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¿Qué diferencia en el radio de giro de las proteínas puede considerarse significativa?

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En las simulaciones de dinámica molecular de proteínas, el radio de giro se utiliza a menudo para evaluar la compacidad de una proteína.
Al comparar el radio de giro de dos proteínas, ¿qué diferencia se puede considerar significativa 1 angstrom, 5 angstrom, 10 angstrom? Significado significativo: sí, definitivamente es más compacto o no, definitivamente no es más compacto. He estado buscando pero no puedo encontrar ninguna referencia relacionada con eso.


¿Qué diferencia en el radio de giro de las proteínas puede considerarse significativa? - biología

El papiloma invertido (IP) es un tipo de tumor en el que las células epiteliales de la superficie crecen hacia abajo hacia el tejido de soporte subyacente. La vejiga, la pelvis renal, el uréter, la uretra, la nariz y los senos paranasales son áreas posibles de aparición de IP [1]. Epistaxis y obstrucción nasal con dolor facial o cefalea atacada cuando la nariz o la mucosa de los senos nasales portan el IP [2]. Aunque la PI que se origina en la membrana respiratoria delimitada pertenece a una neoplasia epitelial benigna, la invasividad local, la mayor tasa de recurrencia y la transformación maligna hacen que sea difícil de tratar [3]. La tasa de transformación maligna es 5 & # x201310 & # x25 y muchos de ellos son sincrónicos y se presentan con carcinoma de células escamosas [4]. El PCNA (antígeno nuclear de la célula proliferante) actúa como expresión de antígeno en los núcleos celulares en la fase de síntesis de ADN durante el ciclo celular y considera el pronóstico del cáncer, pero la relación con IP sigue siendo controvertida [5].

La ciclina y la quinasa dependiente de ciclina (CDK) participan en las funciones importantes del ciclo celular durante la proliferación y afectan a las diferentes fases del ciclo celular [6 & # x2013 9]. El CDK1 es un iniciador muy importante para la proliferación celular y el factor de transformación maligna [10]. Por el contrario, los inhibidores de p21, P27 y CDK limitan las CDK y detienen el ciclo celular [8]. La p21 es un inhibidor de las CDK de la fase celular G1 que restringen la entrada de las células a la fase S. El p27 también podría unirse a CDK y actuar como CDKI como p21. El p27 interactúa con los complejos ciclina E-CDK2, ciclina A-CDK2 y ciclina D1-CDK4, afectando la proliferación celular y la apoptosis [6, 7].

El antígeno marcador de proliferación Ki-67, detectado con el anticuerpo monoclonal MIB-1, se expresa en todas las fases celulares G1, S, G2 y M, excepto G0 [8]. La expresión de Ki-67 también se correlacionó con el comportamiento del tumor, el grado patológico del tumor y la recurrencia temprana en varios carcinomas [11 & # x2013 15].

En cuanto a las IP transformadas o sincrónicas con cánceres, también realizamos el estudio IHC p16, p53, Ki-67 y PLUNC (paladar, pulmón y proteína clon del epitelio nasal). La p16 es una proteína supresora de tumores que desacelera la fase de células G1 a S y previene la transformación maligna [8]. PLUNC es un material inmune innato que tiene un efecto anticancerígeno para el cáncer de nasofaringe, pero ningún estudio reveló su relevancia para los IP nasosinusales [16].

Se realizaron encuestas PCNA, p53, p21, p27 y Ki-67 para ver si estaban correlacionadas con la extensión del tumor y el resultado del tratamiento de las IP nasosinusal [8].

El objetivo de este estudio es investigar las funciones de los reguladores del ciclo celular p53, p21, p27, el marcador de proliferación Ki-67, p16, PCNA y el material inmune innato PLUNC en la recurrencia y la transformación maligna de los IP nasosinusal. También estudiamos si los posibles factores predichos de Ki-67, PCNA y p27 se correlacionan con las CDK mediante simulación computacional para finalmente dar una posible explicación al mecanismo de Ki-67, PCNA y p27 de las CDK en el pronóstico de las IP.

Desde el Hospital de la Universidad Médica del Departamento de China desde enero de 2000 hasta junio de 2010, se recopilaron y revisaron 60 casos de PI nasosinusales y 10 casos de PI con transformación de carcinoma de células escamosas a partir de los registros médicos de manera retrospectiva. Todos los tejidos fijados en formalina 10 & # x25 y preparados en parafina se utilizaron para estudios de IHC mediante el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa. Anticuerpos monoclonales de ratón (mAb), anti-p16 (Neomarcadores, DCS-50, 200 & # x2009mg / L), anti-p21 (Neomarcadores, MS 387-P, 200 & # x2009mg / L), anti-p27 (Neomarcadores, MS 256 -P, 200 & # x2009mg / L), anti-p53 (Neomarcadores, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarcadores RM 9106-S) PCNA y PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.) Se utilizaron para inmunohistoquímica mediante el método estreptavidina-biotina peroxidasa [11]. Se utilizó xileno para desparafinar todas las secciones de tejido y luego se rehidrató con una serie de alcohol y finalmente se saturó en agua destilada. A continuación, el tejido se cambió a una solución salina tamponada con fosfato con la adición de una solución al 0,3% de peroxidasa de hidrógeno para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena a temperatura ambiente durante 10 min, luego se enjuagó el tampón Tris. A continuación, las secciones se hirvieron en un horno microondas durante 15 & # x2009 min en solución tampón de citrato (10 & # x2009 mmol / L pH, 6,0). Los anticuerpos primarios p53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67 y PLUNC se aplicaron uno por uno durante 60 & # x2009 min a temperatura ambiente [11].

Luego agregamos el anticuerpo de unión y el complejo de estreptavidina peroxidasa (DAKO LSAB Kit, K-0675 Carpinteria, CA) durante 15 & # x2009min a temperatura ambiente. El tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB) 0,05 & # x25 se usó durante 15 & # x2009 min para teñir el tejido y finalmente se lavó dos veces con el tampón Tris [8, 11].

Las secciones se tiñeron por contraste con hematoxilina Mayer & # x2019s después de lavar con agua desionizada. Los núcleos inmunoteñidos se cuantificaron en cada caso. Todo el recuento se realizó bajo un microscopio óptico estándar en un campo de 1000x para evaluar los núcleos positivos / número total de células. Se contaron diez campos o al menos 500 células en cada sección. Las secciones tumorales se consideraron negativas si la tinción estaba ausente o estaba presente en & # x3c10 & # x25 de las células tumorales. Se dio una puntuación de 1+ cuando 10 & # x201330 & # x25 de las células fueron positivas a la reacción. Se dio una puntuación de 2+ cuando 30 & # x201350 & # x25 de las células fueron positivas a la reacción. Se dio una puntuación de 3+ cuando & # x3e 50 & # x25 de las células fueron positivas a la reacción, respectivamente (Tablas 1 y 2) [17]. La significación estadística se analizó mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson o la prueba exacta de Fisher para el análisis univariante y la prueba de regresión logística múltiple se utilizó para el análisis multivariado. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando el valor de p era & # x3c 0,05.

La correlación de los resultados de IHC con la recurrencia múltiple en univariante por el cuadrado de Pearson Xi y el análisis de regresión logística multivariante.

La correlación de los resultados de IHC con la transformación maligna en univariante por el cuadrado de Pearson Xi y el análisis de regresión logística multivariante.

El acoplamiento proteína-proteína se llevó a cabo mediante el programa ZDOCK [18] para analizar los tres posibles factores pronósticos de transformación maligna unida a CDK1. Para traducir el posible mecanismo a lo que encontramos en este estudio, calculamos la interacción de Ki-67, p27 y PCNA a CDK1 mediante biología computacional. Además, utilizamos el programa GROMACS 4.5.5 [19] para observar la estabilidad de los complejos después de las predicaciones vinculantes de ZDOCK. El entorno del sistema MD se estableció en el modelo de agua TIP3P con una caja de agua de distancia de 1,2 & # x2009nm que contenía iones de Na y Cl en la concentración de NaCl 0,145 & # x2009M para la neutralización del sistema. Primero, establecemos pasos de 5,000 ciclos en el algoritmo de descenso más empinado para minimizar la energía. En segundo lugar, se emplearon las condiciones de dinámica de temperatura constante (tipo NVT) para proporcionar simulación MD para el equilibrio y se realizaron en un período de tiempo de 1 & # x2009ns. En el paso final, la dinámica de presión y temperatura constante (tipo NPT) se estableció para la producción en un período de tiempo de 5000 & # x2009ps. La temperatura del sistema durante el proceso de simulación se estableció en 310 & # x2009K. Para el análisis de trayectoria, empleamos el software GROMACS 4.5.5 para contar la desviación cuadrática media (RMSD) y el radio de giro (Rg), respectivamente. Se analizaron series de datos de conformación MD cada 20 & # x2009ps de todas las series de producción.

Hubo un total de 55 hombres y 15 mujeres incluidos en este estudio. Sesenta de ellos son PI y los otros 10 son PI nasosinusales recogidos con transformación maligna. La edad es de 45,64 & # xb1 14,45 años y van desde los 25 a los 78 años. Las tinciones revelaron niveles significativamente elevados de PLUNC, pero niveles reducidos de Ki-67, p53, p21 y p27 en pacientes con recurrencia múltiple de IP (Tabla 1). También encontramos el PCNA elevado, Ki-67 y p27 en los IP nasosinusales con transformación de carcinoma de células escamosas en comparación con los IP nasosinusales solos sin malignidad sincrónica (Tabla 2). La expresión elevada de PLUNC se correlaciona con la cirugía de múltiples senos nasales en los pacientes con IP nasosinusal. Sin embargo, el nivel de expresión de PLUNC no se correlaciona con la transformación maligna de IP a SCC. También mostramos la expresión de IHC de diferentes niveles para PCNA, Ki-67, p27 y PLUNC en las Figuras 1, 2, 3 y 4. La resonancia magnética o la tomografía computarizada preoperatoria se realizaron a todos los pacientes como se muestra en las figuras 5 y 6.

La expresión de PCNA IHC (a) +++ y (b) 0 en IP.

La expresión de Ki67 IHC (a) +++ y (b) 0 en IP.

La expresión de p27 IHC (a) +++ y (b) 0 en IP.

La expresión de PLUNC IHC (a) +++ y (b) 0 en IP.

Vista sinoscópica de papiloma invertido nasosinusal con transformación maligna.

RM sinusal (vista coronaria) y tomografía computarizada sinusal (vista axial) de papiloma invertido nasosinusal con transformación maligna.

La tinción inmunohistoquímica Ki-67 elevada se encuentra tanto en IPs nasosinusales con múltiples recurrencias y transformación maligna en nuestro análisis univariante y multivariante mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson & # x2019s y la prueba de regresión logística múltiple como se muestra en las Tablas 1 y 2 y la Figura 2 (a ). Por lo tanto, un índice Ki-67 alto podría considerarse un factor importante para el pronóstico y los marcadores de predicción de malignidad. Incluso podríamos combinar la encuesta del nivel de expresión de IHC de Ki-67 y PCNA significativamente aumentado y el nivel de p27 más bajo para predecir la tendencia de transformación maligna más alta en pacientes con IP nasosinusal en nuestra encuesta.

En consecuencia, hicimos algunos análisis de acoplamiento con estudios finales de dinámica molecular entre lo que encontramos los factores de pronóstico de PCNA y CDK1, Ki-67 y CDK1, y p27 y CDK1 que mostraron todos un acoplamiento estable en la Figura 7 y su puntuación de acoplamiento también se muestra en Programa ZDOCK. El ZDOCK generó las 10 mejores poses de acoplamiento de CDK1 y Ki-67, CDK1-p27 y CDK1-PCNA. Elegimos la mejor puntuación de acoplamiento para analizar la estabilidad de la interacción proteína-proteína. El Ki-67, p27 y PCNA para la puntuación de unión a CDK1 son 20,92, 21,72 y 24,32, respectivamente, según el programa ZDOCK. Los residuos clave son Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 y Val15, que fueron los principales dominios de unión para Ki-67 y p27 a la CDK1 que se muestra en la cinta roja (Figura 7). Además, hicimos análisis de MD para estos residuos clave para ver la interacción de estas tres proteínas con la CDK1. Después de la simulación MD del complejo CDK1 con Ki-67, p27 y PCNA, realizamos el análisis RMSD para tiempos de simulación de 5000 & # x2009ps. Se revela que las tres proteínas (Ki-67, p27 y PCNA) tienen una fluctuación estable después de un tiempo de simulación de 1000 & # x2009ps (Figura 8).

Las mejores poses de acoplamiento de CDK1 (verde) con la proteína diana (azul): (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA. Los diez mejores complejos proteína-proteína con puntuaciones ZDOCK fueron generados por el programa ZDOCK. La puntuación ZDOCK más alta de Ki-67, p27 y PCNA son 20,92, 21,72 y 24,32, respectivamente. Los residuos de unión clave de Ki-67 y p27 están coloreados en rojo, y los residuos clave incluyen Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 y Val15.

El análisis RMSD de todos los átomos de los complejos de CDK1 con (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA durante los tiempos de simulación de 5000 & # x2009ps. Todos los complejos tienden a una fluctuación estable después de un tiempo de simulación de 1000 & # x2009ps.

En la Figura 9, calculamos la rotación del radio de las proteínas para un período de tiempo de simulación de 5000 & # x2009ps. Los tres complejos tienden a valores bajos de radio de giro y fluctuación estable en toda la simulación de MD, lo que indica los complejos compactados entre cada una de las estructuras proteicas. Se utilizó el método SASA (área de disolvente) para la naturaleza hidrófoba de los tres complejos, estos tres se volvieron fluctuantes estables y también mostraron un cambio hidrófobo estable entre cada interacción proteína-proteína (Figura 10). Además del cálculo de energía total de los sistemas MD para cada uno de los tres complejos durante los tiempos de simulación de 5000 & # x2009ps, todos tenían una variación de energía estable en el rango de & # x22129.27 & # xd7 10 5, & # x22129.30 & # xd7 10 5 y & # x22121.66 & # xd7 10 6, respectivamente (Figura 11). El resultado del análisis de energía revela que todos los sistemas de simulación son estables durante 5000 & # x2009ps. En el análisis de fluctuación de residuos, medimos el valor de RMSF de todos los residuos para los tres complejos (Figura 12). En la validación RMSF del complejo CDK1-Ki67, se observan fluctuaciones significativas en los residuos de 38 a 43 de CDK1, que tiene un gran cambio durante la simulación de MD (Figura 12 (a)). También se observó una variación significativa en los residuos de 25 a 40 en la estructura de la proteína p27 durante la simulación de MD, lo que denota los grandes cambios en esta región. Por el contrario, hay menos variación de RMSF en los residuos de 100 a 200 en la estructura de la proteína PCNA durante la simulación de MD. Por lo tanto, hubo menos cambio de RMSF durante la simulación de MD en PCNA que Ki-67 y p27.

El radio de giro de los complejos de CDK1 con (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA durante los tiempos de simulación de 5000 & # x2009ps. Los valores bajos del radio de giro indican los complejos compactados entre dos estructuras de proteínas.

El análisis SASA (área de disolvente) de la conformación de todos los complejos para la definición hidrófoba durante 5000 & # x2009ps, la fluctuación estable indicó que no había cambios claros entre las interacciones proteína-proteína.

Cálculo de energía total de sistemas MD de (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA durante 5000 & # x2009ps tiempos de simulación, cada una de las fluctuaciones promedio es & # x22129.27 & # xd7 10 5, & # x22129. 30 & # xd7 10 5 y & # x22121.66 & # xd7 10 5, respectivamente.

Análisis de RMSF de residuos de proteínas en (a) CDK1 y Ki-67, (b) CDK1 y p27, y (c) CDK1 y PCNA durante el tiempo de simulación de 5000 & # x2009ps. El alto valor de la fluctuación de RMSF denota una fuerte variación de la estructura de la proteína en toda la simulación de MD.

Sin embargo, el análisis de migración reveló que PCNA tenía una gran distancia entre CDK1 en comparación con Ki-67 y p27 durante el estudio de simulación MD de 5000 & # x2009ps. Aunque encontramos la mayor distancia entre PCNA y CDK1 (Figura 13 (a)), su unión estable se mostró en la Figura 12 mediante análisis RMSF. Además, el desplazamiento cuadrático medio (MSD) de PCNA tiene una migración menor (Figura 13 (b)). Además, analizamos los residuos clave de CDK1 para la unión de Ki-67 y p27. El residuo de unión clave incluye Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 y Val15 en el ángulo de diedros de la estructura de la proteína Ki67-CDK1 durante el tiempo de simulación de 5000 & # x2009ps. Todos los residuos de unión son estables durante toda la simulación de MD. Sin embargo, solo hubo ángulos diedros estables en Gly9, Ser10, Leu12 y Val15 en los complejos proteicos p27-CDK1 durante todo el tiempo de simulación de MD. Finalmente, encontramos que todos los residuos de unión clave, incluidos Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 y Val15 en la estructura de la proteína PCNA-CDK1, tenían un ángulo de diedros de unión estable durante toda la simulación de MD, no se encontraron cambios mayores durante el proceso de Unión de PCNA a CDK1 (Figura 14). Los análisis de conglomerados se utilizaron para seleccionar la estructura representativa entre todos los marcos MD. Para el ensayo de comparación de instantáneas, la estructura representada seleccionada de los últimos grupos de agrupamiento para todos los marcos MD de los complejos CDK1 de Ki67, P27 y PCNA desplazados a 4860 & # x2009ps, 2740 & # x2009ps y 3880 & # x2009ps, respectivamente, durante el tiempo de simulación de 5000 & # # x2009ps (Figura 15). El estudio de comparación instantánea para CDK1 y las proteínas diana para Ki-67, p27 y PCNA se muestran en la Figura 16. Encontramos que los residuos de CDK1 de 38 a 43 en CDK1 se están acercando a Ki-67 de 0 & # x2009ps a 4860 & # x2009ps (Figura 16 (a)). El resultado se correlaciona con el análisis de RMSF debido a las altas fluctuaciones en los residuos de 38 a 43 de CDK1 se une a Ki-67. Para el análisis de instantáneas CDK1-p27, p27 se acerca a CDK1 de 0 & # x2009ps a 2740 & # x2009ps. Los hallazgos también se correlacionan con el análisis de RMSF debido a las altas variaciones en los residuos de 25 a 40 de p27 se une a CDK1 (Figura 16 (b)). Solo pudimos encontrar el pequeño cambio de un bucle de PCNA (azul) alejándose de CDK1 (verde) a 3880 & # x2009ps en residuos de 100 a 200 en la interacción de PCNA y CDK1 (Figura 16 (c)). Este resultado también se correlaciona con el análisis de RMSF para pequeñas fluctuaciones en los residuos de 100 a 200 de PCNA se une a CDK1.

El análisis de migración de complejos durante el tiempo de simulación de 5000 & # x2009ps: (a) la distancia entre CDK1 y las proteínas acopladas durante todo el tiempo de MD y (b) el análisis de desplazamiento cuadrático medio (MSD) para todos los complejos de CDK1, el alto valor de MSD denota la gran distancia de migración de proteínas forma la posición inicial.

El ángulo diedro de los residuos de unión clave: (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14 y (g) Val15 en la estructura de la proteína CDK1 durante el tiempo de simulación de 5000 & # x2009ps. Los ángulos de los diedros se calcularon para los complejos de CDK1 con proteínas de unión a la diana: Ki-67, p27 y PCNA durante todo el tiempo de simulación de MD.

Análisis de grupos de todas las CDK1 y las proteínas de unión: (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA durante el tiempo de simulación de 5000 & # x2009ps, las estructuras representadas se seleccionaron de los últimos grupos de agrupamiento para todos los marcos MD de CDK1 complejos. La estructura representada del complejo Ki-67, p27 y PCNA se desplazó a 4860 & # x2009ps, 2740 & # x2009ps y 3880 & # x2009ps, respectivamente.

Comparación entre la instantánea inicial (0 & # x2009ps) y la conformación representada para todos los complejos CDK1. (a) Uno de los bucles CDK1 (verde) se acercó a Ki-67 (azul) a 4860 & # x2009ps. (b) La estructura de la proteína de p27 (azul) se unió a CDK1 (verde) más fuertemente a 2740 & # x2009ps. (c) Uno de los bucles PCNA (azul) se alejó de CDK1 (verde) a 3880 & # x2009ps.

Para resumir los resultados de nuestro estudio y revisiones de la literatura, en la Figura 17 se muestra el mecanismo molecular de Ki-67, p27 y PCNA que interactúan con CDK1 para la proliferación celular y la transformación maligna en pacientes con IP nasosinusal.

El mecanismo molecular de Ki-67, p27 y PCNA en el ciclo celular.

Aunque los papilomas invertidos rara vez ocurren en el tracto nasosinusal, la naturaleza recurrente fácil y la transformación maligna a menudo preocupan a pacientes y médicos.Se necesita un seguimiento regular de por vida para la detección temprana de la recurrencia o el cambio maligno y podría conducir a un mejor control de la enfermedad en los pacientes con PI [9, 20].

El Ki-67 promovió el inicio de la fase G1 a partir de G0 en las células IP, y persistió la expresión del ciclo celular en la fase de proliferación. Ki-67 es una proteína que afecta el ciclo celular en la fase de proliferación de G1-S-G2-M excepto la fase G0 [8, 11, 14]. En la literatura que informa sobre las mutaciones p53, p63, p21 y p27 inducidas por IP nasosinusal con transformación SCC, todavía hubo debates [6, 11, 14]. Ki-67 se informó recientemente sobre la aparición de neoplasias nasosinusales [21], el comportamiento agresivo del tumor se correlacionó con un índice Ki-67 más alto y causó epitelio nasal a displasia grave e incluso carcinoma de células escamosas [22]. El Ki-67 elevado podría incluso encontrarse en los carcinomas de células escamosas contenidos sincrónicamente. Ki-67 también afectará a p21, p27 y CDK [8, 11, 12, 14]. Sin embargo, no pudimos concluir si la disminución de p27 es causada por una expresión elevada de Ki-67 en los tejidos de los PI nasosinusales. Es necesario realizar más estudios para dilucidar la relación entre Ki-67 y P27.

La función de supresión tumoral de p53 está relacionada con muchos cánceres informados por Katori et al. y Gujrathi et al. [22, 23]. Sugirieron que la prueba de p53 puede ayudar a descartar lesiones de papiloma con potencial de displasia o carcinoma; sin embargo, no lo encontramos significativo en el análisis multivariado. Esto se debe al número limitado de pacientes de nuestro estudio. Sin embargo, no sólo p53 sino también p63 se expresa elevado en IP con transformación maligna [11].

Se informó que el aumento de la actividad proliferativa con una expresión elevada de Ki-67 de las células tumorales es un marcador pronóstico importante en muchos tumores humanos; también es importante en la recurrencia y cancerización de los PI. Especialmente, Ki-67 sospecha que afecta directamente el ciclo celular durante la fase de proliferación y podría interactuar con los genes supresores de tumores p53, p21 y p27 y modula el ciclo celular al afectar el punto de control de la fase G1 [8, 24, 25]. El Ki-67 encontró recientemente que tiene interacción entre CDK1 en la estructura natural y biología molecular [26] y CDK1 participa en el papel principal en la proliferación celular e incluso en la transformación maligna [10]. Sospechamos que el Ki-67 no solo inició la entrada de las células IP en la fase G1 del ciclo celular, sino que también provocó una transformación maligna en los núcleos celulares al afectar al CDK1.

Los roles clínicos de p21 y p27 en la cancerización de SCC de cabeza y cuello todavía son debates, pero encontramos que el nivel más bajo de p27 también se reveló en IPs nasosinusales con transformación maligna en nuestro estudio. Aunque hubo pocos estudios de p21 y p27 que informaran la correlación de los IP humanos con la cancerización, los debates aún permanecían. Algunos estaban con Oncel et al. [11, 27] y algunos estaban en contra [25, 28] observado.

Además de Ki-67, también encontramos el PCNA, un predictor de transformación maligna de IP en la colaboración con CDK1. En nuestros IP con transformación maligna, tanto PCNA como Ki-67 fueron elevados por tinciones IHC.

Como mostró la expresión elevada de PCNA en IP con transformación maligna de nuestra encuesta, sospechamos que el PCNA es un factor importante para inducir la cancerización en pacientes con IP nasosinusal. Recientemente, también se ha encontrado el PCNA elevado en IP en comparación con los pólipos nasosinusales por Mumbuc et al. [3]. El PCNA podría interactuar con CDK1 y promover la entrada celular al ciclo celular para la consecuente proliferación y cancerización.

Finalmente, encuestamos el PLUNC a los PI nasosinusales con cancerización, ya que con frecuencia se informa que causa la formación de cáncer nasofaríngeo. En nuestro estudio anterior, la expresión de PLUNC se redujo en la sinusitis por pseudomonas en el estado de enfermedad crónica [29]. El PLUNC también se correlacionó con la rinosinusitis crónica con colonización de múltiples bacterias [17]. Y, además, se suponía que el PLUNC también tenía una función antiinfecciosa y antibiofilm [30, 31]. Porque se suponía que tenía anticancerígeno del carcinoma nasofaríngeo [32], pero no encontramos correlación de los PI nasosinusales con la transformación del SCC. Por el contrario, solo pudimos encontrar la expresión elevada de PLUNC en pacientes con IP nasosinusal con múltiples recidivas y cirugía de revisión del seno. El mecanismo adicional y las razones de la expresión elevada de PLUNC y las recurrencias múltiples deberían estudiarse más a fondo en el futuro.

El diseño de fármacos asistido por computadora (CADD) se puede utilizar para investigar más a fondo la investigación clínica o de enfermedades, que incluye investigación de enfermedades [33], estudios de factores de riesgo [34], informes de casos y mecanismos moleculares. En nuestros resultados de acoplamiento y dinámica molecular de PCNA, Ki-67 y p27 a CDK1, encontramos que los tres tenían acoplamiento estable a CDK1. Y se suponía que la p27 tenía una interacción más estable con la CDK1 para funcionar como inhibidor de los IP nasosinusales con cancerización. El PCNA y Ki67 se consideraron promotores y promueven la proliferación celular y la cancerización en IPs nasosinusal.

En conclusión, este es un primer estudio que muestra que Ki-67, PCNA y p27 son importantes en las recurrencias de IP y la cancerización a través de CDK1. Y también somos los primeros en encontrar una expresión PLUNC elevada en IPs nasosinusales de recurrencia múltiple. Sin embargo, aún se justifica un estudio adicional del mecanismo en el futuro. Los estudios computacionales actuales son todos compatibles con nuestros estudios de laboratorio húmedo, lo que hace que nuestro estudio sea más confiable y podría aplicarse al tratamiento futuro de pacientes con dicha enfermedad. Por lo tanto, los pacientes con IP nasosinusal y Ki-67 expresado, PCNA y p27 disminuido deben considerarse que tienen mayores posibilidades de transformación maligna y deben seguirse más de cerca en la práctica clínica [35].


Clonación molecular y caracterización de un (Lys)6-Etiquetado Hemoglobina I reactiva a sulfuro de Lucina pectinata

Se fusionó una etiqueta de poli-Lys al Lucina pectinata secuencia codificante de hemoglobina I (HbI) y purificada mediante un proceso rápido y eficaz. La HbI es una hemoproteína que se une al sulfuro de hidrógeno (H2S) con alta afinidad y se ha utilizado para comprender las reacciones fisiológicamente relevantes de esta molécula de señalización. El (Lys)6La construcción rHbI etiquetada se expresó en E. coli y purificado por inmovilización en una matriz de intercambio catiónico, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. La identidad, estructura y función del (Lys)6rHbI marcadas con etiquetas se evaluaron mediante espectrometría de masas, dispersión de rayos X pequeña y amplia, espectroscopía óptica y análisis cinético. Los resultados espectroscópicos y de dispersión mostraron que el (Lys)6La rHbI etiquetada es estructural y funcionalmente análoga a la proteína nativa, así como a la (His)6-etiquetado rHbI. Estudios de cinética con H2S indicó que la asociación (k sobre) y disociación (k apagado) las constantes de velocidad fueron 1.4 × 10 5 / M / sy 0.1 × 10 −3 / s, respectivamente. Estos resultados confirmaron que el (Lys)6rHbI marcado se une a H2S con la misma alta afinidad que su homólogo.

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Resultados

La digestión con tripsina proporciona péptidos estables resistentes a la digestión (PRD) para todas las isoformas de conglutina.

Las isoformas de conglutina de maní, Ara h 2.02, Ara h 2.01 y Ara h 6, se digirieron mediante incubación con tripsina. La Fig. S1 complementaria muestra el curso temporal de la digestión tal como se visualiza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en condiciones reductoras. Los péptidos que se originan en la digestión permanecen estables hasta el punto final de 180 minutos de nuestro estudio para todas las isoformas de conglutina. Los DRP de la isoforma Ara h 2.02 constan de dos grupos, con masas moleculares aparentes de aproximadamente 12 kDa y 10 kDa. Los DRP de Ara h 2.01 exhiben un peso molecular aparente de aproximadamente 10 kDa y un examen cuidadoso de esta área revela dos bandas que migran conjuntamente. Los DRP de Ara h 6 migran como bandas de aproximadamente 9 kDa y 5 kDa. Para una caracterización adicional, se utilizaron DRP preparados por digestión durante 90 minutos. En condiciones fisiológicas que utilizan pepsina a pH bajo seguida de tripsina / quimotripsina a pH neutro, las conglutinas de maní también son resistentes a la proteólisis. Los DRP resultantes tienen pesos moleculares similares a los analizados en nuestro estudio, y aún pueden unirse a IgE (datos no mostrados), de acuerdo con otros estudios 13,22.

Identificación de secuencias de PRM a partir de isoformas de conglutina de maní

Se registraron espectros de masas de alta resolución para DRP no reducidos, reducidos y alquilados de las isoformas Ara h 2, Ara h 2.02 y Ara h 2.01 y Ara h 6. Espectros ESI-MS de DRP no reducidos, reducidos y alquilados se muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. Para los DRP no reducidos, se observa una amplia gama de iones m / z con estados de carga más altos (de +8 a +17), que representan masas con masas moleculares & gt13 kDa. Los espectros de masas para estos DRP no reducidos también contienen iones m / z con estados de carga más bajos (de +2 a +6), que representan las masas & lt5 kDa. Los DRP reducidos y alquilados dan un rango de estado de carga de +4 a +12, lo que representa las masas de 2.2 a 10 kDa. En los espectros de los DRP reducidos y alquilados, se puede observar que un ion en estado de carga da varias masas m / z, desviándose 57 Da entre sí. Esto se relaciona con la alquilación parcial de cisteínas. La Tabla complementaria S1 resume las masas encontradas para los PRD, tanto de forma no reducida como reducida y alquilada. La tripsinólisis de Ara h 2.02 y 2.01 dio lugar a PRM de masas moleculares de 16,2 a 17,6 kDa, así como a algunos péptidos pequeños de 2 a 4 kDa (véase la Tabla complementaria S1). Ara h 6 mostró PRD de masas moleculares de 13,5 a 14,1 kDa. Teniendo en cuenta la modificación postraduccional conocida, el procesamiento postraduccional y la combinación de las masas de DRP intacto y reducido y alquilado utilizando el mapeo de enlaces disulfuro 19, las masas experimentales se vincularon a masas teóricas (ver Tabla complementaria S1).

Los DRP no reducidos se sometieron a ESI-MS para determinar masas de péptidos individuales. Los péptidos pueden unirse mediante enlaces disulfuro. Panel a: DRP de Ara h 2.02 Panel b: DRP de Ara h 2.01 Panel c: DRP de Ara h 6.

Los DRP reducidos y alquilados se sometieron a ESI-MS para determinar masas de péptidos individuales. Panel a: DRP de Ara h 2.02 Panel b: DRP de Ara h 2.01 Panel c: DRP de Ara h 6.

Se usaron perfiles de electroforesis bidimensional (2-DE) de DRP de isoformas de conglutina individuales (ver Fig. Complementaria S2) para asignar puntos, donde diferentes valores de pI de DRP proporcionaron instrucciones adicionales para la verificación de péptidos. La Figura 3 proporciona una descripción general de las secuencias de péptidos que se encuentran en los DRP de las tres conglutinas de maní. Después de la digestión, hemos detectado proteínas con un enlace peptídico hidrolizado en el Arg.59/71 para Ara h 2 y Arg50 para Ara h 6 (Fig. 3. Panel a - Ara h 2.02, péptidos ayb Panel b - Ara h 2.01, péptidos b, c, dye Panel c - Ara h 6, péptidos ayb) , que después de la reducción produce dos péptidos con pesos moleculares de 7,2 a 9,7 kDa para Ara h 2 y de 4,8 a 9,4 kDa para Ara h 6. En los DRP intactos de Ara h 2, un procesamiento proteolítico C-terminal del fragmento Y / RY se observó 29, pero también escisión en el sitio de escisión de tripsina Arg149/137-Áspid150/138. Además, los péptidos con segmentos cortos internos eliminados (S48TR50 en Ara h 6 y D61PYSPSPYDRR71 en Ara h 2,02). En los DRP de Ara h 2, los segmentos internos se detectaron comenzando en Asp35 o Asp42 (Fig. 3. Panel a - péptidos f, gyh de Ara h 2.02, Panel b - péptido f de Ara h 2.01). Estos péptidos cortos no contienen residuos de cisteína y no permanecen asociados al núcleo de proteína estable. El N-terminal de Ara h 6 después de la digestión mostró cierta diversidad de N-terminal (proteólisis en Arg5 o Arg7, Fig. 3. Panel c - Ara h 6 péptidos a – d). Para las tres conglutinas, las partes más susceptibles a la digestión son los terminales N y C y, en menor medida, una parte interna limitada. Es evidente que en las tres isoformas de conglutina, el principal sitio interno de ataque de tripsina es estructuralmente idéntico (R59| R60| D61PYSPSPYDRR71| G72 en Ara h 2.02, R58| R59| G60 en Ara h 2.01 y R47| S48TR50| S51 en Ara h 6), ubicado en el bucle que no tiene una estructura local definida. La Fig. S3 complementaria contiene la alineación de secuencia de las isoformas de conglutina con la asignación de elementos de estructura secundaria y un diagrama de topología 2D que muestra los puentes disulfuro.

Utilizando la secuencia de las conglutinas intactas (línea superior de cada panel), los péptidos identificados se muestran mediante líneas posteriores (indicadas con letras). Cada línea representa un péptido único encontrado. Las líneas marcadas con "R" representan péptidos que se liberan del núcleo de la proteína durante la digestión. Panel a: Secuencias de los DRP de la especie de proteína Ara h 2.02 Panel b: Secuencias de los DRP de la especie de proteína Ara h 2.01 Panel c: Secuencias de los DRP de la especie de proteína Ara h 6.

La estructura secundaria de las isoformas de conglutina de maní no se ve afectada por la digestión y la simulación dinámica molecular revela estructuras conformacionalmente estables de los PRM

Los espectros de dicroísmo circular (CD) de UV lejano se adquirieron a pH 8 y pH 1,2, a 37 ° C, con el fin de comprender mejor las propiedades estructurales de los DRP de Ara h 2.02, Ara h 2.01 y Ara h 6. Los espectros de las tres isoformas nativas muestran una fuerte elipticidad positiva de 200 a 190 nm, lo que típicamente indica la presencia de estructuras α-helicoidales (gráficos de líneas en la Fig. 4). La forma de los espectros de CD de UV lejano de los DRP es similar a la de las proteínas nativas (gráficos de guiones en la Fig. 4). El cruce por cero, es decir, la longitud de onda a una elipticidad de 0 mdeg, es el mismo para los DRP y las isoformas nativas, lo que confirma que no se produjo ningún cambio notable en la estructura secundaria como resultado de la degradación de la proteína intacta en fragmentos más pequeños. Las conglutinas nativas y sus DRP tienen espectros de CD de UV lejano muy comparables a pH neutro y pH bajo, lo que indica que no se produce desnaturalización en el estómago.

Las conglutinas nativas y sus DRP se analizaron mediante espectroscopia UV CD lejana para investigar el contenido de la estructura secundaria, tanto a pH neutro como a pH bajo para imitar las condiciones gástricas y duodenales. Las líneas continuas representan las conglutinas de maní nativas. Las líneas punteadas representan los DRP de las respectivas conglutinas. Paneles superiores (a, b, c) a pH = 8,0, paneles inferiores (d, e, f) a pH = 1,2. Paneles izquierdos (a, d): Ara h 2.02 Paneles intermedios (b, e): Ara h 2.01 Paneles derechos (c, f): Ara h 6.

Para analizar las consecuencias de la acción proteolítica de las tres isoformas, se realizó una simulación de dinámica molecular en las proteínas intactas y digeridas para 500 ns para Ara h 2 y 800 ns para Ara h 6. Según las fluctuaciones cuadráticas medias de la raíz de la columna vertebral (RMSF ), se puede observar que ambas isoformas de Ara h 2 tienen tres regiones con alta movilidad: la parte N-terminal flanqueante hasta la primera Cys, la parte C-terminal desde el último residuo de Cys hasta el final de la secuencia, y una región que es casi todo el bucle no estructurado entre el segundo y tercer residuo de Cys (Fig. 5a, b). La movilidad de las regiones Ara h 6 es similar, excepto que la parte C-terminal no es móvil debido a un disulfuro ubicado en el C-terminal de la proteína (Fig. 5c). Los sitios de escisión de tripsina están marcados con una flecha en la Fig. 5 para los DRP y estos se consideran para un análisis de dinámica molecular adicional. Además, las Fig. 5d-f muestran los sitios de escisión sensibles a la tripsina para todos los DRP identificados en este estudio (Fig. 3). Se puede observar que los valores de RMSF de casi todos los sitios sensibles a la tripsina encontrados en este estudio son superiores a 0,60 Å (Fig. 5d-f), mientras que los sitios resistentes a la tripsina muestran prácticamente todos valores de RMSF inferiores a 0,70 Å. De hecho, el valor predictivo positivo para la susceptibilidad de los sitios de corte diana en conglutinas de maní a la tripsinolisis es del 83%, para la resistencia a la acción proteolítica es del 87%, si el valor de corte RMSF se fijó en 0,65 Å.

Paneles superiores (a, b, c): conglutinas intactas, paneles inferiores (d, e, f): sitios afectados por tripsina en los PRM. Paneles izquierdos (a, d): Ara h 2.02 Paneles intermedios (b, e): Ara h 2.01 Paneles derechos (c, f): Ara h 6. Las flechas indican el lugar que está afectado con tripsina La línea azul representa la secuencia de la proteína Las líneas verdes representa las partes de las secuencias de proteínas que contienen α-hélice como estructura secundaria. C representan la cisteína que participa en la formación del enlace disulfuro.

Se pudieron ver cuatro mínimos de RMSF locales con & lt0.5 Å, correspondientes a las regiones α-helicoidales (Fig. 6), es decir, el núcleo de proteína altamente estructurado. De acuerdo con la Fig. 6, que representa valores de RMSF superpuestos de proteína intacta con sus DRP correspondientes, la movilidad local de los DRP demuestra un patrón similar, que incluye regiones α-helicoidales con mínimos de RMSF. La Figura 7 representa la estructura 3D de la proteína intacta superpuesta con su correspondiente DRP. En los DRP, solo se pudo observar un pequeño cambio conformacional, para Ara h 2 en el bucle no estructurado y la región C-terminal, y para Ara h 6 se observan desviaciones en el bucle no estructurado y la región N-terminal , mientras que las regiones α-helicoidales permanecieron en su estructura helicoidal sin ningún movimiento helicoidal y reordenamiento para todas las isoformas de conglutina (Fig. 7), e incluso se vuelven ligeramente menos dinámicas. Estos resultados indican que la proteólisis no cambia sustancialmente la estabilidad conformacional de las proteínas.

Panel a: Comparación de Ara h 2.02 y su DRP (Fig. 3a, péptido d) Panel b: Comparación de Ara h 6 y su DRP (Fig. 3c, péptido d). Las flechas representan los mínimos del RMSF cuya posición se encuentra en la región α-helicoidal de la proteína. Las líneas verdes representan las partes de las secuencias de proteínas que contienen α-hélice como estructura secundaria.

Panel a: Ara h 2.02 Panel b: Ara h 6. La estructura en rojo representa la conformación de proteínas intactas y la estructura en azul representa DRP (péptido d de la Fig. 3a, c). Las flechas muestran los sitios de escisión, lo que indica que las partes no estructuradas se ven afectadas.

La desviación cuadrática media (RMSD) y el radio de giro de los DRP se calculó mediante la evaluación de las desviaciones espaciales en la estructura. Este análisis confirmó aún más la compacidad de los DRP (véanse las figuras complementarias S4 y S5). Durante todo el tiempo de simulación, los DRP tanto de Ara h 2 como de Ara h 6 muestran un perfil de RMSD más bajo, lo que sugiere que son más estables que las correspondientes proteínas intactas.

Los valores del radio de giro (Rg) revelan un gráfico más bajo de DRP durante todo el tiempo de simulación e implican que los DRP tienen una conformación notablemente más compacta en comparación con la proteína intacta. La estructura más compacta de los DRP que las proteínas intactas correspondientes (con un efecto más pronunciado en el caso de Ara h 2), así como una mayor compacidad de Ara h 6 que Ara h 2, está de acuerdo con los cambios en los elementos de la estructura secundaria de la proteína durante el simulación (ver la Fig. complementaria S6), p. ej. notablemente mayor contenido de hélices en los DRP que en las proteínas intactas Ara h 2 y mayor contenido de hélices en Ara h 6 que en Ara h 2.Esto puede explicarse por la pérdida de secuencias de aminoácidos no estructurados que dan como resultado una mayor fracción de elementos estructurados en los productos de la digestión.

Los péptidos resistentes a la digestión exhiben propiedades de unión a IgE como las isoformas de conglutina nativa

La unión a IgE de los DRP de Ara h 2 y Ara h 6 se evaluó mediante electroforesis en gel 2D combinada con inmunotransferencia. La Figura 8a muestra que las tres isoformas dieron lugar a puntos de unión a IgE. Los DRP de Ara h 6 tienen pI más ácidos que los DRP de las isoformas de Ara h 2. La inmunotransferencia de IgE también revela manchas adicionales con pesos moleculares más altos. Esto representa una pequeña fracción de Ara h 6 intacta, que permanece después de 90 minutos de digestión, como se indica en SDS-PAGE y 2-DE. Las manchas que no se unían a IgE (a & lt10 kDa y con pI ácido) parecían originarse a partir de Ara h 6 (figura 8a y figura complementaria S2).

Panel a: electroforesis 2-D (izquierda) y electroforesis 2-D con inmunotransferencia de IgE de DRP de la mezcla Ara h 2 / h 6. M: marcadores moleculares Panel b-d: potencia de unión a IgE determinada por IgE-ELISA de péptidos resistentes a la digestión (líneas discontinuas) y conglutina nativa (líneas continuas). Se muestra un ejemplo típico (Panel b: Ara h 2.02 Panel c: Ara h 2.01 Panel d: Ara h 6). Las potencias de unión a IgE de los DRP son similares a las de las conglutinas intactas.

Además, la potencia de unión a IgE de los DRP en comparación con la de la conglutina de maní intacta se evaluó a un nivel cuantitativo mediante IgE-ELISA. La Figura 8 (paneles b-d) muestra los gráficos de inhibición de Ara h 2.02, Ara h 2.01 y Ara h 6 y sus DRP. Para Ara h 2.02 y Ara h 6, las gráficas de inhibición de DRP se superponen virtualmente con las de las proteínas intactas. Para Ara h 2.01, hay un pequeño cambio a una concentración más alta, lo que sugiere una potencia de unión a IgE ligeramente menor. De tres experimentos independientes, el IC medio50 Se obtuvieron los valores (la concentración necesaria para inhibir el 50% de la señal) y el aumento de veces en IC50 Se determinó el valor entre los DRP y las proteínas intactas. Para Ara h 2,02, Ara h 2,01 y Ara h 6, este aumento fue de 0,8 (± 0,4), 1,4 (± 1,4) y 1,5 (± 0,6), respectivamente. Como estos números se acercan a 1, se puede concluir que la potencia de unión a IgE de las tres isoformas de conglutina del maní no se ve afectada por la tripsinolisis.


Resultados

Para dilucidar la dinámica de las proteínas de la membrana periférica, hemos utilizado la dinámica de partículas disipativas (DPD), una técnica de simulación de grano grueso que se utiliza comúnmente para simular membranas en la escala mesoscópica [30]. En este enfoque, los grupos de átomos se combinan para formar perlas efectivas que son los componentes básicos de construcciones más complejas, p. lípidos y proteínas. Las perlas interactúan a través de potenciales efectivos y están sujetas a un termostato (consulte Métodos para obtener más detalles).

(a) Modelo de un lípido L con una sola cabeza hidrófila (gris) y tres perlas de cola hidrófobas (amarillo). (b) Una proteína modelo con radio constaba de una única capa hexagonal (perlas de diámetro) de perlas hidrófilas (rojo) y tres capas de perlas de cola hidrófobas (azul). (c) Instantánea de una membrana de lípidos L y cinco copias incrustadas de (no se muestra el agua para una mejor visibilidad).

Para modelar un sistema de agua, lípidos y proteínas de la membrana periférica, hemos utilizado tres tipos de perlas que representan grupos hidrófilos, grupos hidrófobos y agua. Los lípidos (indicados como) se construyeron como polímeros lineales que consisten en un solo grupo de cabeza hidrófilo y perlas de cola hidrófobas (Figura 1 a). Como lípido estándar que usamos. Las proteínas de la membrana periférica (indicadas como) se modelaron como cilindros con sección transversal hexagonal, que consisten en una capa de perlas hidrófila e hidrófoba que forman el anclaje de la membrana (Figura 1 b). Las perlas del interior del cilindro se conectaron con resortes armónicos para obtener estructuras proteicas compactas y bastante rígidas, similares a las que se ven en la naturaleza como consecuencia de las interacciones covalentes y no covalentes de la cadena de polipéptidos. El radio de las proteínas se determinó mediante el número de perlas a lo largo de la sección transversal hexagonal de una proteína,. Nos hemos concentrado en PMP con longitud de anclaje de membrana. En todas las simulaciones, las proteínas se insertaron en bicapas lipídicas preensambladas con un tamaño de parche de (Figura 1 c). Aquí, la escala de longitud intrínseca de DPD corresponde a. Antes de registrar las posiciones de todas las perlas en función del tiempo, los sistemas se equilibraron con un barostato hasta un estado libre de tensión (cf. Métodos).

Perturbación de las bicapas lipídicas por proteínas de la membrana periférica

Primero caracterizamos una bicapa lipídica que consta de lípidos sin proteínas incrustadas. El grosor de esta bicapa era (distancia media entre los centros de los grupos de cabezas de lípidos de las valvas opuestas, véase la Figura 2). El grosor de una valva era (distancia media entre los centros de los grupos de cabezas y los centros de las cuentas terminales de la cola dentro de una valva, véase la Figura 2). La distancia entre los folíolos fue (distancia media entre los centros de las cuentas terminales de la cola en los folíolos opuestos, véase la Figura 2). El parámetro de orden de orientación de los lípidos, siendo el ángulo medio entre los lípidos y la bicapa normal, asumió un valor. Dados los extremos (cuando los lípidos se orientan paralelos a la bicapa normal, para una orientación aleatoria), el valor observado indica una bicapa lipídica bastante ordenada pero fluida.

Cuando se incrusta un PMP en una bicapa lipídica, las dos valvas se alteran de una manera característica. Las regiones entre las posiciones medias de la cabeza lipídica y las cuentas terminales de la cola en los dos folíolos se muestran como franjas de colores. El plano medio neutral e imperturbable se indica con una línea discontinua. Se insertó un único PMP en el prospecto inferior (forma indicada en la región). El grosor de la membrana y la valva no perturbado, y, se indican lejos de la proteína. (a) Al insertar proteínas cortas (es decir, y), la valva superior se inclinó hacia el plano medio imperturbable mientras que la valva inferior permaneció casi imperturbable. (b) Para anclajes de membrana más largos (), la valva superior se separó del plano medio debido a la interferencia estérica de los lípidos con el resto hidrofóbico opuesto de la proteína. La valva inferior se dobló solo ligeramente hacia adentro, lo que provocó un engrosamiento local de la membrana. Además, el grosor de la valva superior`` se redujo ligeramente debido a la compresión estérica.

Para sondear las alteraciones de la forma de la bicapa y la configuración de los lípidos al incrustar una proteína de membrana periférica en la membrana, insertamos una única con radio y una longitud hidrófoba creciente () en la bicapa. Después del equilibrio, la inclinación de la proteína con respecto a la bicapa normal fue muy modesta (). Solo la proteína más corta mostró una inclinación algo mejorada () con fluctuaciones mejoradas. Esto último también se refleja en la distribución de los ángulos de inclinación de las proteínas que fue ligeramente más amplia para todos los demás PMP (datos no mostrados). Esta observación sugiere que asume una configuración ligeramente menos estable dentro de la membrana en comparación con proteínas con restos hidrófobos más largos.

A continuación, monitoreamos el perfil de la sección transversal perturbada de la membrana, es decir, las posiciones promedio de los centros de los grupos de cabezas de lípidos y los centros de las cuentas de la cola de los lípidos terminales. En general, fueron visibles perturbaciones marcadas en las regiones de la membrana cercanas a la proteína (Figura 2 a). Cuando el resto hidrofóbico de la proteína no alcanzó la valva opuesta (y, Figura 2 a), la valva opuesta se dobló parcialmente hacia el plano medio imperturbable. La valva en la que se incrustó la proteína permaneció casi imperturbable y, por lo tanto, la membrana era más delgada cerca de la proteína, es decir. Se observó la menor perturbación para la cual la longitud del resto hidrófobo () coincidió aproximadamente con el grosor de la valva no perturbada (). Para los PMP con un resto hidrofóbico más largo (), la valva opuesta se separó del plano medio (Figura 2 b). Las desviaciones absolutas desde el plano medio en el límite del PMP crecieron casi linealmente con la longitud del resto hidrófobo, es decir, para. El prospecto en el que se incrustó el PMP solo se curvó ligeramente en la misma dirección (Figura 2 b), es decir, emergió un aumento neto en el grosor de la membrana () cerca de la proteína.

A continuación, determinamos el grosor de las valvas de la membrana, es decir, la distancia media de las cabezas de los lípidos y los extremos de la cola dentro de una valva. El prospecto en el que se incrustó el PMP cambió su grosor solo marginalmente, independientemente de la proteína que se insertara (datos no mostrados). El prospecto opuesto al PMP, sin embargo, mostró cambios significativos dependiendo de la longitud del resto hidrofóbico (Figura 3 a). En particular, surgió una fuerte compresión de la valva mientras que una longitud del resto hidrófobo solo tuvo un efecto insignificante ya que el resto hidrófobo era demasiado corto para penetrar fuertemente en la valva opuesta. Este hallazgo es corroborado por la observación de que los lípidos mostraron una disminución en el parámetro de orientación, es decir, se alinearon menos con la bicapa normal, al estar situados justo enfrente de estas proteínas (Figura 3 b). Sin embargo, también las proteínas más cortas indujeron un cambio de orientación de los lípidos en la valva opuesta: aquí, los lípidos se alinearon más fuertemente con la bicapa normal, es decir, aumentaron. Dentro de la valva en la que se incrustó la proteína, la orientación de los lípidos también se vio afectada cerca del PMP. Cerca de, los lípidos se inclinaron con más fuerza, mientras que se alinearon mejor a lo largo de la superficie normal para proteínas con un resto hidrófobo más largo. Por lo tanto, en todos los casos, la libertad de los lípidos está restringida, es decir, se desvía del valor no perturbado, que es entrópicamente desfavorable.

(a) Cuando se inserta una construcción, el grosor de la valva opuesta se altera significativamente cerca de la proteína con respecto al valor no perturbado. La compresión de la valva aumenta cuando aumenta la longitud del resto hidrófobo. (b) El parámetro de orden de orientación de los lípidos (siendo el ángulo medio de los lípidos a la bicapa normal) en la valva superior e inferior también se ve afectado en las proximidades de un PMP. Solo lejos de la proteína se observa una convergencia hacia el valor inalterado. De acuerdo con la compresión local de la valva superior, se observa una inclinación más fuerte de los lípidos directamente opuesta al PMP. Leyenda como en (a).

Para complementar los resultados anteriores, también analizamos la distancia promedio entre las valvas, es decir, la distancia promedio de los centros de las perlas lipídicas terminales en cada valva (véase también la Figura 2). Como resultado, encontramos una distancia reducida () cerca de la proteína más corta, mientras que no se observó ningún cambio con respecto a. Para proteínas más largas (), la distancia aumentó en, y, respectivamente.

En resumen, nuestros resultados sobre la inclinación de los lípidos y el grosor de la bicapa están de acuerdo con las observaciones anteriores [31]. Más allá de estos resultados, también hemos cuantificado las perturbaciones de cada monocapa y la longitud de acoplamiento alterada de las monocapas.

Difusión de proteínas de membrana periférica.

Habiendo cuantificado las perturbaciones de la membrana local inducidas por la incrustación de una proteína de la membrana periférica en una bicapa lipídica, a continuación preguntamos cómo se difunden estas proteínas dentro de la membrana. Para las proteínas transmembrana, la famosa relación de Saffman-Delbruck [32] predice una dependencia de tamaño logarítmica para radios pequeños () (1) Aquí, y son el espesor y la viscosidad de la membrana, es el radio de la proteína, es la constante de Euler y es la suma de las viscosidades del fluido por encima () y por debajo () de la membrana [33]. La validez de la ecuación. (1) ha sido confirmado por simulaciones [34] y experimentos [35] - [37].

Para probar si la difusión dependiente del tamaño de las proteínas de la membrana periférica también se describe en la Ec. (1), incrustamos PMP individuales () de radios variables () en una bicapa lipídica (). Debido al uso de potenciales de núcleo blando en DPD, el impulso y el transporte de masa ocurren en la misma escala de tiempo, lo que permite una cuantificación sólida de las propiedades de transporte incluso en sistemas bastante pequeños. Después del equilibrio, se siguió la posición de una proteína por pasos. Durante este período, las proteínas se movieron en promedio una distancia de. A partir de la serie temporal de posiciones, determinamos el desplazamiento cuadrático medio de la proteína (promediado en el tiempo). El coeficiente de difusión se obtuvo posteriormente ajustando el desplazamiento cuadrático medio. La incertidumbre en la determinación del coeficiente de difusión fue menor que a juzgar por varias corridas para la misma configuración de parámetros. Como referencia también determinamos los coeficientes de difusión de una proteína transmembrana con 5 capas de perlas hidrófobas y de un solo lípido. Este último produjo el coeficiente de difusión con el que se compararon todos los coeficientes de difusión de las proteínas.

De manera similar al caso de una membrana que separa dos fluidos de diferentes viscosidades, anticipamos los PMP ya que la parte superior de una proteína siente el agua circundante mientras que su parte inferior está enterrada en el núcleo de la bicapa. Por lo tanto, se esperaba que variara con la profundidad de penetración de la proteína. En consecuencia, se utilizó como parámetro de ajuste abierto en la ecuación. (1). El segundo parámetro de ajuste fue.

Como resultado, encontramos que la ecuación. (1) proporciona un ajuste excelente a los coeficientes de difusión dependientes del tamaño de todas las proteínas simuladas (Figura 4 a). En contraste con nuestras expectativas, no mostró una variación significativa cuando la profundidad de penetración de la proteína se incrementó al extender la longitud del resto hidrofóbico (Figura 4 b). Sin embargo, el cambio de fue proporcional a la longitud del resto hidrofóbico de la proteína (Figura 4 b). Este resultado refleja que la proteína no experimenta el arrastre viscoso completo () de una proteína transmembrana, sino solo una porción más pequeña debido a la menor profundidad de penetración. En particular, el coeficiente de difusión de casi coincidió con el de una proteína transmembrana. En nuestras simulaciones no observamos un anillo significativo de lípidos viajando con la proteína. Lo más probable es que el análisis de grano grueso y el uso de potenciales blandos (es decir, una baja relación de impulso a la propagación de masa inherente a la DPD) suavizan el surgimiento de estos conjuntos dinámicos anticipados de corto alcance.

(a) La dependencia del coeficiente de difusión de una proteína de membrana periférica de su radio está bien descrita por la Ec. (1) denota el coeficiente de difusión de un lípido, es el tamaño de una perla de simulación. Las proteínas con se indican mediante círculos rellenos, diamantes, cuadrados y círculos abiertos, cuadrados, respectivamente. Las barras de error son más pequeñas que el tamaño del símbolo. Tenga en cuenta: Para una mejor visibilidad, las curvas correspondientes a haber sido desplazadas por un factor de curvas no desplazadas coinciden aproximadamente con la curva más alta. (b) La viscosidad en Eq. (1) (que se muestra aquí como cantidad adimensional) no varía sistemáticamente al aumentar la profundidad de penetración de una proteína. Por el contrario, la viscosidad de la superficie (mostrada como cantidad adimensional) muestra un aumento lineal con la profundidad de penetración.

Al diseccionar, es decir, extraer el aporte de la membrana, cabe destacar que aunque ambos surgen de la fricción con los lípidos. Atribuimos esta diferencia a los diferentes contactos que hace un PMP con los lípidos: mientras que la parte inferior de la proteína está principalmente en contacto con las perlas de la cola de los lípidos, la cara lateral está inmersa en cadenas de lípidos alargadas. Comparando los coeficientes de difusión de los PMP, encontramos que varían en máximo entre la profundidad de penetración más baja () y la más grande (). Por lo tanto, de manera similar a las proteínas transmembrana con un desajuste hidrófobo [38], [39] la variación de la movilidad difusiva es muy moderada.

Agrupación de proteínas de la membrana periférica dentro de la misma valva

Dado que las proteínas de la membrana periférica perturban la bicapa lipídica y reducen los grados de libertad de los lípidos, se puede esperar una agrupación de proteínas dinámica, impulsada por la entropía, en analogía con las observaciones realizadas para las proteínas transmembrana [10]. Por lo tanto, estudiamos como un primer paso el comportamiento de agrupamiento de dos proteínas de membrana periférica que residen en el mismo prospecto.

Para sondear y caracterizar las interacciones mediadas por la membrana de las proteínas de la membrana periférica, determinamos la energía libre de asociación entre dos PMP. Con este fin, cuantificamos el potencial de fuerza media (PMF), a través de un muestreo general de la distribución de distancia entre proteínas (ver [40], [41] para una introducción detallada). Aquí, hemos restringido nuestro análisis a pares de proteínas idénticas y hemos variado los radios de las proteínas () y las longitudes de la fracción hidrófoba ().

Como resultado, encontramos que el PMF para todos los pares de PMP dentro del mismo prospecto tenía un mínimo profundo a pequeñas distancias entre proteínas (Figura 5 a), es decir, cuando las proteínas están ubicadas una al lado de la otra. Esta característica indica un estado ligado, es decir, la formación de un dímero (transitorio). Más allá del mínimo en el PMF, emergieron 2-3 mínimos del lado débil que probablemente reflejan configuraciones metaestables con 1-2 lípidos entre los PMP. Para grandes distancias entre proteínas, el PMF converge a una constante, es decir, los PMP no interactúan en distancias más grandes.

(a) Potenciales representativos de fuerza media, de dos PMP () que residen en el mismo prospecto. El mínimo de se encuentra a la distancia anticipada donde las proteínas se tocan entre sí (línea discontinua). La energía de enlace aumenta con el crecimiento de la longitud hidrófoba de la proteína (mostrada en negro, rojo y verde, respectivamente). Las instantáneas representativas indican la configuración de la proteína en el estado unido y no unido. Los grupos hidrófilos e hidrófobos se muestran en rojo / gris y azul / amarillo, respectivamente. (b) La energía de enlace aumenta con la longitud del resto hidrófobo. Mientras que se observa para radios pequeños () solo un aumento muy pequeño en la energía de dimerización, se observa un fuerte aumento para radios más grandes ().

La profundidad del mínimo principal en comparación con el valor de PMF lejos de la proteína, es decir, refleja la fuerza de unión y, por tanto, determina la estabilidad del dímero. Dependiendo de la longitud del resto hidrofóbico y del radio de la proteína, observamos valores en el rango (Figura 5 b). Se informaron valores experimentales comparables para la asociación de hélices transmembrana mediada por membrana () [42]. Observamos la energía de enlace más débil para y el enlace más fuerte para (Figura 5 b). Para una longitud determinada de la fracción hidrófoba, aumenta con los radios de la proteína. Curiosamente, el ancho del mínimo principal apenas cambió con el radio de la proteína cuando los PMP eran bastante cortos (: ancho). Para restos hidrofóbicos más largos (), el ancho aumentó gradualmente con el radio (hasta).

Para relacionar el PMF con la estabilidad real de los dímeros, calculamos a continuación los tiempos medios del primer paso desde el mínimo de energía hasta el estado libre. Resolviendo el problema de Kramers para un pozo de potencial cuadrado, la predicción es que depende cuadráticamente del ancho potencial y exponencialmente de la profundidad potencial (). Por tanto, la contribución dominante para la estabilidad del dímero es. Como resultado de la integración completa, encontramos s ms (cf. Tablas S1, S2).A modo de comparación, también monitoreamos la vida útil de los dímeros preformados que pueden disociarse debido al movimiento de difusión. Las duraciones accesibles de este enfoque coincidieron muy bien con los tiempos medios del primer paso calculados anteriormente.

En resumen, hemos encontrado una atracción mediada por membrana entre PMP en el mismo prospecto que se mejora para aumentar la longitud y el radio del resto hidrofóbico. En particular, observamos que las profundidades potenciales eran bastante pequeñas () cuando el ancla hidrofóbica de las proteínas no penetraba en la valva opuesta. Para las proteínas con radios y longitudes hidrofóbicas, encontramos valores más grandes que resaltan una tendencia significativa de las proteínas a dimerizarse. Vale la pena señalar aquí que la agrupación de PMP dentro del mismo folleto también se investigó en un estudio de simulación relacionado [31], pero no se determinó la PMF. Los autores observaron un aumento del tamaño de los conglomerados cuando las proteínas penetraron también en la valva opuesta, mientras que casi no se observaron agrupaciones para las proteínas que estaban restringidas a una sola valva. Estas observaciones son consistentes con los valores de energía encontrados aquí.

Agrupación de proteínas de la membrana periférica en valvas opuestas

Para dilucidar si las proteínas de la membrana periférica también interactúan y potencialmente se dimerizan cuando están situadas en valvas opuestas de una bicapa, insertamos una única proteína en cada una de las dos valvas (y) y determinamos nuevamente el potencial de fuerza media (PMF). Como se indicó anteriormente, variamos sistemáticamente los radios de las proteínas () y la longitud de los restos hidrófobos ().

De manera similar a nuestros resultados anteriores, todos los PMF mostraron un mínimo profundo a una pequeña distancia entre proteínas, lo que indicó un estado dimerizado metaestable (Figura 6 a). En contraste con los PMP en el mismo folleto, el mínimo de PMF estaba aquí típicamente situado a una distancia muy pequeña (), es decir, los PMP formaron dímeros de folíolos cruzados en los que las proteínas individuales asumieron una configuración apilada (cf. instantáneas en la Figura 6 a) . El mínimo global fue seguido a veces por una pequeña barrera repulsiva a distancias intermedias que debe superarse para alcanzar el estado dimerizado. La energía de enlace, dependía del radio de la proteína y de la combinación de longitudes hidrófobas, (Figura 6 b). La unión más fuerte se encontró para combinaciones de PMP muy corto y largo (y). Las combinaciones que involucraron un PMP que coincidió mejor en una sola monocapa () mostraron valores medios de (con). La unión más débil se observó para, y combinaciones de y. Para aumentar los radios de las proteínas, se conservó la forma característica del PMF, pero la profundidad del pozo potencial () aumentó, es decir, los dímeros se volvieron más estables. Vale la pena señalar aquí que surgió una unión extraordinariamente fuerte, para el radio más grande (es decir, un diámetro de proteína de 3-4 nm). Dada la simplicidad de nuestro modelo y los inevitables efectos de tamaño finito que pueden suprimir parte de las ondulaciones relevantes y los modos bicapa peristálticos, este valor puede ser una sobreestimación. A pesar de algunas correcciones numéricas que se pueden anticipar para estos casos extremos, la tendencia general a estabilizar dímeros para radios crecientes es un resultado consistente de nuestras simulaciones.

(a) Potenciales representativos de fuerza media, de dos PMP () que residen en folletos opuestos. Para combinaciones de proteínas suficientemente cortas (curva negra, curva roja), el mínimo de emerge a distancias de fuga. Se observa un ligero aumento de como resultado de la construcción de los PMP a través de perlas finitas, es decir, la configuración (i) es energéticamente menos favorable que la disposición (ii). Para proteínas más largas (, curva verde), se observa una disposición lado a lado de PMP, y el mínimo de, por lo tanto, se desplaza a distancias más grandes. Las instantáneas representativas indican que las disposiciones discutidas, los grupos hidrófilos e hidrófobos se muestran en rojo / gris y azul / amarillo, respectivamente. (b) Diagrama de fase para la capacidad de dimerización al cambiar las longitudes de anclaje de la membrana y de un par de PMP. Los valores codificados por colores de indican la fuerza de unión. Tenga en cuenta que la escala logarítmica de los valores de codificación de colores con están marcados en negro.

La forma del dímero dependía significativamente de la longitud de los restos hidrófobos de los PMP implicados (véanse las instantáneas de la Figura 6 a). Cuando la longitud hidrófoba de los dos PMP era lo suficientemente pequeña (o), las proteínas formaban un dímero en forma de pila (disposición de abajo hacia abajo), y el ancho del mínimo global en el PMF era aproximadamente el diámetro de las proteínas. Por lo tanto, las proteínas se atraen entre sí siempre que se superpongan. Para distancias más grandes, emergió una pequeña parte repulsiva en el PMF, lo que refleja el trabajo que se debe realizar para reorganizar los lípidos y las proteínas antes de que se pueda formar el dímero. La altura de esta barrera repulsiva era mayor cuando ambas proteínas eran muy cortas (,) o, en menor medida, cuando una era muy larga (,). En particular, la combinación de dos proteínas muy cortas () produjo una barrera energética de tal manera que una dimerización espontánea de estas proteínas es muy improbable. Cuando los anclajes hidrófobos de ambas proteínas penetraron en la valva opuesta (y), los socios de dimerización se ubicaron uno al lado del otro (véase la instantánea en la Figura 6 a). La cuenca atractiva del PMF en este caso fue muy similar a los resultados de los PMP en el mismo prospecto, es decir, más allá de una distancia entre proteínas de prácticamente ninguna atracción se pudo observar.

Como antes, también calculamos los tiempos medios del primer paso como una medida de la vida útil del dímero (véanse las Tablas S3, S4). En comparación con los PMP que residen en el mismo folíolo, los dímeros de folíolos cruzados fueron generalmente más estables debido a mínimos más profundos y anchos en el PMF. Los tiempos de escape variaron de sa 100 ms y más, lo que indica que se puede formar una amplia gama de dímeros de folíolos cruzados bastante estables. Una vez más, probar la estabilidad de un dímero preformado mediante el seguimiento de la disociación impulsada por difusión de las proteínas produjo vidas similares.

Resumiendo nuestros resultados, hemos descubierto que la alteración del radio y / o la longitud hidrófoba de un par de proteínas de la membrana periférica proporciona un medio para inducir la agrupación de valvas cruzadas de proteínas inicialmente independientes. Tal evento de dimerización puede considerarse como la formación de una proteína transmembrana metaestable y eficaz. Nuestras observaciones sugieren además que la tendencia de dos proteínas a formar tal dímero que atraviesa la membrana depende de dos parámetros: (a) de la perturbación de la membrana por cada proteína individual cuando la proteína es más larga o más corta que el grosor del huésped. monocapa, y (b) en el emparejamiento hidrófobo del dominio transmembrana eficaz del dímero de valvas cruzadas. De acuerdo con esta afirmación, encontramos que una combinación de proteínas con mostraba una fuerte dimerización ya en los radios más pequeños (). Si bien la longitud de cada una de estas proteínas coincide con el grosor de la monocapa solo mal, el dímero resultante tiene solo un desajuste hidrofóbico muy pequeño (y, respectivamente). Por el contrario, las combinaciones de proteínas mostraron tiempos de escape más largos solo para radios grandes (), ya que produce la mejor coincidencia con el espesor de la monocapa. En caso de un desajuste muy fuerte del dímero (), solo se observa una dimerización significativa con tiempos de escape prolongados para radios muy grandes.

Establecimiento de conjuntos de proteínas más grandes

Para examinar si un mayor número de proteínas de la membrana periférica en las valvas opuestas puede mostrar una oligomerización de orden superior, insertamos 5 PMP de radio en cada valva en posiciones aleatorias. Las proteínas tenían libertad para difundirse y agregarse espontáneamente. Para radios más grandes (), incluimos solo 3 proteínas en cada folleto para evitar efectos de tamaño finito. De nuevo, se variaron sistemáticamente las longitudes de los restos hidrófobos de las PMP.

Como resultado, encontramos en primera instancia de nuevo la formación espontánea de dímeros cruzados de PMP que ya habíamos observado antes (ver Figura 6). Posteriormente, sin embargo, estos dímeros mostraron la capacidad de formar conjuntos aún más grandes cuando los dímeros eran lo suficientemente longevos para encontrarse entre sí a través de la difusión (Figura 7 a). En particular, observamos la formación de trímeros de dímeros preensamblados para una combinación de y. A partir del curso temporal de la simulación, determinamos la vida útil de estos trimers. Aumentaron al aumentar los radios de (), a () y ().

Los dímeros de las valvas cruzadas (véase la Figura 6) mostraron la capacidad de formar oligómeros más grandes, p. trímeros de dímeros para (izquierda) o grupos grandes de lado a lado para (derecha).

Para una combinación de y observamos la formación de dímeros de folíolos cruzados para el radio más pequeño () sin ningún agrupamiento posterior. Sin embargo, para radios más grandes (), surgieron nuevamente trímeros de dímeros de folíolos cruzados con una estabilidad creciente. En los casos descritos, los dímeros de las valvas cruzadas tenían una longitud de (distancia media de los grupos de cabezas en la proteína superior e inferior). Por tanto, la parte transmembrana eficaz de un dímero de valvas cruzadas induce un pequeño desajuste hidrófobo que impulsa el ensamblaje () con la bicapa no perturbada.

También observamos una dimerización / trimerización de dímeros para radios grandes () cuando los dímeros preformados tenían un desajuste hidrófobo negativo, es decir, para y (), para y () y para y (). No se observó una mayor oligomerización de dímeros para y, donde los dímeros preformados tenían un desajuste de desaparición (). Deducimos de estos hallazgos que un desajuste hidrófobo absoluto de un dímero (meta) estable de dos PMP produce una atracción mediada por la membrana que puede causar una mayor oligomerización de los dímeros. Este resultado está de acuerdo con la noción de que incluso un pequeño desajuste hidrofóbico de una proteína transmembrana produce una interacción atractiva mediada por la membrana que puede impulsar la agrupación transitoria [10], [14]. Por tanto, los dímeros de las valvas cruzadas actúan a este respecto de forma similar a las proteínas transmembrana.

La formación de un tipo variante de grandes conglomerados se observó cuando los PMP en diferentes folíolos penetraban en el opuesto (,) (Figura 7 b). Estos grupos no consistían en entidades transmembrana efectivas como antes, sino que eran un ensamblaje de proteínas lado a lado. El número promedio de proteínas en los grupos fue de 3-6 y la vida útil de los grupos fue (según se determinó a partir del curso de tiempo de simulación). Tanto el tamaño del grupo como la estabilidad aumentaron de nuevo con una longitud y un radio hidrófobos crecientes de los PMP involucrados. La agrupación más fuerte se observó para el radio más grande (). Aquí, todas las proteínas de la membrana se ensamblaron en un solo grupo grande que fue estable durante toda la simulación ().

Para complementar nuestros resultados, también realizamos simulaciones en las que una sola proteína con un radio grande () estaba incrustada en la valva inferior de la membrana, mientras que 5 proteínas con radios pequeños () estaban ubicadas en la valva superior. Como resultado, observamos que las proteínas pequeñas mostraban una tendencia a ensamblarse por encima de la proteína grande situada en la valva opuesta (Figura 8 a). El grado de ensamblaje, es decir, el número de proteínas pequeñas que oligomerizaron de manera estable con la proteína grande, dependía de la combinación de longitudes de los restos hidrófobos de las proteínas. Se observó una fuerte oligomerización con vidas útiles, por ejemplo, para (proteína grande) y (proteínas pequeñas). Para estos casos, normalmente dos proteínas pequeñas se ensamblan por encima de una proteína grande. El efecto más fuerte se observó en y: Cuatro proteínas pequeñas se ensamblaron por encima de la proteína grande y permanecieron allí durante todo el tiempo de simulación (). De hecho, por razones estéricas, en el mejor de los casos, se pueden colocar cuatro proteínas pequeñas () debajo de una proteína grande (). Cuando tanto las proteínas pequeñas como las grandes eran lo suficientemente largas para alcanzar la valva opuesta, es decir, y, encontramos que las proteínas pequeñas no se ubicaban arriba sino en el borde de la proteína grande (véase la Figura 8 a). Encontramos un grupo notablemente grande con,, donde hasta cuatro proteínas pequeñas rodearon la proteína grande, por lo que se estableció un pentámero (vida útil). Los oligómeros más pequeños con la misma configuración de longitud de proteína fueron estables durante toda la simulación ().

(a) Al usar proteínas con diferentes radios, con frecuencia se observa una agrupación de PMP pequeños debajo de una proteína grande en la valva opuesta. En el prospecto inferior se incluyó un único PMP con radio y longitud del resto hidrofóbico, mientras que el prospecto opuesto albergaba cuatro PMP con radio y longitud del resto hidrofóbico. Dependiendo de la longitud de los restos hidrófobos, hasta cuatro PMP pequeños ensamblados de forma estable por encima de un único PMP más grande en la valva opuesta (grado de llenado de los círculos que codifican el número de PMP pequeños). Dos instantáneas representativas ilustran fenotipos representativos. (b) En membranas no homogéneas, los PMP también se ensamblan con frecuencia debajo o junto a un microdominio lipídico (grueso) en la valva opuesta.

Finalmente, probamos si el ensamblaje de proteínas descrito anteriormente en valvas opuestas también se produjo cuando una de las proteínas fue reemplazada por un microdominio lipídico. Con este fin, creamos una bicapa asimétrica que consta de dos tipos de lípidos y, donde el 10% de los lípidos en el prospecto superior eran lípidos largos,. Debido a los parámetros impuestos (cf. Métodos), los lípidos largos formaron un microdominio espeso (distancia media entre la cabeza y la cola de los lípidos) en la valva superior. A continuación, se insertó un único PMP en el prospecto homogéneo opuesto. Nuevamente, variamos sistemáticamente el radio de la proteína () y la longitud hidrofóbica (). Como resultado, observamos una co-localización de lípidos y el PMP con la conformación precisa en función de los parámetros de la proteína. En general, las proteínas de longitud corta y media () se ensamblan por encima del microdominio lipídico (Figura 8 b). Por el contrario, para y observamos que los lípidos largos se localizaban preferentemente en el borde de la proteína, a veces incluso rodeándola. Por tanto, también la agrupación de PMP y microdominios lipídicos (gruesos) en la valva opuesta es un medio de formación de estructuras en las membranas.


Discusión

La formación de nanoclusters K-Ras, que funcionan como conmutadores digitales a nanoescala transitorios en la activación de MAPK, es esencial para la transducción de señales de Ras (5). No se ha resuelto cómo se forman los nanoclusores de K-Ras.GTP y qué mecanismo opera para mantener la fracción agrupada de K-Ras a un nivel constante en un amplio rango de concentraciones de K-Ras.GTP. Abordamos este problema aquí utilizando el modelado in & # x000a0silico para mostrar que las interacciones entre K-Ras y un grupo citosólico de Gal3 desempeñan un papel central en la conducción de la nanoclusión de K-Ras en la membrana plasmática. Desarrollamos un modelo matemático para simular la dinámica del nanoclustering de K-Ras en la membrana plasmática. Aplicamos un algoritmo genético para buscar los posibles parámetros del modelo capaces de realizar las observaciones experimentales y validar los parámetros estimados óptimos que representan los mecanismos de colisión. Además, se diseñó un método computacional para calcular las tasas de colisión de proteínas en función de las tasas de difusión de proteínas y los mecanismos de difusión determinados experimentalmente. Las tasas de colisión calculadas fueron constantes en una amplia gama de números de proteínas, lo que respalda nuestro uso de un sistema de reacción homogéneo para describir la difusión bidimensional de la proteína Ras en la membrana plasmática. El modelo realiza con éxito la fracción constante de Ras agrupada basándose en la bioquímica conocida de Gal3 y, es importante señalar, predice que un mecanismo clave para esta fracción constante es la disponibilidad de la proteína Gal3 en el citosol para el reclutamiento a la membrana plasmática. Además, nuestras simulaciones demuestran que la probabilidad de formación de complejos de proteínas es un parámetro útil para usar en combinación con tasas de colisión constantes para definir tasas de unión que realizan datos experimentales.

Basado en nuestros resultados publicados de imágenes cuantitativas EM y FLIM-FRET (13), el modelo in & # x000a0silico propone que las proteínas & # x000a0Gal3 se reclutan en la membrana plasmática como & # x000a0a resultado de colisiones moleculares con monómeros K-Ras.GTP que se difunden libremente. Los complejos K-Ras.GTP-Gal3 resultantes se ensamblan rápidamente en complejos pentaméricos impulsados ​​por interacciones moleculares entre las proteínas constituyentes Gal3. Los nanoclusters pentaméricos pueden acumular complejos K-Ras.GTP o K-Ras.GTP-Gal3 adicionales. Sin embargo, nuestras simulaciones muestran que la probabilidad de incorporación exitosa de proteínas K-Ras adicionales después de la colisión con un pentámero K-Ras.Gal3 debe ser mucho menor que durante el ensamblaje del pentámero, tal vez reflejando un mecanismo de retención biofísico diferente. Una posibilidad es que el complejo relativamente estable de cinco proteínas K-Ras ancladas a la membrana por dominios polibásicos y un pentámero Gal3 remodele el entorno de lípidos a nanoescala del grupo. Por analogía con la unión del sustrato de cinasa C rica en alanina miristoilada a la membrana plasmática (36), la remodelación implicaría un aumento de la concentración local de fosfolípidos ácidos, incluidos PS y PIP.2, lo que permite un mayor reclutamiento de proteínas K-Ras cargadas positivamente, pero con una afinidad menor que la obtenida por la interacción proteína-proteína Gal3 directa.

Cualquiera que sea el mecanismo preciso, el modelo que hemos formulado ofrece fielmente el importante resultado de la formación de nanocluster K-Ras.GTP independiente de la concentración con la estequiometría de K-Ras previamente observada y la vida útil del nanocluster (8 & # x0201310). El modelo también recapitula nuestros resultados experimentales recientemente publicados que muestran que la disponibilidad de Gal3 en el citosol es el determinante crítico de la fracción agrupada de K-Ras.GTP (13). Por tanto, alterar la expresión de Gal3 modula directamente la transmisión de la señal a través de K-Ras (14,37). Estos hallazgos son significativos porque la expresión de Gal3 y su localización subcelular están alteradas en varios tipos de tumores (38). Dado que la fracción agrupada es un determinante crítico de la sensibilidad de una célula a la activación dependiente de EGF de la cascada de MAPK (5), los nuevos datos implican al grupo citosólico de Gal3 como un modulador de la activación de MAPK por EGF, así como la salida de señal. de & # x000a0 mutante oncogénico K-RasG12V. Tomados en conjunto, estos datos implican una expresión alterada de Gal3 en la tumorigénesis mediada por K-Ras.

Para un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias que tiene soluciones de estado estable, las tasas cinéticas en el modelo deben estar limitadas por las condiciones de equilibrio del sistema. Sin embargo, nuestras simulaciones sugieren que este sistema puede no estar completamente equilibrado, por ejemplo, cuando cambiamos los valores de pares de parámetros, como a1 y D1Simultáneamente y proporcionalmente, se alteraron las propiedades de equilibrio del sistema. Además, las distribuciones simuladas de tamaño de nanocluster no se volvieron exponenciales ni tenían un gran agregado cuyo tamaño escalaba con el número total de moléculas.Estas observaciones sugieren que la formación de nanocluster está regulada por ciertos procesos clave de desequilibrio. De hecho, el sistema incluye una serie de reacciones unidireccionales, como el desmontaje de nanoclusters y la separación de complejos Ras-Gal3 dentro de nanoclusters. Además, la rápida formación de pentámeros de Gal3 da como resultado velocidades de unión muy diferentes para el ensamblaje de pentámeros Ras-Gal3 frente al crecimiento de nanocluster como resultado de colisiones adicionales de Ras y Ras-Gal3. Sería interesante realizar un análisis más detallado de la interacción entre las reacciones equilibradas y no equilibradas a través de las soluciones de estado estacionario. Sin embargo, este no es un ejercicio trivial, porque nuestro sistema modelado incluye 27 ecuaciones y las ecuaciones que involucran K-Ras.GTP, Gal3 y Ras-Gal3 & # x000a0species son complejas. En el futuro, se podrían utilizar otros enfoques teóricos, como el método de la ecuación maestra, para analizar la cinética de los nanocluster y brindar una visión más profunda de la física subyacente de la formación de nanocluster.

Se ha demostrado que varias proteínas ancladas a lípidos operan en distintos nanoclusters en las valvas internas y externas de la membrana plasmática, incluidas otras isoformas de Ras y proteínas ancladas a GPI (7 & # x020139,39,40). Todas estas proteínas muestran una fracción agrupada independiente de la concentración y un exceso de monómero sobre la proteína agrupada, aunque con diferentes números de proteína en cada nanocluster. Aunque el modelo que hemos desarrollado es específico para el nanoclustering de K-Ras, en el núcleo del modelo hay un mecanismo que promueve rápidamente la interacción cooperativa entre monómeros y dímeros. Para K-Ras, esta cooperatividad es proporcionada por la unión proteína-proteína. Al intentar generalizar el modelo, especulamos que un mecanismo central similar podría operar para otras proteínas nanoagrupadas, quizás impulsadas por interacciones proteína-proteína o proteína-lípido. Tal hipótesis es fácilmente manejable mediante simulación y experimentación y puede permitir la definición de un principio biofísico común para la organización no aleatoria de proteínas ancladas a lípidos en la membrana plasmática.


Evaluación de la correlación de las proteínas del ciclo celular y la interacción Ki-67 en el pronóstico del papiloma invertido del seno paranasal y la transformación del carcinoma de células escamosas

El papiloma invertido nasosinusal recurrente (IP) podría transformarse en carcinoma de células escamosas nasosinusal. Usamos patrones de expresión de proteínas por método inmunohistoquímico para ver si la expresión de p53, p16, p21 y p27 pertenece a los reguladores del ciclo celular y PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes) y Ki-67 los marcadores de proliferación en sesenta pacientes con sinonasal invertido. papiloma, y ​​10 de ellos con transformación de carcinoma de células escamosas. Se revelaron niveles significativamente elevados de Ki-67, p27 y PCNA en IP con transformación de carcinoma de células escamosas del tracto nasosinusal en comparación con papiloma invertido. Ninguna variación de p16, p21, PLUNC (paladar, pulmón y proteína clon del epitelio nasal) y la expresión de p53 se correlacionó con la transformación maligna de IP nasosinusal mediante una encuesta multivariante. Sin embargo, encontramos una expresión PLUNC elevada en IP con múltiples recurrencias. Finalmente, encontramos que PCNA, p27 puede interactuar con CDK1 que promueve la proliferación de células IP y se correlaciona con el carcinoma de células escamosas nasosinusal. Ki-67 podría funcionar a lo largo de los ciclos celulares para provocar una transformación maligna. En conclusión, este es un primer estudio que muestra la correlación de Ki-67, PCNA interactuado con CDK1 podría conducir a una transformación maligna. La expresión elevada de PLUNC en los IP nasosinusales se relacionó con múltiples recurrencias en humanos.

1. Introducción

El papiloma invertido (IP) es un tipo de tumor en el que las células epiteliales de la superficie crecen hacia abajo hacia el tejido de soporte subyacente. La vejiga, la pelvis renal, el uréter, la uretra, la nariz y los senos paranasales son áreas posibles de aparición de IP [1]. Epistaxis y obstrucción nasal con dolor facial o cefalea atacada cuando la nariz o la mucosa de los senos nasales portan el IP [2]. Aunque la PI que se origina en la membrana respiratoria delimitada pertenece a una neoplasia epitelial benigna, la invasividad local, la mayor tasa de recurrencia y la transformación maligna hacen que sea difícil de tratar [3]. La tasa de transformación maligna es del 5-10% y muchos de ellos son sincrónicos y se presentan con carcinoma de células escamosas [4]. El PCNA (antígeno nuclear de la célula proliferante) actúa como expresión de antígeno en los núcleos celulares en la fase de síntesis de ADN durante el ciclo celular y considera el pronóstico del cáncer, pero la relación con IP sigue siendo controvertida [5].

La ciclina y la quinasa dependiente de ciclina (CDK) desempeñan funciones importantes en el ciclo celular durante la proliferación y afectan a diferentes fases del ciclo celular [6-9]. El CDK1 es un iniciador muy importante para la proliferación celular y el factor de transformación maligna [10]. Por el contrario, los inhibidores de p21, P27 y CDK limitan las CDK y detienen el ciclo celular [8]. La p21 es un inhibidor de las CDK de la fase celular G1 que restringen la entrada de las células a la fase S. El p27 también podría unirse a CDK y actuar como CDKI como p21. El p27 interactúa con los complejos ciclina E-CDK2, ciclina A-CDK2 y ciclina D1-CDK4, afectando la proliferación celular y la apoptosis [6, 7].

El antígeno marcador de proliferación Ki-67, detectado con el anticuerpo monoclonal MIB-1, se expresa en todas las fases celulares G1, S, G2 y M excepto G0 [8]. La expresión de Ki-67 también se correlacionó con el comportamiento del tumor, el grado patológico del tumor y la recidiva temprana en varios carcinomas [11-15].

En cuanto a las IP transformadas o sincrónicas con cánceres, también realizamos el estudio IHC p16, p53, Ki-67 y PLUNC (paladar, pulmón y proteína clon del epitelio nasal). La p16 es una proteína supresora de tumores que desacelera la fase de células G1 a S y previene la transformación maligna [8]. PLUNC es un material inmune innato que tiene un efecto anticancerígeno para el cáncer de nasofaringe, pero ningún estudio reveló su relevancia para los IP nasosinusales [16].

Se realizaron encuestas PCNA, p53, p21, p27 y Ki-67 para ver si estaban correlacionadas con la extensión del tumor y el resultado del tratamiento de las IP nasosinusal [8].

El objetivo de este estudio es investigar las funciones de los reguladores del ciclo celular p53, p21, p27, el marcador de proliferación Ki-67, p16, PCNA y el material inmune innato PLUNC en la recurrencia y la transformación maligna de los IP nasosinusal. También estudiamos si los posibles factores predichos de Ki-67, PCNA y p27 se correlacionan con las CDK mediante simulación computacional para finalmente dar una posible explicación al mecanismo de Ki-67, PCNA y p27 de las CDK en el pronóstico de las IP.

2. Materiales y métodos

Desde el Hospital de la Universidad Médica del Departamento de China desde enero de 2000 hasta junio de 2010, se recopilaron y revisaron 60 casos de PI nasosinusales y 10 casos de PI con transformación de carcinoma de células escamosas a partir de los registros médicos de manera retrospectiva. Todos los tejidos fijados en formalina al 10% y preparados en parafina se utilizaron para estudios de IHC mediante el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa. Anticuerpos monoclonales de ratón (mAb), anti-p16 (Neomarcadores, DCS-50, 200 mg / L), anti-p21 (Neomarcadores, MS 387-P, 200 mg / L), anti-p27 (Neomarcadores, MS 256-P , 200 mg / L), anti-p53 (Neomarcadores, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarcadores RM 9106-S) PCNA y PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.) Se utilizaron para inmunohistoquímica a través de el método estreptavidina-biotina peroxidasa [11]. Se utilizó xileno para desparafinar todas las secciones de tejido y luego se rehidrató con una serie de alcohol y finalmente se saturó en agua destilada. Luego, el tejido se cambió a solución salina tamponada con fosfato con la adición de una solución al 0,3% de peroxidasa de hidrógeno para bloquear la actividad de peroxidasa endógena a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se enjuagó el tampón Tris. A continuación, las secciones se hirvieron en un horno de microondas durante 15 min en solución tampón de citrato (10 mmol / L pH, 6,0). Los anticuerpos primarios p53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67 y PLUNC se aplicaron uno por uno durante 60 min a temperatura ambiente [11].

Luego agregamos el anticuerpo de unión y el complejo de estreptavidina peroxidasa (DAKO LSAB Kit, K-0675 Carpinteria, CA) durante 15 min a temperatura ambiente. El 0,05% de tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB) se utilizó durante 15 minutos para la tinción de tejidos y finalmente se lavó dos veces con el tampón Tris [8, 11].

Las secciones se tiñeron con hematoxilina de Mayer después de lavarlas con agua desionizada. Los núcleos inmunoteñidos se cuantificaron en cada caso. Todo el recuento se realizó bajo un microscopio óptico estándar en un campo de 1000x para evaluar los núcleos positivos / número total de células. Se contaron diez campos o al menos 500 células en cada sección. Las secciones tumorales se consideraron negativas si la tinción estaba ausente o estaba presente en & lt10% de las células tumorales. Se dio una puntuación de 1+ cuando el 10-30% de las células fueron positivas a la reacción. Se dio una puntuación de 2+ cuando el 30-50% de las células fueron positivas a la reacción. Se dio una puntuación de 3+ cuando & gtEl 50% de las células fueron positivas a la reacción, respectivamente (Tablas 1 y 2) [17]. La significación estadística se analizó mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson o la prueba exacta de Fisher para el análisis univariante y la prueba de regresión logística múltiple se utilizó para el análisis multivariado. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando

El acoplamiento proteína-proteína se llevó a cabo mediante el programa ZDOCK [18] para analizar los tres posibles factores pronósticos de transformación maligna unida a CDK1. Para traducir el posible mecanismo a lo que encontramos en este estudio, calculamos la interacción de Ki-67, p27 y PCNA a CDK1 mediante biología computacional. Además, utilizamos el programa GROMACS 4.5.5 [19] para observar la estabilidad de los complejos después de las predicaciones vinculantes de ZDOCK. El entorno del sistema MD se estableció en el modelo de agua TIP3P con una caja de agua a una distancia de 1,2 nm que contenía iones de Na y Cl en la concentración de NaCl 0,145 M para la neutralización del sistema. Primero, establecemos pasos de 5,000 ciclos en el algoritmo de descenso más empinado para minimizar la energía. En segundo lugar, se emplearon las condiciones de dinámica de temperatura constante (tipo NVT) para proporcionar simulación MD para el equilibrio y se realizaron en un período de tiempo de 1 ns. En el paso final, la dinámica de temperatura y presión constante (tipo NPT) se estableció para la producción en un período de tiempo de 5000 ps. La temperatura del sistema durante el proceso de simulación se estableció en 310 K. Para el análisis de trayectoria, empleamos el software GROMACS 4.5.5 para contar la desviación cuadrática media (RMSD) y el radio de giro (Rg), respectivamente. Se inspeccionaron series de datos de conformación MD cada 20 ps de todas las corridas de producción.

3. Resultados

Hubo un total de 55 hombres y 15 mujeres incluidos en este estudio. Sesenta de ellos son PI y los otros 10 son PI nasosinusales recogidos con transformación maligna. La edad es

años comprendidos entre los 25 y los 78 años. Las tinciones revelaron niveles significativamente elevados de PLUNC, pero niveles reducidos de Ki-67, p53, p21 y p27 en pacientes con recurrencia múltiple de IP (Tabla 1). También encontramos el PCNA elevado, Ki-67 y p27 en los IP nasosinusales con transformación de carcinoma de células escamosas en comparación con los IP nasosinusales solos sin malignidad sincrónica (Tabla 2). La expresión elevada de PLUNC se correlaciona con la cirugía de múltiples senos nasales en los pacientes con IP nasosinusal. Sin embargo, el nivel de expresión de PLUNC no se correlaciona con la transformación maligna de IP a SCC. También mostramos la expresión IHC de diferentes niveles para PCNA, Ki-67, p27 y PLUNC en las Figuras 1, 2, 3 y 4. La resonancia magnética o tomografía computarizada preoperatoria se realizaron para todos los pacientes como en las Figuras 5 y 6 .


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(B) RM sinusal (vista coronaria) y tomografía computarizada sinusal (vista axial) de papiloma invertido nasosinusal con transformación maligna.

La tinción inmunohistoquímica Ki-67 elevada se encuentra tanto en IP nasosinusal con múltiples recurrencias y transformación maligna en nuestro análisis univariante y multivariante mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson y la prueba de regresión logística múltiple como se muestra en las Tablas 1 y 2 y la Figura 2 (a). Por lo tanto, un índice Ki-67 alto podría considerarse un factor importante para el pronóstico y los marcadores de predicción de malignidad. Incluso podríamos combinar la encuesta del nivel de expresión de IHC de Ki-67 y PCNA significativamente aumentado y el nivel de p27 más bajo para predecir la tendencia de transformación maligna más alta en pacientes con IP nasosinusal en nuestra encuesta.

En consecuencia, hicimos algunos análisis de acoplamiento con estudios finales de dinámica molecular entre lo que encontramos los factores de pronóstico de PCNA y CDK1, Ki-67 y CDK1, y p27 y CDK1 que mostraron todos un acoplamiento estable en la Figura 7 y su puntuación de acoplamiento también se muestra en Programa ZDOCK. El ZDOCK generó las 10 mejores poses de acoplamiento de CDK1 y Ki-67, CDK1-p27 y CDK1-PCNA. Elegimos la mejor puntuación de acoplamiento para analizar la estabilidad de la interacción proteína-proteína. El Ki-67, p27 y PCNA para la puntuación de unión a CDK1 son 20,92, 21,72 y 24,32, respectivamente, según el programa ZDOCK. Los residuos clave son Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 y Val15, que fueron los principales dominios de unión para Ki-67 y p27 a la CDK1 que se muestra en la cinta roja (Figura 7). Además, hicimos análisis de MD para estos residuos clave para ver la interacción de estas tres proteínas con la CDK1. Después de la simulación MD del complejo CDK1 con Ki-67, p27 y PCNA, realizamos el análisis RMSD para tiempos de simulación de 5000 ps. Se revela que las tres proteínas (Ki-67, p27 y PCNA) tienen una fluctuación estable después de un tiempo de simulación de 1000 ps (Figura 8).


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(C) Las mejores poses de acoplamiento de CDK1 (verde) con la proteína diana (azul): (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA. Los diez mejores complejos proteína-proteína con puntuaciones ZDOCK fueron generados por el programa ZDOCK. La puntuación ZDOCK más alta de Ki-67, p27 y PCNA son 20,92, 21,72 y 24,32, respectivamente. Los residuos de unión clave de Ki-67 y p27 están coloreados en rojo, y los residuos clave incluyen Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 y Val15.

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(C)
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(C) El análisis RMSD de todos los átomos de los complejos de CDK1 con (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA durante tiempos de simulación de 5000 ps. Todos los complejos tienden a una fluctuación estable después de un tiempo de simulación de 1000 ps.

En la Figura 9, calculamos la rotación del radio de las proteínas para un período de tiempo de simulación de 5000 ps. Los tres complejos tienden a valores bajos de radio de giro y fluctuación estable en toda la simulación de MD, lo que indica los complejos compactados entre cada una de las estructuras proteicas. Se usó el método SASA (área de solvente) para la naturaleza hidrofóbica de los tres complejos, estos tres se convirtieron en fluctuaciones estables y también mostraron un cambio hidrofóbico estable entre cada interacción proteína-proteína (Figura 10). Además del cálculo de la energía total de los sistemas MD para cada uno de los tres complejos durante los tiempos de simulación de 5000 ps, ​​todos tuvieron una variación de energía estable en el rango de −9,27 × 10 5, −9,30 × 10 5 y −1,66 × 10 6, respectivamente (Figura 11). El resultado del análisis de energía revela que todos los sistemas de simulación son estables durante 5000 ps. En el análisis de fluctuación de residuos, medimos el valor de RMSF de todos los residuos para los tres complejos (Figura 12). En la validación RMSF del complejo CDK1-Ki67, se observan fluctuaciones significativas en los residuos de 38 a 43 de CDK1, que tiene un gran cambio durante la simulación de MD (Figura 12 (a)). También se observó una variación significativa en los residuos de 25 a 40 en la estructura de la proteína p27 durante la simulación de MD, lo que denota los grandes cambios en esta región. Por el contrario, hay menos variación de RMSF en los residuos de 100 a 200 en la estructura de la proteína PCNA durante la simulación de MD. Por lo tanto, hubo menos cambio de RMSF durante la simulación de MD en PCNA que Ki-67 y p27.


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(C) El radio de giro de los complejos de CDK1 con (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA durante los tiempos de simulación de 5000 ps. Los valores bajos del radio de giro indican los complejos compactados entre dos estructuras de proteínas.


El análisis SASA (área de disolvente) de la conformación de todos los complejos para la definición hidrófoba durante 5000 ps, ​​la fluctuación estable no indicó ningún cambio distinto entre las interacciones proteína-proteína.

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(C) Cálculo de energía total de los sistemas MD de (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA durante tiempos de simulación de 5000 ps, ​​cada una de las fluctuaciones promedio es −9,27 × 10 5, −9,30 × 10 5 y −1,66 × 10 5, respectivamente.

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(C) Análisis de RMSF de residuos de proteínas en (a) CDK1 y Ki-67, (b) CDK1 y p27, y (c) CDK1 y PCNA durante un tiempo de simulación de 5000 ps. El alto valor de la fluctuación de RMSF denota una fuerte variación de la estructura de la proteína en toda la simulación de MD.

Sin embargo, el análisis de migración reveló que PCNA tenía una gran distancia entre CDK1 en comparación con Ki-67 y p27 durante el estudio de simulación de MD de 5000 ps. Aunque encontramos la mayor distancia entre PCNA y CDK1 (Figura 13 (a)), su unión estable se mostró en la Figura 12 mediante análisis RMSF. Además, el desplazamiento cuadrático medio (MSD) de PCNA tiene una migración menor (Figura 13 (b)). Además, analizamos los residuos clave de CDK1 para la unión de Ki-67 y p27. El residuo de unión clave incluye Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 y Val15 en el ángulo de diedros de la estructura de la proteína Ki67-CDK1 durante el tiempo de simulación de 5000 ps. Todos los residuos de unión son estables durante toda la simulación de MD. Sin embargo, solo hubo ángulos diedros estables en Gly9, Ser10, Leu12 y Val15 en los complejos proteicos p27-CDK1 durante todo el tiempo de simulación de MD. Finalmente, encontramos que todos los residuos de unión clave, incluidos Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 y Val15 en la estructura de la proteína PCNA-CDK1, tenían un ángulo de diedros de unión estable durante toda la simulación de MD, no se encontraron cambios mayores durante el proceso de Unión de PCNA a CDK1 (Figura 14). Los análisis de conglomerados se utilizaron para seleccionar la estructura representativa entre todos los marcos MD. Para el ensayo de comparación de instantáneas, la estructura representada seleccionada de los últimos grupos de agrupamiento para todos los marcos MD de los complejos CDK1 de Ki67, P27 y PCNA desplazados a 4860 ps, ​​2740 ps y 3880 ps, ​​respectivamente, durante el tiempo de simulación de 5000 ps (Figura 15). El estudio de comparación instantánea para CDK1 y las proteínas diana para Ki-67, p27 y PCNA se muestran en la Figura 16.Encontramos que los residuos de CDK1 de 38 a 43 en CDK1 se están acercando a Ki-67 de 0 ps a 4860 ps (Figura 16 (a)). El resultado se correlaciona con el análisis de RMSF debido a las altas fluctuaciones en los residuos de 38 a 43 de CDK1 se une a Ki-67. Para el análisis de instantáneas de CDK1-p27, p27 se acerca a CDK1 de 0 ps a 2740 ps. Los hallazgos también se correlacionan con el análisis de RMSF debido a las altas variaciones en los residuos de 25 a 40 de p27 se une a CDK1 (Figura 16 (b)). Solo pudimos encontrar que el pequeño cambio de un bucle de PCNA (azul) se aleja de CDK1 (verde) a 3880 ps en los residuos de 100 a 200 en la interacción de PCNA y CDK1 (Figura 16 (c)). Este resultado también se correlaciona con el análisis de RMSF para pequeñas fluctuaciones en los residuos de 100 a 200 de PCNA se une a CDK1.


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(B) El análisis de migración de complejos durante el tiempo de simulación de 5000 ps: (a) la distancia entre CDK1 y las proteínas acopladas durante todo el tiempo de MD y (b) el análisis de desplazamiento cuadrático medio (MSD) para todos los complejos de CDK1 el ​​alto valor de MSD denota el gran distancia de migración de proteínas desde la posición inicial.


El ángulo diedro de los residuos de unión clave: (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14 y (g) Val15 en la estructura de la proteína CDK1 durante el tiempo de simulación de 5000 ps. Los ángulos de los diedros se calcularon para los complejos de CDK1 con proteínas de unión a la diana: Ki-67, p27 y PCNA durante todo el tiempo de simulación de MD.

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(C) Análisis de grupos de todas las CDK1 y las proteínas de unión: (a) Ki-67, (b) p27 y (c) PCNA durante el tiempo de simulación de 5000 ps, ​​las estructuras representadas se seleccionaron de los últimos grupos de agrupamiento para todos los marcos MD de los complejos CDK1 . La estructura representada del complejo Ki-67, p27 y PCNA se desplazó a 4860 ps, ​​2740 ps y 3880 ps, ​​respectivamente.

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(C) Comparación entre la instantánea inicial (0 ps) y la conformación representada para todos los complejos CDK1. (a) Uno de los bucles CDK1 (verde) se acercó a Ki-67 (azul) a 4860 ps. (b) La estructura de la proteína de p27 (azul) se unió a CDK1 (verde) más fuertemente a 2740 ps. (c) Uno de los bucles de PCNA (azul) se alejó de CDK1 (verde) a 3880 ps.

Para resumir los resultados de nuestro estudio y revisiones de la literatura, el mecanismo molecular de Ki-67, p27 y PCNA que interactúan con CDK1 para la proliferación celular y la transformación maligna en pacientes con IP nasosinusal se muestra en la Figura 17.


4. Discusión

Aunque los papilomas invertidos rara vez ocurren en el tracto nasosinusal, la naturaleza recurrente fácil y la transformación maligna a menudo preocupan a pacientes y médicos. Se necesita un seguimiento regular de por vida para la detección temprana de la recurrencia o el cambio maligno y podría conducir a un mejor control de la enfermedad para los pacientes con PI [9, 20].

El Ki-67 promovió el inicio de la fase G1 a partir de G0 en las células IP, y persistió la expresión del ciclo celular en la fase de proliferación. Ki-67 es una proteína que afecta el ciclo celular en la fase de proliferación de G1-S-G2-M excepto la fase G0 [8, 11, 14]. En la literatura que informa sobre las mutaciones p53, p63, p21 y p27 inducidas por IP nasosinusal con transformación SCC, todavía hubo debates [6, 11, 14]. Ki-67 se informó recientemente sobre la aparición de neoplasias nasosinusales [21], el comportamiento agresivo del tumor se correlacionó con un índice Ki-67 más alto y causó epitelio nasal a displasia grave e incluso carcinoma de células escamosas [22]. El Ki-67 elevado podría incluso encontrarse en los carcinomas de células escamosas contenidos sincrónicamente. Ki-67 también afectará a p21, p27 y CDK [8, 11, 12, 14]. Sin embargo, no pudimos concluir si la disminución de p27 es causada por una expresión elevada de Ki-67 en los tejidos de los PI nasosinusales. Es necesario realizar más estudios para dilucidar la relación entre Ki-67 y P27.

La función de supresión tumoral de p53 está relacionada con muchos cánceres informados por Katori et al. y Gujrathi et al. [22, 23]. Sugirieron que la prueba de p53 puede ayudar a descartar lesiones de papiloma con potencial de displasia o carcinoma; sin embargo, no lo encontramos significativo en el análisis multivariado. Esto se debe al número limitado de pacientes de nuestro estudio. Sin embargo, no sólo p53 sino también p63 se expresa en IPs con transformación maligna [11].

Se informó que el aumento de la actividad proliferativa con una expresión elevada de Ki-67 de las células tumorales es un marcador pronóstico importante en muchos tumores humanos; también es importante en la recurrencia y cancerización de los PI. Especialmente, Ki-67 sospecha que afecta directamente al ciclo celular durante la fase de proliferación y podría interactuar con los genes supresores de tumores p53, p21 y p27 y modula el ciclo celular al afectar el punto de control de la fase G1 [8, 24, 25]. El Ki-67 encontró recientemente que tiene interacción entre CDK1 en la estructura natural y biología molecular [26] y CDK1 participa en el papel principal en la proliferación celular e incluso en la transformación maligna [10]. Sospechamos que el Ki-67 no solo inició la entrada de las células IP en la fase G1 del ciclo celular, sino que también provocó una transformación maligna en los núcleos celulares al afectar al CDK1.

Los roles clínicos de p21 y p27 en la cancerización de SCC de cabeza y cuello todavía son debates, pero encontramos que el nivel más bajo de p27 también se reveló en IPs nasosinusales con transformación maligna en nuestro estudio. Aunque hubo pocos estudios de p21 y p27 que informaran la correlación de los IP humanos con la cancerización, los debates aún permanecían. Algunos estaban con Oncel et al. [11, 27] y algunos estaban en contra [25, 28] observado.

Además de Ki-67, también encontramos el PCNA, un predictor de transformación maligna de IP en la colaboración con CDK1. En nuestros IP con transformación maligna, tanto PCNA como Ki-67 fueron elevados por tinciones IHC.

Como mostró la expresión elevada de PCNA en IP con transformación maligna de nuestra encuesta, sospechamos que el PCNA es un factor importante para inducir la cancerización en pacientes con IP nasosinusal. Recientemente, también se ha encontrado el PCNA elevado en IP en comparación con los pólipos nasosinusales por Mumbuc et al. [3]. El PCNA podría interactuar con CDK1 y promover la entrada celular al ciclo celular para la consecuente proliferación y cancerización.

Finalmente, encuestamos el PLUNC a los PI nasosinusales con cancerización, ya que con frecuencia se informa que causa la formación de cáncer nasofaríngeo. En nuestro estudio anterior, la expresión de PLUNC se redujo en la sinusitis por pseudomonas en el estado de enfermedad crónica [29]. El PLUNC también se correlacionó con la rinosinusitis crónica con colonización de múltiples bacterias [17]. Y, además, se suponía que el PLUNC también tenía una función antiinfecciosa y antibiofilm [30, 31]. Porque se suponía que tenía anticancerígeno del carcinoma nasofaríngeo [32], pero no encontramos correlación de los PI nasosinusales con la transformación del SCC. Por el contrario, solo pudimos encontrar la expresión elevada de PLUNC en pacientes con IP nasosinusal con múltiples recidivas y cirugía de revisión del seno. El mecanismo adicional y las razones de la expresión elevada de PLUNC y las recurrencias múltiples deberían estudiarse más a fondo en el futuro.

El diseño de fármacos asistido por computadora (CADD) se puede utilizar para investigar más a fondo la investigación clínica o de enfermedades, que incluye investigación de enfermedades [33], estudios de factores de riesgo [34], informes de casos y mecanismos moleculares. En nuestros resultados de acoplamiento y dinámica molecular de PCNA, Ki-67 y p27 a CDK1, encontramos que los tres tenían acoplamiento estable a CDK1. Y se suponía que la p27 tenía una interacción más estable con la CDK1 para funcionar como inhibidor de los IP nasosinusales con cancerización. El PCNA y Ki67 se consideraron promotores y promueven la proliferación celular y la cancerización en IPs nasosinusal.

En conclusión, este es un primer estudio que muestra que Ki-67, PCNA y p27 son importantes en las recurrencias de IP y la cancerización a través de CDK1. Y también somos los primeros en encontrar una expresión PLUNC elevada en IPs nasosinusales de recurrencia múltiple. Sin embargo, aún se justifica un estudio adicional del mecanismo en el futuro. Los estudios computacionales actuales son todos compatibles con nuestros estudios de laboratorio húmedo, lo que hace que nuestro estudio sea más confiable y podría aplicarse al tratamiento futuro de pacientes con dicha enfermedad. Por lo tanto, los pacientes con IP nasosinusal y Ki-67 expresado, PCNA y p27 disminuido deben considerarse con mayores posibilidades de transformación maligna y deben seguirse más de cerca en la práctica clínica [35].

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Expresiones de gratitud

La investigación fue apoyada por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencias de Taiwán (NSC101-2314-B-039-013-MY3, NSC102-2325-B039-001, NSC102-2221-E-468-027), de la Universidad Médica de China ( CMU102-BC-3), de la Universidad de Asia (ASIA100-CMU-2, ASIA101-CMU-2 y 102-ASIA-07) y del Hospital de la Universidad Médica de China (DMR-102-001, DMR-103-025, DMR-103-058, DMR-103-001 y DMR-103-096). Este estudio también es apoyado en parte por el Centro de Investigación y Ensayos Clínicos de Excelencia del Departamento de Salud de Taiwán (DOH102-TD-B-111-004) y el Centro de Excelencia de Investigación del Cáncer del Departamento de Salud de Taiwán (MOHW103-TD-B-111-03 ), y CMU bajo el objetivo del Plan Universitario Superior del Ministerio de Educación de Taiwán.

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