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12.5: BCL-2 - Biología

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BCL-2 es un protooncogén humano ubicado en el cromosoma 18. Su producto es una proteína de membrana integral (llamada Bcl-2) ubicada en las membranas del retículo endoplásmico (RE), la envoltura nuclear y en las membranas externas de las mitocondrias. El gen fue descubierto como el locus translocado en un B-Cana leucemia (de ahí el nombre). Esta translocación también se encuentra en algunos linfomas de células B.

En las células B cancerosas, la porción del cromosoma 18 que contiene el BCL-2 el locus ha sufrido una translocación recíproca con la parte del cromosoma 14 que contiene el locus de la cadena pesada del anticuerpo. Esta translocación t (14; 18) coloca al BCL-2 gen cercano al potenciador del gen de la cadena pesada. Este potenciador es muy activo en las células B (cuya función es sintetizar grandes cantidades de anticuerpos). Por lo tanto, no es sorprendente encontrar que la proteína Bcl-2 se expresa en niveles altos en estas células t (14; 18).

Que hace BCL-2 un protooncogén?

Las células B, como todos los linfocitos activados, mueren unos días después de haber tenido la oportunidad de hacer su trabajo. Esto asegura que no se demoren después de que se haya tratado la amenaza y dirijan su ataque contra los componentes propios. Las células B envejecidas se matan a sí mismas al apoptosis. Sin embargo, los altos niveles de la proteína Bcl-2 protegen a las células de la muerte prematura por apoptosis. La proteína Bcl-2 suprime la apoptosis impidiendo la activación de las caspasas que llevan a cabo el proceso. Por tanto, los genes que codifican inhibidores de la apoptosis deben añadirse a la lista de genes que pueden actuar como oncogenes. En este caso, el efecto no se logra aumentando la tasa de proliferación celular sino reduciendo la tasa de muerte celular.

Aunque la translocación t (14:18) se encuentra en los linfomas y leucemias de células B, algo más debe contribuir a crear el cáncer porque más del 50% de nosotros tenemos pequeñas cantidades de células B con esa translocación que nunca progresan a cáncer. Los loci de genes de anticuerpos son lugares peligrosos para que los protooncogenes se establezcan. Translocación del protooncogén c-myc cerca del potenciador de los genes de la cadena pesada del anticuerpo también produce células B cancerosas que resultan en el linfoma de Burkitt. La translocación de la BCL-2 locus es solo una de las muchas mutaciones que pueden dar lugar a un clon maligno de células B. Todas las leucemias resultantes se designan leucemia linfocítica crónica o CLL.


El orégano demuestra distintos efectos supresores de tumores en el modelo de carcinoma de mama

Objetivo: Ha habido un interés considerable en la identificación de alimentos vegetales naturales para desarrollar agentes eficaces contra el cáncer. Por tanto, se evaluaron los efectos antitumorales del orégano en el modelo de cáncer de mama in vivo e in vitro.

Métodos: Se administró orégano liofilizado (ORE) en dos concentraciones de 0.3 y 3% a través de la dieta. El experimento se terminó 14 semanas después de la administración del carcinógeno. En la autopsia, los tumores mamarios se extrajeron y se prepararon para análisis histopatológico e inmunohistoquímico. Además, se llevó a cabo una evaluación in vitro en células MCF-7.

Resultados: ORE en dosis bajas suprimió la frecuencia de tumores en un 55,5%, la incidencia de tumores en un 44% y el volumen de tumores en un 44,5% en comparación con los animales de control. El análisis de células tumorales de rata mostró una disminución de la expresión de Ki67, VEGFR-2, CD24 y EpCAM y un aumento de la expresión de caspasa-3 después del tratamiento con dosis bajas de ORE. Las dosis altas de ORE alargaron la latencia tumoral en 12,5 días, además, se observó una disminución de la expresión de Bcl-2, VEGFR-2, CD24 y EpCAM y un aumento de la expresión de caspasa-3 en las células de carcinoma. El análisis histopatológico reveló una disminución en la proporción de carcinomas de grado alto / bajo en ambos grupos tratados. Los estudios in vitro mostraron que ORE disminuyó la supervivencia y la proliferación de células MCF-7. En las células MCF-7 tratadas con ORE, un aumento en las células que expresan sub-G 0/GRAMO 1 Se observó contenido de ADN y un aumento en el porcentaje de células MCF-7 positivas a anexina V / PI. In vitro, se encontraron vías apoptóticas tanto dependientes de caspasa como posibles vías apoptóticas no dependientes de caspasa. Se observó la desactivación de la actividad antiapoptótica de Bcl-2, una disminución del potencial de membrana mitocondrial y la activación de la vía de apoptosis mitocondrial en las células MCF-7 tratadas con ORE.

Conclusiones: Nuestros resultados demuestran, por primera vez, un efecto supresor de tumores distinto del orégano en el modelo de cáncer de mama.

Palabras clave: Angiogénesis Apoptosis Células madre cancerosas Proliferación celular Células MCF-7 Carcinogénesis mamaria Orégano Rata.


Papel de la activación de la autofagia en el alivio de la neurotoxicidad del alcohol

Proteína de la familia Bcl-2

Las proteínas de la familia Bcl-2 son objetivos conocidos de la exposición al alcohol en el cerebro (Heaton et al., 2015). Son bien conocidos por su regulación de la muerte / supervivencia celular. Estudios recientes indican que las proteínas de la familia Bcl-2 juegan un papel doble en la regulación de la autofagia además de su papel en la supervivencia celular (Decuypere et al, 2012 Hardwick y Soane, 2013). Las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2, como Bcl-2, Bcl-xL y Mcl-1, pueden suprimir la autofagia al unirse directamente a Beclin1. Parece que solo la proteína Bcl-2 que reside en ER suprime la autofagia (Pattingre et al., 2005 Chang et al., 2010). Además de unirse con Beclin1, Bcl-2 y Bcl-xL también pueden regular negativamente la respuesta autofágica al controlar la homeostasis del calcio ER, que juega un papel importante en el inicio de la autofagia (Brady et al., 2007 Høyer-Hansen et al. ., 2007). A diferencia de las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2, las proteínas proapoptóticas solo de BH3, como Bnip3, Bnip3L / Nix, Bad, Bik, Noxa, Puma y Bim, generalmente inducen autofagia a través de su unión a Bcl-2 y el posterior desplazamiento de la inhibidor Bcl-2 del complejo Beclin1. Sin embargo, el papel de las proteínas proapoptóticas Bax y Bak en la autofagia es controvertido. Se ha informado de la regulación tanto positiva como negativa de la autofagia por Bax y Bak (Ding et al., 2011).

Se ha demostrado que el etanol modula la proteína de la familia Bcl-2 en neuronas in vitro e in vivo (Ge et al., 2004 Liu et al., 2009 Heaton et al., 2011, 2015 Ali Shah et al., 2013). Generalmente, el alcohol disminuye la expresión de proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 pero aumenta la expresión de proteínas antiapoptóticas, que pueden activar la autofagia.


Resultados

Proteína Bcl-2 recombinante con la secuencia transmembrana (TM) C-terminal reemplazada por una His6-etiqueta (Su6-Bcl-2 & # x00394TM). El liposoma se hizo con los lípidos característicos de MOM y un análogo de lípido quelante de Ni 2+ que se une a la His6-etiqueta en el extremo C-terminal del Bcl-2 recombinante, generando así un Bcl-2 unido a la membrana que imita al Bcl-2 unido a MOM nativo. El liposoma también se cargó con colorante de fluorescencia, Cascade Blue (CB, Mr & # x0223c0,5 kDa) o dextranos marcados con CB (Mr & # x0223c3 o 10 kDa). La formación de poros por el Bcl-2 liberaría las moléculas fluorescentes del liposoma, que se unirían al anticuerpo anti-CB fuera del liposoma provocando la reducción (extinción) de la fluorescencia del CB. La extensión y la cinética de la extinción de la fluorescencia indican la extensión y la cinética de la liberación de tinte del liposoma, que se correlacionan directamente con la extensión y la cinética de la formación de poros de Bcl-2 en la membrana.

Correlación directa entre concentración y tamaño de poro de Bcl-2

Usando el enfoque anterior, examinamos el grado de liberación de las tres moléculas fluorescentes de diferentes tamaños por diferentes concentraciones de Bcl-2 después de la interacción con tBid. Como se muestra en la Figura 1A, la liberación significativa de CB de 0,5 kDa comenzó a una concentración de Bcl-2 más baja (25 nM) que la de CB-dextrano de 3 kDa (50 nM). No se detectó liberación de CB-dextrano de 10 kDa incluso a la concentración más alta de Bcl-2 (100 nM). Si los poros de Bcl-2 están formados solo por monómeros, estos poros deben tener un tamaño uniforme que será independiente de la concentración de Bcl-2. Dado que los resultados muestran que el tamaño de poro de Bcl-2 depende positivamente de la concentración de Bcl-2, sugiere que la oligomerización de Bcl-2 está implicada en la formación de los poros, al menos el grande.

A, grado de liberación de colorantes CB de 0,5 kDa (barra negra), 3 (barra estirada) o dextranos CB de 10 kDa (barra blanca) de liposomas quelantes de Ni 2+ 12,5 & # x003bcM por diversas concentraciones de His6-La proteína Bcl-2 & # x00394TM en presencia o ausencia de tBid 10 nM se determinó por el grado de extinción de la fluorescencia (& # x00394FBcl-2 y # x00394TM/ & # x00394FTritón) después de una incubación de 3 horas a pH 7,4. Los datos mostrados son promedios de tres experimentos independientes con desviación estándar (S.D., barra de error). B, libera la cinética del colorante CB y CB-dextranos de 12.5 & # x003bcM Ni 2+ -liposoma por 100 nM His6Se midió -Bcl-2 & # x00394TM y tBid 10 nM a pH 7,4 controlando continuamente el grado de extinción de la fluorescencia durante 3 horas. Los datos mostrados son promedios de tres experimentos independientes con S.D. (barras de error). (& # x025a1) CB de 0,5 kDa (& # x025cf) CB-dextrano de 3 kDa (& # x025cb) CB-dextrano de 10 kDa (& # x025a0) el control negativo, liposoma cargado con CB de 0,5 kDa incubado con tampón de proteína .

Correlación inversa entre la cinética de liberación de tinte por Bcl-2 y el tamaño del tinte

Para probar más el modelo para la formación de poros de Bcl-2, se examinó la cinética de liberación de tintes de diferentes tamaños. Como se muestra en la Figura 1B, aunque tanto CB de 0,5 kDa como CB-dextrano de 3 kDa fueron liberados del liposoma por Bcl-2 100 nM después de la interacción con tBid, el colorante pequeño se liberó a una velocidad mayor que el grande. El tiempo para la mitad de la liberación máxima (t1/2) para CB y CB-dextrano fue & # x0223c3 y 30 min, respectivamente. El CB-dextrano de 10 kDa no se liberó incluso después de horas de incubación, descartando la posibilidad de que la exposición prolongada de los liposomas a Bcl-2 y tBid pueda causar daños no específicos a la membrana. Si los poros de Bcl-2 están formados solo por monómeros, los tintes de diferentes tamaños deben liberarse del liposoma a la misma velocidad que dicta la velocidad de conversión de Bcl-2 de la conformación unida a la membrana a la conformación de los poros, una constante a una concentración de proteína dada. Por el contrario, si la oligomerización está implicada en la formación de poros, la velocidad de liberación del colorante pequeño debería ser mayor que la del colorante grande, ya que la velocidad de formación de poros oligoméricos pequeños debería ser mayor que la de los poros oligoméricos grandes. Por lo tanto, los datos cinéticos anteriores proporcionan más apoyo al modelo de que las proteínas Bcl-2 forman poros mediante oligomerización.

Mejora de la formación de poros por oligomerización de Bcl-2

Para determinar el efecto de la oligomerización de Bcl-2 sobre la formación de poros, se utilizaron proteínas Bcl-2 en diferentes estados oligoméricos o de diferentes potencias oligomerizantes. Durante la purificación de Su6-Bcl-2 & # x00394TM, observamos que la proteína se eluyó de la columna de filtración en gel Superdex 200 principalmente en las fracciones monomérica y oligomérica según se juzga por su coelución con los estándares de proteína de 25 y 200 kDa, respectivamente (Fig.2A ). La proteína en ambas fracciones es & # x0223c90% pura según el análisis SDS-PAGE seguido de tinción con azul de Coomassie (Fig. 2B). La identidad de la proteína se confirmó mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo específico para Bcl-2 (Fig. 2C). La masa molar media ponderada de la proteína monomérica es 24,540 & # x000b1 982 g / mol según se determina mediante análisis de dispersión de luz de múltiples ángulos (Fig. 2D), cerrado al valor calculado para His monomérico6-Bcl-2 & # x00394TM, 24,795 g / mol, lo que confirma que la proteína monomérica es la Bcl-2 monomérica. Posiblemente, la proteína oligomérica es un oligómero Bcl-2 ya que eluyó antes que la proteína monomérica de la columna de filtración en gel. El monómero y oligómero Bcl-2 purificado son bastante estables ya que se eluyeron en la fracción correspondiente después de una segunda cromatografía de filtración en gel (Fig. 2E). Esto nos brindó la oportunidad de probar qué forma de la proteína Bcl-2 es más eficiente en la formación de poros. Como se muestra en la Figura 2F, las proteínas Bcl-2 tanto monoméricas como oligoméricas liberaron la misma cantidad de CB-dextranos de 3 kDa de los liposomas después de una incubación de 3 horas. Sin embargo, la cinética de liberación de colorante por las dos formas de Bcl- es diferente. La tasa de liberación inducida por el oligomérico Bcl-2 es mucho mayor que la del monomérico ya que t1/2 para el primero es & # x0223c3.3 min y el segundo & # x0223c30 min. Estos resultados demuestran que, aunque tanto el oligómero como el monómero de Bcl-2 son competentes para la formación de poros, el oligómero es mucho más eficiente en la formación de poros que el monómero, lo que indica que la oligomerización de Bcl-2 es un paso intermedio durante la formación de poros. formando reacción.

A, oligomerización de His6-Bcl-2 & # x00394TM se examinó mediante cromatografía de filtración en gel. La A280 se controló para cada fracción eluida y se representó gráficamente. Las posiciones de elución para los estándares de proteínas se indican en la parte superior del gráfico con la correspondiente Mr. B, pureza de His monomérico (carril 1) y oligomérico (carril 2)6Las proteínas -Bcl-2 & # x00394TM eluidas de la columna de filtración en gel anterior se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie. METROr de patrones de proteínas se indica a la izquierda del gel. C, identidad del monomérico (carril 1) y oligomérico (carril 2) His6Las proteínas -Bcl-2 & # x00394TM se determinaron mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo específico de Bcl-2. D, peso promedio de la masa molar de His6El monómero -Bcl-2 & # x00394TM eluido de la columna de filtración en gel se determinó mediante análisis de dispersión de luz de múltiples ángulos. mi, estabilidad de His de tipo salvaje6-El oligómero Bcl-2 & # x00394TM (gráfico superior, & # x025cf) y monómero (gráfico inferior, & # x025a0), o el monómero mutante G154A / G155A (gráfico inferior, & # x025cb) en solución se probó inyectando las fracciones correspondientes de la primera columna de filtración en gel en la segunda cromatografía. F, libera la cinética de CB-dextrano de 3 kDa de 12,5 & # x003bcM Ni 2+ -liposoma por 100 nM His6Se monitorizó el monómero u oligómero -Bcl-2 & # x00394TM y tBid 10 nM a pH 7,4 como anteriormente. Los datos mostrados son promedios con S.D. (barras de error) de tres experimentos independientes usando el oligómero Bcl-2 (& # x025b2), monómero (& # x025cb) o tampón de proteína (& # x025cf).

En un estudio anterior, generamos un mutante Bcl-2 en el que los dos residuos de glicina en las posiciones 154 y 155 se cambiaron a alanina. Este mutante mostró una mayor actividad de formación de poros en los liposomas (14). Midiendo el aumento dependiente de la concentración de la anisotropía de triptófano, encontramos que la proteína mutante tiene una afinidad de homoasociación 6,5 veces mayor que la proteína de tipo salvaje (Fig. 3A). Cuando se compara con la proteína monomérica de tipo salvaje, la proteína mutante monomérica (Fig. 3B) tenía una extensión mucho mayor de formación del poro que libera tinte de 3 kDa después de una incubación de 3 horas. Además, la cinética de formación de poros fue mucho más rápida con el mutante, con una t1/2 de & # x0223c10 min, que es 3 veces más corto que el t1/2 para el tipo salvaje (Fig. 3B). Estos datos apoyan aún más el modelo de que la oligomerización de las proteínas Bcl-2 facilita la formación de poros.

A, homo-asociación de His de tipo salvaje6-Bcl-2 & # x00394TM o el mutante G154A / G155A se examinó midiendo la anisotropía de fluorescencia después de valorar la proteína correspondiente en el tampón D. Los datos mostrados son promedios de tres valoraciones independientes con S.D. (barras de error) y (& # x025a0) para el tipo salvaje y (& # x025cf) para el mutante. KD para la unión de tipo salvaje o mutante es 196 & # x000b1 43 o 30 & # x000b1 5 nM, respectivamente. B, se controló la cinética de liberación de CB-dextrano de 3 kDa del liposoma de Ni 2+ 12,5 & # x003bcM en presencia de His monomérico 100 nM de tipo salvaje6-Bcl-2 & # x00394TM o el mutante G154A / G155A y tBid 10 nM a pH 7,4 como anteriormente. Los datos mostrados son promedios con S.D. (barras de error) de tres experimentos independientes utilizando el tampón de tipo salvaje (& # x025cb), mutante (& # x025cf) o proteico (& # x025a1).

Oligomerización de Bcl-2 en membrana detectada por reticulación química y cromatografía de filtración en gel

Para determinar si se produce la oligomerización de Bcl-2 en la membrana liposomal, se utilizó un reticulante BMH reactivo con sulfhidrilo homobifuncional. El suyo6La proteína -Bcl-2 & # x00394TM contiene solo una cisteína en la posición 158. Por lo tanto, solo se puede generar el aducto dímero (Fig. 4A), aunque algunos Bcl-2 están en forma oligomérica como se muestra por cromatografía de filtración en gel (Fig. 2A). La especificidad de la reacción de BMH se demostró por el hecho de que no se observó ningún aducto de dímero incluso en presencia de BMH cuando se usó un mutante Bcl-2 nulo en cisteína (Fig. 4A).

A, homo-asociación de Su6-Bcl-2 & # x00394TM en solución (pH 7,4) se detectó mediante reticulación con BMH. Los datos mostrados son un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie representativo de tres experimentos independientes. (& # x025cf), flecha de monómero Bcl-2, dímero Bcl-2 reticulado. B, homo-asociación de Su6-Bcl-2 & # x00394TM en la membrana liposomal se controló mediante reticulación de BMH después de que la proteína se incubó con el liposoma a pH 5,0, y la proteína unida a la membrana se purificó usando centrifugación flotante con sacarosa. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes. C, oligomerización de His 50 u 800 nM6-Bcl-2 & # x00394TM en la membrana se determinó mediante cromatografía de filtración en gel después de incubar la proteína a pH 7,4 con liposoma Ni 2+ 12,5 & # x003bcM en ausencia o presencia de tBid 5 nM. Las proteínas de las fracciones eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia con un anticuerpo específico de Bcl-2. Las posiciones de elución de los estándares de proteínas se indican en la parte superior del gráfico con Mr. D, la oligomerización de Bax 200 nM en la membrana en ausencia o presencia de tBid 20 nM se determinó de manera similar, excepto que se usó un anticuerpo específico de Bax en la inmunotransferencia.

La proteína Bcl-2 se incubó con el liposoma a pH 5 durante 3 horas, una condición que se sabía que promueve la formación de poros (14). Después de la centrifugación por flotación de densidad de sacarosa, se recogió la fracción superior que contenía liposomas y se sometió a reticulación de BMH. Se detectó un aducto dependiente de BMH con un Mr & # x0223c50 kDa, el M predichor del dímero His6-Bcl-2 & # x00394TM (Fig. 4B). Dado que BMH contiene dos grupos maleimida espaciados por un enlazador 16 & # x000c5 y la molécula Bcl-2 tiene dimensiones de 50 & # x000d745 & # x000d735 (& # x000c5) de acuerdo con la estructura de RMN (3), el producto de reticulación es más probable formado por dos moléculas de Bcl-2 que se unen entre sí en la membrana. Por tanto, los datos demuestran que al menos algunas proteínas Bcl-2 forman dímeros en la membrana en la condición de formación de poros.

Para determinar el estado oligomérico de Bcl-2 unido a la membrana después de la interacción con tBid, otra condición bajo la cual Bcl-2 forma poros (Fig.1), primero aislamos los liposomas después de la incubación con Bcl-2 y / o tBid usando CL- 2B cromatografía de filtración en gel. Las proteínas unidas a la membrana se solubilizaron mediante CHAPS, un detergente iónico bipolar que no cambia el estado oligomérico de las proteínas de la familia Bcl-2 (25, 26), y luego se sometieron a cromatografía de filtración en gel Superdex 200. Como se muestra en la Figura 4C, la Bcl-2 unida a la membrana se detectó fácilmente después de la incubación con liposomas en presencia de tBid. La forma principal de Bcl-2 es dímero y trímero según se juzga por su coelución con los estándares de proteína de 43 y 67 kDa, respectivamente. En ausencia de tBid, sólo se detectan proteínas Bcl-2 residuales en estas fracciones, lo que sugiere que una pequeña fracción de la proteína Bcl-2 unida a la membrana está en los estados dímero y trímero incluso en ausencia de tBid. La interacción tBid aumenta sustancialmente la cantidad de proteínas Bcl-2 diméricas y triméricas unidas a la membrana. Curiosamente oligómeros Bcl-2 más grandes con aparente Mr se detectó más de 67 kDa cuando se utilizó una concentración más alta de Bcl-2. Dado que el tamaño de los poros de Bcl-2 se correlaciona directamente con su concentración (Fig. 1A), este resultado sugiere que los oligómeros de Bcl-2 más grandes forman los poros de Bcl-2 más grandes.

En nuestro estudio anterior, Bax también formó poros en la membrana liposomal después de la interacción con tBid (14). El poro Bax es más grande que el poro Bcl-2, liberando CB-dextrano de 10 kDa. Es posible que el poro de Bax esté formado por un oligómero más grande. De hecho, se detectaron oligómeros Bax grandes en las fracciones de membrana usando el mismo ensayo de filtración en gel que para Bcl-2. En presencia de tBid, oligómeros de Bax con Mr se detectaron de 67 a 200 kDa y superiores (Fig. 4D, gráfico inferior). En comparación, los oligómeros de Bcl-2 son todos menores de 200 kDa incluso a una concentración 4 veces mayor que la de Bax (Fig. 4C). No se detectó Bax en la fracción de membrana en ausencia de tBid (Fig. 4D, gráfico superior), de acuerdo con el hecho de que Bax es una proteína soluble antes de la interacción con tBid. Tomados en conjunto, estos resultados demostraron que tanto Bcl-2 como Bax forman oligómeros en la membrana después de la interacción con tBid, pero el tamaño de los oligómeros Bcl-2 es más pequeño que los oligómeros Bax, lo que se correlaciona directamente con el tamaño de sus poros.


Biología de la familia BCL-2

La vía apoptótica intrínseca está regulada por la familia BCL-2 y consta de 2 grupos principales de proteínas: (1) las proteínas prosupervivencia con su miembro fundador BCL-2, 3,4 MCL-1, 9 BCL-xL, 15 B- linfoma celular-w (BCL-w), 19 y gen relacionado con BCL-2 expresado en el hígado fetal-1 (BFL-1), 20 todos los cuales inhiben la muerte celular y (2) las proteínas proapoptóticas, que pueden subdividirse aún más en (a) proteínas que solo contienen BH3: mediador de la muerte celular que interactúa con BCL-2 (BIM), 21 modulador de apoptosis regulado al alza por p53 (PUMA BBC2), 22,23 NOXA (proteína inducida por forbol-12 miristato-13-acetato 1 PMAIP1), 24 promotor de muerte asociado a BCL-2 (BAD), dominio de interacción BH3 (BID), 25 asesino que interactúa con BCL-2 (BIK), 26 factor modificador de BCL-2 (BMF), 27 Harakiri (HRK ) 28 y (b) la proteína X asociada a BCL-2 (BAX) 29 / proteínas similares al antagonista asesino homólogo (BOK) 30 de BCL-2 (incluido el asesino ovárico relacionado con BCL-2 [BOK]). 31 Todas las proteínas de la familia BCL-2 comparten los dominios de homología BCL-2 (BH) comunes en función de su similitud de secuencia. 32 Las proteínas prosurvival y de tipo BAX / BAK contienen 4 y 3 dominios BH, respectivamente, mientras que las proteínas solo BH3 solo comparten el dominio BH3 con la familia más amplia (Figura 1).

Miembros de la familia BCL-2 y su activación. La familia de proteínas BCL-2 contiene dominios BH funcionalmente conservados y se puede subdividir en proteínas efectoras proapoptóticas solo para BH3 y proapoptóticas de supervivencia. TM, transmembrana.

Miembros de la familia BCL-2 y su activación. La familia de proteínas BCL-2 contiene dominios BH funcionalmente conservados y se puede subdividir en proteínas efectoras proapoptóticas solo para BH3 y proapoptóticas de supervivencia. TM, transmembrana.

Activación de la vía apoptótica

La apoptosis se compone de 3 fases distintas: (1) iniciación, (2) compromiso y (3) ejecución. Este proceso se induce ante estímulos de estrés como la privación de nutrientes o el daño del ADN (Figura 2). Las proteínas de solo BH3 se activan como un estímulo de muerte de una manera temporal y específica del tipo celular, y desplazan / activan las proteínas similares a BAX / BAK en el paso de inicio. 33 Durante la fase de compromiso, BAX y BAK forman homodímeros y heterodímeros, que luego se ensamblan en estructuras similares a poros en la membrana mitocondrial externa y causan la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MOMP). 34-38 Esto posteriormente conduce a la pérdida del potencial transmembrana mitocondrial y fosforilación oxidativa, y la liberación de citocromo C desde el espacio intermembrana mitocondrial hacia el citoplasma. 39 En el paso de ejecución, el citocromo C junto con APAF-1 y procaspasa-9 forman el apoptosoma, que media la escisión de la procaspasa-9 a su forma activa caspasa-9 y consecuentemente promueve la activación de las caspasas efectoras-3, 6 y 7 , que inducen a las ADNasas a escindir el ADN en fragmentos. Es importante señalar que el “punto de no retorno” generalmente ocurre al nivel de activación de BAX / BAK, 37 momento en el cual la célula se compromete a sufrir una muerte celular programada. Debido a las diferencias estructurales, las proteínas de solo BH3 tienen afinidades variables por proteínas de prosupervivencia particulares (Figura 3). 40 Algunas proteínas que solo contienen BH3, como BIM y PUMA, se unen de manera promiscua a todas las proteínas de supervivencia. 41,42 Otras proteínas que solo contienen BH3 se unen de forma más selectiva, como BAD, que se une a BCL-2, BCL-xL y BCL-W, y NOXA, que se une principalmente a MCL-1. 40

La vía apoptótica intrínseca.

La vía apoptótica intrínseca.

Perfil de unión de las proteínas proapoptóticas BH3 solo y efectoras a las proteínas de supervivencia y cómo las proteínas de supervivencia son el objetivo de los inhibidores de proteínas de la familia BCL-2.

Perfil de unión de las proteínas proapoptóticas BH3 solo y efectoras a las proteínas de supervivencia y cómo las proteínas de supervivencia son el objetivo de los inhibidores de proteínas de la familia BCL-2.

Se han propuesto dos formas principales de inducción de apoptosis. (1) En el modelo de activación directa, las proteínas solo BH3 actúan como activadores (p. Ej., BIM, Bid / tBid, PUMA) o sensibilizadores (p. Ej., BAD, NOXA). Los activadores se unen tanto a proteínas de supervivencia como a proteínas similares a BAX / BAK, lo que lleva a la integración en la membrana mitocondrial externa. Las proteínas de supervivencia como BCL-xL pueden secuestrar proteínas solo de BH3 y, por lo tanto, prevenir la activación de BAX. Los sensibilizadores se unen directamente a la proteína de supervivencia y median en la liberación de activadores. (2) El modelo indirecto (desplazamiento) asume que BAX y BAK son constitutivamente activos pero están unidos a proteínas de supervivencia para prevenir la apoptosis. Las proteínas que solo contienen BH3 desplazan a BAX y BAK tras el estímulo de muerte. Debido a que las proteínas de solo BH3 tienen diferentes afinidades de unión para cada proteína de supervivencia, el inicio de la apoptosis requiere la activación de varias proteínas de solo BH3 para desplazar cantidades suficientes de BAX y BAK para causar MOMP. Durante la última década, se hizo evidente que estos 2 modelos probablemente coexisten y operan de una manera específica del contexto, lo que lleva a un modelo unificado en el que las proteínas de supervivencia secuestran tanto proteínas solo BH3 como también activadas BAX y BAK (Figura 2). 38 El hecho de que las proteínas solo BH3 tengan diferentes modalidades de unión para cada proteína de supervivencia ofrece una oportunidad para apuntar a las proteínas de supervivencia con inhibidores farmacológicamente selectivos con gran potencial terapéutico en neoplasias hematológicas malignas. 40


Contenido

El silenciamiento de ARN describe varias vías relacionadas mecánicamente que están involucradas en el control y la regulación de la expresión génica. [4] [5] [6] Las vías de silenciamiento del ARN están asociadas con la actividad reguladora de ARN pequeños no codificantes (aproximadamente de 20 a 30 nucleótidos de longitud) que funcionan como factores involucrados en la inactivación de secuencias homólogas, promoviendo la actividad endonucleasa, detención de la traducción, y / o modificación cromática o de ADN. [7] [8] [9] En el contexto en el que se estudió por primera vez el fenómeno, se encontró que el ARN pequeño juega un papel importante en la defensa de las plantas contra los virus. Por ejemplo, estos estudios demostraron que las enzimas detectan ARN bicatenario (dsRNA) que normalmente no se encuentran en las células y se digieren en pequeños trozos que no pueden causar enfermedades. [10] [11] [12] [13] [2]

Si bien se comprenden algunas funciones del silenciamiento del ARN y su maquinaria, muchas no. Por ejemplo, se ha demostrado que el silenciamiento de ARN es importante en la regulación del desarrollo y en el control de los eventos de transposición. [14] Se ha demostrado que el silenciamiento del ARN desempeña un papel en la protección antiviral en plantas e insectos. [15] También en la levadura, se ha demostrado que el silenciamiento del ARN mantiene la estructura de la heterocromatina. [16] Sin embargo, el papel variado y matizado del silenciamiento del ARN en la regulación de la expresión génica sigue siendo una investigación científica en curso. Se ha propuesto una gama de funciones diversas para un número creciente de secuencias de ARN pequeñas caracterizadas, por ejemplo, regulación del desarrollo, destino de las células neuronales, muerte celular, proliferación, almacenamiento de grasa, destino de las células hematopoyéticas, secreción de insulina. [17]

El silenciamiento del ARN funciona reprimiendo la traducción o escindiendo el ARN mensajero (ARNm), dependiendo de la cantidad de complementariedad del emparejamiento de bases. El ARN se ha investigado ampliamente dentro de su papel como intermediario en la traducción de genes en proteínas. [18] Sin embargo, los investigadores solo comenzaron a abordar funciones reguladoras más activas a partir de fines de la década de 1990. [19] El estudio histórico que proporciona una comprensión del primer mecanismo identificado fue publicado en 1998 por Fire et al., [1] demostrando que el ARN bicatenario podría actuar como desencadenante del silenciamiento génico. [19] Desde entonces, se han identificado y caracterizado varias otras clases de silenciamiento de ARN. [4] Actualmente, se está explorando el potencial terapéutico de estos descubrimientos, por ejemplo, en el contexto de la terapia génica dirigida. [20] [21]

Si bien el silenciamiento de ARN es una clase de mecanismos en evolución, un tema común es la relación fundamental entre los ARN pequeños y la expresión génica. [8] También se ha observado que las principales vías de silenciamiento de ARN actualmente identificadas tienen mecanismos de acción que pueden involucrar tanto el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) [22] como las vías de silenciamiento génico dependiente de cromatina (CDGS). [4] CDGS implica el ensamblaje de pequeños complejos de ARN en transcripciones nacientes y se considera que abarca los mecanismos de acción que implican el silenciamiento del gen transcripcional (TGS) y el silenciamiento del gen co-transcripcional (CTGS). [23] Esto es significativo al menos porque la evidencia sugiere que los ARN pequeños juegan un papel en la modulación de la estructura de la cromatina y TGS. [24] [25]

A pesar del enfoque temprano en la literatura sobre la interferencia de ARN (ARNi) como un mecanismo central que se produce al nivel de la traducción del ARN mensajero, desde entonces se han identificado otros en la familia más amplia de rutas de silenciamiento del ARN conservado que actúan a nivel del ADN y la cromatina. [26] El silenciamiento de ARN se refiere a la actividad de silenciamiento de una variedad de ARN pequeños y generalmente se considera una categoría más amplia que el ARNi. Si bien los términos a veces se han utilizado indistintamente en la literatura, el ARNi se considera generalmente como una rama del silenciamiento del ARN. En la medida en que sea útil establecer una distinción entre estos conceptos relacionados, se puede pensar que el silenciamiento de ARN se refiere al esquema más amplio de pequeños controles relacionados con ARN involucrados en la expresión génica y la protección del genoma contra secuencias de ADN repetitivas móviles, retroelementos, y transposones en la medida en que puedan inducir mutaciones. [27] Los mecanismos moleculares para el silenciamiento del ARN se estudiaron inicialmente en plantas [12], pero desde entonces se han ampliado para cubrir una variedad de temas, desde hongos hasta mamíferos, lo que proporciona una fuerte evidencia de que estas vías están altamente conservadas. [28]

Actualmente se han identificado al menos tres clases primarias de ARN pequeño, a saber: ARN pequeño de interferencia (ARNip), microARN (miARN) y ARN que interactúa con piwi (piRNA).

Pequeño ARN de interferencia (ARNip) Editar

Los ARNip actúan en el núcleo y el citoplasma y están involucrados en el ARNi y en el CDGS. [4] Los siRNAs provienen de precursores de dsRNA largos derivados de una variedad de precursores de ARN monocatenario (ssRNA), como los ARN sentido y antisentido. Los ARNip también provienen de ARN en horquilla derivados de la transcripción de regiones repetidas invertidas. Los ARNip también pueden surgir enzimáticamente de precursores de ARN no codificantes. [29] El volumen de literatura sobre siRNA dentro del marco de RNAi es extenso.

MicroARN (miARN) Editar

The majority of miRNAs act in the cytoplasm and mediate mRNA degradation or translational arrest. [30] However, some plant miRNAs have been shown to act directly to promote DNA methylation. [31] miRNAs come from hairpin precursors generated by the RNaseIII enzymes Drosha and Dicer. [32] Both miRNA and siRNA form either the RNA-induced silencing complex (RISC) or the nuclear form of RISC known as RNA-induced transcriptional silencing complex (RITS). [33] The volume of literature on miRNA within the framework of RNAi is extensive.

Three prime untranslated regions and microRNAs Edit

Three prime untranslated regions (3'UTRs) of messenger RNAs (mRNAs) often contain regulatory sequences that post-transcriptionally cause RNA interference. Such 3'-UTRs often contain both binding sites for microRNAs (miRNAs) as well as for regulatory proteins. By binding to specific sites within the 3'-UTR, miRNAs can decrease gene expression of various mRNAs by either inhibiting translation or directly causing degradation of the transcript. The 3'-UTR also may have silencer regions that bind repressor proteins that inhibit the expression of a mRNA.

The 3'-UTR often contains microRNA response elements (MREs). MREs are sequences to which miRNAs bind. These are prevalent motifs within 3'-UTRs. Among all regulatory motifs within the 3'-UTRs (e.g. including silencer regions), MREs make up about half of the motifs.

As of 2014, the miRBase web site, [34] an archive of miRNA sequences and annotations, listed 28,645 entries in 233 biologic species. Of these, 1,881 miRNAs were in annotated human miRNA loci. miRNAs were predicted to have an average of about four hundred target mRNAs (affecting expression of several hundred genes). [35] Freidman et al. [35] estimate that >45,000 miRNA target sites within human mRNA 3'UTRs are conserved above background levels, and >60% of human protein-coding genes have been under selective pressure to maintain pairing to miRNAs.

Direct experiments show that a single miRNA can reduce the stability of hundreds of unique mRNAs. [36] Other experiments show that a single miRNA may repress the production of hundreds of proteins, but that this repression often is relatively mild (less than 2-fold). [37] [38]

The effects of miRNA dysregulation of gene expression seem to be important in cancer. [39] For instance, in gastrointestinal cancers, nine miRNAs have been identified as epigenetically altered and effective in down regulating DNA repair enzymes. [40]

The effects of miRNA dysregulation of gene expression also seem to be important in neuropsychiatric disorders, such as schizophrenia, bipolar disorder, major depression, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorders. [41] [42] [43]

Piwi-interacting RNA (piRNA) Edit

piRNAs represent the largest class of small non-coding RNA molecules expressed in animal cells, deriving from a large variety of sources, including repetitive DNA and transposons. [44] However, the biogenesis of piRNAs is also the least well understood. [45] piRNAs appear to act both at the post-transcriptional and chromatin levels. They are distinct from miRNA due to at least an increase in terms of size and complexity. Repeat associated small interfering RNA (rasiRNAs) are considered to be a subspecies of piRNA. [3]

The most basic mechanistic flow for RNA Silencing is as follows: (For a more detailed explanation of the mechanism, refer to the RNAi:Cellular mechanism article.)

1: RNA with inverted repeats hairpin/panhandle constructs --> 2: dsRNA --> 3: miRNAs/siRNAs --> 4: RISC --> 5: Destruction of target mRNA

  1. It has been discovered that the best precursor to good RNA silencing is to have single stranded antisense RNA with inverted repeats which, in turn, build small hairpin RNA and panhandle constructs. [6] The hairpin or panhandle constructs exist so that the RNA can remain independent and not anneal with other RNA strands.
  2. These small hairpin RNAs and/or panhandles then get transported from the nucleus to the cytosol through the nuclear export receptor called exportin-5, and then get transformed into a dsRNA, a double stranded RNA, which, like DNA, is a double stranded series of nucleotides. If the mechanism didn't use dsRNAs, but only single strands, there would be a higher chance for it to hybridize to other "good" mRNAs. As a double strand, it can be kept on call for when it is needed.
  3. The dsRNA then gets cut up by a Dicer into small (21-28 nt = nucleotides long) strands of miRNAs (microRNAs) or siRNAs (short interfering RNAs.) A Dicer is an endoribonucleaseRNase, which is a complex of a protein mixed with strand(s) of RNA.
  4. Lastly, the double stranded miRNAs/siRNAs separate into single strands the antisense RNA strand of the two will combine with another endoribonuclease enzyme complex called RISC (RNA-induced silencing complex), which includes the catalytic component Argonaute, and will guide the RISC to break up the "perfectly complementary" target mRNA or viral genomic RNA so that it can be destroyed. [2][6]
  5. It means that based on a short sequence specific area, a corresponding mRNA will be cut. To make sure, it will be cut in many other places as well. (If the mechanism only worked with a long stretch, then there would be higher chance that it would not have time to match to its complementary long mRNA.) It has also been shown that the repeated-associated short interference RNAs (rasiRNA) have a role in guiding chromatin modification. [2]

For an animated explanation of the mechanism of RNAi by Nature Reviews, see the External Links section below.

Immunity against viruses or transposons Edit

RNA silencing is the mechanism that our cells (and cells from all kingdoms) use to fight RNA viruses and transposons (which originate from our own cells as well as from other vehicles). [2] In the case of RNA viruses, these get destroyed immediately by the mechanism cited above. In the case of transposons, it's a little more indirect. Since transposons are located in different parts of the genome, the different transcriptions from the different promoters produce complementary mRNAs that can hybridize with each other. When this happens, the RNAi machinery goes into action, debilitating the mRNAs of the proteins that would be required to move the transposons themselves. [46]

Down-regulation of genes Edit

For a detailed explanation of the down-regulation of genes, see RNAi:downregulation of genes

Up-regulation of genes Edit

For a detailed explanation of the up-regulation of genes, see RNAi:upregulation of genes

RNA silencing also gets regulated Edit

The same way that RNA silencing regulates downstream target mRNAs, RNA silencing itself is regulated. For example, silencing signals get spread between cells by a group of enzymes called RdRPs (RNA-dependent RNA polymerases) or RDRs. [2]

Growing understanding of small RNA gene-silencing mechanisms involving dsRNA-mediated sequence-specific mRNA degradation has directly impacted the fields of functional genomics, biomedicine, and experimental biology. The following section describes various applications involving the effects of RNA silencing. These include uses in biotechnology, therapeutics, and laboratory research. Bioinformatics techniques are also being applied to identify and characterize large numbers of small RNAs and their targets.

Biotechnology Edit

Artificial introduction of long dsRNAs or siRNAs has been adopted as a tool to inactivate gene expression, both in cultured cells and in living organisms. [2] Structural and functional resolution of small RNAs as the effectors of RNA silencing has had a direct impact on experimental biology. For example, dsRNA may be synthesized to have a specific sequence complementary to a gene of interest. Once introduced into a cell or biological system, it is recognized as exogenous genetic material and activates the corresponding RNA silencing pathway. This mechanism can be used to effect decreases in gene expression with respect to the target, useful for investigating loss of function for genes relative to a phenotype. That is, studying the phenotypic and/or physiologic effects of expression decreases can reveal the role of a gene product. The observable effects can be nuanced, such that some methods can distinguish between “knockdown” (decrease expression) and “knockout” (eliminate expression) of a gene. [47] RNA interference technologies have been noted recently as one of the most widely utilized techniques in functional genomics. [48] Screens developed using small RNAs have been used to identify genes involved in fundamental processes such as cell division, apoptosis and fat regulation.

Biomedicine Edit

Since at least the mid-2000s, there has been intensifying interest in developing short interfering RNAs for biomedical and therapeutic applications. [49] Bolstering this interest is a growing number of experiments which have successfully demonstrated the clinical potential and safety of small RNAs for combatting diseases ranging from viral infections to cancer as well as neurodegenerative disorders. [50] In 2004, the first Investigational New Drug applications for siRNA were filed in the United States with the Food and Drug Administration it was intended as a therapy for age-related macular degeneration. [48] RNA silencing in vitro and in vivo has been accomplished by creating triggers (nucleic acids that induce RNAi) either via expression in viruses or synthesis of oligonucleotides. [51] Optimistically many studies indicate that small RNA-based therapies may offer novel and potent weapons against pathogens and diseases where small molecule/pharmacologic and vaccine/biologic treatments have failed or proved less effective in the past. [49] However, it is also warned that the design and delivery of small RNA effector molecules should be carefully considered in order to ensure safety and efficacy.

The role of RNA silencing in therapeutics, clinical medicine, and diagnostics is a fast developing area and it is expected that in the next few years some of the compounds using this technology will reach market approval. A report has been summarized below to highlight the many clinical domains in which RNA silencing is playing an increasingly important role, chief among them are ocular and retinal disorders, cancer, kidney disorders, LDL lowering, and antiviral. [51] The following table displays a listing of RNAi based therapy currently in various phases of clinical trials. The status of these trials can be monitored on the ClinicalTrials.gov website, a service of the National Institutes of Health (NIH). [52] Of note are treatments in development for ocular and retinal disorders, that were among the first compounds to reach clinical development. AGN211745 (sirna027) (Allergan) and bevasiranib (Cand5) (Opko) underwent clinical development for the treatment of age-related macular degeneration, but trials were terminated before the compounds reached the market. Other compounds in development for ocular conditions include SYL040012 (Sylentis) and QPI-007 (Quark). SYL040012 (bamosinan) is a drug candidate under clinical development for glaucoma, a progressive optic neurdegeneration frequently associated to increased intraocular pressure QPI-007 is a candidate for the treatment of angle-closure glaucoma and Non-arteritic anterior ischaemic optic neuropathy both compounds are currently undergoing phase II clinical trials. Several compounds are also under development for conditions such as cancer and rare diseases.

Clinical domain Droga Indication Objetivo
Ocular and retinal disorders TD101 Pachyonychia congenita Keratin 6A N171K mutant
Ocular and retinal disorders QPI-1007 Non-arteritic anterior ischaemic optic neuropathy Caspase 2
Ocular and retinal disorders AGN211745 Age-related macular degeneration, choroidal neovascularization VEGFR1
Ocular and retinal disorders PF-655 Diabetic macular oedema, age-related macular degeneration RTP801
Ocular and retinal disorders SYL040012 Glaucoma β2 adrenergic receptor
Ocular and retinal disorders Bevasiranib Diabetic macular oedema VEGF
Ocular and retinal disorders Bevasiranib Macular degeneration VEGF
Cáncer CEQ508 Familial adenomatous polyposis β-catenin
Cáncer ALN-PLK1 Tumor de hígado PLK1
Cáncer FANG Solid tumor Furin
Cáncer CALAA-01 Solid tumor RRM2
Cáncer SPC2996 leucemia linfocítica crónica BCL-2
Cáncer ALN-VSP02 Solid tumor VEGF, kinesin spindle protein
Cáncer NCT00672542 Metastatic melanoma LMP2, LMP7, and MECL1
Cáncer Atu027 Solid malignancies PKN3
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Acute kidney injury p53
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Graft dysfunction kidney transplant p53
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Kidney injury acute renal failure p53
LDL lowering TKM-ApoB Hypercholesterolaemia APOB
LDL lowering PRO-040,201 Hypercholesterolaemia APOB
Antivírico miravirsen Virus de la hepatitis C miR-122
Antivírico pHIV7-shI-TAR-CCR5RZ VIH HIV Tat protein, HIV TAR RNA, human CCR5
Antivírico ALN-RSV01 RSV RSV nucleocapsid
Antivírico ALN-RSV01 RSV in lung transplant patients RSV nucleocapsid

Main challenge Edit

As with conventional manufactured drugs, the main challenge in developing successful offshoots of the RNAi-based drugs is the precise delivery of the RNAi triggers to where they are needed in the body. The reason that the ocular macular degeneration antidote was successful sooner than the antidote with other diseases is that the eyeball is almost a closed system, and the serum can be injected with a needle exactly where it needs to be. The future successful drugs will be the ones who are able to land where needed, probably with the help of nanobots. Below is a rendition of a table [51] that shows the existing means of delivery of the RNAi triggers.

Laboratory Edit

The scientific community has been quick to harness RNA silencing as a research tool. The strategic targeting of mRNA can provide a large amount of information about gene function and its ability to be turned on and off. Induced RNA silencing can serve as a controlled method for suppressing gene expression. Since the machinery is conserved across most eukaryotes, these experiments scale well to a range of model organisms. [53] In practice, expressing synthetic short hairpin RNAs can be used to reach stable knock-down. [54] If promoters can be made to express these designer short hairpin RNAs, the result is often potent, stable, and controlled gene knock-down in both in vitro and in vivo contexts. [55] Short hairpin RNA vector systems can be seen as roughly analogous in scope to using cDNA overexpression systems. [56] Overall, synthetic and natural small RNAs have proven to be an important tool for studying gene function in cells as well as animals. [57]

Bioinformatics approaches to identify small RNAs and their targets have returned several hundred, if not thousands of, small RNA candidates predicted to affect gene expression in plants, C. elegans, D. melanogaster, zebrafish, mouse, rat, and human. [58] These methods are largely directed to identifying small RNA candidates for knock-out experiments but may have broader applications. One bioinformatics approach evaluated sequence conservation criteria by filtering seed complementary target-binding sites. The cited study predicted that approximately one third of mammalian genes were to be regulated by, in this case, miRNAs. [59]

Ethics & Risk-Benefit Analysis Edit

One aspect of RNA silencing to consider is its possible off-target affects, toxicity, and delivery methods. If RNA silencing is to become a conventional drug, it must first pass the typical ethical issues of biomedicine. [60] Using risk-benefit analysis, researchers can determine whether RNA silencing conforms to ethical ideologies such as nonmaleficence, beneficence, and autonomy. [61]

There is a risk of creating infection-competent viruses that could infect non-consenting people. [62] There is also a risk of affecting future generations based on these treatments. These two scenarios, in respect to autonomy, is possible unethical. At this moment, unsafe delivery methods and unintended aspects of vector viruses add to the argument against RNA silencing. [61]

In terms of off-target effects, siRNA can induce innate interferon responses, inhibit endogenous miRNAs through saturation, and may have complementary sequences to other non-target mRNAs. These off-targets could also have target up-regulations such as oncogenes and antiapoptotic genes. The toxicity of RNA silencing is still under review as there are conflicting reports. [61] [62] [63]

RNA silencing is quickly developing, because of that, the ethical issues need to be discussed further. With the knowledge of general ethical principles, we must continuously perform risk-benefit analysis. [61]


Conclusiones

The method reported here, EMIRGE, reconstructs full-length SSU sequences from metagenomic data from a microbial community of interest, accurate to the species level. In addition, the method also provides accurate SSU sequence abundance estimates. EMIRGE is robust to errors and omissions in the reference database, and is broadly applicable to any dataset produced with short read sequencing technology. An open-source implementation of the algorithm is freely available [41]. We expect that application of the method, especially with very deep sequencing, will provide new insights into fine details of changing microbial community structure.


Original articles

Lovell, J. F. et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Celda 135, 1074–1084 (2008)

Edlich, F. et al. Bcl-x(L) retrotranslocates Bax from the mitochondria into the cytosol. Celda 145, 104–116 (2011)

Czabotar et al. Bax crystal structures reveal how BH3 domains activate Bax and nucleate its oligomerization to induce apoptosis. Celda 152, 519–531 (2013)

Ichim et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol. Celda 57, 860–872 (2015)

McArthur, K. et al. BAK/BAX macropores facilitate mitochondrial herniation and mtDNA efflux during apoptosis. Ciencias 23, eaao6047 (2018)


Información del autor

Jonathan B Baell, Sanji Kulasegaram, John P Parisot & Brian J Smith

Present address: Present addresses: Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Parkville, Victoria, Australia (J.B.B.) Chemistry Department, Monash University, Clayton, Victoria, Australia (S.K.) Peter McCallum Cancer Centre, East Melbourne, Victoria, Australia (J.P.P.) Department of Chemistry, La Trobe Institute of Molecular Sciences, La Trobe University, Bundoora, Victoria, Australia (B.J.S.).,

Peter E Czabotar and Brad E Sleebs: These authors contributed equally to this work.

Afiliaciones

Chemical Biology Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Guillaume Lessene, Brad E Sleebs, Kym N Lowes, Jonathan B Baell, Wilhelmus J A Kersten, Sanji Kulasegaram, Rebecca M Moss, John P Parisot, Brian J Smith, Ian P Street, Hong Yang, David C S Huang & Keith G Watson

Department of Medical Biology, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australia

Guillaume Lessene, Peter E Czabotar, Brad E Sleebs, Kym N Lowes, Jerry M Adams, Jonathan B Baell, Peter M Colman, Wilhelmus J A Kersten, Sanji Kulasegaram, Rebecca M Moss, John P Parisot, Brian J Smith, Ian P Street, Hong Yang, David C S Huang & Keith G Watson

Structural Biology Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Peter E Czabotar & Peter M Colman

Department of Early Discovery Biochemistry, Genentech, Inc., San Francisco, California, USA

Kerry Zobel, Kurt Deshayes & Wayne J Fairbrother

Molecular Genetics of Cancer Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Department of Discovery Chemistry, Genentech, Inc., San Francisco, California, USA


Ver el vídeo: The 20-year journey yielding a new weapon against cancer (Mayo 2022).