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Problemas de tarea - Módulo de aprendizaje de literatura Inhibición de enzimas - KAT: CLAVE - Biología

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Trabajo de investigación: Las siguientes preguntas se basan en datos, gráficos y figuras del siguiente artículo: Inhibición de lisina acetiltransferasa KAT3B / p300 mediada por naftoquinona, base para la síntesis de inhibidores no tóxicos. doi: 10.1074 / jbc.M113.486522

ANTECEDENTES

El ADN de doble cadena es un polianión, ya que cada fosfato de la columna vertebral está cargado negativamente. Para empaquetarlo en un cromosoma en el núcleo, el ADN se compleja con una variedad de proteínas. En la primera etapa de empaquetamiento, el ADN se enrolla alrededor de un núcleo de proteína histona cargada positivamente, formando un nucleosoma. El tamaño del nucleosoma es aproximadamente el tamaño de la ARN polimerasa.

Nucleosoma: Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

A. Para que la ARN polimerasa transcriba el ADN empaquetado en un nucleosoma, ¿qué debe suceder probablemente con el complejo del nucleosoma?

El ADN debe desenrollarse del núcleo de histonas del nucleosoma para permitir la unión de los factores de transcripción y, en última instancia, la ARN polimerasa a las regiones reguladoras del ADN (promotor, etc.). De lo contrario, no se producirá la polimerización de ARN dependiente de ADN.

B. El fenotipo de una célula depende de la secuencia de ADN de la célula y del subconjunto de genes que expresa esa célula. El campo emergente de la epigenética describe cómo factores distintos de la secuencia de ADN controlan el fenotipo celular y la heredabilidad de los rasgos. Las características clave en la regulación epigenética de la transcripción de genes son la remodelación de la cromatina, el empaquetamiento y la modificación covalente del ADN. Empaquetamiento de cromatina a nivel de ADN: las interacciones de histonas son críticas. La clave de estas interacciones es el estado de modificación covalente de las cadenas laterales de lisina (K) en proteínas por histonas acetilasas (HAT), que también se denominan lisina acetilasas (KAT) e histonas desacetilasas (HDAC). A continuación se muestran dos modificaciones químicas de las cadenas laterales de lisina en las histonas.

una. Ofrezca una explicación química de por qué KAT no acetilará la estructura b.

El grupo amino épsilon de Lys actúa como nucleófilo cuando ataca al carbonilo C electrófilo de acetil CoA. Una amina protonada no es nucleofílica.

B. ¿Qué efecto podría tener la modificación de KAT de las cadenas laterales de lisina de histona sobre la competencia transcripcional del ADN en los nucleosomas?

El pKa de Lys en solución acuosa es de aproximadamente 9,0. En una proteína puede variar de eso, pero a pH fisiológico, estaría principalmente protonado con una carga positiva. En la acetilación, las cadenas laterales de la histona Lys perderían cualquier carga positiva, lo que debilitaría las interacciones de Coulombic con el ADN, lo que promovería el desenrollamiento del ADN del núcleo de la histona del nucleosoma. Esto aumentaría la competencia transcripcional del ADN.

Los derivados de 1,4-naftoquinona son compuestos naturales que están presentes en los géneros de plantas Plumbago y Diospyros y tienen una variedad de actividades biológicas. Uno de tales derivados, la plumbagina, es un potente inhibidor de una lisina acetiltransferasa particular, KAT p300 lisina acetiltransferasas 3B / 3A (p300 / CBP). Algunos de los inhibidores son tóxicos para las células, ya que reaccionan con los grupos RSH libres en las células y generan especies reactivas de oxígeno (ROS). Un fármaco ideal no sería tóxico y sería un inhibidor / activador eficaz de una enzima específica. Los investigadores sintetizaron un derivado (PTK1) de plumbagin que inhibe p300 y con una toxicidad mucho menor que la plumbagin. ¿Como funciona?

Fig 1A: Para estudiar la toxicidad de la plumbagina, los investigadores la disolvieron en el disolvente DMSO + N-acetilcisteína (NAC) que elimina las ROS. Agregaron estos reactivos a tres líneas de células humanas diferentes, SHSY-5Y, HEK293 y HeLa S3, como se muestra a continuación.

una. ¿Qué efecto tuvo la plumbagina sobre la toxicidad celular?

La adición de plumbagin a las células (fila 2) cambia claramente la morfología, las propiedades y el número de las células. Se puede inferir que conduce a la muerte celular.

B. ¿Qué efecto tuvo NAC efectos de células plumbagin?

Está claro a partir de la fila C de la Figura 1A que NAC previene / interfiere con los efectos citotóxicos de plumbagin.

C. ¿Qué hicieron los investigadores en un experimento solo con DMSO?

Se disolvió plumbagin en DMSO antes de añadirlo a las células. Para determinar cualquier efecto celular observado que no se derivara del DMSO, llevaron a cabo este experimento. DMSO, el "vehículo" que transportaba el fármaco, sirvió como control en este experimento.

Figura 1B. Se ha demostrado que en el daño oxidativo o roturas del ADN, una de las histonas, H2AX, es fosforilada por una quinasa, pI3K. Las células se trataron como se describe a continuación (Plu = plumbagin_ y se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Después de la electroforesis, se colocó una membrana de nitrocelulosa en la parte superior y las proteínas del gel se sometieron a electroforesis en la membrana (una técnica llamada transferencia Western. Proteína individual La banda se visualizó agregando anticuerpos que reconocieron el H2AXg fosforilado, o la histona H3 (sin modificación), seguido de reactivos que producen una banda oscura. Interprete los resultados. ¿Por qué los investigadores hicieron transferencias para H3 sin modificar?

Cuando se añadió Plumbagin a las células sin NAC (carriles de recuadro rojo), hubo una fuerte fosforilación de H2AX gamma. La adición de NAC evitó la fosforilación que surgió con Plu en ausencia de NAC. La tercera fila es otro control que asegura que se cargó la misma cantidad de muestras en el gel. No se esperaría que H3 cambiara en el corto período de tiempo del experimento.

Figura 1C. ¿Qué efecto tuvo el plumbagin sobre la acetilación de histonas? Se realizaron inmunotransferencias después del tratamiento con plumbagina en presencia o ausencia de NAC en las líneas celulares indicadas como anteriormente usando anticuerpos que reconocían Lys 9 acetilado en H3 (H3K9), o histona H3 (sin modificación). ¿Plu inhibe la acetilación de H3K9? ¿Cómo afecta el NAC el efecto de Plumbagin sobre la acetilación?

Plu parece disminuir la intensidad de las bandas cuando se agrega en ausencia de NAC. Esto sugiere que Plu inhibe la acetilación de H3K9 mediante algún mecanismo. Como en el experimento anterior, NAC pareció antagonizar completamente el efecto de Plu en el sentido de que impidió que Plu disminuyera la acetilación (compare los carriles encuadrados en rojo y verde). NAC inhibió los efectos inhibidores de Plu sobre la acetilación de H3K9.

Fig. 1D: Se estudió otro inhibidor de la acetilación de H3K9, isogarcinol (IsoGar) mediante transferencia Western. ¿Tuvo NAC el mismo efecto sobre la acetilación de H3K9 de las células tratadas con IsoGAr que las tratadas con Plu, que se muestran en la Fig. 1C?

SUGERENCIA | ANS

En contraste con Blumgartin, otro inhibidor, IsoGar, inhibe claramente la acetilación de H3K9, pero esta inhibición no se alivia con NAC (ver las líneas recuadradas en rojo a continuación).

La NAC parece comportarse de manera diferente en presencia de dos inhibidores de acetilación. Estos resultados ofrecen dos posibilidades para sus efectos. • ROS podría conducir a una disminución de la acetilación de histonas, y NAC, al disminuir ROS, restaurar la acetilación. • Alternativamente, plumbagin reacciona con el RSH de NAC, lo que disminuye su efecto sobre KAT y restaura la acetilación.

Dibuje modelos de dibujos animados que reflejen estos dos escenarios diferentes usando una línea con una flecha para indicar la activación o promoción de una actividad, y una línea con un extremo romo para mostrar inhibición. Utilice también estos símbolos:

Los investigadores no encontraron ningún aumento de ROS con KAT purificado en una célula libre in vitro que no produjo radicales libres. ¿Cuál de tus modelos es más probable?

Modelo B anterior, ya que el modelo A daría lugar a un aumento de ROS como peróxido o superóxido


Figura 2AB. Para simplificar el estudio de estos efectos, los investigadores realizaron in vitro ensayos (sin células) en los que no se producirían ROS (superóxido, peróxido de hidrógeno). Estudiaron dos KAT diferentes, p300 (A) y CBP (B) utilizando histonas del núcleo de células HeLa, con plumbagina de 100 μm (carriles 5-7 en A y B) en presencia o ausencia de NAC, DTT y otro agente reductor. Trolox (carril 8). ¿Qué parte de NAC y DTT parece importante en sus efectos sobre la inhibición de la plumbagina?

Los carriles 5 y 7 y los carriles 5 y 8 muestran que tanto NAC como DTT (ambos tienen tioles) alivian el efecto inhibidor de blumbagin sobre la actividad de KAT. Los carriles 5 y 8 muestran que Trolox, que no tiene un grupo tiol, no alivia la inhibición de blumbagin.


Figura 3A: estos datos sugieren una reacción química de NAC y DTT con plumgartina. La estructura genérica de los derivados de 1,4-naftoquinona, incluida la plumgartina, se muestra a continuación, junto con NAC y DTT.

Fig. 3B; Es probable que el grupo tiol en NAC reaccione con un sp2 C, que en última instancia conduce a un producto que conserva la conjugación si es posible. Dibuje un mecanismo que muestre cómo podría reaccionar NAC con la estructura a continuación y muestre los productos finales.


Fig 4 A: Se ensayó una variedad de derivados de 1,4-naftoquinona para ver su efecto sobre la actividad de p300 en presencia y ausencia de NAC. Uno, LawSone, cuya estructura se da a continuación, no mostró efectos inhibidores, como se muestra a continuación. Dé una explicación química probable para esta observación.

Lawsone puede existir en las siguientes formas tautoméricas y, por lo tanto, no es probable que reaccione con un tiol en C3.

Figura 4C. Si reaccionaron con tioles libres, entonces los derivados de naftoquinona deberían tener un efecto sobre la concentración de tioles libres en ensayos in vitro. Los resultados de uno de estos ensayos se muestran a continuación.

Compare este gráfico con el siguiente. ¿Qué conclusión puedes sacar?

Lawson, como se predijo a partir de su estructura, no reacciona con los tioles, por lo que no puede reaccionar con el plumbagin.


Figura 5 (no mostrada): los autores utilizaron espectroscopia de fluorescencia y UV-Vis para estudiar el efecto de NAC en los espectros de análogos de 1,4-naftoquinona. ¿Qué efectos probables esperaría observar en el espectro de leyes uno?

Ninguno, ya que LawSone no reacciona con el NAC que contiene tiol.


Fig. 6A: El objetivo final de los investigadores era producir un derivado de 1,4-naftoquinona que no fuera citotóxico y que presumiblemente resulta de sus interacciones con tioles libres. Sintetizaron PTK1 como se muestra a continuación. ¿Por qué esta reacción produciría un inhibidor potencial que no reaccionaba con los thols libres en las células?

Tiene un metilo en C3 que inhibiría su reacción con tioles libres.

FIGURA 6B. Los investigadores estudiaron los efectos de PTK1 en la acetilación P300 de histonas del núcleo de HeLa con diferentes concentraciones de PTK1 en ausencia y presencia de NAC (Figura B), así como la presencia de tiol libre en presencia o ausencia de PTK1 (Figura C).

¿Qué puedes concluir de estos gráficos?

Como era de esperar, PTIK1 inhibe la acetilación de P300 sin efectos por la adición de NAC.

Figura 6D: La siguiente figura muestra el espectro de absorción UV-visible de PTK1 en presencia o ausencia de NAC?

¿Qué conclusiones puedes sacar?

PTK1 no reacciona con NAC, como se esperaba.

Fig 6E: La figura siguiente muestra el análisis de inmunotransferencia (IB) de lisados ​​celulares tras 24 h de tratamiento con PTK1 usando anticuerpos de acetilación H3K9. Las concentraciones de PTK1 utilizadas se indican en la figura E. Barras de error, S.D. ¿Qué conclusiones puedes sacar de las manchas?

PTK1 actúa como un potente inhibidor de la acetilación de H3K9 in vivo.


7. ¿Cómo podría PTK1 inhibir la actividad de p300 KAT? Los análisis cinéticos enzimáticos serían útiles. La enzima tiene dos subestados, acetil CoA e histonas. Estudios anteriores han demostrado que los sustratos se unen a p300, en un mecanismo ordenado. El inhibidor no competitivo PTK1 podría unirse a la enzima libre así como a la forma unida al sustrato, dando como resultado un complejo ternario abortivo. T

Suponga que los inhibidores reversibles agregados se comportan de manera similar con reacciones de un solo sustrato y de múltiples sustratos. Aquí hay algunas reglas simples que se aplican a las gráficas recíprocas dobles (1 / v vs 1 / [S} cuando 1 sustrato se mantiene constante:

La pendiente cambia cuando:

  • I y S se unen a la misma forma de la enzima (por ejemplo, E se une tanto a S como a I) O
  • Me enlazo a una forma de E (en la línea horizontal) que está conectada a la forma que S enlaza, y yo enlazo primero (por ejemplo, yo enlazo a E y luego S enlaza).

La intersección con Y cambia cuando:

  • I y S se unen a diferentes formas de la enzima a menos que I se una primero y la unión de I y S esté en rápido equilibrio.

Figura 7 AB: Las figuras 7 A y B a continuación muestran gráficas recíprocas dobles o de Lineweaver-Burk (1 / v frente a 1 / [S]) de p300 KAT con un sustrato fijo y el otro variando a diferentes concentraciones fijas del inhibidor PTK1.

  • En la Figura 7A, la concentración de histonas centrales se mantuvo constante en 1,7 μm mientras aumentaba la concentración de isótopos marcados [3H] acetil-CoA de 1 a 8 μm en ausencia (sin inhibidor) o concentraciones crecientes de PTK1 (15, 20, 25, 35 y 45 μm). La dirección de aumento de la concentración de inhibidor se muestra con la flecha roja.
  • En la Figura 7B: se estudió la inhibición de la actividad de p300 KAT por PTK1 a una concentración fija de [3H] acetil-CoA (1,6 μm) y concentraciones crecientes de histonas centrales (5 a 70 nm) en ausencia (sin inhibidor) o concentraciones crecientes de PTK1 (15, 20, 25, 35 y 45 μm).

Por analogía con las reacciones de un solo sustrato que se muestran a continuación en las ecuaciones químicas vinculadas, ¿qué tipo de inhibición muestra PTK1?

Parece ser un inhibidor no competitivo para cada sustrato. Para una enzima de sustrato único, la inhibición no competitiva se caracteriza por gráficas recíprocas dobles que varían en pendiente y se cruzan en el eje x. Esto se aplica a que el inhibidor no altera la Km, pero la Vm aparente disminuye. Este análisis está un poco simplificado.


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