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Vectores para ingenieria genetica

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Bueno, ¿se puede usar una bacteria como vector? He aprendido que Agrobacterium tumifacian puede usarse para entregar un gen de interés en células vegetales, pero en un libro con una pregunta de opción múltiple dice que solo se pueden usar plásmidos y bacteriófagos y no las bacterias para entregar un gen de interés a una célula huésped.


Sí, Agrobacterium es de hecho un vector muy utilizado en plantas. Por tanto, no estaría mal considerar a las bacterias como vectores. Solo para agregar, vale la pena señalar que en los últimos tiempos, las opciones de vectores bacterianos también se han explorado en el caso de los humanos, especialmente en el caso de la terapia génica para el tratamiento del cáncer, aunque aún no se ha demostrado su éxito. Consulte https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3056088/ para obtener más información al respecto.

Para concluir, las bacterias pueden considerarse sin duda un vector.


Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes son cepas bacterianas patógenas de plantas del suelo que contienen plásmido. Este plásmido se conoce como plásmido Ti y es responsable de inducir el tumor. Parte de este plásmido llamado T-DNA puede integrarse en los cromosomas del huésped. Entonces, este plásmido bacteriano actúa como vector, pero no como la célula bacteriana completa.

(Vía: https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/agrobacterium-tumefaciens)

Esto es cierto con todas las cepas de bacterias patógenas, ya que pueden transferir su material de ADN para causar patogenicidad. Por lo tanto, estas cepas patógenas se pueden usar en ingeniería genética para transferir un gen particular a una célula huésped / mamífero. El uso de bacterias como vector para tratar el cáncer u otras afecciones patológicas aún se encuentra en una etapa de desarrollo.

(A través de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3056088/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16362987/)


El error conceptual que está cometiendo es que Agrobacterium Tumifaciens, al ser una bacteria, contiene material genético adicional dentro de su célula, llamado 'plásmido Ti'. Por lo tanto, está bastante justificado que el plásmido dentro de la bacteria actúe como un vector o un portador de un gen extraño y no como la bacteria en su totalidad.

Por tanto, la respuesta proporcionada en el libro es correcta.


Vectores para la ingeniería genética de corinebacterias

Corynebacterium glutamicum y especies relacionadas son microorganismos de importancia biotecnológica. Estas bacterias tienen una larga historia de uso para la producción de productos químicos finos como aminoácidos y ácidos orgánicos. Además, recientemente se han contemplado para la producción de proteínas xenogénicas, como proteínas de micobacterias de importancia médica, dada la relación filogenética relativamente estrecha que existe entre estos dos géneros. En este artículo, revisamos varias herramientas moleculares disponibles para manipular Corynebacteria, proporcionar información de secuencia de ADN en varios vectores útiles e informar sobre nuevos vectores lanzadera para la ingeniería genética de estos organismos. En particular, esta serie de plásmidos novedosos permite el uso de resistencia al cloranfenicol, kanamicina, gentamicina o espectinomicina para la selección positiva en Corynebacteria. Estos vectores complementan las diversas herramientas de biología molecular disponibles para diseñar estos importantes bioconvertidores y así allanar el camino hacia el aumento de sus aplicaciones industriales. Además, presentamos evidencias que corroboran la opinión de que el plásmido pB Y503 de B. stationis pertenece a una nueva familia de plásmidos de círculo rodante que comprenden pNG2 aislado de C. diphtheriae.

© 2004 Sociedad Química Estadounidense

Corynebacterium glutamicum es una bacteria grampositiva con un contenido de GC moderadamente alto. Es un organismo que tiene una larga historia de uso en biotecnología para la producción de aminoácidos, que representan solo para los aditivos alimentarios un mercado global de más de $ 2 mil millones (1-3). Además, el potencial de las corinebacterias para la producción de proteínas xenogénicas parece prometedor (4). La reciente secuenciación de su genoma completo facilitará la ingeniería genética de este importante bioconvertidor, por ejemplo, al permitir la ingeniería racional (5) como herramienta complementaria a la mutagénesis clásica de células enteras o la reorganización del genoma (6). Las numerosas cepas que se han aislado como organismos productores de glutamato constituyen especies de C. glutamicum (7), que, en el grupo Corynebacterium-Mycobacterium-Nocardia, están estrechamente relacionadas con C. acetoacidophilum, C. callunae y G ammoniagenes. Las especies clínicas más estrechamente relacionadas son C. minutissimum, C. striatum y C. xerosis (8, 9).

Se han desarrollado herramientas genéticas para manipular las bacterias corineformes productoras de aminoácidos. Por ejemplo, varios grupos han informado de protocolos de electroporación que permiten la transformación eficiente de células corinebacterianas con una alta eficiencia (10-14). Dicho protocolo también se desarrolló para diseñar G glutamicum R, una cepa que exhibe varias características biotecnológicas útiles, incluida la capacidad de crecer en etanol como única fuente de carbono, sin autólisis en condiciones de inanición y una tasa de crecimiento rápida. Utilizando el protocolo descrito por Kurusu et al. (75), las células R de C. glutamicum se transformaron con éxito a una eficiencia de aproximadamente 104 transformantes por ßg de ADN. Normalmente, en este procedimiento, las células en fase logarítmica media se prepararon para la electroporación mediante incubación con penicilina G como un medio para debilitar la pared celular. Se demostró que una barrera importante para la electroporación es la barrera de restricción, que se debe, en C. glutamicum MJ233C, a un sistema de restricción similar a mrr, y a un sistema similar a mcr en C. glutamicum ATCC 31831. Por otro lado, ningún sistema de este tipo pudo identificarse en C. glutamicum ATCC 13869 (16). Cuando se aisló el ADN plasmídico de células corineformes, o de un mutante de E. coli dam dem como la cepa JM110 (17), se alcanzaron típicamente eficiencias de transformación de hasta 4.0x107 transformantes por ADN jig (16).

La conjugación es un protocolo alternativo que ha sido desarrollado por varios investigadores (18-21) ya que se ha observado transferencia de ADN plasmídico conjugativo entre bacterias Gram positivas y Gram negativas (22). El éxito de la conjugación como método de transferencia de genes también se explica por la observación de que permite eludir, hasta cierto punto, la barrera de restricción. Schäfer y col. (20) y van der Rest et al. (14) utilizaron además la exposición al estrés, un método bien descrito para inactivar temporalmente la barrera de restricción, como un medio para aumentar las frecuencias de conjugación.

El advenimiento de estas técnicas de transformación eficientes permitió el uso de ADN plasmídico integrativo para realizar la alteración y el reemplazo de genes en este grupo de importantes productores de aminoácidos (23). Muchos de estos protocolos se basan en la transferencia conjugativa de plásmidos que solo tienen un origen de replicación de E. coli. Se desarrolló un protocolo basado en electroporación para C. glutamicum MJ233C que también es adecuado para la manipulación de otras cepas de bacterias corineformes, alcanzando eficiencias de transformación con plásmidos integradores de hasta 2.4x102 transformantes por higo ADN (24).

En los últimos años, se han construido varios vectores de clonación útiles, diseñados alrededor de plásmidos endógenos (25), incluidos los vectores lanzadera de expresión génica (21, 26-29). Anteriormente informamos sobre pBY503, un plásmido críptico de 16,4 kb de Brevibacterium stationis (30) y función de partición asociada (5 /), plásmido pPROBE17, un vector de sonda promotora (52), pMV5, un vector de trampa de transposones (33) basado en el fenotipo letal conferido por el gen sacB de B. subtilis (34), y pMVl 1 (Tn3 / 83 /) y pMV23 (mi niTni / & amp? /), dos vehículos de suministro de elementos móviles (35).

En este artículo informamos sobre la construcción de nuevos vectores lanzadera para la manipulación de C. glutamicum.

Materiales y métodos Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

En este estudio se utilizaron E. co / i JM109 (/ 7), E. co / i JM110 (/ 7) y C. glutamicum R, una cepa sin plásmido de la colección de laboratorio. Los plásmidos pBL1 y pMVS eran de la colección de laboratorio. Los plásmidos pHSG299 y pHSG398 se obtuvieron de Takara (Osaka, Japón). Las cepas de E. coli se cultivaron a 37 ° C en medio LB suplementado con ampicilina SO pg-mT1, 50 µg.ml'1 de cloranfenicol, 50 µg ml'1 de kanamicina, 10 µg ml de gentamicina o 200 µg ml de espectinomicina, según fuera apropiado. Las corinebacterias se cultivaron de forma rutinaria a 33 ° C en medio AR (15). Se añadieron kanamicina, cloranfenicol, gentamicina y espectinomicina según fuera apropiado (50 ml de figura x ', 5 ml de figura ", 10 ml de figura" y 200 ml de figura * 1, respectivamente).

Técnicas de ADN

El ADN cromosómico se aisló usando el kit Genomic Prep de Amersham Pharmacia Biotech (Reino Unido). El ADN plasmídico se aisló mediante el procedimiento de lisis alcalina (36). Las endonucleasas de restricción, el fragmento de Klenow y la ADN ligasa T4 se obtuvieron de Takara (Osaka, Japón) y se usaron según las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de restricción se aislaron cuando fue necesario a partir de geles de agarosa con la matriz Prep-a-Gene (Bio-Rad, Richmond, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Toda la PCR se llevó a cabo en un Applied Biosystems GenAmp System 9700 según lo recomendado por el fabricante utilizando el siguiente protocolo de amplificación: 30 ciclos a temperaturas de 95 ° C para desnaturalización (1 min), 54 ° C para hibridación (1 min) y 72 ° C para la extensión (1 min).

Transformación de células bacterianas

Las corinebacterias se transformaron mediante electroporación (16) utilizando ADN plasmídico purificado de E. coli JM110. Las cepas de E. coli se transformaron mediante el método CaClj (36).

Secuencia ADN

Hemos generado una biblioteca de los fragmentos de ADN para ser secuenciados usando un sonicador Misonics (Farmingdale, NY) en el ajuste de potencia 1. El tubo Eppendorf que contiene la muestra de ADN se colocó en un baño de hielo y 8 ciclos de sonicación durante 1 segundo interrumpidos por 1 Se realizaron intervalos de segundos. Los fragmentos aleatorios resultantes se separaron por tamaño en un gel de agarosa al 1% y la fracción correspondiente al conjunto de 2-3 kb se purificó posteriormente del gel. Los fragmentos se hicieron romos por tratamiento con el fragmento de Klenow y se ligaron a ADN plasmídico pUCl 19 digerido con £ mal (obtenido de Takara). La mezcla de ligación se usó para transformar E. coli JM109, los recombinantes se seleccionaron en placas suplementadas con IPTG (36). Con fines de secuenciación, los clones se cultivaron durante la noche en placas de microtitulación de 96 pocillos profundos en 1 ml de medio 2X-LB usando un TAITEC Bioshaker. Los plásmidos correspondientes se aislaron en placas de 96 pocillos utilizando el kit Millipore Montage Plasmid Miniprep96 y un robot de pipeteo de formato simple de 96 pocillos Cosmotec HT Station 500 (Tokio, Japón). La biblioteca de plásmidos así generada se secuenció en ambos extremos usando cebadores directos e inversos universales M13 (36) y secuenciación cíclica usando el método BigDye de ABI Biosystem Inc. en un secuenciador ABI 3700 CE. El Applied Biosystems GeneAmp System 9700 se utilizó para las reacciones en cadena de la polimerasa como se describe en la sección de Técnicas de ADN. Antes de la secuenciación, los productos de PCR resultantes se trataron con exonucleasa utilizando ExoSAP-IT de USB (Cleveland, OH, EE. UU.) Para destruir los cebadores restantes.

Las secuencias de ADN se analizaron como sigue. Los archivos de cromatograma sin procesar (archivos .abi) se recopilaron en una computadora personal con Windows 2000 (Microsoft Corp.). Los archivos de cromatograma se transfirieron posteriormente a una computadora SunBlade 1000 (Sun) con una CPU UltraSparc-III de 900 MHz de 64 bits y 2 GB de memoria. El programa Tlje PREGAP4 del paquete Staden (37,38) se utilizó para recortar secuencias de vectores, así como para recortar de calidad y detectar contaminación después de la llamada de bases por PHRED (39, 40). Las búsquedas BLASTX se llevaron a cabo en la computadora Sun usando el programa BLAST independiente (41) de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) usando la matriz BLOSUM62 (42).

Número de acceso de nucleótidos

Las secuencias de nucleótidos informadas en este artículo aparecen en las bases de datos de secuencias de nucleótidos de EMBL y GenBank con los números de acceso AY211882 (pCRAl) y AY211883 (pMV5).

Construcción del vector lanzadera pCRAl E. coli- C. glutamicum

El plásmido pCRA1 es un vector ideal para la expresión de alto nivel; sin embargo, debido a su modo de replicación, se puede observar inestabilidad segregacional y estructural (49, 50), particularmente cuando se sobreexpresan genes cuyas actividades son perjudiciales para la cepa huésped. Para la clonación de dichos genes, los plásmidos que se replican a través de un mecanismo 0 proporcionan una clara ventaja, ya que estos plásmidos se benefician típicamente de una mayor estabilidad estructural y segregacional (50).

Bola DraX 1653 1661 Nco 1697

Bola DraX 1653 1661 Nco 1697

Figura I. El mapa físico y genético del vector lanzadera pCRA I. de E. coli - C. glutamicum. Sólo se indican los sitios que son únicos o están presentes en dos copias. Las flechas indican la dirección de la transcripción. El promotor lac está representado por pLAC, el origen de replicación que codifica el gen que codifica la proteína por ori y el gen de resistencia al cloranfenicol por Cmr. MCS: sitio de clonación múltiple, el orden de los sitios de restricción se indica en el cuadro en el sentido de las agujas del reloj. Los números dados para cada sitio son coordenadas.

10 Sello 20 30 40 50 60 70 80 90100110120

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360

370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480

EcoRI SacI Kpnl XhoIBglll PstI SmalBamHI Sail PshAI

490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720

Figura 2. Secuencia de ADN del polienlazador de pCRA I y sus regiones flanqueantes. El promotor lac se indica en negrita. Cmr: resistencia al cloranfenicol, Km: resistencia a la kanamicina, Gmr: resistencia a la gentamicina, Spec: resistencia a la espectinomicina. Los diversos sitios de restricción en los polienlazadores se dan en el sentido de las agujas del reloj en los recuadros adyacentes a cada plásmido junto con las coordenadas.

La lanzadera pCRB E. coli - Corynebacterium shuttle vector series

El diseño utilizado para construir el vector pCRAl se optimizó para generar una serie de vectores lanzadera versátiles que permiten una clonación rápida utilizando lacZa. complementación en E. coli y una variedad de marcadores seleccionables positivamente (cloranfenicol, kanamicina, gentamicina o espectinomicina). Los mapas de restricción y los mapas genéticos de estos vectores, pCRB1, pCRB2, pCRB3 y pCRB4, se presentan en la Fig. 3.

El plásmido pCRB 1 se construyó como sigue. Los cebadores 2 y 3 (respectivamente CTC TGA TAT QGT TCC ACT GAG CGT CAG ACC, CTC TGA TAT CTC CGT CGA ACG GAA GAT CAC se han subrayado las bases correspondientes a los sitios de restricción utilizados en la clonación) se utilizaron para amplificar por PCR todo el pHSG398 plásmido. El amplicón resultante se digirió con EcoRV y se ligó a ADN plasmídico pBL1 linealizado con Hpal. La mezcla de ligación se usó para transformar E. coli y uno de los clones resultantes se seleccionó al azar como fuente de ADN plasmídico pCRB1, que tiene un tamaño de 4.050 pb.

El plásmido pCRB2 se construyó mediante linealización del ADN del plásmido pHSG299 usando Sfal y ligación a un fragmento de PCR digerido con Hpal que codifica el origen de replicación del plásmido pBL1. Este fragmento se generó utilizando los oligonucleótidos CTC TGT TAA CACA TGC AGT CAT GTC GTG CT y CTC TGJ TAA CAC AAC AAG ACC CAT CAT AGT. El plásmido resultante tiene un tamaño de 4.494 pb.

El gen de resistencia a la gentamicina (51) estaba disponible en un cartucho EcoRI clonado en el plásmido pGP704Gm (52). El ADN del plásmido pCRB1 se utilizó como molde para amplificar por PCR un amplicón desprovisto del marcador de resistencia al cloranfenicol, utilizando los cebadores 1 y 5 (respectivamente CTC TGA TAT CCA ATA CGC AAA CCG CCT CTC y CTC JGJ TAA CAC AAC AAG ACC CAT CAT AGT) . El producto de PCR resultante se digirió con EcoRV y Hpal y se ligó a ADN de plásmido pGP704Gm linealizado con Dra , para producir el plásmido pCRB3, de 4.729 pb de tamaño, recuperado de una colonia de E. coli obtenida tras la transformación de células de E. coli HB101.

El vector lanzadera de resistencia a espectinomicina de 4.155 pb pCRB4 se construyó ligando el casete de resistencia a espectinomicina Xba -Nde disponible en el plásmido pMV5 (33) a un amplicón pCRB 1 desprovisto del marcador de cloranfenicol y obtenido como se describió anteriormente. El fragmento Xba -Nde se hizo romo mediante tratamiento con el fragmento Klenow y se ligó al producto de PCR descrito anteriormente digerido con EcoRV-Hpal.

Las secuencias completas de estos cuatro nuevos vectores se han ensamblado in silico basándose en la información de secuencia disponible en bases de datos públicas.

El vector de trampa de transposones pMV5

Se ha observado que la expresión de la sacarasa de B. subtilis levan (53, 54) es letal para las bacterias corineformes cuando estas células se cultivan en un medio mínimo suplementado con sacarosa al 10% (33, 34).

Figura 3. Los mapas físicos y genéticos de los vectores lanzadera de E. coli - C. glutamicum pCRB1, pCRB2, pCRB3 y pCRB4. Solo se indican los sitios que son únicos o están presentes en dos copias. Las flechas indican la dirección de la transcripción. Los números dados para cada sitio son coordenadas.

El plásmido pMV5 se ha construido para permitir la selección positiva de eventos de recombinación de reemplazo en corinebacterias. Además, este vector puede resultar útil para la clonación de elementos genéticos móviles de especies estrechamente relacionadas como Rhodococcus o Mycobacterium. La construcción de la trampa de transposones pMV5 se ha informado en otro lugar (J J). Este vector se basa en el origen de replicación del plásmido pB YS03, un episoma críptico de bajo número de copias de 16,2 kb que se origina en Brevibacterium stationis IFO 12144 (31,44).

La secuencia de nucleótidos del origen de replicación del plásmido pBY503 (número de acceso de GenBank AY211883) se determinó usando el fragmento correspondiente transportado por el plásmido pMV5. Este fragmento codifica un marco de lectura abierto de 1.488 pb de largo cuyo producto comparte un 79% de similitud y un 65% de identidad con la proteína RepA de los plásmidos de C. diphtheriae pSV5 (número de acceso de Genbank X57320), pNGA2 (AY061891) y pNG2 (AF492560). 73% de similitud y 61% de identidad con el plásmido de C. glutamicum pTET3 (55), 73% de similitud y 60% de identidad con el plásmido C. eficiente pCE2 (AP005225), y 66% de similitud y 51% de identidad con el plásmido de Cjeikeium pB85766 ( AF486522). Si bien el tamaño del plásmido pBY503 y su bajo número de copias de 4,6 por equivalente cromosómico en C. glutamicum MJ233C (31) son características típicas de los plásmidos que se replican a través de un mecanismo 0 (50), estas homologías observadas sugieren que pBY503 pertenece a un familia de plásmidos que comprende miembros que se ha demostrado que se replican mediante el modo de círculo rodante (56). Esta familia de plásmidos así representada por pGAl (57), pSRI (58), pNG2, pNGA2, pSV5, pCE2, pB85766 y pBY503 parece distinta de la familia de plásmidos de círculo rodante que se originan de estafilococos, estreptococos o lactococos (59). La opinión de que pBY503 no se replica a través de un mecanismo 0 se corrobora con la observación de que no se pudieron encontrar iterones típicos (60) aguas arriba del gen repA.Además, un motivo conservado típico para las proteínas Rep codificadas por virus y plásmidos de círculo rodante (61), uxxYuxKxxx (donde u representa un residuo hidrófobo voluminoso como I, L, V, M, F, Y o W), es observada en la proteína RepA de pBY503 (Tabla 1), con la notable excepción de que el residuo K se reemplaza por Q. La observación de que, además de pBY503, están presentes secuencias similares en pTET3, pNG2, pNGA2 y pSV5 sugiere que Q representa un residuo canónico en esta posición particular. Asimismo, es de destacar que esta familia de plásmidos parece caracterizada por la secuencia VRGYV. El análisis de la secuencia además revela un marco de lectura abierto adicional incompleto, OrfX, ubicado aguas abajo de repA cuyo producto génico exhibe un terminal carboxi que muestra fuertes homologías con proteínas de transporte: 80% de similitud con una proteína hipotética conservada de C. eficiente YS-3I4, 78% a una supuesta permeasa de C. glutamicum ATCC 13032, y 71% a una supuesta proteína de transporte transmembrana de Streptomyces coelicolor A3 (2).

Discusión

La ingeniería genética de bacterias corineformes, y en particular de C. glutamicum R, se ha visto facilitada por desarrollos recientes en herramientas de biología molecular y en el conocimiento de la secuencia de ADN de sus componentes.

Tabla 1. Motivo de la firma RepA de plásmidos de círculo rodante

Motivo de host de plásmidos uxxYuxKxxx

Tabla 1. Motivo de la firma RepA de plásmidos de círculo rodante

cromosoma (Yukawa et al., inédito). En este informe describimos la construcción de E. coli -C versátil. vectores lanzadera glutamicum basados ​​en el origen de replicación del plásmido pBL1, un episoma de alto número de copias aislado de varias cepas de corinebacterias y cuyo mecanismo de replicación implica círculos rodantes (47, 48). Estos vectores permiten la complementación de lacZa en E. coli. Además, tienen un sitio de clonación múltiple en este último gen para facilitar la clonación. Los cuatro marcadores de resistencia diferentes que caracterizan a esta nueva serie de vectores lanzadera, a saber, cloranfenicol, kanamicina, espectinomicina y gentamicina, proporcionan herramientas versátiles de biología molecular. Estos vectores complementan el conjunto de herramientas de biología molecular existentes para la manipulación genética de estas bacterias, herramientas que incluyen promotores de una amplia gama de fortalezas y especificidades, así como sistemas de mutagénesis de transposones. Además, presentamos evidencias de que el plásmido pBY503 (JO) de B. stationis pertenece a la familia distinta de plásmidos que comprende pGAl (57), pSR1 (5J), pNG2 (número de acceso de GenBank AF492560), pNGA2 (AY061891), pSV5 (X57320). ), pCE2 (AP005225) y pB85766 (AF486522). Es de destacar que el pNG2

Se ha demostrado que la pEP2 miniderivada se replica mediante un mecanismo de círculo rodante (56). Aunque las observaciones disponibles promueven fuertemente la opinión de que todos estos plásmidos se replican de manera similar, valdría la pena identificar los orígenes de una sola hebra y de doble hebra (50, 62) de estos otros plásmidos utilizando derivados de deleción y demostrando que también se replican a través de un mecanismo similar al de pNG2. Curiosamente, la función de partición presente en pBY503 es un elemento de acción cis que no actúa aumentando el número de copias del plásmido (5 /), en contraste con el elemento de acción frwu identificado recientemente en pGAl, que promueve números de copia de hasta 35 copias. por equivalente de cromosoma (57).

La ingeniería de corinebacterias es de importancia biotecnológica para la producción de una variedad de compuestos. Por ejemplo, nuestro grupo ha producido con éxito a escala industrial numerosos aminoácidos por fermentación, incluidos, por ejemplo, ácido L-aspártico (05), L-isoleucina (64, 65) y L-valina (65). Anteriormente describimos un nuevo proceso industrial para la producción de estos aminoácidos. Este proceso se caracteriza por el uso de células intactas de C. glutamicum en condiciones de división celular reprimida, y se basa en una combinación de reutilización celular y recuperación de producto como medio para optimizar la proporción de sustratos transformados en productos útiles evitando el sumidero de energía en ciclos de mantenimiento celular y producción de biomasa. En nuestras manos, las células podrían reutilizarse hasta un mínimo de 30 veces (Fig. 4). Este esquema es posible principalmente por la propiedad intrínseca de C. glutamicum R que no sufre autólisis en condiciones de inanición. Además, se pueden aplicar una variedad de métodos para limitar la formación de subproductos, como el tratamiento térmico previo de las células para inactivar reacciones enzimáticas indeseables (65) o la adición de reactivos particulares (64).

Este proceso quizás esté mejor ejemplificado por el esquema que usamos para la producción de ácido L-aspártico (63). La cepa MJ233 de C. glutamicum (Brevibacterium flavum) es un aislado natural que exhibe una fuerte actividad aspartasa. Aprovechando esta propiedad, la conversión estequiométrica de fumarato a aspartato se logró mediante la inactivación térmica de la fumarasa, la enzima en el origen de la formación del subproducto (ácido málico). Se encontró que los tratamientos térmicos de 5 a 9 ha 45 ° C o de 2 ha 50 ° C eran óptimos para lograr una disminución del 90% en la actividad de la fiimarasa. Además, los iones calcio eran los únicos iones metálicos divalentes capaces de activar la aspartasa de C. glutamicum MJ233, y se observó que la adición de 0,08% peso / volumen del detergente Tween 20 (monolaurato de polioxietilensorbitán) aumentaba la actividad de la aspartasa hasta 40 %, presumiblemente a través de un aumento de la permeabilidad celular. Asimismo, se encontró que el ácido L-aspártico a una concentración mínima de 0,6 M protege la aspartasa durante el tratamiento térmico. Con base en este conocimiento empírico y en consideraciones económicas u operativas, el proceso de producción de ácido aspártico industrial fue diseñado como un proceso de múltiples fases. La primera fase comprende un paso de cultivo para generar biomasa y un paso de pre-reacción para diseñar a medida el conjunto de enzimas intracelulares. El paso de generación de biomasa se realiza en condiciones aeróbicas a 33 ° C durante 30 h en un medio de pH 7,6 que consta de 2,3% (NHUfcSO * 0,05% K2HP04, 0,05% KH2P04, 0,05% MgS04,7H20, 0,3% extracto de levadura, 0,3% casamino ácidos, 200 ppb de biotina, 100 ppb

Figura 4. El proceso de reacción de células vivas. Este proceso se caracteriza por el uso de una cepa de producción bacteriana que no sufre autólisis en condiciones de no crecimiento. Esta propiedad hace que la inmovilización sea innecesaria y permite el uso de equipos de fermentación estándar. Además, la tasa de utilización del carbono para la producción de productos se maximiza a medida que se minimizan el crecimiento vegetativo y las funciones de mantenimiento. La separación del producto de la mezcla de reacción y el reciclado de las células se realiza utilizando un aparato de ultrafiltración. La purificación de los productos secretados, como los aminoácidos, se ve facilitada por la contaminación insignificante de los materiales intracelulares. Además, las temperaturas y el pH subóptimos para el crecimiento se pueden utilizar como un medio para limitar la contaminación microbiana.

Figura 4. El proceso de reacción de células vivas. Este proceso se caracteriza por el uso de una cepa de producción bacteriana que no sufre autólisis en condiciones de no crecimiento. Esta propiedad hace que la inmovilización sea innecesaria y permite el uso de equipos de fermentación estándar. Además, la tasa de utilización del carbono para la producción de productos se maximiza a medida que se minimizan el crecimiento vegetativo y las funciones de mantenimiento. La separación del producto de la mezcla de reacción y el reciclado de las células se realiza utilizando un aparato de ultrafiltración. La purificación de los productos secretados, como los aminoácidos, se ve facilitada por la contaminación insignificante de los materiales intracelulares. Además, las temperaturas y el pH subóptimos para el crecimiento se pueden utilizar como un medio para limitar la contaminación microbiana.

clorhidrato de tiamina, 0,002% de FeSO4,7H20, 0,002% de MnSO4 / tH20, etanol al 2%. La etapa de prerreacción consiste en un tratamiento térmico a 45 ° C durante 5 h en una mezcla que consta de células al 3% peso / volumen, ácido L-aspártico 750 mM, cloruro amónico 2 M, cloruro cálcico 7,5 mM y 0,08% en peso. / volumen Tween 20. Este paso está diseñado para disminuir a un nivel insignificante la actividad de la fumarasa sin afectar significativamente la actividad de la aspartasa. La segunda fase se inicia recogiendo por centrifugación células tratadas térmicamente e inoculando con esas células una mezcla de reacción de pH 9,3 que consta de ácido fumárico 860 mM, NH4OH 4 M, CaCl2 7,5 mM. Los riesgos de contaminación se reducen al mínimo realizando operaciones a una temperatura relativamente alta (45 ° C) y a un pH alcalino. La tercera fase se caracteriza por el reciclaje celular en el que, aprovechando las características fisiológicas de C. glutamicum MJ233 (sin autólisis y sin fugas de macromoléculas intracelulares), la mezcla de reacción se separa de las células mediante ultrafiltración, normalmente utilizando una fibra hueca de polisulfón. Membrana de tipo tubular que puede soportar altas temperaturas y un pH alcalino. Como resultado, la concentración de producto puede alcanzar niveles de hasta aproximadamente 1,3 M. La capacidad de alcanzar concentraciones de producto tan altas es una característica industrial importante de este proceso, ya que facilita la última fase, la purificación del producto.

Por lo tanto, este proceso combina un diseño racional y empírico, y ofrece varias ventajas, incluida una fácil implementación en equipos de fermentación estándar, el uso de células vivas que no requieren inmovilización, además de una disminución de los riesgos de contaminación y un procesamiento posterior eficiente. Acuñamos la palabra LCR (Living-Cell-Reaction) para englobar todas las modificaciones de este proceso básico, y en particular aquellos esquemas industriales donde la fase de reacción se realiza en un medio mínimo desprovisto de biotina, un factor de crecimiento esencial, de manera que se detiene el crecimiento celular. . Este diseño industrial se puede adaptar a la producción de muchos otros productos químicos finos como los aminoácidos o los ácidos orgánicos (64,65).

A pesar de estos desarrollos, el uso industrial de bacterias corineformes se beneficiaría de la disponibilidad de una serie de vectores basados ​​en un plásmido de amplio rango de huéspedes que se replica a través de un mecanismo 0, como, en contraste con los típicos plásmidos de círculo rodante (50, 59) , las propiedades intrínsecas de estos episomas incluyen una alta estabilidad estructural y segregacional (60).

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio de Economía, Comercio e Industria (METI).

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Vectores de ingeniería genética

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Doctor investigando, Ilustración de estilo de dibujos animados

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Vectores en ingeniería genética - Presentación de PowerPoint PPT

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Plásmidos

Los plásmidos son secuencias de ADN bicatenarias, generalmente circulares, capaces de replicarse automáticamente en una célula huésped. Los vectores plasmídicos consisten mínimamente en el inserto transgénico y un origen de replicación, lo que permite la replicación semiindependiente del plásmido en el hospedador. Los plásmidos modernos generalmente tienen muchas más características, en particular un "sitio de clonación múltiple" con protuberancias de nucleótidos para la inserción de un inserto y múltiples sitios de consenso de enzimas de restricción a cada lado del inserto. Los plásmidos pueden ser conjugativos / transmisibles o no conjugativos. Los plásmidos conjugativos median la transferencia de ADN a través de la conjugación y, por lo tanto, se propagan rápidamente entre las células bacterianas de una población. Los plásmidos no conjugados no median el ADN a través de la conjugación.

Figura: Vector de clonación bacteriana: El plásmido pGEX-3x es un vector de clonación popular. Los diversos elementos del plásmido están marcados.


Técnicas de ingeniería genética [volver arriba]

La ingeniería genética es una disciplina muy joven, y solo es posible gracias al desarrollo de técnicas a partir de la década de 1960. Watson y Crick han hecho posibles estas técnicas a partir de nuestra mayor comprensión del ADN y cómo funciona tras el descubrimiento de su estructura en 1953. Aunque el objetivo final de la ingeniería genética suele ser la expresión de un gen en un huésped, de hecho la mayoría de los se emplean técnicas y tiempo en ingeniería genética para aislar un gen y luego clonarlo. Esta tabla enumera las técnicas que veremos en detalle.

Técnica

Objetivo

Para hacer una copia de ADN de ARNm

Para cortar el ADN en puntos específicos, haciendo pequeños fragmentos.

Unir fragmentos de ADN juntos

Para llevar ADN a las células y asegurar la replicación.

Para entregar un gen a una célula viva.

Para identificar células que han sido transformadas.

Para hacer copias exactas de colonias bacterianas en una placa de agar.

Amplificar muestras de ADN muy pequeñas.

Para identificar y etiquetar un fragmento de ADN que contiene una determinada secuencia.

Para encontrar un gen en particular en un genoma completo.

Para detener la expresión de un gen en una célula.

Para hacer un gen desde cero

Para separar fragmentos de ADN

* Información adicional que no se incluye directamente en AS Biology. Sin embargo, puede ayudar a consolidar otras técnicas.

1. ADN complementario [volver arriba]

El ADN complementario (ADNc) es ADN elaborado a partir de ARNm. Esto hace uso de la enzima. la transcriptasa inversa, que hace lo contrario de la transcripción: sintetiza ADN a partir de una plantilla de ARN. Es producido naturalmente por un grupo de virus llamado retrovirus (que incluye el VIH) y les ayuda a invadir las células. En ingeniería genética, la transcriptasa inversa se utiliza para hacer una gen artificial de ADNc como se muestra en este diagrama.

El ADN complementario ha ayudado a resolver diferentes problemas en ingeniería genética:

Hace que los genes sean mucho más fáciles de encontrar. Hay unos 70 000 genes en el genoma humano, y encontrar un gen entre tantos es una tarea muy difícil (aunque no imposible). Sin embargo, una célula determinada solo expresa unos pocos genes, por lo que solo produce unos pocos tipos diferentes de moléculas de ARNm. Por ejemplo, las células b del páncreas producen insulina, por lo que producen muchas moléculas de ARNm que codifican la insulina. Este ARNm puede aislarse de estas células y usarse para producir ADNc del gen de la insulina.

2. Enzimas de restricción [volver arriba]

Son enzimas que cortan el ADN en sitios específicos. Se llaman propiamente endonucleasas de restricción porque cortan los enlaces en el medio de la cadena de polinucleótidos. Algunas enzimas de restricción cortan directamente a través de ambas cadenas, formando extremos romos, pero la mayoría de las enzimas hacen un corte escalonado en las dos hebras, formando extremos pegajosos.

Los extremos cortados son `` pegajosos '' porque tienen tramos cortos de ADN monocatenario con secuencias complementarias. Estos extremos pegajosos se pegarán (o recocer) a otro fragmento de ADN mediante el emparejamiento de bases complementarias, pero solo si ambos han sido cortados con el mismo enzima restrictiva. Las enzimas de restricción son muy específicas y solo cortan el ADN en secuencias de bases específicas, de 4 a 8 pares de bases de longitud, llamadas secuencias de reconocimiento.

Las enzimas de restricción son producidas naturalmente por las bacterias como defensa contra los virus (restringen el crecimiento viral), pero son enormemente útiles en la ingeniería genética para cortar el ADN en lugares precisos (& quot; tijeras moleculares & quot). Los tramos cortos de ADN cortados por enzimas de restricción se denominan fragmentos de restricción. Se conocen miles de enzimas de restricción diferentes, con más de cien secuencias de reconocimiento diferentes. Las enzimas de restricción llevan el nombre de las especies de bacterias de las que provienen, por lo que EcoR1 es de E. coli cepa R, y HindIII es de Haemophilis influenzae.

3. ADN ligasa [volver arriba]

Esta enzima repara el ADN roto uniendo dos nucleótidos en una hebra de ADN. Se usa comúnmente en ingeniería genética para hacer lo contrario de una enzima de restricción, es decir, para unir fragmentos de restricción complementarios.

Los extremos pegajosos permiten que dos fragmentos de restricción complementarios recocer, pero solo por enlaces de hidrógeno débiles, que pueden romperse con bastante facilidad, por ejemplo, mediante un calentamiento suave. La columna vertebral aún está incompleta.

La ADN ligasa completa la estructura del ADN formando enlaces covalentes. Por lo tanto, las enzimas de restricción y la ADN ligasa pueden usarse juntas para unir longitudes de ADN de diferentes fuentes.

4. Vectores [volver arriba]

En biología, un vector es algo que transporta cosas entre especies. Por ejemplo, el mosquito es un vector de enfermedad porque transporta el parásito de la malaria a los humanos. En ingeniería genética un vector es una longitud de ADN que transporta el gen que queremos a la célula huésped. Se necesita un vector porque una longitud de ADN que contiene un gen por sí solo no hace nada dentro de una célula huésped. Dado que no es parte del genoma normal de la célula, no se replicará cuando la célula se divida, no se expresará y, de hecho, probablemente se descompondrá con bastante rapidez. Un vector soluciona estos problemas al tener estas propiedades:

Se han creado muchos vectores diferentes para diferentes propósitos en ingeniería genética mediante la modificación de moléculas de ADN de origen natural, y ahora están disponibles en el mercado. Por ejemplo un vector de clonación contiene secuencias que hacen que el gen se copie (quizás muchas veces) dentro de una célula, pero no se exprese. Un vector de expresión contiene secuencias que hacen que el gen se exprese dentro de una célula, preferiblemente en respuesta a un estímulo externo, como una sustancia química particular en el medio. También se encuentran disponibles diferentes tipos de vectores para diferentes longitudes de inserto de ADN:

Plásmido

Cromosoma artificial bacteriano (BAC)

5. Plásmidos [volver arriba]

Los plásmidos son, con mucho, el tipo de vector más común, por lo que veremos cómo se usan con cierto detalle. Los plásmidos son pequeños trozos circulares de ADN que se encuentran naturalmente en las células bacterianas. Un plásmido típico contiene 3-5 genes y generalmente hay alrededor de 10 copias de un plásmido en una célula bacteriana. Los plásmidos se copian por separado del ADN bacteriano principal cuando la célula se divide, por lo que los genes del plásmido se transmiten a todas las células hijas. También se utilizan de forma natural para el intercambio de genes entre células bacterianas (lo más cercano al sexo), por lo que las células bacterianas absorberán fácilmente un plásmido. Debido a que son tan pequeños, son fáciles de manipular en un tubo de ensayo y se pueden incorporar genes extraños con bastante facilidad utilizando enzimas de restricción y ADN ligasa.

Uno de los plásmidos más comúnmente utilizados es el Plásmido R (o pBR322). Este plásmido contiene un origen de replicación, varias secuencias de reconocimiento para diferentes enzimas de restricción (con nombres como Pstyo y EcoRI) y dos genes marcadores, que confieren resistencia a diferentes antibióticos (ampicilina y tetraciclina).

El siguiente diagrama muestra cómo se pueden incorporar fragmentos de ADN en un plásmido utilizando enzimas de restricción y ligasa. La enzima de restricción utilizada aquí (PstI) corta el plásmido en medio de uno de los genes marcadores (veremos por qué esto es útil más adelante). El ADN extraño se hibrida con el plásmido y se une covalentemente por ADN ligasa para formar un vector híbrido (en otras palabras, una mezcla o híbrido de ADN bacteriano y extraño). También se forman varios otros productos: algunos plásmidos simplemente se reasociarán consigo mismos para volver a formar el plásmido original, y algunos fragmentos de ADN se unirán para formar cadenas o círculos. Estos diferentes productos no se pueden separar fácilmente, pero no importa, ya que los genes marcadores se pueden usar más tarde para identificar el vector híbrido correcto.

6. Transferencia de genes [volver arriba]

Los vectores que contienen los genes que queremos deben incorporarse a las células vivas para que puedan replicarse o expresarse. Las células que reciben el vector se llaman células huésped, y una vez que han incorporado con éxito el vector, se dice que son transformado. Los vectores son moléculas grandes que no atraviesan fácilmente las membranas celulares, por lo que las membranas deben hacerse permeables de alguna manera. Hay diferentes formas de hacer esto según el tipo de célula huésped.

1. Bacteriófagos (o fagos) son virus que infectan bacterias. Son una forma muy eficaz de introducir genes grandes en células bacterianas en cultivo.

2. Adenovirus son virus humanos que causan enfermedades respiratorias, incluido el resfriado común. Su material genético es ADN de doble hebra y son ideales para transmitir genes a pacientes vivos en terapia génica. Su ADN no se incorpora a los cromosomas del huésped, por lo que no se replica, pero sus genes se expresan.

El adenovirus se modifica genéticamente para que las proteínas de su cubierta no se sinteticen, por lo que no se pueden ensamblar nuevas partículas de virus y no se destruye la célula huésped.

3. Retrovirus son un grupo de virus humanos que incluyen el VIH. Están encerrados en una membrana lipídica y su material genético es ARN bicatenario. En la infección, este ARN se copia al ADN y el ADN se incorpora al cromosoma del huésped. Esto significa que los genes extraños se replican en cada célula hija.

Después de cierto tiempo, el ADN inactivo se enciende y los genes se expresan en todas las células huésped.

7. Marcadores genéticos [volver arriba]

Estos son necesarios para identificar las células que han captado con éxito un vector y, por lo tanto, se han transformado. Con la mayoría de las técnicas anteriores, menos del 1% de las células absorben el vector, por lo que se necesita un marcador para distinguir estas células de todas las demás. Veremos cómo hacer esto con células huésped bacterianas, ya que esa es la técnica más común.

Un marcador común, utilizado en el plásmido R, es un gen de resistencia a un antibiótico como la tetraciclina. Las células bacterianas que absorben este plásmido pueden producir este producto genético y, por lo tanto, son resistentes a este antibiótico. Entonces, si las células se cultivan en un medio que contiene tetraciclina, todas las células normales no transformadas, junto con las células que han absorbido ADN que no está en un plásmido (99%), morirán. Solo sobrevivirán las células transformadas al 1%, que luego pueden cultivarse y clonarse en otra placa.

8. Galjanoplastia de réplica [volver arriba]

El recubrimiento de réplicas es una técnica simple para hacer una copia exacta de una placa de agar. Se presiona una almohadilla de tela estéril del mismo tamaño que la placa sobre la superficie de una placa de agar en la que crecen bacterias. Algunas células de cada colonia se pegarán a la tela. Si luego se presiona la tela sobre una nueva placa de agar, algunas células se depositarán y las colonias crecerán exactamente en las mismas posiciones en la nueva placa. Esta técnica tiene varios usos, pero el uso más común en ingeniería genética es ayudar a resolver otro problema en la identificación de células transformadas.

Este problema consiste en distinguir aquellas células que han ocupado un híbrido vector plásmido (con un gen extraño en él) de aquellas células que han absorbido el normal plásmido. Aquí es donde se usa el segundo gen marcador (para la resistencia a la ampicilina). Si el gen extraño se inserta en el medio de este gen marcador, el gen marcador se interrumpe y no producirá su producto génico adecuado. Por tanto, las células con el plásmido híbrido serán destruidas por la ampicilina, mientras que las células con el plásmido normal serán inmunes a la ampicilina. Dado que este método de identificación implica matar las células que queremos, primero debemos hacer una placa de agar maestra y luego hacer una placa de réplica de esta para probar la resistencia a la ampicilina.

Una vez que se han identificado las colonias de células que contienen el vector plásmido híbrido correcto, las colonias apropiadas en la placa maestra pueden seleccionarse y cultivarse en otra placa.

El plásmido R con sus genes de resistencia a los antibióticos data de los primeros días de la ingeniería genética en la década de 1970. En los últimos años se han desarrollado mejores plásmidos con diferentes genes marcadores que no matan las células deseadas, por lo que no necesitan una placa de réplica. Estos nuevos genes marcadores producen una enzima (en realidad, lactasa) que convierte un sustrato incoloro en el medio de agar en un producto de color azul que se puede ver fácilmente. Entonces, las células con un plásmido normal se vuelven azules en el medio correcto, mientras que aquellas con el plásmido híbrido no pueden producir la enzima y permanecer blancas. Estas colonias blancas se pueden identificar fácilmente y transferir a otra placa. Otro gen marcador, transferido de medusas, produce una proteína verde fluorescente (GFP).

9. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [volver arriba]

Los genes se pueden clonar clonando las células bacterianas que los contienen, pero esto requiere una gran cantidad de ADN en primer lugar. La PCR puede clonar (o amplificar) Muestras de ADN tan pequeñas como una sola molécula. Es una técnica más nueva, desarrollada en 1983 por Kary Mullis, por cuyo descubrimiento ganó el premio Nobel en 1993. La reacción en cadena de la polimerasa es simplemente la replicación del ADN en un tubo de ensayo. Si se mezcla una longitud de ADN con los cuatro nucleótidos (A, T, C y G) y la enzima ADN polimerasa en un tubo de ensayo, entonces el ADN se replicará muchas veces. Los detalles se muestran en este diagrama:

La PCR se puede automatizar por completo, por lo que en unas pocas horas una pequeña muestra de ADN se puede amplificar millones de veces con poco esfuerzo. El producto se puede utilizar para estudios adicionales, como clonación, electroforesis o sondas de genes. Debido a que la PCR puede usar muestras tan pequeñas, puede usarse en medicina forense (con ADN tomado de muestras de sangre, cabello o semen), e incluso puede usarse para copiar ADN de cuerpos humanos momificados, mamuts lanudos extintos o de un insecto que es estado encerrado en ámbar desde el período Jurásico. Un problema de la PCR es tener una muestra de ADN lo suficientemente pura para empezar. También se amplificará cualquier ADN contaminante, y esto puede causar problemas, por ejemplo, en casos judiciales.

10. Sondas de ADN [volver arriba]

Estos se utilizan para identificar y etiquetar fragmentos de ADN que contienen una secuencia específica. Una sonda es simplemente una pequeña longitud de ADN (20-100 nucleótidos de largo) con una etiqueta adherida. Hay dos tipos comunes de etiquetas que se utilizan:

Las sondas son siempre monocatenarias y pueden estar hechas de ADN o ARN. Si se agrega una sonda a una mezcla de diferentes piezas de ADN (por ejemplo, fragmentos de restricción), se apareará (par de bases) con cualquier longitud de ADN que contenga la secuencia complementaria. Estos fragmentos ahora estarán etiquetados y se destacarán del resto del ADN. Las sondas de ADN tienen muchos usos en la ingeniería genética:

11. Escopeta [volver arriba]

Esto se usa para encontrar un gen en particular en un genoma completo, un poco como encontrar la aguja proverbial en un pajar. Se llama técnica de la escopeta porque comienza rompiendo indiscriminadamente el genoma (como disparar una escopeta a un objetivo blando) y luego clasificando los escombros para el gen particular que queremos. Para que esto funcione, se necesita una sonda genética para el gen, lo que significa que se debe conocer al menos una pequeña parte de la secuencia del gen.

12. Genes antisentido [volver arriba]

Se utilizan para desactivar la expresión de un gen en una célula. El principio es muy simple: una copia del gen que se va a desconectar se inserta en el genoma del huésped al revés, de modo que se transcribe la hebra complementaria (o antisentido). El ARNm antisentido producido se hibridará con el ARNm de sentido normal formando ARN bicatenario. Los ribosomas no se pueden unir a esto, por lo que el ARNm no se traduce y el gen se `` desconecta '' de manera efectiva.

13. Síntesis de genes [volver arriba]

Es posible sintetizar químicamente un gen en el laboratorio uniendo laboriosamente los nucleótidos en el orden correcto. Las máquinas automatizadas ahora pueden hacer esto mucho más fácil, pero solo hasta un límite de aproximadamente 30 pb, por lo que se podrían crear muy pocos genes reales de esta manera (de todos modos, generalmente es mucho más fácil hacer ADNc). Los genes de las dos cadenas de insulina (xx pb) y de la hormona somatostatina (42 pb) se han sintetizado de esta manera. Es muy útil para hacer sondas genéticas.

14. Electroforesis [volver arriba]

Esta es una forma de cromatografía que se utiliza para separar diferentes piezas de ADN en función de su longitud. Por lo general, se puede usar para separar fragmentos de restricción. Las muestras de ADN se colocan en pocillos en un extremo de una placa delgada de gel hecha de agarosa o poliacrilamiday se cubre con una solución tampón. Se pasa una corriente eléctrica a través del gel. Cada nucleótido de una molécula de ADN contiene un grupo fosfato cargado negativamente, por lo que el ADN es atraído hacia el ánodo (el electrodo positivo). Las moléculas tienen que difundirse a través del gel, y las longitudes más pequeñas de ADN se mueven más rápido que las longitudes más grandes, que son retardadas por el gel. Entonces, cuanto menor sea la longitud de la molécula de ADN, más abajo se moverá el gel en un tiempo determinado. Al final de la carrera, se corta la corriente.

Desafortunadamente, el ADN del gel no se puede ver, por lo que debe visualizarse. Hay tres métodos comunes para hacer esto:


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Contenido

El término plásmido fue introducido en 1952 por el biólogo molecular estadounidense Joshua Lederberg para referirse a "cualquier determinante hereditario extracromosómico". [4] El uso temprano del término incluía cualquier material genético bacteriano que exista extracromosómicamente durante al menos parte de su ciclo de replicación, pero debido a que esa descripción incluye virus bacterianos, la noción de plásmido se refinó con el tiempo para incluir elementos genéticos que se reproducen de forma autónoma. [5] Más tarde en 1968, se decidió que el término plásmido debería ser adoptado como el término para elemento genético extracromosómico, [6] y para distinguirlo de virus, la definición se redujo a elementos genéticos que existen exclusiva o predominantemente fuera del cromosoma y puede replicarse de forma autónoma. [5]

Para que los plásmidos se repliquen de forma independiente dentro de una célula, deben poseer un tramo de ADN que pueda actuar como origen de replicación. La unidad de autorreplicación, en este caso, el plásmido, se llama replicón. Un replicón bacteriano típico puede constar de varios elementos, como el gen de la proteína de iniciación de la replicación (Rep) específica del plásmido, unidades repetidas llamadas iterones, cajas de DnaA y una región adyacente rica en AT. [5] Los plásmidos más pequeños hacen uso de las enzimas replicativas del huésped para hacer copias de sí mismos, mientras que los plásmidos más grandes pueden portar genes específicos para la replicación de esos plásmidos. Algunos tipos de plásmidos también pueden insertarse en el cromosoma del huésped, y estos plásmidos integradores a veces se denominan episomas en procariotas. [7]

Los plásmidos casi siempre portan al menos un gen. Muchos de los genes transportados por un plásmido son beneficiosos para las células huésped, por ejemplo: permiten que la célula huésped sobreviva en un entorno que de otro modo sería letal o restrictivo para el crecimiento. Algunos de estos genes codifican rasgos de resistencia a antibióticos o resistencia a metales pesados, mientras que otros pueden producir factores de virulencia que permiten a una bacteria colonizar un huésped y superar sus defensas o tener funciones metabólicas específicas que le permiten a la bacteria utilizar un nutriente particular, incluido el capacidad de degradar compuestos orgánicos recalcitrantes o tóxicos. [5] Los plásmidos también pueden proporcionar a las bacterias la capacidad de fijar nitrógeno. Sin embargo, algunos plásmidos no tienen un efecto observable sobre el fenotipo de la célula huésped o no se puede determinar su beneficio para las células huésped, y estos plásmidos se denominan plásmidos crípticos. [8]

Los plásmidos naturales varían mucho en sus propiedades físicas. Su tamaño puede variar desde miniplasmidos muy pequeños de menos de 1 kilopares de bases (Kbp) hasta megaplasmidos muy grandes de varios pares de megabase (Mbp). En el extremo superior, hay poca diferencia entre un megaplasmido y un minicromosoma. Los plásmidos son generalmente circulares, pero también se conocen ejemplos de plásmidos lineales. Estos plásmidos lineales requieren mecanismos especializados para replicar sus extremos. [5]

Los plásmidos pueden estar presentes en una célula individual en un número variable, desde uno hasta varios cientos. El número normal de copias de plásmido que se pueden encontrar en una sola célula se denomina número de copias de plásmido y está determinado por la forma en que se regula el inicio de la replicación y el tamaño de la molécula. Los plásmidos más grandes tienden a tener un menor número de copias. [7] Los plásmidos de bajo número de copias que existen solo como una o unas pocas copias en cada bacteria están, tras la división celular, en peligro de perderse en una de las bacterias segregantes. Dichos plásmidos de copia única tienen sistemas que intentan distribuir activamente una copia a ambas células hijas. Estos sistemas, que incluyen el sistema parABS y el sistema parMRC, a menudo se denominan sistema de partición o función de partición de un plásmido.

Los plásmidos pueden clasificarse de varias formas. Los plásmidos se pueden clasificar ampliamente en plásmidos conjugativos y plásmidos no conjugativos. Los plásmidos conjugativos contienen un conjunto de genes de transferencia que promueven la conjugación sexual entre diferentes células. [7] En el complejo proceso de conjugación, los plásmidos pueden transferirse de una bacteria a otra a través de pili sexuales codificados por algunos de los genes de transferencia (ver figura). [9] Los plásmidos no conjugativos son incapaces de iniciar la conjugación, por lo que solo pueden transferirse con la ayuda de plásmidos conjugativos. Una clase intermedia de plásmidos son movilizables y transportan solo un subconjunto de los genes necesarios para la transferencia. Pueden parasitar un plásmido conjugativo, transfiriéndose a alta frecuencia solo en su presencia.

Los plásmidos también se pueden clasificar en grupos de incompatibilidad. Un microbio puede albergar diferentes tipos de plásmidos, pero diferentes plásmidos solo pueden existir en una sola célula bacteriana si son compatibles. Si dos plásmidos no son compatibles, uno u otro se perderá rápidamente de la célula. Por lo tanto, se pueden asignar diferentes plásmidos a diferentes grupos de incompatibilidad dependiendo de si pueden coexistir juntos. Los plásmidos incompatibles (que pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad) normalmente comparten los mismos mecanismos de replicación o partición y, por lo tanto, no pueden mantenerse juntos en una sola célula. [10] [11]

Otra forma de clasificar los plásmidos es por función. Hay cinco clases principales:

  • Plásmidos F de fertilidad, que contienen tra genes. Son capaces de conjugarse y dan como resultado la expresión de pili sexuales.
  • Plásmidos de resistencia (R), que contienen genes que brindan resistencia contra antibióticos o venenos. Históricamente conocidos como factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plásmidos.
  • Col plásmidos, que contienen genes que codifican bacteriocinas, proteínas que pueden matar otras bacterias.
  • Plásmidos degradantes, que permiten la digestión de sustancias inusuales, p. Ej. tolueno y ácido salicílico.
  • Plásmidos de virulencia, que convierten a la bacteria en patógeno. p.ej. Plásmido Ti en Agrobacterium tumefaciens

Los plásmidos pueden pertenecer a más de uno de estos grupos funcionales.

Los plásmidos construidos artificialmente pueden usarse como vectores en ingeniería genética. Estos plásmidos sirven como herramientas importantes en los laboratorios de genética y biotecnología, donde se usan comúnmente para clonar y amplificar (hacer muchas copias de) o expresar genes particulares. [12] Existe una amplia variedad de plásmidos comercialmente disponibles para tales usos. El gen que se va a replicar normalmente se inserta en un plásmido que normalmente contiene una serie de características para su uso. Estos incluyen un gen que confiere resistencia a antibióticos particulares (la ampicilina se usa con mayor frecuencia para las cepas bacterianas), un origen de replicación para permitir que las células bacterianas repliquen el ADN plasmídico y un sitio adecuado para la clonación (denominado sitio de clonación múltiple ).

La inestabilidad estructural del ADN se puede definir como una serie de eventos espontáneos que culminan en una reordenación, pérdida o ganancia imprevista de material genético. Estos eventos se desencadenan con frecuencia por la transposición de elementos móviles o por la presencia de elementos inestables, como estructuras no canónicas (no B). Las regiones accesorias pertenecientes a la columna vertebral bacteriana pueden participar en una amplia gama de fenómenos de inestabilidad estructural.Los catalizadores bien conocidos de la inestabilidad genética incluyen repeticiones directas, invertidas y en tándem, que se sabe que son conspicuas en un gran número de vectores de clonación y expresión disponibles comercialmente. [13] Las secuencias de inserción también pueden afectar gravemente la función y el rendimiento del plásmido, al provocar deleciones y reordenamientos, activación, regulación a la baja o inactivación de la expresión de genes vecinos. [14] Por lo tanto, la reducción o eliminación completa de secuencias de la columna vertebral no codificantes extrañas reduciría significativamente la propensión a que ocurran tales eventos y, en consecuencia, el potencial recombinogénico general del plásmido. [15] [16]

Clonación Editar

Los plásmidos son los vectores de clonación bacteriana más utilizados. [17] Estos vectores de clonación contienen un sitio que permite insertar fragmentos de ADN, por ejemplo, un sitio de clonación múltiple o un polienlazador que tiene varios sitios de restricción de uso común a los que se pueden ligar fragmentos de ADN. Una vez que se inserta el gen de interés, los plásmidos se introducen en las bacterias mediante un proceso llamado transformación. Estos plásmidos contienen un marcador seleccionable, generalmente un gen de resistencia a antibióticos, que confiere a las bacterias la capacidad de sobrevivir y proliferar en un medio de crecimiento selectivo que contiene los antibióticos particulares. Las células después de la transformación se exponen al medio selectivo y solo las células que contienen el plásmido pueden sobrevivir. De esta forma, los antibióticos actúan como un filtro para seleccionar solo las bacterias que contienen el ADN plasmídico. El vector también puede contener otros genes marcadores o genes indicadores para facilitar la selección de plásmidos con inserciones clonadas. A continuación, las bacterias que contienen el plásmido pueden cultivarse en grandes cantidades, recolectarse y luego aislarse el plásmido de interés usando varios métodos de preparación de plásmidos.

Normalmente se usa un vector de clonación de plásmido para clonar fragmentos de ADN de hasta 15 kpb. [18] Para clonar longitudes más largas de ADN, se utilizan fagos lambda con genes de lisogenia eliminados, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos o cromosomas artificiales de levadura.

Producción de proteínas Editar

Otro uso importante de los plásmidos es producir grandes cantidades de proteínas. En este caso, los investigadores cultivan bacterias que contienen un plásmido que alberga el gen de interés. Así como la bacteria produce proteínas para conferir su resistencia a los antibióticos, también puede inducirse a producir grandes cantidades de proteínas a partir del gen insertado. Esta es una forma barata y fácil de producir en masa la proteína que el gen codifica, por ejemplo, para la insulina.

Terapia genética Editar

Los plásmidos también pueden usarse para la transferencia de genes como un tratamiento potencial en la terapia génica para que puedan expresar la proteína que falta en las células. Algunas formas de terapia génica requieren la inserción de genes terapéuticos en sitios diana cromosómicos preseleccionados dentro del genoma humano. Los vectores plasmídicos son uno de los muchos enfoques que podrían usarse para este propósito. Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) ofrecen una forma de provocar una rotura de doble hebra específica del sitio en el genoma del ADN y provocar una recombinación homóloga. Los plásmidos que codifican ZFN podrían ayudar a administrar un gen terapéutico a un sitio específico para evitar el daño celular, las mutaciones que causan cáncer o una respuesta inmune. [19]

Modelos de enfermedades Editar

Históricamente, los plásmidos se utilizaron para diseñar genéticamente las células madre embrionarias de ratas para crear modelos de enfermedades genéticas de ratas. La eficacia limitada de las técnicas basadas en plásmidos impidió su uso en la creación de modelos de células humanas más precisos. Sin embargo, los avances en las técnicas de recombinación de virus adenoasociados y las nucleasas con dedos de zinc han permitido la creación de una nueva generación de modelos de enfermedades humanas isogénicas.

El término episome fue introducido por François Jacob y Élie Wollman en 1958 para referirse al material genético extracromosómico que puede replicarse de forma autónoma o integrarse en el cromosoma. [20] [21] Desde que se introdujo el término, sin embargo, su uso ha cambiado, ya que plásmido se ha convertido en el término preferido para la replicación autónoma del ADN extracromosómico. En un simposio de 1968 en Londres, algunos participantes sugirieron que el término episome ser abandonado, aunque otros continuaron usando el término con un cambio de significado. [22] [23]

Hoy en día, algunos autores utilizan episome en el contexto de procariotas para referirse a un plásmido que es capaz de integrarse en el cromosoma. Los plásmidos integradores pueden replicarse y mantenerse de manera estable en una célula a través de múltiples generaciones, pero en algún momento, existirán como una molécula de plásmido independiente. [24] En el contexto de eucariotas, el término episome se utiliza para referirse a una molécula de ADN circular cerrada extracromosómica no integrada que puede replicarse en el núcleo. [25] [26] Los virus son los ejemplos más comunes de esto, como los herpesvirus, adenovirus y poliomavirus, pero algunos son plásmidos. Otros ejemplos incluyen fragmentos cromosómicos aberrantes, como cromosomas de doble minuto, que pueden surgir durante amplificaciones de genes artificiales o en procesos patológicos (p. Ej., Transformación de células cancerosas). Los episomas en eucariotas se comportan de manera similar a los plásmidos en procariotas en que el ADN se mantiene y se replica de manera estable con la célula huésped. También pueden aparecer episomas virales citoplasmáticos (como en las infecciones por poxvirus). Algunos episomas, como los herpesvirus, se replican en un mecanismo de círculo rodante, similar a los virus fagos bacterianos. Otros se replican a través de un mecanismo de replicación bidireccional (Tipo theta plásmidos). En cualquier caso, los episomas permanecen físicamente separados de los cromosomas de la célula huésped. Varios virus del cáncer, incluido el virus de Epstein-Barr y el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi, se mantienen como episomas cromosómicamente distintos latentes en las células cancerosas, donde los virus expresan oncogenes que promueven la proliferación de células cancerosas. En los cánceres, estos episomas se replican pasivamente junto con los cromosomas del huésped cuando la célula se divide. Cuando estos episomas virales inician la replicación lítica para generar múltiples partículas de virus, generalmente activan los mecanismos de defensa de la inmunidad innata celular que matan a la célula huésped.

Algunos plásmidos o huéspedes microbianos incluyen un sistema de adicción o un sistema de muerte possegregacional (PSK), como el sistema hok / sok (muerte del huésped / supresor de muerte) del plásmido R1 en Escherichia coli. [27] Esta variante produce tanto un veneno de larga duración como un antídoto de corta duración. En la bibliografía [28] se describieron varios tipos de sistemas de adicción a plásmidos (toxina / antitoxina, basados ​​en el metabolismo, sistemas de TRO) y se utilizaron en aplicaciones biotécnicas (fermentación) o biomédicas (terapia de vacunas). Las células hijas que retienen una copia del plásmido sobreviven, mientras que una célula hija que no hereda el plásmido muere o sufre una tasa de crecimiento reducida debido al veneno persistente de la célula madre. Finalmente, se podría mejorar la productividad general.

Por el contrario, los plásmidos utilizados en biotecnología, como pUC18, pBR322 y vectores derivados, casi nunca contienen sistemas de adicción a toxina-antitoxina y, por lo tanto, deben mantenerse bajo presión de antibióticos para evitar la pérdida de plásmidos.

Las levaduras albergan de forma natural varios plásmidos. Entre ellos se destacan los plásmidos de 2 μm (pequeños plásmidos circulares que se utilizan a menudo para la ingeniería genética de levaduras) y los plásmidos pGKL lineales de Kluyveromyces lactis, que son responsables de fenotipos asesinos. [29]

Otros tipos de plásmidos a menudo están relacionados con vectores de clonación de levadura que incluyen:

  • Plásmido integrativo de levadura (YIp), vectores de levadura que dependen de la integración en el cromosoma del hospedador para la supervivencia y la replicación, y se usan generalmente cuando se estudia la funcionalidad de un solo gen o cuando el gen es tóxico. También relacionado con el gen URA3, que codifica una enzima relacionada con la biosíntesis de nucleótidos de pirimidina (T, C)
  • Plásmido replicativo de levadura (YRp), que transportan una secuencia de ADN cromosómico que incluye un origen de replicación. Estos plásmidos son menos estables, ya que pueden perderse durante la gemación.

Los plásmidos se utilizan a menudo para purificar una secuencia específica, ya que pueden purificarse fácilmente del resto del genoma. Para su uso como vectores y para la clonación molecular, los plásmidos a menudo deben aislarse.

Existen varios métodos para aislar el ADN plasmídico de las bacterias, que van desde el miniprep hasta el maxiprep o bulkprep. [12] El primero se puede utilizar para averiguar rápidamente si el plásmido es correcto en cualquiera de varios clones bacterianos. El rendimiento es una pequeña cantidad de ADN plásmido impuro, que es suficiente para el análisis por digestión por restricción y para algunas técnicas de clonación.

En este último, se cultivan volúmenes mucho mayores de suspensión bacteriana a partir de los cuales se puede realizar una maxi-prep. En esencia, se trata de una minipreparación ampliada seguida de una purificación adicional. Esto da como resultado cantidades relativamente grandes (varios cientos de microgramos) de ADN plasmídico muy puro.

Se han creado muchos kits comerciales para realizar la extracción de plásmidos a diversas escalas, pureza y niveles de automatización.

El ADN plasmídico puede aparecer en una de las cinco conformaciones, que (para un tamaño determinado) se ejecutan a diferentes velocidades en un gel durante la electroforesis. Las conformaciones se enumeran a continuación en orden de movilidad electroforética (velocidad para un voltaje aplicado dado) de más lenta a más rápida:

  • Circular abierta mellada El ADN tiene una hebra cortada.
  • Circular relajado El ADN está completamente intacto con ambas hebras sin cortar, pero ha sido enzimáticamente relajado (superenrollamientos eliminados). Esto se puede modelar dejando que un cable de extensión retorcido se desenrolle y se relaje y luego enchufándolo a sí mismo.
  • Lineal El ADN tiene extremos libres, ya sea porque se han cortado ambas hebras o porque el ADN era lineal. en vivo. Esto se puede modelar con un cable de extensión eléctrico que no esté enchufado a sí mismo.
  • Superenrollado (o circular covalentemente cerrado) El ADN está completamente intacto con ambas hebras sin cortar y con una torsión integral, lo que da como resultado una forma compacta. Esto se puede modelar girando un cable de extensión y luego enchufándolo a sí mismo.
  • Superenrollado desnaturalizado El ADN es como ADN superenrollado, pero tiene regiones no apareadas que lo hacen un poco menos compacto, esto puede resultar de una alcalinidad excesiva durante la preparación del plásmido.

La tasa de migración de pequeños fragmentos lineales es directamente proporcional al voltaje aplicado a bajos voltajes. A voltajes más altos, los fragmentos más grandes migran a velocidades continuamente crecientes pero diferentes. Por tanto, la resolución de un gel disminuye con el aumento de voltaje.

A un voltaje bajo especificado, la tasa de migración de pequeños fragmentos de ADN lineal es función de su longitud. Los fragmentos lineales grandes (más de 20 kb aproximadamente) migran a una cierta velocidad fija independientemente de la longitud. Esto se debe a que las moléculas "respetan", con la mayor parte de la molécula siguiendo el extremo principal a través de la matriz de gel. Los digestiones de restricción se utilizan con frecuencia para analizar plásmidos purificados. Estas enzimas rompen específicamente el ADN en ciertas secuencias cortas. Los fragmentos lineales resultantes forman "bandas" después de la electroforesis en gel. Es posible purificar ciertos fragmentos cortando las bandas del gel y disolviendo el gel para liberar los fragmentos de ADN.

Debido a su estrecha conformación, el ADN superenrollado migra más rápido a través de un gel que el ADN lineal o circular abierto.

El uso de plásmidos como técnica en biología molecular está respaldado por software bioinformático. Estos programas registran la secuencia de ADN de los vectores plasmídicos, ayudan a predecir los sitios de corte de las enzimas de restricción y a planificar las manipulaciones. Ejemplos de paquetes de software que manejan mapas de plásmidos son ApE, Clone Manager, GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler, LabGenius, Lasergene, MacVector, pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI y WebDSV. Estas piezas de software ayudan a realizar experimentos completos in silico antes de realizar experimentos húmedos. [30]

Se han creado muchos plásmidos a lo largo de los años y los investigadores han distribuido plásmidos a bases de datos de plásmidos como las organizaciones sin fines de lucro Addgene y BCCM / LMBP. Uno puede encontrar y solicitar plásmidos de esas bases de datos para la investigación. Los investigadores también suelen cargar secuencias de plásmidos en la base de datos del NCBI, desde donde se pueden recuperar secuencias de plásmidos específicos.


Vectores para ingeniería genética - Biología

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