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¿Puedo usar un tampón de PCR en lugar de un tampón de síntesis de ADNc?

¿Puedo usar un tampón de PCR en lugar de un tampón de síntesis de ADNc?


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Estoy usando el kit de síntesis de cDNA Fermentase First strand pero su tampón ha terminado. Necesito trabajar hoy pero no tengo acceso a ningún hechicero actualmente. Tengo tampón de PCR en el laboratorio. ¿Puedo usar un tampón de PCR en lugar de un tampón de síntesis de ADNc? ¿Cuáles son tus otras sugerencias? Gracias


Esta página tiene la receta para el búfer RT 10X M-MuLV:

  • Tris-HCl 500 mM
  • 750 mM de KCl
  • 30 mM de MgCl2
  • TDT de 100 mM
  • pH 8,3

Si tiene los reactivos básicos, sugiero hacer eso.


Aislamiento de vesículas extracelulares preguntas frecuentes

El kit de aislamiento de vesículas extracelulares Capturem proporciona una solución completa para el aislamiento simple y rápido de vesículas extracelulares (EV, por ejemplo, exosomas) de varios fluidos biológicos, como plasma, suero, orina, leche, saliva, medios acondicionados con células y líquido cefalorraquídeo. . Ofrecemos dos tamaños de kit y mdashmini y formatos maxi y mdash para que pueda purificar los vehículos eléctricos a partir de una variedad de volúmenes de muestra.

Para cualquier pregunta que no haya sido respondida a continuación, consulte los manuales de usuario y otros documentos accesibles a través de la tabla de productos en esta página. Comuníquese con nosotros si no puede encontrar la respuesta a su pregunta.

¿Qué compuesto aglutinante se utiliza en las columnas Capturem EV?

Las columnas de giro Capturem EV contienen membranas que están funcionalizadas con un sustrato a base de lectina que se une a las vesículas extracelulares.

¿En qué se diferencia el método Capturem EV del aislamiento EV mediante ultracentrifugación?

  • La ultracentrifugación separa las partículas según su densidad. Por lo tanto, aísla una población mixta de vesículas de diferentes tamaños, junto con contaminantes no EV, como proteínas como la albúmina. Debido a la alta velocidad, este proceso es bastante duro y a menudo daña los vehículos eléctricos.
  • El kit de aislamiento de vesículas extracelulares Capturem aísla específicamente los vehículos eléctricos que tienen menos de 200 nm de diámetro. El proceso es suave y los vehículos eléctricos permanecen intactos para aplicaciones posteriores, como la microscopía electrónica.

¿Por qué la concentración de proteína total es menor con el kit de aislamiento de vesículas extracelulares Capturem que con la ultracentrifugación?

Las columnas Capturem EV proporcionan una muestra EV de alta pureza que no contiene proteínas contaminantes. La ultracentrifugación produce una muestra que incluye impurezas, como albúmina. Por lo tanto, la ultracentrifugación dará una mayor concentración de proteína total debido a estas impurezas.

¿Puedo usar la muestra purificada directamente para mis aplicaciones posteriores?

Nuestro kit eluye los vehículos eléctricos utilizando un tampón a base de fosfato que contiene sales orgánicas. Las partículas eluidas se pueden utilizar directamente para el análisis de partículas físicas, como el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y el etiquetado para ensayos de absorción celular. Si su aplicación posterior implica la extracción de proteínas y / o ARN, primero será necesario someter a ultrasonidos o desalar las muestras eluidas.

¿Puedo usar un tampón de elución diferente?

Sí, puede utilizar una elución competitiva con un tampón de manosa o glucosa. Sin embargo, esto reducirá el rendimiento de su vehículo eléctrico y deberá determinar si estos búferes son compatibles con sus aplicaciones posteriores.

Rendimiento de vesículas extracelulares con diferentes tampones de elución. Se aislaron vesículas extracelulares de la misma cantidad de plasma (200 µl) usando columnas de aislamiento de vesículas extracelulares Capturem (mini). El contenido se eluyó con 100 µl de 1) metil y alfa-D-manopiranósido 200 mM en NaCl 150 mM, 2) glucosa 1 M en NaCl 150 mM, o 3) tampón de elución Capturem EV. Panel A. Se utilizó NTA para evaluar la concentración y distribución de tamaño de los EV obtenidos con las diferentes condiciones de elución. Panel B. El rendimiento general (número total de vehículos eléctricos) de 200 y microlitros de plasma es más alto si se utiliza el tampón de elución proporcionado con el kit.

¿Puedo someter a ultrasonidos los vehículos eléctricos purificados para el análisis de inmunotransferencia (western blot)?

Si. Sonicamos nuestras muestras a 20 ° C durante 5 min en un sonicador de agua (Limpiador ultrasónico, JSP). Si está utilizando un sonicador diferente, es posible que necesite optimización.

¿Cómo puedo desalar las muestras de VE purificadas?

Recomendamos los siguientes pasos:

  1. Cargue toda la muestra obtenida con el mini kit (o 500 microlitros de la muestra obtenida con el maxi kit) en una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5 (MWCO de 3 kDa o 10 kDa, suministrada por el usuario). Si el volumen de la muestra es inferior a 500 microlitros, agregue agua a la unidad de filtro para llevar el volumen hasta 500 microlitros. Centrifugar a 14.000gramo durante 5 & ndash30 min y deseche el flujo continuo.
  2. Agregue agua a la unidad de filtro para llevar el volumen hasta 500 microlitros y centrifugue a 14,000gramo durante 5 & ndash30 min.
  3. Transfiera el retenido (muestra en el filtro) a un nuevo tubo de recolección de 2 ml (suministrado por el usuario).
  4. Para la muestra obtenida con el kit maxi, repita los pasos 1 y ndash3 con los 500 microlitros restantes de la muestra.

¿Cuánta proteína y ARN puedo esperar purificar de las muestras de EV?

Este número puede variar según el tipo de muestra de entrada, el volumen y las condiciones. En nuestra experiencia, para los vehículos eléctricos recuperados de 1 ml de plasma, se obtienen aproximadamente 1 ng de ARN y 5 microgramos de proteína de la carga de vehículos eléctricos.

¿Cómo se compara el rendimiento de EV de la columna maxi con el rendimiento de la mini columna?

A partir de 1 ml de plasma, la columna Capturem EV maxi ofrece un rendimiento de EV que es 10 veces mayor que la mini columna. En su capacidad máxima, la columna Capturem EV maxi da un rendimiento de EV (número total de EV) de

¿Cuál es el propósito de la columna de compensación previa?

La columna de limpieza previa elimina cualquier fragmento grande de membrana, cuerpos apoptóticos, fragmentos de células más pequeños, etc., que de otra manera obstruirían la columna Capturem y evitarían el aislamiento de EV.

¿Cuál es el propósito de la unidad de filtro Amicon y por qué es necesaria?

La unidad de filtro elimina agregados de proteínas no específicos, lipoproteínas, citocinas, etc., lo que da como resultado EV de mayor pureza según se mide mediante análisis de seguimiento de nanopartículas fluorescentes.

Al usar el mini kit, ¿qué filtro Amicon para recolectar el sobrenadante de la muestra debo comprar por separado?

Compre unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5 (Thermo Fisher Scientific, n.o de catálogo UFC510024), que tienen un MWCO de 100 kDa. Asegúrese de utilizar los filtros como se describe en nuestro protocolo.

¿Puedo tratar los vehículos eléctricos aislados de Capturem con proteinasa K para eliminar la mayor parte de las proteínas de las muestras en lugar de utilizar un filtro Amicon?

Puede usar la proteinasa K, pero puede resultar en una degradación parcial de las proteínas expuestas en la superficie de los vehículos eléctricos y, por lo tanto, afectar su capacidad para detectar estas proteínas en su análisis posterior.

Para las columnas maxi, ¿puedo usar un rotor de cubo oscilante o de ángulo fijo?

Sí, puede utilizar un rotor de cubeta oscilante o un rotor de ángulo fijo.


Transcripción inversa (síntesis de ADNc)

La síntesis de ADN a partir de una plantilla de ARN, mediante transcripción inversa, produce ADN complementario (ADNc). Las transcriptasas inversas (RT) utilizan una plantilla de ARN y un cebador corto complementario al extremo 3 'del ARN para dirigir la síntesis de la primera hebra de ADNc, que se puede usar directamente como plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta combinación de transcripción inversa y PCR (RT-PCR) permite la detección de ARN de baja abundancia en una muestra y la producción del ADNc correspondiente, facilitando así la clonación de genes de baja copia. Alternativamente, el ADNc de la primera hebra puede hacerse de doble hebra usando ADN polimerasa I y ADN ligasa. Estos productos de reacción se pueden utilizar para la clonación directa sin amplificación. En este caso, se requiere la actividad de la ARNasa H, ya sea de la RT o suministrada de forma exógena.

Muchos RT están disponibles en proveedores comerciales. La transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV, MMLV) son RT que se utilizan comúnmente en los flujos de trabajo de biología molecular. La transcriptasa inversa M-MuLV carece de actividad exonucleasa 3 & aguda & rarr 5 & aguda. La transcriptasa inversa ProtoScript & reg II es una transcriptasa inversa M-MuLV recombinante con actividad de RNasa H reducida y termoestabilidad aumentada. Puede usarse para sintetizar el ADNc de la primera hebra a temperaturas más altas que el M-MuLV de tipo salvaje. La enzima es activa hasta 50 ° C, proporcionando mayor especificidad, mayor rendimiento de cDNA y más producto de cDNA de longitud completa, hasta 12 kb de longitud.

El uso de RT modificados mejora la eficiencia de la formación de productos de longitud completa, asegurando que la copia del extremo 5 'de la transcripción de ARNm sea completa y permitiendo la propagación y caracterización de una copia fiel de ADN de una secuencia de ARN. El uso de RT más termoestables, donde las reacciones se realizan a temperaturas más altas, puede ser muy útil cuando se trata de ARN que contiene grandes cantidades de estructura secundaria.

Para obtener ayuda sobre la comparación de los reactivos de síntesis de ADNc y RT disponibles, consulte nuestra tabla de selección de síntesis de ADNc / RT.

Elija el tipo:

Este producto está protegido por una o más patentes, marcas comerciales y / o derechos de autor propiedad o controlados por New England Biolabs, Inc (NEB).

Si bien NEB desarrolla y valida sus productos para diversas aplicaciones, el uso de este producto puede requerir que el comprador obtenga derechos de propiedad intelectual adicionales de terceros para ciertas aplicaciones.

Para obtener más información sobre los derechos comerciales, comuníquese con el equipo de Desarrollo comercial global de NEB en [email protected]

Este producto está destinado únicamente a fines de investigación. Este producto no está destinado a ser utilizado con fines terapéuticos o de diagnóstico en humanos o animales.


Aplicación de ADNc:

El ARNc contiene una secuencia de ADN solo para codificar el ADN. Utilizando la PCR de cuantificación de transcriptasa inversa, se puede estimar la cantidad de la transcripción particular o ARNm o el gen de nuestro interés.

También se utiliza para experimentos de clonación y transformación de genes.

La biblioteca de ADNc también se usa para estudiar la expresión de ADN eucariota insertándolo en una célula procariota.

Expresión heteróloga:

La síntesis de cDNA es aplicable en el proceso de expresión heteróloga en el que una proteína se expresa en un tipo de célula que no es capaz de sintetizar esa proteína de forma natural.

Uno de los usos importantes de la construcción de ADNc es clonar genes con un número de copias bajo.


Resultados y discusión del amplificador

Se generó un ADNc de 1,1 Kb homeobox D13 de longitud completa mediante cebadores DF1 (cebador directo 1 HoxD13) y DR2 (cebador inverso HoxD13 2) utilizando secuencias de clones genómicos como se muestra en la figura 1. Digestión con endonucleasas de restricción de este producto de PCR con Ppum 1 mostró fragmentos de tamaño esperado correcto de 519, 316 y 265 bps respectivamente. El clon D13 de longitud completa en el vector PCR® II (Invitrogen) se digirió con tres endonucleasas de restricción que dieron como resultado un patrón de tamaño de fragmento esperado correcto como se muestra en la figura 2. Además, secuenciamos este clon D13 usando cebadores T7 para determinar el marco de lectura abierto correcto para este gen. No se observaron mutaciones en el ADNc de D13 como consecuencia de la manipulación por PCR.

Análisis completo del producto de PCR de ADNc de HOXD13. 1) ADNc de homeobox D13 de longitud completa de 1,1 kb generado utilizando cebadores específicos de DF1 y DR2. 2 y 3) escalera de 100 pb (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD) 4). Digestión con endonucleasas de restricción del producto de PCR con Ppum 1 que muestra fragmentos de tamaño esperado correcto de 519, 316 y 265 bps. respectivamente 5). Escalera de 1 kb (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD) 6-8). son fragmentos de digestión de restricción de HOXD13 de longitud completa clonados en PCR II (vector) con Eco R1 (1,1 kb), Kpn 1 (381 pb) y Sma 1 y Bam H1 (826 pb) respectivamente.


Los cebadores aleatorios son oligonucleótidos cortos que tienen una secuencia aleatoria. Dado que suelen tener 6 nucleótidos de longitud, a menudo se les conoce como hexámeros aleatorios. La secuencia aleatoria permite la unión imparcial de los cebadores a cualquier lugar de la mayoría de los tipos de ARN, incluidos los ARNr y los ARN pequeños. Dado que se unen por completo, la mayoría de los productos génicos deben cubrirse, aumentando así la posibilidad de amplificación durante la PCR.

Los cebadores de oligo (dT) se componen de tramos de desoxitimidina. Están disponibles en varias longitudes, siendo las más comunes las de 12-18 nucleótidos. Los cebadores oligo (dT) están diseñados para que se unan a las colas complementarias poli (A) del ARN mensajero (ARNm). Por lo tanto, los oligo (dT) s solo son útiles en reacciones de ADNc cuando los ARNm son el objetivo de la aplicación posterior. No se aparearán con fragmentos de ARNm que no sean poliA, como ARNr 18S. Además, tenga en cuenta que si sus cebadores de PCR están diseñados cerca del extremo 5 'de un gen, el uso de cebadores oligo (dT) para la síntesis de ADNc no es la mejor idea. Dado que estos cebadores se aparean con el extremo 3 'del ARNm, es posible que el extremo 5' no esté presente en el producto extendido, especialmente si está investigando un gen grande.


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¿Puedo usar un tampón de PCR en lugar de un tampón de síntesis de ADNc? - biología

En los métodos de aislamiento de ARN comúnmente utilizados, la ausencia de ADN genómico sigue siendo un desafío. Particularmente para la RT-PCR cuantitativa aguas abajo (qRT-PCR, el ADN genómico coamplificado puede conducir a resultados inespecíficos.

1.) Detección de ADN genómico en muestras de ARN

Se han utilizado diferentes técnicas para controlar la contaminación del ARN por ADN genómico. Se pueden detectar grandes cantidades de ADN contaminante usando la medición de DO (que produce una relación de 260/280 nm muy por debajo del valor óptimo de 2), o mediante electroforesis en gel de agarosa, donde se obtienen bandas de ácido nucleico de muy alto peso molecular.

No obstante, en aplicaciones sensibles posteriores como qRT-PCR, las trazas de ADN genómico, no detectables por los métodos anteriores, también pueden producir resultados inespecíficos. Esto se debe a que tanto el ARNm de transcripción inversa (ADNc) como el ADN genómico contaminante pueden servir como molde para la posterior amplificación por PCR. El resultado de esta coamplificación es uno o más fragmentos de PCR adicionales que se pueden visualizar mediante electroforesis en gel de agarosa en función de su peso molecular distinto (ver Figura 1).
Una estrategia para evitar esta coamplificación es un diseño de cebador de PCR que abarque los límites del exón.
Esta estrategia de diseño de cebadores incluye uno o más motivos de secuencia intrónica en el ADN genómico que desplazan la eficiencia de amplificación de la reacción de PCR hacia la plantilla de ADNc. La especificidad del ensayo de qRT-PCR debe controlarse mediante una reacción de control de transcriptasa inversa menos en la configuración de qRT-PCR. Esta reacción de control se trata y maneja de manera similar a las otras reacciones de qRT-PCR, con la excepción de que en lugar de la enzima transcriptasa inversa, se agrega agua a la mezcla de reacción. Los fragmentos de PCR amplificados en esta reacción de control indican ADN genómico contaminante.

Figura 1: Resumen de la síntesis de ADNc de la primera hebra con diferentes tipos de cebadores de RT.

Se realizó una PCR específica del gen GAPDH (carriles 1, 3 y 5) y RP49 (carriles 2, 4 y 6) que incluía una reacción de control que carecía de la enzima transcriptasa inversa (carriles 5 y 6). Los fragmentos de PCR en los carriles 5 y 6 indicados por flechas, son de mayor peso molecular basado en la secuencia del intrón incluida y, por lo tanto, son indicativos de contaminación de la plantilla de ARN con ADN genómico.

2.) Tratamiento con DNasa I
Para eliminar el ADN genómico de las muestras de ARN, se recomienda un tratamiento con DNasa I. La enzima ADNsa I se clasifica como una endonucleasa que es capaz de digerir el ADN monocatenario y bicatenario en bases simples u oligonucleótidos. La enzima es específica de ADN sin efecto negativo sobre la integridad del ARN restante (Vanecko y Lasbowski, 1961).

El tratamiento con DNasa I se puede realizar al mismo tiempo que el aislamiento de ARN. Este conveniente procedimiento se utiliza en el kit de aislamiento de ARN de alta pureza. La enzima DNasa I se incluye en el kit y se aplica directamente durante el procedimiento de aislamiento de la columna de centrifugación. El ARN se une al vellón de sílice en presencia de sales caotrópicas, y la DNasa I se aplica directamente y se incuba con el ARN purificado en la columna de centrifugación. Posteriormente, el ADN digerido se lava de la columna de centrifugado, lo que conduce a ARN puro eluido de la columna de centrifugado.

Para proteger el ARN aislado, la enzima DNasa I utilizada debe ser de calidad libre de ARNasa. La enzima recombinante DNasa I, libre de ARNasa de Roche no solo está garantizada como libre de ARNasa de acuerdo con el estricto control de calidad actual, sino que además está libre de cualquier componente animal, como ADN contaminante.

En casos de niveles muy altos de ADN genómico endógeno, el tratamiento con ADNasa I durante el proceso de aislamiento aún puede dejar ADN contaminante residual en el ARN aislado. En este caso, el tratamiento con ADNasa se puede realizar después del aislamiento del ARN.

Consejo: Como regla general para la digestión de DNasa I, use una unidad de DNasa I por 1 a 5 μg de ARN total en un volumen total de 50 μl incubado durante 20 minutos a +25 a + 37 ° C.

Después del paso adicional de digestión de la DNasa, es obligatoria una purificación adicional del ARN de la enzima DNasa I. Esta purificación se puede realizar mediante un procedimiento de limpieza utilizando el kit de aislamiento de ARN de alta pureza siguiendo el protocolo del kit (2.2 Aislamiento de ARN total de células cultivadas). Antes del procedimiento de limpieza, el volumen de la muestra debe aumentarse a 200 μl utilizando el tampón de elución incluido en el kit.
Tenga en cuenta que, en este caso, el paso de digestión de DNasa de la columna en rotación debe omitirse del protocolo mencionado en el prospecto.
El principal beneficio de este método es su facilidad de uso, la ausencia de sustancias tóxicas y la alta recuperación de ARN total.

Figura 2: Digestión de ADN genómico mediante tratamiento con DNasa I.

Se realizó una PCR específica del gen GAPDH (carriles 1, 3 y 5) y RP49 (carriles 2, 4 y 6) que incluía una reacción de control que carece de la enzima transcriptasa inversa (carriles 5 y 6). Los fragmentos de PCR en los carriles 5 y 6 indicados por flechas, son de mayor peso molecular basado en la secuencia del intrón incluida y, por lo tanto, son indicativos de contaminación de la plantilla de ARN con ADN genómico.


A) Amplificación de un fragmento de GAPDH por PCR.
B) Reacción de control Minus-RT con y sin tratamiento con DNasa I. Se aisló ARN de 1 x 106 células K562 (linfocitos humanos) usando el kit de aislamiento de ARN de alta pureza con una posterior amplificación de fragmentos de PCR específicos de GAPDH (carriles 1 a 6). No se obtuvieron fragmentos de PCR inesperados, lo que indica la ausencia de ADN genómico en los carriles 1 a 4 (tratamiento + DNasa), mientras que las muestras que carecen del tratamiento con ADNasa mostraron productos de PCR producidos a partir de ADN genómico contaminante (carriles 5 y 6) que sirven como molde en el Amplificación por PCR.
Consejo: incluso después del tratamiento con DNasa, se debe realizar una PCR posterior utilizando un diseño de cebador superpuesto al exón. También debe incluirse una reacción negativa de transcriptasa inversa como reacción de control para controlar la especificidad de amplificación.

3.) Digestión incompleta de DNasa.
Los niveles muy altos de ADN genómico endógeno aún pueden dejar ADN contaminante residual en el ARN aislado. En caso de que un paso adicional de digestión de ADNasa con limpieza posterior no sea una opción, la cantidad de material de partida debe reducirse (es decir, 106 células cultivadas, 500 μl de sangre entera, 108 células de levadura o 109 células bacterianas son máximas para el aislamiento de ARN de alta pureza Equipo).
Otra posible causa de la digestión incompleta del ADN es que la actividad de la enzima DNasa I puede disminuir en condiciones de tampón subóptimas. La enzima DNasa I requiere diferentes cationes divalentes, tanto Mg 2+ como Ca 2+, para un rendimiento óptimo.
Consejo: Para un rendimiento óptimo de la digestión con DNasa I, la concentración de ácido nucleico debe ser de aproximadamente 100 μg / ml.

Ocasionalmente, el tratamiento adicional con DNasa I, y específicamente la inactivación por calor de la enzima DNasa I, puede afectar negativamente los resultados posteriores de RT-PCR. Las altas temperaturas necesarias para la inactivación de la enzima DNasa I también pueden conducir a la degradación del ARN. La inactivación por calor de la enzima DNasa I requiere una incubación a + 75 ° C durante 15 minutos. Dado que las moléculas de ARN son sensibles al calor (Huang et al., 1996), este tiempo de incubación debe ser lo más corto posible.

1. Chomczynski, P, Sacchi, N (1987). Anal Biochem. 162, 156-9.

2. Huang, Z, Fasco, MJ, Kaminsky LS (1996). BioTechniques 20, 1012-20.

3. Moore, S (1981). En: Las enzimas (Boyer PD, Ed.). Academic Press, Nueva York.


¿Puedo utilizar un tampón de PCR en lugar de un tampón de síntesis de ADNc? - biología

Las tecnologías 'Omic', que adoptan una visión holística de las moléculas que componen un organismo, están destinadas principalmente a la detección global de genes (genómica), ARNm (transcriptómica), proteínas (proteómica) y metabolitos (metabonómica) en una determinada biología. muestra. La aplicación de técnicas genómicas en el campo de la microbiología diagnóstica tiene limitaciones, ya que la genómica se dirige a ácidos nucleicos específicos de organismos microbianos, por lo que puede producirse un resultado positivo tanto con microorganismos activos como inactivos. La transcriptómica ha progresado junto con los avances en la tecnología de PCR de transcriptasa de reserva en tiempo real y microarrays, mientras que la proteómica y la metabonómica se han beneficiado enormemente de la creciente sofisticación de las técnicas de espectrometría de masas que detectan proteínas y analitos metabólicos. Juntos, la transcriptómica, la proteómica y la metabonómica están ayudando a abordar cuestiones sobre la expresión génica, proporcionando así un diagnóstico "funcional" y una evaluación de las infecciones microbianas.

La DNasa I y la Proteinasa K eliminan el ADN de las bacterias dañadas o muertas, pero no de las bacterias vivas en sistemas de referencia microbianos y biopelículas naturales de agua potable para análisis de biología molecular posteriores.

Los resultados indicaron una discriminación relativamente buena entre el ADN expuesto de C. jejuni muerta y el ADN protegido de bacterias vivas. La ADNasa I se ha utilizado principalmente en el campo de la biología molecular para la eliminación de la contaminación del ADN genómico bacteriano en muestras para análisis adicionales de ARN (Wang et al. ., 2002) .Sugerir que una muestra que contiene ADN libre, eDNA y células vivas y muertas está expuesta a DNasa I, los ácidos nucleicos de las células vivas deben protegerse de la acción de la enzima debido a su membrana celular intacta.

Las técnicas moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR cuantitativa (qPCR), son muy sensibles, pero pueden detectar el ADN total presente en una muestra, incluido el ADN extracelular (eDNA) y el ADN procedente de células vivas y muertas. La DNasa I es una endonucleasa que escinde de forma no específica el ADN monocatenario y bicatenario. Esta enzima fue probada en este estudio para analizar su capacidad de digerir el ADN proveniente de células muertas con membranas celulares dañadas, dejando ADN de células vivas con membranas celulares intactas disponible para métodos basados ​​en ADN. Para ello, se desarrolló un protocolo optimizado de DNasa I / Proteinasa K (DNasa / PK). Intacto Staphylococcus aureus células muertas por calor Pseudomonas aeruginosa células, ADN genómico libre de Salmonella enterica, y una mezcla de estos objetivos se trató de acuerdo con el protocolo desarrollado de DNasa / PK. Paralelamente, estas muestras se trataron con monoazida de propidio (PMA) como un ensayo ya descrito para la discriminación de vivo-muerto. Se utilizaron PCR cuantitativa y PCR-DGGE del fragmento de rDNA 16S eubacteriano para probar la capacidad de los tratamientos con DNasa / PK y PMA para distinguir el ADN procedente de células con membranas celulares intactas en presencia de ADN de células muertas y ADN genómico libre. Los métodos se aplicaron a biopelículas de agua potable autóctonas de tres meses de una instalación piloto construida en una planta de abastecimiento de agua en Alemania. Los cambios en los patrones de ADN observados después del análisis de DGGE demostraron la aplicabilidad de DNasa / PK, así como del tratamiento con PMA para la investigación de biopelículas naturales. Sin embargo, el tratamiento con DNasa / PK demostró algunas ventajas prácticas en comparación con el tratamiento con PMA para la discriminación de objetivos bacterianos vivos / muertos en los sistemas de agua potable.

Identificación de una tercera proteína de unión a EspA que forma parte del sistema de secreción de tipo III de Escherichia coli enterohemorrágica

Enterohemorrágico Escherichia coli utiliza un sistema de secreción de tipo III para administrar efectores virulentos a las células. El aparato de secreción comprende un cuerpo basal de membrana y un complejo de agujas externas del cual EspA es el componente principal. Un l0050Se encontró que la mutación -deleción (ΔL50) altera la secreción de tipo III y la adherencia bacteriana. Estos fenotipos y la localización del producto génico en la membrana interna apoyan la hipótesis de que L0050, rebautizado como EscL, forma parte del aparato de secreción. Además, en ΔL50, se encontró que la cantidad de EspA presente dentro del lisado celular había disminuido, mientras que la proteína asociada EspB expresada en co-cistrón de EspA permaneció inalterada. La disminución del nivel de EspA pareció deberse a la inestabilidad de la proteína EspA recién sintetizada en ΔL50 más que a una disminución del ARNm de EspA. Utilizando tanto la co-purificación bioquímica como un sistema de interacción bacteriana de dos híbridos, pudimos concluir que EscL es una tercera proteína que, además de CesAB y CesA2, interactúa con EspA y mejora la estabilidad de EspA intracelular.


Afiliaciones

Laboratorio de Biología de Células Germinales de Mamíferos, Centro de Biología del Desarrollo, Instituto RIKEN Kobe, 2-2-3 Minatojima-Minamimachi, Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japón

Kazuki Kurimoto, Yukihiro Yabuta, Yasuhide Ohinata y el amplificador Mitinori Saitou

Investigación precursora para la ciencia y tecnología embrionarias, Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón, 4-1-8 Hon-cho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012, Japón

Laboratorio de Biología Celular Molecular y Desarrollo, Escuela de Posgrado de Bioestudios, Universidad de Kyoto, Oiwake-cho, Kitashirakawa, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8502, Japón



Comentarios:

  1. Treasach

    Te pido disculpas, pero, en mi opinión, cometes un error. Discutámoslo. Escríbeme por PM, nos comunicamos.

  2. Doutaur

    Maravilloso, muy precioso mensaje.

  3. Bragis

    Escuché recientemente que esto es posible



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