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Visualización de fagémidos

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Si estoy usando un bacteriófago para la exhibición de fagos y estoy tratando de evitar los efectos de la avidez usando un fago auxiliar, ¿cuál sería la mejor manera de mantener un tamaño de biblioteca grande mientras se mantiene todo monomérico? Estoy preguntando en términos de mantener una proporción de infección apropiada yo trucos y herramientas de fagos para mantener esa estequiometría.


Encontré un artículo en Nature:

Un fago auxiliar para mejorar la presentación de anticuerpos monocatenarios en la presentación de fagos

protocolo experimental

Los procedimientos de clonación estándar, la determinación de las unidades formadoras de colonias y las unidades formadoras de placas, y la inmunotransferencia después de PAGE se llevaron a cabo de acuerdo con Sambrook et al.

Construcción de la línea celular de envasado.

DH5alpha / pIII [M13KO7DeltapIII]. El gen pIII de M13 fusionado al promotor P / A1 / 04/03 (ref. 17) se insertó en el sitio de clonación múltiple del plásmido lambdaattP pLDR9 (ref. 18). Se cortaron el origen de replicación y el gen de resistencia a kanamicina y se volvió a ligar el ADN no replicativo de lambdaattP-pIII restante. Se transformó Escherichia coli DH5alpha que contenía el plásmido pLDR8 (ref. 18) con el ADN no replicativo lambdaattP-pIII y se sembraron en placas de agar que contenían ampicilina 25 μg / ml. Después de la incubación durante la noche a 42 ° C, las colonias obtenidas fueron replicadas en placa y se identificaron clones resistentes a ampicilina, denominados E. coli DH5alpha / pIII. Posteriormente se transformaron con M13KO7DeltapIII, dando como resultado la línea celular de empaquetamiento E. coli DH5alpha / pIII [M13KO7DeltapIII].

Producción de fagos.

Para obtener el fago auxiliar M13KO7DeltapIII, se electrotransfectó ADN de M13KO7DeltapIII en E. coli K802 que contenía pNDI (ref. 15). Para obtener hiperfago, el ADN de M13KO7DeltapIII se electrotransfectó en E. coli DH5alpha / pIII. Los fagos se produjeron mediante cultivo en presencia de isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) 0,5 mM a 30 ° C durante 24 h con agitación a 200 r.p.m. Se infectaron Escherichia coli Top10F 'o E. coli Xl1blue que portaban el fagémido pSEXphOx (Yol) o una biblioteca scFv en pSEX81, respectivamente, con una preparación de fagos auxiliares a una DO600 de 0,1 a una multiplicidad de infección de 20 como se describe.

Cuantificación de fagos por ELISA.

Se recubrieron series de dilución de fagos en NaHCO3 100 mM, pH 8,6 en placas de ELISA MaxiSorb (Life Technologies, Karsruhe, Alemania) durante 16 ha 4ºC. El bloqueo se realizó con leche desnatada en polvo al 2% en PBS (NaCl 137 mM, KCl 3 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 1 mM, pH 7,3) durante 2 ha temperatura ambiente. Los fagos se detectaron con el anticuerpo monoclonal de ratón B62-FE2 (Progen, Heidelberg, Alemania) que se une específicamente a un epítopo en la proteína de la cubierta principal pVIII del fago M13. Se utilizó el fago M13KO7 de unidades formadoras de colonias conocidas para la estandarización.

Inmunoblot.

Se aplicaron aproximadamente 1010 fagos por carril en un gel de poliacrilamida al 10%. El bloqueo se realizó con leche desnatada en polvo al 2% en PBS durante 2 ha temperatura ambiente. La inmunotinción se realizó con el mAb de ratón anti-g3p (MoBiTec, Göttingen, Alemania) reconociendo la proteína de cubierta pIII de M13KO7, visualizada con sustrato 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzideno (TMB) (Promega, Madison, WI).

ELISA de fago de unión a antígeno.

Se recubrieron series de dilución de antígeno BSA-phOx en NaHCO3 100 mM, pH 8,6, en placas de ELISA MaxiSorb (Life Technologies) durante 16 ha 4ºC. Después de bloquear la unión inespecífica con leche desnatada en polvo al 2% en PBS durante 2 ha temperatura ambiente, se aplicaron 2 veces 109 fagos monocatenarios diluidos en leche desnatada en polvo al 2% en PBS a cada pocillo durante 1 ha temperatura ambiente. Después de lavar seis veces con 400 µl de PBS por pocillo, el fago unido se detectó con mAb B62-FE2 como se describió anteriormente.

Panorámica.

Se generó una biblioteca de fragmentos de scFv humano en pSEX81 con una complejidad máxima calculada de 2 veces 107 a partir de preparaciones de linfocitos periféricos como se describe21. Se recubrieron seis pocillos de ELISA (Life Technologies) con toxina tetánica obtenida de Virotech (Rüsselsheim, Alemania) a una concentración de 0,1 μg / ml en NaHCO3 100 mM, pH 8,6, durante 16 ha 4 ° C. Los pocillos se bloquearon con leche desnatada al 2% en PBS durante 2 ha temperatura ambiente, después de lo cual se aplicaron 1011 fagos de la biblioteca a cada pocillo y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Después de cinco lavados con PBS / Tween al 0,1% y cinco con PBS, los fagos unidos se eluyeron con 1 taza / ml de tripsina (Life Technologies) en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Se utilizaron fagos eluidos para la infección de 20 ml de E. coli XL1blue a una DO600 de 0,4. Las bacterias infectadas se cultivaron en placas de agar Luria-Bertani que contenían glucosa y ampicilina, se rasparon de las placas y se usaron para la producción de fagos de anticuerpos para la siguiente ronda de cribado como se describió anteriormente.


El primer caso descrito de Phage Display ocurrió en 1985, cuando George P. Smith fusionó un péptido con un gen III de un fago filamentoso. Presentó una patente que detalla el proceso de generación de bibliotecas de presentación de fagos en el mismo año. Finalmente, un mayor desarrollo de la tecnología Phage Display liderado por diferentes grupos del Laboratorio de Biología Molecular MRC, así como del Instituto de Investigación Scripps, llevó a la posibilidad de mostrar proteínas con el propósito de la ingeniería de proteínas terapéuticas. La técnica se ha mejorado continuamente para seleccionar y amplificar grandes colecciones de proteínas que muestran mejor la conexión del fenotipo y el genotipo.

Un fago filamentoso tiene un diámetro de alrededor de 6,5 nanómetros, con una longitud que depende del tamaño de su genoma. Proviene de una gran familia de virus bacterianos que también infectan otras formas de bacterias. Contiene un pequeño genoma con una región intergénica que contiene las secuencias necesarias para la replicación y encapsidación del ADN.

Una partícula de fago consta de cinco proteínas de cubierta. La partícula tiene un tubo hueco que alberga tantas copias de la proteína de la cubierta primaria. También hay interacciones de unión entre las secciones medias hidrofóbicas de las subunidades adyacentes. Un extremo de la partícula es desafilado y el otro es afilado. El extremo romo contiene muchas copias de las dos proteínas más pequeñas traducidas ribosómicamente, mientras que el extremo afilado contiene solo alrededor de 5 copias de los genes pIII y pVI, que son necesarios para el desprendimiento del fago de la membrana celular.


Contenido

La presentación de fagos fue descrita por primera vez por George P. Smith en 1985, cuando demostró la presentación de péptidos en fagos filamentosos al crear la fusión de la proteína de la cápside del virus en una biblioteca de secuencias de péptidos. & # 911 & # 93 Esto mostró los péptidos en la superficie viral, donde se podrían seleccionar aquellos con la mayor afinidad de unión. En 1988, Stephen Parmley y George Smith describieron el biopanning para la selección por afinidad y demostraron que las rondas recursivas de selección podrían enriquecer los clones presentes en 1 en mil millones o menos. & # 915 & # 93 En 1990, Jamie Scott y George Smith describieron la creación de grandes bibliotecas de péptidos aleatorios mostrados en fagos filamentosos. & # 916 & # 93 La tecnología de visualización de fagos fue desarrollada y mejorada por grupos en el Laboratorio de Biología Molecular con Greg Winter y John McCafferty, el Instituto de Investigación Scripps con Lerner y Barbas y el Centro Alemán de Investigación del Cáncer con Breitling y Dübel para la visualización de proteínas tales como anticuerpos para la ingeniería de proteínas terapéuticas. Smith y Winter recibieron la mitad del premio Nobel de química 2018 por su contribución al desarrollo de la exhibición de fagos. & # 917 & # 93 Una patente de George Pieczenik que reivindica la prioridad de 1985 también describe la generación de bibliotecas de péptidos. & # 918 & # 93


¿Qué es un fagémido (Fásmido)?

Fagémido, también denominado como Fásmido, también es un tipo de vector híbrido. El fagémido contiene un origen de replicación especial denominado origen de replicación f1. El origen de replicación f1 se extrae de un fago f1.

El fagémido puede replicar tanto el ADN monocatenario como el bicatenario. La replicación puede tener lugar como un plásmido mientras se realiza una replicación independiente o puede empaquetarse en partículas de fagos y finalmente infectar al huésped bacteriano. E. coli. Al infectar el E. coli células, el fago f1 requiere la presencia de un pilus. Por lo tanto, los pili sexuales son importantes durante in vitro envasado de fagémidos.


DISCUSIÓN

A pesar de la enorme atención centrada en la presentación de fagos mediada por pIII y pVIII, no existían informes publicados para pVII y pIX. Como se describe en el presente documento, se demostró que pVII y pIX podrían usarse para mostrar el péptido Flag cuando se fusionan con los extremos N de las dos proteínas de la cubierta. Luego, de mayor importancia, mostramos que las regiones variables de anticuerpos fusionadas con pVII y pIX participaron en una interacción dinámica para mostrar un anticuerpo Fv funcional, un motivo heterodimérico representativo.

Las proteínas de la cubierta pIII, pVI, pVIII, pVII y pIX son proteínas integrales de la membrana interna antes del ensamblaje (24). Con la llegada de nuestros resultados, los cinco ahora se han utilizado para mostrar proteínas en la superficie del fago. Otros investigadores demostraron que pVII y pIX estaban presentes como cinco moléculas ubicadas en el mismo extremo de la partícula del fago que emergió primero de la célula y fueron necesarias para el inicio del ensamblaje a través de la interacción con la señal de empaquetamiento del genoma del fago (11). La ausencia de pVII y pIX dio como resultado una producción extremadamente baja de fagos. Aunque se había sugerido previamente que pVII y pIX no eran funcionales con otra proteína fusionada a su extremo N (24), nuestra investigación mostró que tales fusiones eran viables. Las posibles razones de nuestro éxito fueron que (I) se incorporó una secuencia líder que dirigía las proteínas de fusión a la membrana interna y evitaba la acumulación en el citoplasma y (ii) se utilizaron pVII y pIX de tipo salvaje del fago auxiliar para competir con las proteínas de fusión pVII y pIX. Con el éxito de nuestro trabajo, pVII y pIX deberían ser fácilmente aplicables a protocolos combinatorios de presentación de fagos que utilizan secuencias de proteínas muy diversas.

El marcaje con oro específico del fago Fv determinado por microscopía electrónica mostró claramente la presencia de oro en un extremo de la partícula del fago. Curiosamente, se observaron fagos que albergaban una o dos marcas de oro. Suponemos que este último resultó de la presentación bivalente de fragmentos Fv, en lugar de etiquetado con oro múltiple de PCP-BSA. Aproximadamente el 20% de los fagos estaban marcados con oro y, por lo tanto, mostraban un anticuerpo Fv funcional. Sin embargo, un análisis cinético mostró que la actividad del fago Fv de 21H3 150 nM era igual a la actividad de IgG de 21H3 50 nM. Los datos, tomados en conjunto, junto con la suposición de que las actividades específicas de Fv e IgG eran comparables sugirieron que algunas partículas de fagos mostraban simultáneamente más de un fragmento Fv. Previamente se mostró una presentación multivalente de fragmentos Fv en el extremo C de pIII (23). Además, la modulación de las condiciones de crecimiento dio como resultado valencias alteradas de la presentación de anticuerpos (25) y, por lo tanto, nuestra inducción con isopropil β-d-tiogalactopiranósido 1 mM bien podría aumentar la posibilidad de multivalencia.

Los fragmentos Fv son heterodímeros formados por VH y VL dominios y son los fragmentos de anticuerpos más pequeños que contienen toda la información necesaria para la unión de antígenos específicos. Sin embargo, las cadenas asociadas no covalentemente en un fragmento Fv aislado no son muy estables y tienden a disociarse (26). Los métodos conocidos para estabilizar fragmentos de Fv son los Fvs de cadena sencilla (scFvs) (1, 27, 28) y los Fvs estabilizados con disulfuro (dsFvs) (29–31). Sin embargo, los scFv todavía son a menudo inestables (29, 32, 33) y pueden tener afinidades más bajas en comparación con los Fab y la IgG completa porque el enlazador interfiere con la unión o no estabiliza suficientemente el heterodímero (30, 34, 35). Aunque los dsFv generalmente son más estables y no tienen un enlazador, requieren la incorporación de un disulfuro en la construcción de la biblioteca. Además, es probable que las bibliotecas de dsFv cubran un subconjunto de anticuerpos sesgado en el que el disulfuro entre cadenas no interfiere con la unión del antígeno (35). El anticuerpo Fv mostrado por pVII y pIX en nuestro formato puede verse como un Fv estabilizado por fagos (psFv) que imita la estructura del anticuerpo natural sin las desventajas de scFvs y dsFvs. Nuestros Fv conservan la afinidad y son robustos, ya que cada cadena está anclada de forma independiente a la capa del fago.

Más importante aún, nuestro nuevo formato sería particularmente útil para la visualización combinatoria de matrices heterodiméricas. Además, aunque las razones aún no están claras, este formato parece producir un enriquecimiento particularmente poderoso durante los protocolos de barrido. El pVII y el pIX aparentemente están lo suficientemente cerca para las proteínas de fusión con el VH y VL de un anticuerpo para formar un heterodímero funcional. Anticipamos plenamente que el enfoque puede extenderse a la presentación de diversos polipéptidos para la creación de anticuerpos artificiales. La capacidad de mostrar un gran repertorio de nuevos dominios de unión diméricos sin restricciones por la programación específica de la estructura del anticuerpo aumentará nuestra comprensión de las interacciones proteína-proteína y potencialmente conducirá al descubrimiento de actividades biológicas únicas.


Un vector de presentación de fagos optimizado para la generación de bibliotecas combinatorias de anticuerpos humanos y la clonación molecular de fragmentos de anticuerpos monoclonales.

Se optimizó un nuevo vector fagémido, denominado pCM, para la clonación y presentación de bibliotecas de fragmentos de anticuerpos (Fab) en la superficie de fagos filamentosos. Este vector contiene dos fragmentos de "relleno" de ADN largos para facilitar la diferenciación de las formas correctamente cortadas del vector. Además, en pCM, el fragmento en el sitio de clonación de la cadena pesada contiene un gen que codifica la fosfatasa ácida que permite una fácil distinción de las células de Escherichia coli que contienen la forma no modificada del fagémido frente al ADNc que codifica el fragmento de la cadena pesada. En pCM, la transcripción de la cadena pesada Fd / gen III y la cadena ligera está dirigida por un único promotor lacZ. La cadena ligera se dirige al periplasma por el péptido señal ompA, mientras que la Fd de cadena pesada / proteína de cubierta III es traficada por el péptido señal pelB. El fagémido pCM se usó para generar una biblioteca de anticuerpos de presentación de fagos combinatorios humanos que permitió la selección de un anticuerpo de fragmento Fab monoclonal dirigido contra la nucleoproteína (NP) del virus Influenza A.


Materiales y métodos

Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento y fagos auxiliares

E. coli cepa TG1 (supE thi-1 Δ (lac-proAB) Δ (mcrB-hsdSM)5 (rK - mK -) [F ' traD36 proAB lacI q ZΔM15]) se utilizó para construir el vector fagémido pDJ01 y la biblioteca de presentación de fagos. E. coli Las células se incubaron en caldo de triptona de extracto de levadura (2xYT) y E. coli transformantes en 2xYT con 20 μg ml -1 de cloranfenicol (Cm) a 37 ° C con aireación. Medio sólido para el crecimiento de E. coli los transformantes también contenían agar al 1,5% (p / v). L. rhamnosus la cepa HN001 se obtuvo del Centro de Investigación Fonterra y se propagó en caldo Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Inglaterra) a 37 ° C. Stocks del fago auxiliar VCSM13d3 con eliminado gIII se obtuvieron por infección de complementos E. coli cepa K1976 (TG1 transformada con el plásmido pJARA112 que contiene gIII bajo el control del promotor inducible por infección por fagos psp [49]). Fago auxiliar VCSM13 (gIII + Stratagene, Cedar Creek, Texas, EE. UU.) Se propagó en la cepa TG1.

Aislamiento de ADN cromosómico de L. rhamnosusHN001

Para la construcción de la biblioteca, se aisló el ADN cromosómico de un cultivo de una noche de L. rhamnosus HN001 utilizando una modificación del método descrito anteriormente [102]. Brevemente, se diluyó un cultivo durante la noche 1: 100 en 80 ml de caldo MRS y se incubó durante la noche a 37ºC. Las células se recolectaron por centrifugación a 5.500 xg durante 10 minutos, se resuspendieron en 80 ml de caldo MRS y se incubaron durante 2 h más a 37ºC. Las células se lavaron dos veces en 16 ml de Tris-HCl 30 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM, EDTA 5 mM y se resuspendieron en 2 ml del mismo tampón que contenía sacarosa al 25% (p / v), 20 mg ml -1 de lisozima ( Sigma-Aldrich, Castle Hill, New South Wells, Austarlia) y 20 μg ml -1 de mutanolisina (Sigma). La suspensión se incubó durante 1 ha 37 ° C. Se consiguió una lisis adicional de las células añadiendo 2 ml de EDTA 0,25 M, 800 µl de SDS al 20% (p / v). Después de la adición de SDS, la suspensión se mezcló cuidadosamente y se incubó a 65 ° C durante 15 minutos. A continuación, se añadió RNasa A (Roche, Basilea, Suiza) hasta una concentración final de 100 µg ml -1 y se continuó la incubación durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió proteinasa K (Roche) hasta una concentración final de 200 μg ml -1 y la suspensión se incubó a 65 ° C durante 15 minutos. Finalmente, después de extracciones con fenol y cloroformo, el ADN se precipitó mediante la adición de 1/10 volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 95% (v / v). El ADN se sedimentó mediante centrifugación, se lavó con etanol al 70% (v / v), se secó al aire y se resuspendió en un volumen apropiado de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0).

Construcción del nuevo vector fagémido pDJ01

Imprimaciones pDJ01F01 (5'-GGCCCGGAAGAGCTGCAGCATGATGAAATTC-3 ', que contiene un OrejaI (subrayado) en el extremo 5 ') y pDJ01R01 (5'-GGGGAATTC TCTAGA CCCGGG GCATGCATTGTCCTCTTG-3 ', que contiene, desde el extremo 5', EcoRI (primera secuencia subrayada), XbaYo (primera secuencia en negrita), SmaI (segunda secuencia subrayada) y SphI (segunda secuencia en negrita) sitios de restricción) y el molde pJARA144 (no publicado) se usaron para generar un producto de PCR que contiene el psp promotor seguido de un sitio de unión ribosomal y un sitio de clonación múltiple. El producto se escindió con Orejayo y EcoRI y ligado en OrejaI-EcoFagémido pAK100 digerido con RI [73]. La ligadura colocó el psp promotor, sitio de unión ribosomal y el sitio de clonación múltiple directamente aguas arriba de una secuencia que codifica la etiqueta peptídica C-myc, seguido de supresible ámbar (TAG) codón de parada y una secuencia de codificación para el dominio carboxi-terminal de pIII (Figura 1). El plásmido se denominó pDJ01.

Construcción del fagémido que muestra el SOF de S. pyogenes

Cebadores pSOF22F01 (5'-CCGCCGATGCATTGACAAATTGTAAG-3 ', que contiene un NsiI (subrayado)) y pSOF22R01 (5'-CCGCCGGAATTCCTCGTTATCAAAGTG-3 ', que contiene un EcoSitio RI (subrayado)) y la plantilla, ADN purificado de un clon λEMBL4 del sof22 de S. pyogenes cepa D734 (serotipo M22 The Rockefeller University Collection), se utilizaron para generar un producto de PCR que codifica el SOF de la cepa M22, incluida la secuencia señal pero excluyendo la pared celular y las secuencias de anclaje a la membrana (963 residuos). Se utilizaron veintisiete ciclos para amplificar sof22. El protocolo de termociclado comenzó con un paso de desnaturalización inicial durante 2 minutos a 94 ° C, seguido de 10 ciclos de: un paso de desnaturalización (94 ° C durante 15 s), un paso de recocido (59 ° C durante 30 s) y un paso de extensión (72 ° C durante 2,5 minutos). Se llevaron a cabo 17 ciclos posteriores con los mismos pasos de desnaturalización y recocido, pero el paso de alargamiento se incrementó en duración en 2 s en cada ciclo. El paso de extensión en el ciclo final se extendió a siete minutos para garantizar que todos los productos estuvieran completamente sintetizados. El producto de PCR se escindió con Nsiyo y EcoRI y ligado al NsiI-EcoVector pDJ01 escindido con RI. Este fagémido se denominó pSOF22.

Producción y ensayos funcionales de las partículas de fagémidos que muestran SOF

Las partículas de fagémido se generaron mediante la infección de 100 ml de cultivos de TG1 (pSOF22) de crecimiento exponencial con reservas de fagos auxiliares a una multiplicidad de infección de 50 fagos por bacteria. Los fagos auxiliares VCSM13 y VCSM13d3 se utilizaron para la producción de partículas de fagémido de pSOF22 (denominado pSOF22 PP / wt y pSOF PP / d3, respectivamente) y VCSM13 solo para la producción de pDJ01 (control de partículas de fagémido negativo denominado pDJ01 PP / wt). El fago auxiliar VCSM13d3 no se utilizó para la producción de partículas de fagémido pDJ01 debido a la falta de pIII funcional. Las células infectadas se incubaron durante 4 ha 37 ° C con aireación. Las células huésped se sedimentaron mediante centrifugación y las partículas de fagémido se recogieron en el sobrenadante. Las partículas de fagémido se purificaron mediante precipitación en PEG al 5% (p / v), NaCl 500 mM y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS NaCl 125 mM, KH 1,5 mM2correos4, Na 8 mM2HPO4 y KCl 2,5 mM, pH 7,6). Las partículas de fagémido se cuantificaron en función de la cantidad de ADN de fagémido después de la interrupción de los viriones a 70 ° C en SDS al 1% (p / v) como se describió anteriormente [33].

El ensayo de opacidad del suero se llevó a cabo mezclando 1 ml de suero de caballo inactivado por calor con 10 11 partículas de fagémido que presentaban SOF (pSOF22 PP / wt pSOF22 / d3) o control negativo (pDJ01 PP / wt) en presencia de azida sódica. Las reacciones se incubaron a 37ºC y se controló la evolución temporal del aumento de la densidad óptica a lo largo del tiempo midiendo la densidad óptica a una longitud de onda de 405 nm.

El ensayo de unión a fibronectina se llevó a cabo mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de fagos (ELISA [103]). Los pocillos de microvaloración (Nunc-Immuno MaxySorp ™, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con fibronectina plasmática a una concentración final de 20 µg ml -1, 100 µl por pocillo en PBS (pH 7,2) durante 1 ha 37ºC. Los pocillos se lavaron una vez con 300 µl de PBS, tampón Tween 20 al 0,05% (PBST) y luego se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% (p / v) en PBS durante 2 ha temperatura ambiente. A continuación, los pocillos se lavaron (tres veces) con 300 µl de tampón PBST. Se añadieron a los pocillos partículas de fagémido (2 x 108) en 100 µl de PBS. Los controles de tampón negativos fueron TE (Tris 10 mM, 1 mM, EDTA, pH 8,0), PBS y BSA al 0,05% (p / v) en PBS, y el control de partículas de fagémido negativo fue pDJ01 PP / p, generado como se describió anteriormente. Las placas se incubaron durante 2 ha temperatura ambiente. Las partículas de fagémido no unidas se eliminaron lavando con PBST (siete veces). Para detectar partículas de fagémido unidas, se añadieron 100 μl de anti-pVIII de ratón (anticuerpo monoclonal contra M13, fd y f1, Progen Biotechnik, Heidelberg, Alemania) a 0,1 μg ml -1 en 0,1% (p / v) de BSA / PBS y se incubaron durante 1 ha temperatura ambiente. A continuación, los pocillos se lavaron con 300 µl de tampón PBST (cinco veces) y se añadieron 100 µl de anticuerpo anti-ratón secundario conjugado con HRP a una dilución de 1: 2000 y se incubaron durante 1 ha temperatura ambiente. La placa se lavó siete veces con tampón PBST y se reveló usando el kit de sustrato ImmunoPure TMB (Pierce, Rockford, Illinois, EE. UU.). La absorbancia se leyó a 450 nm. Las partículas de fagémido se cuantificaron como se describió anteriormente.

Construcción de toda la biblioteca del genoma

La biblioteca se construyó a partir de cizallas mecánicas (nebulización) L. rhamnosus HN001 y se clonó en el vector fagémido pDJ01. Un nebulizador médico desechable que contenía 1,5 ml de un ADN cromosómico tamponado (aproximadamente 20 µg) y glicerol al 25% (v / v) se sometió a gas nitrógeno a una presión de 10 psi durante 90 s. Los fragmentos obtenidos variaron en tamaño entre 0,3 y 4 kb, siendo la mayoría entre 0,5 y 1,6 kb. Los extremos romos se consiguieron mediante tratamiento con ADN polimerasa T4 (Roche), fragmento Klenow de ADN polimerasa I (Roche) y OptiKinase ™ (USB Corporation, Cleveland, Ohio, EE. UU.). Para eliminar fragmentos por debajo de 0,3 kb, se utilizó resina de exclusión por tamaño Sepharose CL-4B 200 (Sigma). El vector fagémido pDJ01 se digirió con la enzima de restricción SmaI (Roche) y desfosforilado con fosfatasa alcalina de camarón (Roche). Las manipulaciones del ADN se realizaron de acuerdo con métodos estándar [104].

Aproximadamente 10 µg de los fragmentos genómicos se ligaron a 3 µg del vector pDJ01 usando ligasa T4 (Roche). Después de la extracción con fenol y cloroformo, el ADN ligado se precipitó con etanol, se lavó con etanol al 70% (v / v) y se disolvió en 25 μl de H2O. La mezcla de ligadura se transformó en E. coli TG1 por electroporación (2,5 kV, 25 μF, 400 Ω) en cubetas con espacio de 2 mm. Las células transformadas se transfirieron a 50 ml de 2xYT y se incubaron durante 1 ha 37 ° C con agitación rotatoria. Después de la incubación, se tomó una alícuota de 2 ml para determinar el número de transformantes mediante placa en agar 2xYT con 20 µg ml -1 de cloranfenicol. Las bacterias restantes se amplificaron durante la noche a 37 ° C con aireación.

Selección directa de la biblioteca de presentación de fagos secretoma

Se usó una alícuota de 1 ml del cultivo de una noche que contenía la genoteca completa para inocular 25 ml de 2xYT-Cm. La cultura en crecimiento exponencial (OD600 aproximadamente 0,2) se infectó con el fago auxiliar VCSM13d3 (multiplicidad de infección = 50) durante 1 h. Luego, las células se recolectaron por centrifugación a 3200 xg durante 10 minutos, el sedimento se resuspendió en 1 ml de 2xYT, se mezcló con 10 ml de agar blando (caldo 2xYT con agarosa al 0,5% (p / v)) y se vertió sobre cuatro 2xYT-Cm platos. Tanto el agar blando como las placas contenían agarosa de grado de biología molecular en lugar de agar bacteriológico. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC, luego las partículas de fagémido se extrajeron de las placas añadiendo 5 ml de 2xYT en cada placa seguido de agitación rotatoria lenta a temperatura ambiente durante 4 h. Las partículas de fagémido extraídas se precipitaron con PEG al 5% (p / v), NaCl 0,5 M y se resuspendieron en tampón TN (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6). Para eliminar las partículas de fagémido inestables (defectuosas), el precipitado se trató con sarcosilo a una concentración final del 0,1% (p / v). El ADNss liberado de las partículas de fagémidos defectuosos se eliminó mediante DNasa I (100 μg ml -1) en presencia de MgCl 5 mM2. Después, la ADNasa I fue inactivada por EDTA (20 mM). A continuación, se extrajo el ssDNA de los viriones resistentes a sarcosilo. En primer lugar, se liberó el ADNss de las partículas de fagémido mediante incubación a 70ºC durante 10 minutos en presencia de SDS al 1,2% (p / v). Se llevó a cabo una purificación adicional del ssDNA usando un mini kit de preparación de plásmido (Roche). Para amplificar la biblioteca de secretomas a partir del origen de replicación del plásmido, E. coli la cepa TG1 se transformó con ssDNA purificado.

Análisis de secuencia de seleccionados L. rhamnosusClones de HN001

Después de la transformación, se seleccionaron aleatoriamente 491 clones para el análisis. El ADN del fagémido de estos clones se purificó usando el kit 96-easy Mini-prep Kit (V-Gene Biotechnology, Hangzhou City, China). Los insertos se secuenciaron utilizando el cebador pDJ01R02 (5'-CCGGAAACGTCACCAATGAA) y el kit de secuenciación de ciclo BigDye ® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, California, EE. UU.) Y se analizaron en un analizador genético ABI3730 (Applied Biosystems) en AWC Genome Services (Universidad de Massey). Todos los insertos se secuenciaron desde el extremo 3 ', ya que nuestro interés se centró en los ORF en fusión con gIII. La secuenciación y el análisis de la secuencia se llevaron a cabo en lotes de 96 clones. Después del análisis de secuencia de los primeros 192 clones, los clones cuyas secuencias se detectaron más de cinco veces se excluyeron de la secuenciación adicional usando hibridación por transferencia puntual. Las secuencias obtenidas se analizaron con el software Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) Y GLIMMER versión 3.02 utilizando un conjunto de entrenamiento generado contra el L. rhamnosus HN001 borrador de secuencia del genoma, una matriz de peso de posición que representa los sitios de unión del ribosoma para los genes HN001 y un enfoque iterativo, como se describe en la documentación del software, para predecir los ORF [105]. Si no se alcanzó el extremo 5 'del ORF, se llevó a cabo una reacción de secuenciación utilizando el cebador complementario del vector directo pDJF03 (5'-ATGTTGCTGTTGATTCTTCA-3').

Se utilizaron SignalP 3.0 [106] y TMHMM 2.0 [107] para la predicción de la secuencia de señales y las hélices transmembrana, respectivamente, utilizando la configuración predeterminada (para bacterias Gram-positivas) y valores de corte [14, 50]. Las hélices transmembrana ubicadas en el extremo amino que en el análisis de SignalP 3.0 mostraban una puntuación para el sitio de escisión de la peptidasa señal (puntuación C) por debajo de 0,52 se consideraron anclajes de membrana aminoterminales. La presencia de una hélice transmembrana se confirmó mediante el programa de predicción TMHMM [108]. Las secuencias de señales de las lipoproteínas fueron predichas por el servidor LipPred [109] utilizando la configuración predeterminada y los valores de corte [53]. TATFIND 1.4 se utilizó para la predicción de secuencias de señales Tat [110].

Todas las secuencias de inserción traducidas se examinaron con BlastP [111] en el sitio web del NCBI [112] con la configuración predeterminada para identificar similitudes con otras proteínas bacterianas. Se utilizó un valor e inferior a e -10 como punto de corte para una similitud notable. Además, los dominios conservados fueron identificados en nuestras secuencias de consulta por el motor Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART) en el curso de la búsqueda de dominios conocidos que se derivan de grupos de grupos ortólogos de proteínas (COG) [113] o Pfam [114 ] bases de datos.


Fagémido

Fagémido
Plásmido que contiene una parte del genoma de un fago. Tras la coinfección del huésped con un fago colaborador, el plásmido se puede empaquetar en partículas de fago. Un tipo de uso común de fagémido se empaqueta como ssDNA en partículas de fago M13.

Fagémido: Tipo de plásmido que lleva dentro de su secuencia un origen de replicación bacteriófago. Cuando la bacteria huésped se infecta con el fago "auxiliar", el fagémido se replica junto con el ADN del fago y se empaqueta en las cápsides del fago.
.

[12] El fragmento de ADN que se va a mutar se inserta en un fagémido como M13mp18 / 19 y luego se transforma en una cepa de E. coli deficiente en dos enzimas, dUTPasa (dut) y uracildesglicosidasa (ung).

vector de clonación: construcción de ADN artificial diseñada intencionalmente utilizada por biólogos moleculares para amplificar piezas seleccionadas de ADN insertadas en la construcción.Los ejemplos incluyen plásmido, fago,

y fago lambda - Lysogen
Fago T4 (169 a 170 kbp, 200 nm de largo)
Fago T7
Fago R17
Fago M13 -


Vectores fagémidos

Nuestro socio Antibody Design Labs ofrece una amplia variedad de fagos y vectores fagémidos para superar el desafío de la exhibición de fagos. La selección de aglutinantes es un proceso complejo que depende de múltiples variables y condiciones experimentales, por lo que el tiempo y los recursos son los principales factores limitantes para el éxito de los biopanning.

Actualmente ofrecemos opciones variadas para la visualización en el lado N-terminal de la proteína del gen III de longitud completa con el péptido líder PelB, ya sea utilizando un sistema de fagémidos o vectores de fagos.


Los vectores de fagos (ver enlace a continuación) producen una presentación multivalente y son los más adecuados para péptidos y scFv.

Los fagémidos son los más adecuados para la presentación de anticuerpos tales como fragmentos scFv y Fab, pero también se pueden usar para presentar péptidos de baja valencia.

pADL ™ -100 Vector de fagémido de visualización máxima:


Aplicaciones:
• Presentación de fagos en el lado N-terminal de la proteína del gen III del bacteriófago filamentoso
• Exhibición de polipéptidos
• Bibliotecas de péptidos de presentación de fagos


pADL ™ -20c / 22c / 23c Serie de vectores fagémidos de alta pantalla:


Aplicaciones:
• Presentación de fagos en el lado N-terminal de la proteína del gen III del bacteriófago filamentoso
• Pantalla scFv y Fab
• Expresión de scFv o Fab libre

pADL ™ -10 Vector fagémido de baja pantalla:


Aplicaciones:
• Presentación de fagos en el lado N-terminal de la proteína del gen III del bacteriófago filamentoso
• pantalla scFv enlaces relacionados


Visualización de fagémidos - Biología

Una revisión completa de la tecnología de presentación de fagos para la producción de anticuerpos monoclonales recombinantes.

Los anticuerpos monoclonales han contribuido significativamente en varios campos, como la biología molecular, la investigación farmacéutica y médica, y también han ayudado en el tratamiento de enfermedades como el cáncer y las enfermedades infecciosas [1-3]. Los anticuerpos recombinantes (rAb) han surgido como un medio valioso y práctico para la investigación, el diagnóstico de diversas enfermedades y como una de las clases de proteínas terapéuticas de más rápido crecimiento. Se han empleado diversos sistemas para la producción rápida y a gran escala de anticuerpos recombinantes para satisfacer la creciente demanda de anticuerpos. The benefit of huge amount and consistent quality of the in vitro antibody production methods have interested researchers to make improvements and try various production systems, viz. Gram-negative and Gram-positive bacteria, yeast (for example Adimab platform [4] ) and filamentous fungi, insect / mammalian cell lines, or more recently in transgenic plants and animals [5-7] for economic and large-scale production of rAbs. The other advantages offered by the rAbs include improvements in intrinsic properties such as immunogenicity, affinity, specificity, and stability of antibodies by a variety of mutagenesis techniques [8-10]. Libraries of antibody gene fragments can be cloned into expression vectors and displayed as a single-chain variable fragment or Fab-fragment antibodies on the surface of filamentous bacteriophage [11]. This technique, known as phage display, has helped enormously to study molecular biology mechanisms involving protein-protein [12] or protein-nonprotein interactions [13]. There are many excellent and comprehensive reviews on this topic, and one of the most recent ones is by the Bio-Rad group [14]. Phage display with pre-selected antibodies has also been exploited to enable barcoding of antibodies and thus highly multiplexed and quantitative cell-surface protein profiling [15]. Phage display can also be used to identify other types of protein affinity reagents such as Ras-binding domains [16].

The technique was initially demonstrated by George P. Smith in 1985 [17]. McCafferty and colleagues, in 1990, confirmed its use for the production of recombinant antibodies with desired specificities [18]. Since then, many research groups have contributed towards essential improvements and modifications of the technique for its potential applications in basic and applied biological sciences. Phage display technology allows the isolation of human antibodies against almost any antigen through the clonal selection of antibody fragments in a prokaryotic system, thus facilitating both immunotherapy and in vivo diagnosis. The range of antibodies from antibody libraries is limited by the initial calculated complexity of the antibody fragment gene library. Because the antigen-binding fragment is a heterodimer, the library complexity is increased by the random combination of heavy- and light-chain sub-libraries.

As previously mentioned, phage display technology refers to the use of phages for display of random peptides, foreign proteins or protein domains, as fusion proteins, on their surface [19]. Phages are viruses which infect bacterial cells. Mostly, the vectors used in recombinant DNA technology, are bacteriophages which infect Escherichia coli, the standard recombinant DNA host. An essential feature of such recombinant DNA vectors is that they can contain stretches of foreign DNA, which gets expressed in the host cell when the vector replicates. A phagemid vector, termed so for its phage origin genome, provides such features and enables expression of the foreign DNA, purposely introduced in the vector in such a way that it is expressed in conjunction with a phage protein, as a fusion protein, for display on the phage surface [19]. A variety of bacteriophages, viz. Ff filamentous phage, Lambda and T7 [20, 21] have been utilized in phage display with the most common being the Ff phage family (e.g., M13, fd-phage). These have been preferred, amounting to their potential as excellent cloning vehicles and simplicity for correct assembly of longer phage particles [21]. The PIII or PVIII surface proteins of the phage are used for display of recombinant peptides. Several options aid in avoiding the limitations of the conventional display system [22]. M13 filamentous phage-based libraries like Ph.D.TM-7, Ph.D.TM-12, Ph.D.TMC7C from New England Biolabs, or spherical T7 phage, T7Select® from Merck are available.

The most productive phage in nature is the filamentous phage which infects Escherichia coli. It generates titers of up to 10 13 per ml of bacterial culture. These bacteriophages infect a range of Gram-negative bacteria using the bacterial pili as a receptor. The best characterized of these phages (M13, fl, and fd) are collectively referred to as the Ff phage. These infect E.coli containing the F conjugative plasmid. The first phage display libraries of peptides and antibodies were published in 1990-1991 [23-26], after which the technique underwent numerous improvements for its varied applications.

The vectors designed by combining portions of plasmid and phage genome, for cloning and expression of fusion proteins are known as phagemid vectors. These vectors enclose an M13 phage origin of replication and packaging signal along with an origin of replication and the expression system of the plasmid. Usually, the expression plasmids are composed of multiple cloning sites, an antibiotic resistance marker, epitope tags such as a hexahistidine tag or a c-myc tag [27], and a lacZ promoter [28]. The phagemids habitually contain a gene sequence which codes for coat protein which will be fused to the foreign DNA that is to be expressed [23, 29], and a stop codon (usually amber), to permit host specific expression of the pIII fusion protein or a soluble fusion partner [30]. Phagemids can uphold themselves as plasmids, allowing the expression of the desired protein in the bacterial cell, but they do not have the other genes necessary for phage assembly. Therefore, infection of the phagemid-transformed host cells, with a helper phage becomes essential for the production of viable phage particles. The helper phage is the bacteriophage itself, which is engineered to provide the proteins essential for phage assembly. The phage-foreign fusion proteins can be displayed as either N-terminal fusions with pIII, pVII, pVIII, or pIX, for large proteins [31, 32] or C-terminal fusions with pIII, pVI, or pVIII proteins of the phage [33, 34]. The phage particles can be used in binding selections, and the binding clones can be multiplied through infection of E. coli host.

A drawback of the phagemid system is the reduction in the number of recombinant fusion proteins displayed on each phage particle due to competition between the wild-type coat protein and a fusion coat protein for integration into the phage particle [11]. Because of this problem, a modified helper phage, known as the hyperphage, was designed [35] which reportedly enhanced the yields of recombinant phages displaying the recombinant antibodies by more than two orders of magnitude. Hyperphages have a wild-type pIII phenotype and are therefore able to infect F+ E. coli cells with high efficiency however, they lack a functional pIII gene which renders these particles non-functional and thus require the phagemid-encoded pIII–antibody fusion for complete phage assembly (Figure 1). The outcome is a significant rise in the proportion of recombinant antibody displaying phages. It was reported that the antigen-binding activity also got affected by the use of the hyperphage. As a result, the hyperphage was found to be valuable in cases of selecting antibodies against rare epitopes.

Apart from this, specific mutations were also introduced in the coat proteins for the development of a hybrid phage display system [27], in which, two copies of the gene encoding coat protein exist: one with the scFv fusion and the other coding the natural non-fusion protein. Finally, the amount of recombinant proteins displayed is determined by more than a few factors, viz., type of coat protein chosen for fusion (pIII or pVIII), display system chosen for expression (phage or phagemid), and the choice of helper phage in case a phagemid system is used.

Some of the most widely used and commercially available phage display vector systems include, pSEX81 [36, 37], pCANTAB 5E [38-40], pCOMB3 [41] or its derivates, for example, pComb3XSS (Addgene 63890) [42, 43].

The phagemid vector, pSEX81, has been engineered for expression of functional single-chain Fv antibody-pIII fusion proteins on the surface of M13 bacteriophages. The phagemid was constructed explicitly for cloning of immunoglobulin heavy and light chain gene fragments isolated from human or mouse antibody libraries. The cassette vector, pSEX81, was designed for the convenient insertion of heavy and light chain variable domain coding regions and the production of a functional single chain of M13 bacteriophages. The corresponding DNA fragments of human or mouse origin can be amplified by PCR using the degenerate IgG/IgM, or IgG primer sets respectively, available from the same company. The amplified gene fragments encoding variable heavy or light domain are cloned in-frame between a signal peptide sequence of bacterial pectate lyase (pelB) for secretion of the fusion protein into periplasmic space and pIII gene of M13 bacteriophage.

The VH and VL genes are joined by a DNA fragment coding for a flexible 18 amino acid residue linker containing first six amino acids of CH1 constant region domain and the hydrophilic pig brain alpha tubulin peptide sequence "EEGEFSEAR". Vector backbone further provides a strong promoter, the T7 terminator, ColE1 origin of replication, intergenic region of phage F1 and an ampicillin resistance marker for selection. In pSEX81 the recognition sites of restriction endonucleases Nco I and Hind III allow insertion of VH gene fragments. For the insertion of a VL gene fragment, sites of restriction endonucleases Mlu I and Not I are present.

The systems for phage display can be categorized along the lines of the arrangement of the phage genes coding for coat proteins [44, 45]. A ‘type 3’ vector, consists of a single phage chromosome (genome) containing a single gene III for expression of foreign DNA and a single type of pIII protein molecule. In theory, the foreign peptide encoded by the insert gets displayed on all the five pIII molecules on a virion (though practically the host proteolytic enzymes remove the foreign peptide from some or even most of the pIII copies, especially if the foreign peptide is large). Likewise, the ‘type 8’ and ‘type 6’ vectors display foreign peptides on every copy of pVIII and pVI, respectively [46-48]. In a ‘type 88’ vector, the phage genome bears two VIII genes, which encodes for two different types of pVIII molecules, a recombinant one, bearing the foreign DNA and the wild-type one. This system allows the display of larger proteins on the phage surface. In the same way, the ‘type 33’ vector bears two genes III. A ‘type 8+8’ system is different in the manner that the two VIII genes are on separate genomes. The wild-type being on a phage (helper phage), while the recombinant one on the phagemid [28, 49]. The ‘type 3+3’ and the ‘type 6+6’ systems are reminiscent of ‘type 8+8’ systems.

Production of large quantities of antibodies becomes challenging due to the high complexity of the immunoglobulin molecules. The immunoglobulin G is a heterotetramer, consisting of two different polypeptide chains joined by the inter-chain disulfide bonds. The antibody light chain and heavy chain consist of several domains known as “immunoglobulin folds”, each of which requires intra-domains disulfide bond for stabilization. An oxidizing environment along with the complex apparatus is much needed for efficient and correct conformation of a large number of disulfide bonds together with folding and assembly of four chains to one IgG molecule. The in vitro hosts for the production or selection of antibodies, generally have less optimal conditions for expression of a correct and complete immunoglobulin molecule. Thus, many researchers opted for other smaller sized formats of antibodies, which retained the antigen-specificity and also provided significant advantages.

By far, the ‘Fv’ fragment is the smallest antigen-binding fragment of immunoglobulin retaining complete antigen binding site and consists of only the variable fragments of an antibody structure. A single-chain variable fragment (scFv) is a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL) of immunoglobulins (Figure 2), connected with a short linker peptide often to about 25 amino acids, which helps to improve the stability of the short antibody. The flexibility and solubility of the linker are due to the glycine and serine or threonine amino acid residues, respectively. The linker can either connect the N-terminus of the VH with the C-terminus of the VL or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin, despite the removal of the constant regions and the introduction of the linker. These molecules were created to facilitate phage display, where it is highly convenient to express the antigen-binding domain as a single peptide. As an alternative, scFv can be constructed directly from a sub-cloned heavy and light chains derived from a hybridoma. Since the scFvs are only half the size of a Fab fragment and still retain the original specificity of the parent immunoglobulin, they have significant applications in techniques, such as flow cytometry, immune-histochemistry, and as antigen-binding domains of artificial T cell receptors, etc. Unlike monoclonal antibodies, which are often produced in mammalian cell cultures, scFvs are more often produced in bacteria cell cultures such as E. coli, allowing an easy and faster production of antibodies in massive amounts.

The fragment antigen-binding (Fab fragment) is the antigen-binding region on an antibody, which is composed of a constant and a variable domain. The domains form the paratope — the antigen-binding site — at the amino-terminal portion of the monomer. The two variable domains facilitate binding with specific antigens. For example, Tao Y et al selected for Fabs against Wnt receptors from a phage-displayed synthetic library F [50]. Slezak T et al developed a modular antibody platform based on the phage display of Fab fragments [51].

A diabody comprises two scFvs which are connected with linker peptides, too short for the two variable regions to fold together (about five amino acids), forcing dimerization of the scFvs. Diabodies have a much higher affinity to their target, due to much lower dissociation constants.

Another recombinant antibody format, called as scFv-zipper, consists of two scFv antibodies, with same or different antigen specificities, linked with leucine zippers.

Thus, the phage-displayed recombinant antibodies (rAbs), which provide a direct link between the genotype and phenotype of the antibody to be displayed [52], have been displayed as functional binding molecules in different formats of antibody fragments [18, 30]. At present, the most widely used and applicable formats are scFv and Fab fragments, particularly expressed in eukaryotes.

Various types of libraries have been utilized for selection of specific antibodies: (1) antigen- or pathogen-specific library sourced from immunized animals, for example, leukocytes from an immunized llama [42, 53], (2) a single-pot or universal library without any specificity, (3) mutant libraries generated from mutated DNA sequences of a monoclonal hybridoma line or single phage clone [54, 55]. The single-pot universal libraries are extremely assorted and allow the selection of antibody fragments with binding affinities to a wide range of antigens [21] due to the size of their repertoire [56].

Polymerase chain reaction (PCR) has enormously simplified the cloning of variable region genes. The cDNA synthesized from mRNA isolated from B-lymphocyte population is used as a template for PCR- based amplification of VL and VH immunoglobulin genes. The mRNA can also be isolated from hybridoma cell lines, single clones obtained from the primary library. PCR amplification requires oligonucleotide primers complementary to the antibody gene sequences. Degenerate primer sets have been used to amplify almost all the possible sequences for the variable light or variable heavy chain genes for the generation of a library. Many of the primer sets have been reported with various target sequences for primer annealing [57-60].

A set of downstream primers analogous to sequences encoding parts of CH1 and CL chains have been used for amplification of the variable genes from antibodies of different subclasses. Assembly of the two variable domains into a single gene can be made possible by a DNA linker either in the VH-linker-VL format or the VL-linker-VH type [61, 62]. It has been noted that the expression level of scFv in N-termini-VL domain-linker-VH domain C-termini orientation was relatively high in comparison to the other format. Hence, to obtain high yields of the antibodies, insertion of the gene sequence coding for them should be in the desired frame in the phagemid vector. The most significant advantage offered by phagemid vectors is their small size (3–5 kb) and high efficiency for transformation in bacterial cells. In general, the recombinant phagemid is introduced into competent E. coli, followed by infection of the bacterial host cells with a helper phage (M13VCS or K07) to yield a recombinant phage that displays antibody fragments as fusions to one of the phage coat proteins.

Solemani Zadeh et al published a detailed protocol for efficient construction and screening of synthetic domain phage variable libraries (with 50-fold improvement of elution efficiency) [63]. Ferrara F et al combined phage and yeast display to identify monoclonal antibodies with desired binding properties [64].

Phage display based in vitro affinity selection of antibodies resembles the clonal selection of antibodies in vivo [65]. The target antigen is immobilized on surfaces based on the choice of the researcher, and the library is applied onto it, enabling affinity-based selection of highly reactive antibodies. The non-specific phage particles get eliminated during washing steps, and those which remain bound to the immobilized antigen, are eluted by addition of appropriate elution reagents. The antigen-specific phages can then be amplified in a proper strain of E. coli for their downstream applications or the next selection cycle facilitating further enrichment. This affinity selection process is known as bio-panning, and the final round of it can be determined by assessment of no more additional rise in the yield of eluted phages [65].

Bio-panning includes recurring rounds of phage binding to the target, washing to remove non-binding phage and elution steps to get binding phage and re-amplification of the phage pool enriched for specific binding phage. Any other methods which help in separation of specific from non-binding clones can be employed as selection methods. Most commonly in vitro selection method, such as bio-panning on immobilized antigen coated onto paramagnetic beads [66], plastic tubes or Petri dishes [54], columns with an antigen-activated matrix [18], or specifically coated BIAcore sensor chips [56], selection using biotinylated antigen [55] or direct selection on fixed prokaryotic cells respectively mammalian cells [67] have been reported.

A large fraction of non-specific phages get washed, and the phage clones bearing antibodies with specific binding properties to the matrix are eluted by using appropriate elution reagents. The fact that the M13 phage is stable at extremes of temperature and pH has been utilized successfully in experimenting with the choice of elution reagents. Acidic solutions, like HCl, glycine buffers [56, 68], basic solutions, like triethylamine [54], or even reducing agents have been used. In other cases, a competition elution by an excess concentration of antigen [24] or antibodies to the antigen has also been reported. Another gentle strategy has been the use of enzymes for cleavage of a protease site engineered between the antibody and pIII protein of the phage [21].

An in vivo selection involves the introduction of phage particles directly into animals of choice followed by the collection of target tissues. Such a method has helped in the research studies on cellular receptors and identification of peptides or antibodies with specificity for them [69, 70]. For a further selection of monoclonal antibodies, the phage clones obtained after final round are propagated individually and characterized for desired binding specificities [21].

Alfaleh et al, for example, used cell-based biopanning to isolate anti-CD117 antibodies, which were evaluated by flow cytometry and immunohistochemistry [71]. Kim et al panned a Fab phage display library against the spike protein of Middle East respiratory syndrome-coronavirus and generated highly specific Fab fragments and monoclonal antibodies, with the potential as diagnostic agents [72]. D Wrapp et al developed a VHH phage library against the S proteins of MERS-CoV and SARS-CoV-1 viruses using the pMECS vector [73].

The antibodies generated through recombinant methods hold superiority than the hybridoma produced [74], as the former can be improved for its qualities and modified as per the desired applications. Affinity maturation of rAbs has been reported [24, 75]. High-affinity antibodies against a broad spectrum of antigens have been derived from various immunized animals, such as llamas [53, 76], mice [77], chickens [78], rabbits [79], and also from sheep [80] and nonhuman primates [75].

Very high volumetric yields have been reported for cytoplasmic expression of rAbs in E. coli. Production of smaller antibody fragments has been reported up to grams per liter amounts in bacteria [81]. Expression of a functional rAb in E. coli was first reported by Skerra and Plückthun in 1988 [82], where both V chains were translocated into the periplasmic space of the bacterial cells. The oxidizing environment in the compartment allowed correct conformation of the functional Fv fragment by the formation of appropriate disulfide bonds. The approach was also utilized for the expression of first time functional Fab fragments in E. coli [83]. The expression of recombinant antibodies in reducing cytoplasm more often than not results in non-functional aggregates [84].

On the other hand, expression of functional antibody fragments in cytoplasm most of the times requires complete denaturation and refolding [85]. However, successful production of functional scFvs in the cytoplasm of E. coli, not requiring refolding has also been reported [86-88]. The type of host strain and the specificity of the antibodies are known to affect the expression of functional rAbs in E. coli. A good number of rAbs have been produced in the periplasm of E. coli using N-terminal leader sequences targeting the periplasmic Sec pathway [89-91]. Following the expression of the rAbs, the molecules are isolated from the periplasmic fraction [92, 93], or culture supernatants [94, 95]. The expression, periplasmic transport, accurate folding and assembly of two different polypeptide chains is highly necessary for the expression of rAbs in the Fab format. The bi-cistronic vectors with the first cistron encoding the light chain and the second cistron encoding the Fd fragment (consisting of VH and CH1) were found to be optimal for such requirements [92]. Production of a full size glycosylated IgG in E. coli has also been reported [96], only after the fine-tuning of the translation strength of both IgG chains, by the introduction of silent mutations into the translation initiation region of the leader sequence which facilitated optimal periplasmic transport [96].

  • Origin, diversity, and parallel selection: A variety of sources can be used for generation of large diversity antibody libraries. High diversity allows the selection of antibodies against multiple targets simultaneously, thereby saving considerable time, efforts and costs associated with monoclonal antibody (mAb) generation.
  • Ease of development: The time required for construction of libraries, the selection of mAbs with desired specificities, and optimization of assays based on mAbs are much less than the conventional fusion methods.
  • Specificity/ affinity: Direct relation of the genotype to the phenotype of the developed antibody.
  • Formats: Different variants can be generated depending upon the downstream applications of mAbs.
  • Scope of improvement: Molecular methods allow the scope of perfection for the mAbs either before or after development. Affinity maturation strengthens the binding efficacy of antibodies to the target antigen, providing mAbs a higher affinity, and specificity towards the target. The recombinant mAbs can be conjugated to reporter enzymes for direct detection.
  • Stability: The phage display libraries are very stable, even for an indefinite period, and can be revived after long-term storage, by infection of bacterial cells.
  • Concentration: The large diversity libraries often contain displayed antibodies at low molarities.
  • Library complexity: The number of antibody display clones is less than the recombinants, which may at times interfere with the selection of mAbs directed towards rare targets.
  • Selection bias: Biological selection is reported to be biased against cysteine residues in odd numbers, positive charged or specific residues at fixed positions. Further, the selection is limited to the interaction of target antigen and the antibody.
  • Biological efficacy: The application of monoclonal antibodies is limited for use as therapeutics in organisms different than their origin.

Hence, high yield expression of rAbs in E. coli can be achieved only after addressing various issues like host toxicity, vector mutation, and plasmid loss. Such decisive constraints can be addressed by the promoter system, plasmid copy number, etc. [97]. One modification is the growth of bacterial cells between the temperature range 20 to 30°C rather than at 37°C to steer clear of the overloading of E. coli’s secretory pathway. Nevertheless, very high yields of antibody fragments in E. coli can be facilitated by high cell density fermentation in bioreactors. Cell-wall-less L-forms of the Gram-negative bacterium Proteus mirabilis have also been experimented for the production of miniAbs and scFvs [98, 99], to obtain high yields of functional scFvs [99].

The expression of recombinant antibody fragments (scFv, Fab) has been reported in numerous microorganisms, especially in selected strains of E. coli. The choice for E. coli host strains such as BL21 and their derivatives amounts to the fact that the antibodies can be produced economically in bulk amounts. The soluble antibody fragments can be expressed in the culture supernatant, bacterial periplasm, and/or inside the bacterial cytoplasm [100-102]. Though the secretion of the rAbs in the periplasm and the media provide a less overall yield, the oxidative environment outside the cell cytoplasm confers proper formation of disulfide bonds required for natural folding of antibody domains.

Antibodies expressed into the periplasmic space are extracted by osmotic shock. RAbs expressed in considerable amounts in the cell cytoplasm frequently results in extensive aggregation and formation of inclusion bodies, which can be purified from the other cellular components. The aggregated antibody mass can be made soluble by adding strong denaturants for instance urea or guanidium hydrochloride including some oxido-reduction system. The native antibody fragments are recovered by refolding upon removal of the denaturants. Guidelines for antibody refolding have been extensively reviewed [103].

Apart from E. coli host cells, the rAbs have been expressed in mammalian systems [104, 105], insect cells [106, 107], yeasts like Saccharomyces cerevisiae [108], Schizosaccharomyces pombe [109], Hansenula polymorpha [110], and also in Pichia pastoris [111] and in bacterial host strains such as Bacillus brevis [112]. Generally, the choice of expression hosts (bacteria, yeast, plants, insect or mammalian cells) must be reliable as per the final application of the antibody molecule.