también es necesario para la expresión del gen del retinoblastoma (Rb) represor de tumores y las mutaciones y deleciones de este gen se asocian con neoplasias malignas heredadas. Cuando se elimina el sitio de unión de CTCF, la expresión de Rb disminuye y los tumores pueden prosperar. [2]

Otros genes que codifican reguladores del ciclo celular incluyen BRCA1 y p53, que son supresores del crecimiento que están silenciados en muchos tipos de cáncer y cuya expresión está controlada por CTCF. La pérdida de función de CTCF en estos genes conduce al silenciamiento del supresor del crecimiento y contribuye a la formación de cáncer. [2]


Arqueas oxidantes de amoníaco: fisiología, ecología y evolución

Christa Schleper, Graeme W. Nicol, en Avances en fisiología microbiana, 2010

6 Genomas y metagenomas de arqueas oxidantes de amoniaco

Inspirado por los rápidos avances en las técnicas genómicas aplicadas a los microorganismos cultivados, Stein et al. (1996) utilizaron un vector fosmídico derivado de BAC para preparar una biblioteca de insertos grandes a partir de agua marina del Pacífico nororiental con el fin de caracterizar las arqueas planctónicas marinas. Se identificó un fragmento genómico de 38,5 kb de una Crenarchaeota mesófila no cultivada dentro de 3552 clones utilizando sondas del gen de ARNr 16S específicas de arqueas. Este estudio fue el comienzo de un campo novedoso y ahora en expansión de la genómica ambiental microbiana o "metagenómica". Los grandes fragmentos del genoma se clonan en cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o, más comúnmente, vectores fosmídicos derivados de BAC (un híbrido de un cósmido y BAC) que se archivan en Escherichia coli bibliotecas de clones (Handelsman, 2004 Treusch y Schleper, 2005). Alternativamente, la secuenciación a gran escala utilizando un enfoque de escopeta de genoma completo permite la generación de pequeñas lecturas de secuencia a partir de muestras ambientales que se pueden ensamblar en fragmentos más grandes. en silico (Venter et al., 2004). Estas técnicas se utilizan ahora cada vez más para la caracterización de comunidades microbianas, en particular porque las nuevas tecnologías de secuenciación profunda permiten análisis cada vez más baratos y de alto rendimiento. El primer genoma completo de un AOA potencial (C. simbiosum) también se reunió a partir de una biblioteca metagenómica, y ahora, con los organismos cultivados o enriquecidos disponibles, se obtienen fácilmente genomas de referencia completos de los primeros organismos modelo. Si bien las secuencias del genoma completo serán invaluables para la reconstrucción de vías metabólicas completas, los conjuntos de datos metagenómicos de AOA son de gran importancia para estudiar la distribución y el potencial genómico de los organismos en los diversos entornos.

6.1 Estudios metagenómicos de oxidantes de amoniaco no cultivados

Se han producido varias bibliotecas metagenómicas de microorganismos asociados con una esponja marina, plancton marino o suelo para caracterizar el contenido genómico de las arqueas del Grupo I (Schleper et al., 1998 Béjà et al., 2000, 2002 Quaiser et al., 2002 López-García et al., 2004 Treusch et al., 2004). El suelo fosmid 54d9 se detectó en una biblioteca de este tipo y condujo al descubrimiento de amogenes relacionados en arqueas (Treusch et al., 2005). Los análisis comparativos de clones metagenómicos del plancton marino indicaron la conservación del orden genético alrededor del gen ARNr 16S, confirmando así la estrecha relación de las arqueas planctónicas, incluso en cepas de diferentes provincias oceánicas (Béjà et al., 2002 López-García et al., 2004). Por el contrario, se diseccionó una variación genómica considerable, incluida la microheterogeneidad, en las regiones que codifican proteínas y los espaciadores intergénicos, cuando se compararon fragmentos del genoma con genes de ARNr 16S idénticos o casi idénticos de la misma biblioteca de ADN (Schleper et al., 1998 Béjà et al., 2002). Dada la abundancia y ubicuidad de las arqueas planctónicas marinas, es plausible que se detecten un gran número de genes de arqueas en estudios globales de secuenciación aleatoria de ADN obtenido de aguas filtradas (Venter et al., 2004 Nealson y Venter, 2007). Las enormes bases de datos de las bibliotecas BAC y fosmid (Treusch et al., 2004 Martín-Cuadrado et al., 2008 Konstantinidis et al., 2009), así como los esfuerzos de secuenciación de escopeta a gran escala son un recurso valioso para diseccionar la diversidad y distribución de AOA, particularmente desde que los primeros genomas de aislamientos cultivados están ahora disponibles que nos permiten probar hipótesis sobre funciones genéticas y metabolismos experimentalmente.

6.2 Predicciones a partir de secuencias genómicas completas de dos arqueas marinas

A pesar de que C. simbiosum no ha sido cultivado o separado físicamente por completo de los tejidos de su huésped (la esponja marina A. mexicana) y de las bacterias coexistentes, las fracciones de células que se enriquecieron con la arqueona se utilizaron para la construcción de bibliotecas genómicas de inserto grande (Schleper et al., 1997, 1998), facilitando el aislamiento de fragmentos del genoma y dando lugar a un proyecto de secuenciación del genoma que se completó en 2006 (Hallam et al., 2006a, b). El segundo genoma de N. maritimus, el primer aislado cultivado de AOA marino, se ha completado recientemente (Walker et al., 2010 ).

los C. simbiosum El genoma tiene un contenido de G + C considerablemente más alto (& gt55%) (Schleper et al., 1998 Hallam et al., 2006a) que sus parientes en el plancton marino (aproximadamente el 34%), lo que podría reflejar la adaptación al estilo de vida del huésped metazoario, más que una gran distancia evolutiva. Sin embargo, a pesar de esta diferencia, los dos organismos muestran una gran superposición en el contenido de genes entre sí (aproximadamente 1200 genes) y con metagenomas marinos, lo que indica que pueden servir como modelos adecuados para estudiar las abundantes arqueas planctónicas marinas distribuidas globalmente (Walker et al., 2010). Con unas pocas excepciones menores, ambos genomas comparten un contenido genético similar con respecto al metabolismo energético potencial y las vías de fijación de carbono, las cuales parecen ser claramente diferentes de los oxidantes de amoniaco bacterianos conocidos. AOA contiene amoGenes A, B y C para las tres subunidades de un AMO archaeal potencial, pero no genes homólogos del complejo bacteriano hidroxilamina oxidorreductasa (HAO) que cataliza el segundo paso de este proceso en bacterias, que es la oxidación de hidroxilamina a nitrito (Hallam et al., 2006b Walker et al., 2010). En AOB, este complejo devuelve electrones al AMO y a una cadena de transporte de electrones con citocromo. C proteínasC554 y C552) requerido para el flujo de electrones a ubiquinona (Fig. 6). Estos citocromos tampoco están presentes en AOA, pero poseen numerosas proteínas que contienen cobre, como oxidasas multicopper, pequeñas proteínas azules que contienen cobre (Hallam et al., 2006a Bartossek et al., 2010 Walker et al., 2010), así como potenciales oxidorreductasas de tiol-disulfuro, que pueden reemplazar funcionalmente a los citocromos (Walker et al., 2010). En principio, parece que el metabolismo energético de AOA se basa en sistemas de transferencia de electrones que contienen cobre en lugar de hierro (Hallam et al., 2006a Walker et al., 2010 ).

Tiempo C. simbiosum (como los metagenomas marinos) contiene genes de ureasa, lo que indica un potencial espectro de sustrato más amplio, N. maritimus no. Ambos organismos tampoco parecen contener un homólogo de óxido nítrico reductasa, que es parte de la vía de desnitrificación de AOB, reduciendo el óxido nítrico (NO) a óxido nitroso (N2O). N. maritimus (Caminante et al., 2010), así como arqueas del suelo (Treusch et al., 2004a Bartossek et al., 2010), contiene, sin embargo, homólogos de la nitrito reductasa, la primera enzima involucrada en la desntrificación, que (en las bacterias) reduce el nitrito, el producto de la oxidación del amoníaco, a óxido nítrico. En total, la composición genética de los oxidantes de amoníaco arqueales indica que la bioquímica subyacente a la oxidación del amoníaco a nitrito podría ser fundamentalmente diferente de la de AOB. Incluso la enzima metabólica clave, AMO, muestra solo una pequeña similitud de secuencia con la AMO bacteriana y los pMMO. Es posible que AOA use la misma vía que AOB, es decir, oxidar el amoníaco a través de la hidroxilamina a nitrito, pero con diferentes enzimas. Alternativamente, puede estar operando una vía fundamentalmente diferente. Martin Klotz (Universidad de Louisville, Kentucky, EE. UU.) Ha propuesto una vía alternativa para AOA que no involucra hidroxilamina como intermedio, sino nitroxilo (HNO) (ver Walker et al., 2010) (Figura 7). Entonces, una nitroxil oxidorreductasa podría operar para oxidar el nitroxilo a nitrito (Walker et al., 2010). En su modelo extendido, Klotz propone que la activación de AMO podría lograrse reciclando NO, el producto de la reducción de nitrito a través de la nitrito reductasa (ver Fig. 7). La activación de O2 por NO daría lugar a la producción de N2. Si esta o una vía similar para la oxidación del amoníaco está operando, lo más probable es que indique que los AOA no producen el gas de efecto invernadero N2O, al igual que sus contrapartes bacterianas. Es interesante notar en este contexto que Bartossek et al. (2010) encontraron recientemente variantes de genes que codifican las reductasas de nitrito dependientes de cobre en suelos y otros ambientes, lo que indica que esta enzima podría estar ampliamente distribuida en AOA. Además, la transcripción del homólogo de nitrito reductasa en arqueas del suelo se observó incluso en condiciones aeróbicas (y potencialmente oxidantes del amoníaco), en lugar de en condiciones de bajo oxígeno que favorecen la desnitrificación (Bartossek et al., 2010). Por lo tanto, la nitrito reductasa de arqueas dependiente de cobre podría de hecho cumplir una función diferente en el metabolismo de la AOA de la que se supone para la contraparte bacteriana.

Figura 7. Vías propuestas del flujo de nitrógeno, oxígeno y electrones en las ramas oxidantes y reductoras de quinonas de las cadenas de transporte de electrones (ETC) en bacterias oxidantes de amoníaco (AOB) y arqueas (AOA). (a) Inventario básico codificado en todos los AOB. Módulo redox de amoniaco monooxigenasa (AMO) N-óxido-ubiquinona (NURM) que consta de hidroxilamina oxidorreductasa (HAO), citocromo C554 y quinona reductasa CMETRO552 citocromo C552 citocromos B y C1 (complejo III), con varias oxidasas hemo-cobre reductoras de oxígeno que bombean protones (complejo IV) y varias oxidasas hemo-cobre reductoras de NO (HCO-NOR) en la rama asociada a la membrana, y nitrito reductasa que contiene cobre (NirK ) y citocromo C NO-reductasas en la rama soluble del ETC, más F bacteriano0F1-tipo ATP sintetasa. El signo de interrogación indica que aún no se ha demostrado una función quinol oxidasa directa de la AMO / pMMO bacteriana. (b) Inventario básico predicho a partir de secuencias del genoma en AOA. AMO NURM que consiste en nitroxil oxidorreductasa (NxOR) y dominio de plastocianina que contiene quinona reductasa putativa asociada a la membrana (Pcy) plastocianinas (pcy) citocromo B y plastocianina asociada (complejo III) con varias oxidasas de cobre-plastocianina reductoras de oxígeno de bombeo de protones (complejo IV) más F0F1-tipo ATP sintetasa en la rama asociada a la membrana. La nitrito reductasa que contiene cobre (NirK), activa en la rama soluble del ETC, se ha identificado en todos los genomas de la AOA con la excepción de Cenarchaeum symbiosum (Bartossek et al., 2010). Sin inventario que codifique el citocromo C y se han identificado NO-reductasas de hemo-cobre. Los asteriscos indican la necesidad de activación de oxígeno en la reacción de monooxigenasa facilitada por AMO. Debido a que una función de quinol oxidasa de la AMO archaeal no es parte del modelo, se predice que la activación de oxígeno en AOA se logra utilizando el radical NO producido en la rama soluble del ETC. Esto produciría media molécula de gas dinitrógeno por amoníaco oxidado e introduciría AOA como desnitrificantes aeróbicos no clásicos. Esta química debe ser probada experimentalmente como lo indica "??" (Figura y leyenda amablemente proporcionadas por el Prof. Martin G. Klotz, Universidad de Louisville, EE. UU.).

A partir de las secuencias del genoma de los dos organismos marinos, también se puede deducir una posible vía de fijación de carbono. Mientras que los AOB autótrofos fijan carbono con la ribulosa bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (RubisCO) en el ciclo de Calvin-Bassham-Benson, N. maritimus y C. simbiosum parecen contener una vía diferente, similar a la descrita recientemente para la arqueona hipertermofílica Metallosphaera sedula (Berg et al., 2007). La vía implica la transformación de acetil-CoA con dos moléculas de bicarbonato a través de 3-hidroxipropionato en succinil-CoA. Este intermedio se reduce a 4-hidroxibutirato y posteriormente se convierte en dos moléculas de acetil-CoA. Las enzimas clave para esta vía se encuentran en ambos organismos AOA, como la acetil-CoA / propionil-CoA carboxilasa biotinilada, metilmalonil-CoA epimerasa y mutasa y 4-hidroxibutirato deshidratasa, pero algunas proteínas de la M. sedula También faltan vías, lo que indica que la AOA usa una variante de esta vía o puede poseer reemplazos de genes no ortólogos (Hallam et al., 2006b Walker et al., 2010). Mientras que el crecimiento autotrófico de N. maritimus y se ha informado de su inhibición por compuestos orgánicos, ambos AOA contienen componentes de un ciclo de TCA oxidativo que potencialmente pueden ser utilizados para el consumo de carbono orgánico o para la producción de intermedios para la biosíntesis de aminoácidos y cofactores. Aún no se ha demostrado el crecimiento mixotrófico para ninguno de los AOA cultivados o enriquecidos, pero es muy posible que este modo de crecimiento se encuentre a medida que se obtengan más organismos en cultivos de laboratorio.

6.3 Oxidantes de amoniaco: un filo distinto dentro de las arqueas

Basado en la filogenia de la secuencia de ARNr 16S, AOA se colocó originalmente como un grupo hermano de Crenarchaeota (DeLong, 1992 Fuhrman et al., 1992), lo que sugiere que estas arqueas podrían tener antepasados ​​en fuentes termales y solo más tarde se irradiaron a ambientes moderados. Desde entonces, se ha hecho referencia a la AOA como Crenarchaeota en todos los siguientes estudios de diversidad basados ​​en ARNr 16S. Usando un conjunto de datos concatenados de 53 proteínas ribosomales de C. simbiosum que son compartidos por arqueas y eucariotas, Brochier-Armanet et al. (2008) calcularon que las "Crenarchaeota moderadas" constituyen un filo separado de las arqueas que se ramifica antes de la separación de Crenarchaeota y Euryarchaeota.. Incluyendo la información genómica de N. maritimus y N. gargensis (borrador del genoma) en este análisis confirmó la separación de AOA (Spang et al., 2010). Se propuso el nombre Thaumarchaeota (de la palabra griega 'thaumas' que significa maravilla) para el nuevo filo (Brochier-Armanet et al., 2008 ).

Varios genes de procesamiento de información, cuya presencia o ausencia es característica de Euryarchaeota y / o Crenarchaeota, muestran un patrón en los tres genomas de Thaumarchaeota investigados que es distintivo de cualquiera de los dos filos descritos y esto apunta a diferencias fundamentales en los procesos celulares. Por lo tanto, esta comparación del contenido de genes apoya firmemente la propuesta de Thaumarchaeota (Tabla 2 y Brochier-Armanet et al., 2008 Spang et al., 2010). Más notablemente, Thaumarchaeota posee genes de ARN polimerasa A y B no divididos, tanto topoisomerasas IA como B, e histonas, pero carecen de la proteína r específica de arqueas LXa. Thaumarchaeota, como todas las demás arqueas, contiene genes para la maquinaria central de procesamiento de información (replicación, transcripción, etc.) que se comparten con eucariotas o están más estrechamente relacionados con eucariotas que con bacterias (Bell y Jackson, 1998 Garrett y Klenk, 2007). En varios análisis filogenéticos con factores de procesamiento de la información, como las subunidades de la ARN polimerasa (ver Fig.8), Thaumarchaeota se ramifica temprano, lo que indica que una caracterización más detallada de este grupo previamente enigmático podría cambiar nuestra percepción de la evolución temprana dentro de las arqueales y eucariotas. linaje (Spang et al., 2010 ).

Tabla 2 . Distribución de genes centrales de procesamiento de información en los cuatro filos diferentes de arqueas

ThaumarchaeotaEuryarchaeotaCrenarchaeotaKorarchaeota
Proteínas ribosomales
proteína r S25e+++
proteína r S26e+++
proteína r S30e+++
proteína r L13e++
proteína r L14e+ (algunos)++
proteína r L34e+ (algunos)++
proteínas r L38e±
proteína r L29p+++
proteína r Lxa+ (la mayoría)+
Transcripción / ARN polimerasa
rpoG (= rpo8)++
rpoA - ORF único+separarseparar+
rpoB - ORF único+± separar++
Rpc34+±+
MBF 1±+++
EIF 1++
ADN polimerasas / replicación
ADN pol D+++
RPA (similar a Eury)+++
RPA / SSB++ (algunos)+/(−)+
& ampgtone PCNA gen+
Topoisomerasas
Topo IB+
Topo IA±+++
Girasa inversa+ (HT)++
Topo IIA±
División celular
ESCRT-III++
Vps4 (CdvC)++
CdvA++
Pies Z+++
Smc+++
ScpA + ScpB++ (muchos)+
Histonas (H3 / H4)
++ (exc. ​​2)+
Reparar
Hef-nucleasa+
Nucleasa de tipo ERCC4+++
Helicasa de tipo ERRC4+
RadB+
HSP70s GrpE, Hsp40++
UvrABC+±

Figura 8 . Árbol filogenético de la subunidad A de la ARN polimerasa (rpoA) y descripción esquemática de los arreglos de genes en diferentes linajes de arqueas y en bacterias y eucariotas. Como los dos ltimos, Thaumarchaeota tiene un no dividido rpoUn gen. De acuerdo con este hallazgo, forman un linaje separado y profundamente ramificado dentro de las arqueas en el análisis filogenético de la proteína RpoA correspondiente.

(Modificado de Spang et al. (2010), con autorización.)


Abstracto

Los primeros pasos en la biosíntesis de 7,8-didemetil-8-hidroxi-5-deazariboflavina (Fo) y riboflavina en las arqueas difieren de las rutas eucariotas y bacterianas establecidas. Se ha propuesto que la vía de las arqueas comience con una GTP ciclohidrolasa III específica de las arqueas que hidroliza el anillo de imidazol de GTP pero no elimina el grupo formilo resultante de la formamida [Graham, DE, Xu, H. y White, RH (2002 ) Bioquímica 41, 15074-15084]. Esta enzima es diferente a la GTP ciclohidrolasa II bacteriana que cataliza ambas reacciones. Aquí describimos la identificación y caracterización de la formamida hidrolasa que cataliza el segundo paso en la vía biosintética archaeal Fo y riboflavina. los Methanocaldococcus jannaschii Se clonó el gen MJ0116 y se expresó heterólogamente, y se demostró que la enzima resultante catalizaba la formación de 2,5-diamino-6-ribosilamino-4 (3H) -pirimidinona 5′-fosfato (APy) y formato de 2-amino-5-formilamino-6-ribosilamino-4 (3H) -pirimidinona 5′-monofosfato (FAPy). La proteína derivada de MJ0116 se ha denominado ArfB para indicar que cataliza el segundo paso en archaeal riboflavina y Fo biosíntesis. Se encontró que ArfB requería hierro ferroso para su actividad, aunque el análisis de metales por ICP indicó la presencia de zinc así como de hierro en la proteína purificada. La identificación de esta enzima confirma la participación de GTP ciclohidrolasa III (ArfA) en la biosíntesis de riboflavina de arqueo y Fo.


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