Información

Pipeteo de daños en las células

Pipeteo de daños en las células


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tengo curiosidad por saber cuánto daño puede causar el esfuerzo cortante al pipetear. Sé que las jeringas que se usan para la inyección de células madre pueden causar mucho daño. Sin embargo, ¿hasta qué punto sucede esto con las puntas de pipeta P20 y P200? Es comprensible que el módulo de cizallamiento de las células bacterianas sea significativamente diferente al de las células cancerosas, que será diferente al de las células madre.


Esta es una excelente pregunta, he estado capacitando a personas para cultivar células durante aproximadamente 12 años y los estudiantes tienen dificultades para comprender esto y apreciar la importancia, etc.

Lo que las células experimentan normalmente durante el pipeteo es análogo a una multitud de personas que intentan pasar por la puerta de un edificio. El cizallamiento durante el pipeteado es sin duda una preocupación legítima en el cultivo celular. Notará su efecto negativo sobre la viabilidad de forma más explícita al pipetear células en medio de congelación (que contiene DMSO) después de una descongelación. Hasta que su concentración de DMSO cae, sus membranas son más débiles y más fluidas. Es por eso que pipetea las células congeladas gota a gota al medio fresco, para ser especialmente suave en este punto.

Las células procariotas, como las células TOP10 mencionadas anteriormente, se tratan con cloruro de calcio y glicerol, que tiene esencialmente el mismo efecto en sus paredes y membranas. Por lo tanto, el pipeteo también debe realizarse con delicadeza después de descongelar estas células.

Dicho esto, si compara la sensibilidad de las células procariotas y eucariotas al cizallamiento, las células eucariotas son profundamente más sensibles.

Para las personas que utilizan bacterias competentes para la subclonación y otros usos de rutina, matar un pequeño porcentaje de sus células no es tan importante. Sin embargo, si está utilizando la transformación para generar bibliotecas de ADNc, es muy importante que tenga un título que represente suficientemente el transcriptoma del que se compone la biblioteca.

En estos casos, es esencial utilizar una celda competente de mayor calidad, respetar las temperaturas correctas y minimizar el pipeteo. Esta es la razón por la que a muchos se les enseña a mezclar el ADN con las células competentes, en lugar de la alternativa más dura: pipetear hacia arriba y hacia abajo.

Los cuatro factores más importantes que contribuyen al cizallamiento celular son, y en orden de más a menos contribuyentes:

  1. Diámetro del orificio en la punta de la pipeta, cuanto más pequeño, más cizallamiento.
  2. Velocidad a la que pasa la suspensión por la abertura de la punta. Cuanto más rápido, más dañino.
  3. Tamaño y rigidez de la celda. Las células más grandes son más propensas a sufrir daños. Las células con una pared de mureína son menos propensas a sufrir daños.
  4. Concentración de células. Las culturas que están más concentradas son más propensas a sufrir daños.

Debido a que la composición de la propia célula es tan influyente en la cantidad de daño y debido a la enorme variedad de células; diseñar un experimento representativo para evaluar los daños sería muy difícil y laborioso.

Finalmente, la variedad de puntas y seriológicos también es enorme. Sin embargo, si uno intentara evaluar esto, se podría hacer:

Elija una variedad representativa de líneas celulares, elija una variedad representativa de pipetas. Probablemente uno querría usar una pipeta robótica para poder evaluar velocidades y presiones asignadas de manera incremental. Observe las diferentes concentraciones de cultivo, las fases de la curva de crecimiento, el tiempo entre el pipeteo y el análisis, la distancia entre el fluido que sale y el cultivo, etc.

Creo que un método de análisis muy exitoso sería usar yoduro de propidio y FACS.

Después de su experimento, que costará mucho tiempo y $, creo que encontrará reglas de sentido común: mantenga el pipeteo al mínimo y use puntas más amplias siempre que sea posible.


Es un experimento fácil de hacer. Tome sus células alícuotas en 10 tubos de microcentrífuga y pipetee cada suspensión cada vez más veces, tiñe con azul tripán y cuente.

Los factores más importantes serán el tipo de pipeta que utilice; Yo esperaría que un p1000 causara más daño que un p200 y luego un p20 debido a la velocidad del fluido. Además, el factor más importante será la habilidad del científico, si pipetea lentamente debería disminuir el estrés en lugar de pipetear rápidamente.

En mi experiencia, depende del tipo de pipeta y la habilidad del operador. La única forma de responder a esto es intentarlo empíricamente.


Como anécdota, no he observado ninguna muerte celular al pipetear E. coli DH5alpha o TOP10, sin embargo, como células competentes, no se recomienda mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo debido a la pared celular comprometida.


Esta pregunta estaría mejor servida en física o química. No creo que tengamos una ingeniería genérica en la que la dinámica de fluidos pueda describirse en un método diferente al de la física, pero si lo hiciéramos, también debería responderse allí.

De hecho, la presión osmótica o líquida en sí misma causaría cambios que posiblemente dañen la célula. Luego, otras reacciones eexotérmicas y endotérmicas a los productos químicos debido a la fuerza del impacto, como una quemadura química o por fricción.

Estoy seguro de que los otros requisitos de conservación de la energía los ignoré a medias.

Encontré este artículo interesante que se centra en el esfuerzo cortante en general.

El pipeteo causa tensión de cizallamiento y elevación de la proteína quinasa / jun quinasa activada por estrés fosforilada en embriones preimplantacionales.

Xie Y1, Wang F, Puscheck EE, Rappolee DA.

El esfuerzo cortante a 1,2 dinas / cm (2) induce la fosforilación de la proteína quinasa / jun quinasa activada por estrés que precede y causa la apoptosis en los embriones (Xie et al., 2006b, Biol Reprod). El pipeteo de embriones es necesario para muchos protocolos, desde la fertilización in vitro hasta la recolección de embriones antes de analizar la expresión génica mediante microarrays. Intentamos determinar si el pipeteo regula al alza la MAPK8 / 9 fosforilada (anteriormente conocida como proteína quinasa activada por estrés / jun quinasa / SAPK / JNK1, 2). Encontramos que MAPK8 / 9 fosforilado, un marcador de activación de MAPK8 / 9, se regula al alza de una manera dependiente de la dosis mediante pipeteo. Mientras que los embriones a los que se les eliminó la zona pelúcida eran más sensibles a la letalidad inducida por estrés mediada por una fuerza de corte de 1,2 dinas / cm (2), se indujo MAPK8 / 9 fosforilado a un menor número de trituraciones de pipeta en embriones eclosionados en E4.5. Los embriones E4.5 fueron más sensibles a la inducción de MAPK8 / 9 que los embriones no eclosionados en E2.5 o E3.5. Los embriones E3.5 también mostraron una inducción dependiente de la dosis de pipeteo de la proteína FOS (anteriormente conocida como c-fos), un marcador de estrés por cizallamiento en muchos tipos de células. MAPK8 / 9 fosforilado medido en embriones ex vivo de E1.5 a E4.5 se expresó a niveles bajos. Los embriones que se habían pipeteado lo suficiente para inducir MAPK8 / 9 fosforilado y FOS tenían el mismo número de células que los embriones no tratados 24 horas después. Esto sugiere que la fosforilación rápida de MAPK8 / 9 debido a la tensión transitoria de cizallamiento no media los resultados biológicos negativos a largo plazo. Pero, es posible que las técnicas que requieren múltiples eventos de manejo induzcan MAPK8 / 9 y causen resultados biológicos o que otros resultados biológicos se vean afectados por cantidades bajas de esfuerzo cortante transitorio. Este estudio sugiere que la manipulación de embriones antes de la medición experimental de fosfoproteínas de transducción de señales, proteínas y ARNm debe realizarse con cuidado. De hecho, es probable que la tensión de cizallamiento provoque cambios transitorios rápidos en cientos de proteínas y ARNm.


El esfuerzo cortante $ tau $ en estos tamaños pequeños generalmente se mide en dinas / cm2 o N / m2 = Pa. Las ecuaciones entre ellos: $ 1dyn / cm ^ 2 = 10 ^ {- 5} N / cm ^ 2 = 0.1N / m ^ 2 = 0.1Pa $.

¿Qué tipo de daños pueden sufrir los cigotos al pipetear?

Usando microscopía electrónica de barrido, encontramos agujeros abiertos en la superficie de los huevos lisados, lo que indica que la membrana plasmática no se vuelve a sellar después de la microinyección. No se observaron agujeros en los huevos sin lisar, pero muchos de ellos tenían alteraciones en la membrana que sugerían perforaciones curadas.

  • 1987 - Viabilidad del cigoto en experimentos de transferencia de genes

Incluso un pequeño esfuerzo cortante de 1,2 dyn / cm2 induce la apoptosis pipeteando cigotos. Entonces, los cigotos tienen su nivel crítico de esfuerzo cortante en 1.2 dyn / cm2 y el pipeteo implica fuerzas mayores que 1.2 dyn / cm2.

El esfuerzo cortante a 1,2 dinas / cm2 induce la fosforilación de la proteína quinasa / jun quinasa activada por estrés que precede y causa la apoptosis en los embriones (Xie et al., 2006b, Biol Reprod). El pipeteo de embriones es necesario para muchos protocolos, desde la fertilización in vitro hasta la recolección de embriones antes de analizar la expresión génica mediante microarrays. Intentamos determinar si el pipeteo regula al alza la MAPK8 / 9 fosforilada (anteriormente conocida como proteína quinasa activada por estrés / jun quinasa / SAPK / JNK1, 2). Encontramos que MAPK8 / 9 fosforilado, un marcador de activación de MAPK8 / 9, se regula al alza de una manera dependiente de la dosis mediante pipeteo.

  • 2007 - El pipeteo causa tensión de cizallamiento y elevación de la proteína quinasa / jun quinasa activada por estrés fosforilada en embriones preimplantacionales

El nivel crítico de esfuerzo cortante se encuentra entre 0.01 y 1000 dyn / cm2 por células animales, dependiendo del tipo de célula y la especie. (Creo que el promedio es de alrededor de 50 dyn / cm2, pero es muy difícil diferenciar entre artículos que mencionan niveles de cizallamiento críticos y niveles de cizallamiento más letales, por lo que el rango y el promedio pueden ser más bajos). La constante de muerte (1 / h ) aumenta exponencialmente al aumentar el esfuerzo cortante.

Se desarrolló un aparato para la investigación detallada de la influencia del esfuerzo cortante en las células BHK adherentes. Se estudiaron fuerzas cortantes entre 0.0 y 2.5 N m − 2. Se determinó la influencia sobre la viabilidad celular, la morfología celular, la lisis celular y el tamaño celular. El aumento de las fuerzas de cizallamiento, así como el aumento de la duración de la exposición, provocó cambios crecientes en la morfología celular y la muerte celular. Se determinó un "nivel crítico de esfuerzo cortante".

  • 1992 - Determinación de un "nivel crítico de esfuerzo cortante" aplicado a células de mamíferos adherentes

Abu-Reesh y Kargi examinaron el daño relacionado con el esfuerzo cortante en un hibridoma de ratón en condiciones laminares y turbulentas en un viscosímetro Searle de cilindro coaxial. Las células se expusieron a niveles de esfuerzo cortante de 5 a 100 N / m2 durante 0,5 a 3,0 h. A un esfuerzo de cizallamiento y tiempo de exposición dados, el cizallamiento turbulento fue mucho más dañino que el cizallamiento laminar, como también se informó en el pasado para protozoos y células vegetales. En condiciones turbulentas, se produjeron daños cuando el esfuerzo cortante excedió los 5 N / m2. La actividad respiratoria de las células se dañó antes que la membrana celular, lo que implica la transmisión de la señal de estrés al interior de la célula. El daño celular siguió a una cinética de primer orden tanto en entornos laminares como turbulentos. Para niveles de esfuerzo cortante turbulento de 5 a 30 N / m2, la constante de tasa de muerte (kd) aumentó exponencialmente al aumentar el nivel de esfuerzo; los valores de kd variaron entre 0,1 y 1,0 l / h.

  • 2001 - Daño hidrodinámico a las células animales

Los cultivos endoteliales subconfluentes expuestos continuamente a una cizalladura de 1-5 dinas / cm2 proliferan a una velocidad comparable a la de los cultivos estáticos y alcanzan la misma densidad de saturación (≃ 1,0-1,5 × 105 células / cm2). Cuando se exponen a un esfuerzo cortante laminar de 5-10 dinas / cm2, las monocapas confluentes experimentan un cambio dependiente del tiempo en la forma de la celda de poligonal a elipsoidal y se orientan uniformemente con el flujo. La regeneración de "heridas" lineales en la monocapa confluente parece estar influenciada por la dirección de la fuerza aplicada. Los estudios preliminares indican que ciertas funciones de las células endoteliales, incluida la endocitosis de fluidos, el ensamblaje citoesquelético y las propiedades superficiales no trombogénicas, también son sensibles al esfuerzo cortante. Estas observaciones sugieren que las fuerzas mecánicas de los fluidos pueden influir directamente en la estructura y función de las células endoteliales.

  • 1981 - La respuesta dinámica de las células endoteliales vasculares al esfuerzo cortante del fluido

El esfuerzo cortante por encima de 0,25 dinas / cm (2) resultó en una pérdida dramática de podocitos pero no de células epiteliales tubulares proximales (células LLC-PK (1)) después de 20 h.

  • 2006 - Los podocitos son sensibles al esfuerzo cortante de fluidos in vitro

Se ha realizado una serie de estudios cuidadosos sobre el daño sanguíneo en un viscosímetro rotacional. Se ha prestado especial atención a los efectos de la interacción de la superficie sólida, la fuerza centrífuga, la interacción de la interfaz de aire, la mezcla de capas cortadas y no cortadas, la interacción célula-célula y el calentamiento viscoso. Los resultados muestran que hay un umbral de esfuerzo cortante, 1500 dinas / cm2, por encima del cual el daño celular extenso se debe directamente al esfuerzo cortante, y los diversos efectos secundarios enumerados anteriormente son insignificantes.

  • 1972 - Daño de glóbulos rojos por esfuerzo cortante

El umbral de esfuerzo cortante de algunos dinoflagelados (microalgas) es incluso más bajo que el de los eritrocitos (0,029 N / m2). Por ejemplo, un nivel de esfuerzo cortante laminar continuo de sólo 0,0044 N / m2 (equivalente a una velocidad de corte de 2,2 1 / s) ha resultado letal para el dinoflagelado Gonyaulax polyedra.

Otros tipos de células no son necesarios tan sensibles como las células animales y no necesariamente reaccionan con apoptosis (aproximadamente 10 dyn / cm2) al esfuerzo cortante, por lo que debe usar fuerzas necróticas (aproximadamente 5000 dyn / cm2) para destruirlas:

tipo de célula tamaño sensibilidad al cizallamiento células microbianas 1-10μm gránulos / grumos microbianos bajos hasta 1 cm células vegetales moderadas 100μm agregados de células vegetales moderadas / altas hasta 1-2 cm células animales de altura 20 μm células animales de altura en microportadores 80-200 μm células de hongos muy altas 2 -10μm moderado / alto
  • Tabla 1 - sensibilidad al cizallamiento por tipos de células
  • Principios de ingeniería de bioprocesos: tabla 8.6 - Pauline M. Doran
  • 1996 - Papel de la cizalladura hidrodinámica en el cultivo de células animales, vegetales y microbianas
  • 1988 - Efecto del cizallamiento sobre la viabilidad de las suspensiones de células vegetales
  • 2004 - Un análisis cuantitativo de los efectos de cizallamiento en la suspensión celular y el cultivo celular de perilla frutescens (planta) en biorreactores
  • 2009 - Sensibilidad al corte - el texto completo probablemente contiene todos los números

Los resultados muestran que los ovarios de hámster chino y las células del riñón embrionario humano entrarán en la vía apoptótica cuando se sometan a niveles bajos de estrés hidrodinámico (alrededor de 2,0 Pa) en un flujo extensional oscilante. En contraste, la muerte necrótica prevalece cuando las células están expuestas a tensiones hidrodinámicas alrededor de 1.0 Pa en flujo de cizallamiento simple o alrededor de 500 Pa en flujo extensional.

  • 2009 - Inducción de la muerte de células de mamíferos por cizallamiento simple y flujos extensionales

La sensibilidad al cizallamiento no está determinada solo por el tipo de célula y la especie, hay muchos otros factores involucrados:

  • tipo de célula y especie
  • composición y espesor de la pared celular cuando está presente
  • tamaño y morfología de la célula
  • la intensidad y la naturaleza del esfuerzo cortante, ya sea turbulento o laminar, o asociado con interfaces (por ejemplo, durante el ascenso y la ruptura de la burbuja)
  • historial de crecimiento, tanto a corto plazo (por ejemplo, inanición) como adaptación a largo plazo
  • medio de crecimiento (oligoelementos, vitaminas, fuentes de carbono y nitrógeno)
  • tasa de crecimiento
  • etapa de crecimiento
  • tipo y concentración de agentes protectores contra el cizallamiento, si están presentes

Las células pueden ser muy sensibles al esfuerzo cortante causado por el flujo turbulento, mientras que no tan sensibles al esfuerzo cortante causado por el flujo laminar.

Sobre la base de las mediciones de viscosidad de flujo laminar, se ha sugerido un nivel crítico de esfuerzo cortante de 80-200 N / m2 para las células de Morindata citrifolia.

… Mientras que para Daucus carota un nivel de esfuerzo cortante de 50 N / m2 se ha asociado con daño celular. En otro estudio, las células de zanahoria en un viscosímetro Couette de flujo laminar perdieron la capacidad de crecer y dividirse en el rango de esfuerzo cortante de 0.5-100 N / m2. La actividad de la enzima intracelular se vio afectada a niveles de esfuerzo cortante superiores a 3000 N / m2, pero no se produjo una lisis significativa hasta que se aplicó un nivel de esfuerzo cortante de 10.000 N / m2 durante un período prolongado (> 1 h).

En contraste con el comportamiento en flujo laminar, las células eran bastante sensibles a la agitación turbulenta del impulsor. Las velocidades de la punta del impulsor de ~ 1,1 m / s lisaron una proporción significativa de las células en 40 minutos.

El daño de la burbuja es severo (1000 células por una sola burbuja de 3,5 mm de tamaño) debido a la adherencia de las células a la interfaz de la burbuja y las fuertes fuerzas involucradas (> 1000 dinas / cm2 por biorreactores agitados). La adherencia y, por tanto, el daño se pueden reducir con tensioactivos.

  • 2004 - Estudios cuantitativos de interacciones célula-burbuja y daño celular a diferentes concentraciones celulares y pluronic F-68.
  • 2004 - Reducción de surfactante en la adhesión de burbujas de embolia y daño endotelial

Se propone que cuando las células están unidas o muy cerca de una burbuja en ruptura, las fuerzas hidrodinámicas asociadas con la ruptura son suficientes para matar las células.

Todos los experimentos se realizaron con células de insectos Spodoptera frugiperda (SF-9), en medio TNM-FH y SFML, con y sin Pluronic F-68. Los experimentos indican que aproximadamente 1050 células mueren por cada ruptura de burbuja única de 3,5 mm en medio TNM-FH y aproximadamente el mismo número de células muertas está presente en el chorro ascendente. También se observó que la concentración de células en este chorro ascendente es más alta que la suspensión celular en medio TNM-FH sin Pluronic F-68 en un factor de dos. Se cree que esta mayor concentración es el resultado de que las células se adhieran a la interfaz de la burbuja. Estas células son arrastradas hacia el chorro ascendente durante el proceso de ruptura de la burbuja. Finalmente, se sugiere que una capa delgada alrededor de la burbuja que contiene estas células absorbidas es el "volumen hipotético de muerte" presentado por otros investigadores.

  • 1994 - Cuantificación del daño a las células de insectos suspendidas como resultado de la ruptura de burbujas.

Para una línea de hibridoma, informó que la exposición a un esfuerzo cortante laminar (208 N / m2) en un flujo no aireado en un viscosímetro de cono y placa condujo a una pérdida sustancial en el recuento de células y la viabilidad en 20 min. A una exposición constante de 180 s, el aumento de la tensión de cizallamiento por encima de 100-350 N / m2 mejoró linealmente la disrupción celular, con> 90% de las células destruidas a un nivel de tensión de 350 N / m2. Los niveles de esfuerzo cortante asociados con la ruptura de burbujas en la superficie de un biorreactor pueden oscilar entre 100 y 300 N / m2. Estos valores son notablemente consistentes con las velocidades de cizallamiento que dañaron los hibridomas en experimentos de flujo laminar no aireado.

Las pipetas de orificio más pequeño causan más daño.

También examinamos aspectos del procedimiento de transferencia génica que podrían influir en la supervivencia, como el tamaño de las pipetas de inyección y su estrechamiento en relación con el diámetro del cigoto, la posible toxicidad del medio de inyección, el momento de la inyección y la retirada inmediata frente a la retrasada de la pipeta. Los únicos factores que afectaron significativamente la viabilidad celular fueron el tamaño y la conicidad de la pipeta, y el momento de la inyección en relación con la primera escisión. Esto sugiere que la viabilidad del cigoto se correlaciona inversamente con el tamaño del orificio producido por la pipeta de inyección y que el daño a la membrana se repara con menos éxito a medida que el óvulo fertilizado se prepara para la división.

  • 1987 - Viabilidad del cigoto en experimentos de transferencia de genes

Es difícil encontrar algo sobre el nivel de esfuerzo cortante al pipetear. Sin duda, puede ser más de 1 dyn / cm2. Tiene una duración corta (como máximo unos segundos). Creo que los siguientes factores pueden influir en los niveles de esfuerzo cortante al pipetear:

  • tipo de pipeta
  • velocidad de flujo (el flujo más rápido puede ser más turbulento)
    • presión negativa por succión
    • tamaño del orificio (un orificio más grande puede reducir la velocidad del flujo)
    • viscosidad liquida
  • formación de burbujas

Probablemente haya más factores involucrados, pero no soy un experto en pipeteo. ;-) Estoy de acuerdo con los demás, seguramente depende de las habilidades personales, p. Ej. un aficionado puede crear enormes burbujas al pipetear, lo que puede matar muchas células por formación y rotura ...

Estoy de acuerdo con Artem en que este es un experimento para hacer, especialmente si el resultado es importante para ti. Lo que necesita para crear un modelo sobre el daño de la pipeta son los niveles de esfuerzo cortante por pipeteo y los niveles críticos de esfuerzo cortante de las células. Creo que es difícil diseñar y experimentar en el que pueda medir los niveles de esfuerzo cortante en sus pipetas y no existe un modelo de flujo para pipetear hasta donde yo sé, por lo que puede ser un buen tema para un trabajo de tesis o diploma.


Sé que este es un hilo de dos años, pero pensé que lo publicaría de todos modos en caso de que alguien más esté buscando esta respuesta como yo esta noche. Este artículo citado a continuación no analiza las puntas de pipeta frente a las agujas específicamente, pero sí analiza la diferencia en los efectos del estrechamiento frente a las agujas cilíndricas sobre el daño celular. Desafortunadamente, las matemáticas en el papel están un poco más allá de mí (soy médico, no ingeniero, y no cubrieron este tema en la escuela de medicina), pero descubrieron que con agujas cilíndricas resultan en aproximadamente 5 veces la cantidad de muerte celular en comparación con una aguja cónica a cualquier caudal dado, y aproximadamente 6-8 veces la cantidad de células dañadas. Esto probablemente se debió en parte a la necesidad de presiones más altas para aumentar los caudales en las agujas cilíndricas en comparación con las agujas cónicas y a las variaciones en el corte debido a las geometrías. Si bien una aguja cónica no es idéntica a una punta de pipeta de plástico, las geometrías son comparables.

Biotechnol Prog. 2011 noviembre-diciembre; 27 (6): 1777-84. Efecto de la geometría de la aguja sobre la velocidad de flujo y el daño celular en el proceso de biofabricación basado en dispensación. Li M1, Tian X, Schreyer DJ, Chen X.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/btpr.679/full


Tengo un ejemplo biológico de la vida real. Configuración del experimento simplificado: las células B purificadas ex vivo se someten a 3 lavados en PBS (centrifugación y resuspensión), luego se incuban in vitro durante 24 horas y se analizan mediante citometría de flujo utilizando Acqua Zombie y PI para la exclusión de células muertas. Experimento 1: pipeteo después de los lavados con una punta de 1 ml Experimento 2: pipeteo después de los lavados con una pipeta de 10 ml

Supervivencia celular analizada por citometría de flujo: Experimento 1: 9,96% Experimento 2: 43,9%


Cultivo de células primarias: 3 técnicas (con diagrama)

El cultivo primario implica ampliamente las técnicas de cultivo realizadas después del aislamiento de las células, pero antes del primer subcultivo. Los cultivos primarios generalmente se preparan a partir de grandes masas de tejido. Por tanto, estos cultivos pueden contener una variedad de células diferenciadas, p. Ej. fibroblastos, linfocitos, macrófagos, células epiteliales.

Con la experiencia del personal que trabaja en los laboratorios de cultivo de tejidos, se consideran los siguientes criterios / características para el desarrollo eficiente de cultivos primarios:

una. Se prefieren los tejidos embrionarios en lugar de los tejidos adultos para los cultivos primarios. Esto se debe al hecho de que las células embrionarias se pueden desagregar fácilmente y producir células más viables, además de proliferar rápidamente in vitro.

B. La cantidad de células utilizadas en el cultivo primario debería ser mayor ya que su tasa de supervivencia es sustancialmente menor (en comparación con los subcultivos).

C. Los tejidos deben procesarse con un daño mínimo a las células para su uso en cultivo primario. Además, las células muertas deben eliminarse.

D. Es aconsejable la selección de un medio apropiado (preferiblemente uno rico en nutrientes). Para la adición de suero, se prefiere una fuente fetal bovina en lugar de suero de ternera o caballo.

mi. Es necesario eliminar las enzimas utilizadas para la disgregación de las células mediante centrifugación.

Técnicas de cultivo primario:

Entre las diversas técnicas diseñadas para el cultivo primario de tejidos aislados, las más utilizadas son tres:

1. Desagregación mecánica.

2. Desagregación enzimática.

3. Técnica de explante primario.

En la figura 36.1 se muestra un esquema de estas técnicas y los procedimientos se describen brevemente:

Técnica # 1. Desagregación mecánica:

Para la desagregación de tejidos blandos (por ejemplo, bazo, cerebro, hígado embrionario, tumores blandos), se suele emplear una técnica mecánica. Básicamente, esta técnica implica cortar con cuidado o cortar el tejido en pedazos y recoger las células derramadas.

Las células se pueden recolectar de dos formas:

I. Presionar los trozos de tejido a través de una serie de tamices con una reducción gradual del tamaño de la malla.

ii. Forzar los fragmentos de tejido a través de una jeringa y una aguja.

Aunque la desagregación mecánica implica el riesgo de daño celular, el procedimiento es menos costoso, rápido y simple. Esta técnica es particularmente útil cuando la disponibilidad de tejido es abundante y la eficiencia del rendimiento no es muy importante. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la viabilidad de las células obtenidas mediante técnicas mecánicas es mucho menor que la técnica enzimática.

Técnica # 2. Desglose enzimático:

La desagregación enzimática se usa principalmente cuando se requiere una alta recuperación de células de un tejido. La desagregación de tejidos embrionarios es más eficiente con un mayor rendimiento de células mediante el uso de enzimas. Esto se debe a la presencia de tejido conectivo menos fibroso y matriz extracelular. La desagregación enzimática se puede llevar a cabo utilizando tripsina, colagenasa o algunas otras enzimas.

Desagregación por tripsina:

El término tripsinización se usa comúnmente para la desagregación de tejidos por la enzima tripsina.

Muchos trabajadores prefieren usar tripsina cruda en lugar de tripsina pura por las siguientes razones:

I. La tripsina cruda es más eficaz debido a la presencia de otras proteasas.

ii. Las células pueden tolerar mejor la tripsina cruda.

iii. La actividad residual de la tripsina cruda se puede neutralizar fácilmente con el suero de los medios de cultivo (cuando se usan medios sin suero, se puede usar un inhibidor de tripsina para la neutralización).

La desagregación de las células también se puede llevar a cabo utilizando tripsina pura, que es menos tóxica y más específica en su acción. El tejido deseado se corta en trozos de 2-3 mm y luego se somete a desagregación con tripsina. Hay dos técnicas de tripsinización: tripsinización en caliente y tripsinización en frío (fig. 36.2).

Tripsinización caliente (Fig. 36.2A):

Este método se utiliza ampliamente para el desglose de células. El tejido cortado se lava con solución salina basal de disección (DBSS) y luego se transfiere a un matraz que contiene tripsina caliente (37 ° C). Se agita el contenido y, en un intervalo de cada treinta minutos, se puede recoger el sobrenadante que contiene las células disociadas. Después de eliminar la tripsina, las células se dispersan en un medio adecuado y se conservan (manteniendo el vial en hielo).

El proceso de adición de tripsina fresca (a los trozos de tejido), incubación y recolección de células disociadas (a intervalos de 30 minutos) se lleva a cabo durante aproximadamente 4 horas. Las células desagregadas se agrupan, se cuentan, se diluyen adecuadamente y luego se incuban.

Tripsinización fría (Fig. 36.2B):

Esta técnica se conoce más apropiadamente como tripsinización con preexposición al frío. El riesgo de daño a las células por exposición prolongada a tripsina a 37 ° C (en tripsinización caliente) puede minimizarse con esta técnica.

Después de picar y lavar, los trozos de tejido se mantienen en un vial (en hielo) y se empapan con tripsina fría durante aproximadamente 6-24 horas. La tripsina se elimina y se desecha. Sin embargo, los trozos de tejido contienen tripsina residual. Estos trozos de tejido en un medio se incuban a 37 ° C durante 20-30 minutos. Las células se dispersan por repetidas caricias de pi. Las células disociadas se pueden contar, diluir adecuadamente y luego usar.

El método de tripsinización en frío generalmente da como resultado un mayor rendimiento de células viables con una supervivencia mejorada de las células después de 24 horas de incubación. Este método no requiere agitación ni centrifugación y puede adoptarse convenientemente en un laboratorio. La principal limitación de la tripsinización en frío es que no es adecuada para la desagregación de células de grandes cantidades de tejidos.

Limitaciones de la desagregación de tripsina:

La desagregación por tripsina puede dañar algunas células (por ejemplo, células epiteliales) o puede ser casi ineficaz para ciertos tejidos (por ejemplo, tejido conectivo fibroso). Por tanto, también se utilizan otras enzimas para la disociación de células.

Desagregación por colagenasa:

El colágeno es la proteína estructural más abundante en animales superiores. Está presente principalmente en la matriz extracelular de tejido conectivo y músculo. La enzima colagenasa (normalmente una cruda contaminada con proteasas inespecíficas) se puede utilizar eficazmente para la desagregación de varios tejidos (normales o malignos) que pueden ser sensibles a la tripsina.

Se han probado grados de colagenasa altamente purificados, pero son menos efectivos en comparación con la colagenasa cruda. Las etapas importantes de la desagregación de colagenasa, que se muestran en la figura 36.3, se describen brevemente a continuación.

El tejido deseado suspendido en una solución de sal basal que contiene antibióticos se corta en trozos. Estas piezas se lavan por sedimentación y luego se suspenden en un medio completo que contiene colagenasa. Después de incubar durante 1-5 días, los trozos de tejido se dispersan pipeteando. Los grupos de células se separan por asentamiento. Las células epiteliales y las células fibroblásticas se pueden separar.

La desagregación de colagenasa se ha utilizado con éxito para el cerebro humano, los pulmones y varios otros tejidos epiteliales, además de varios tumores humanos y otros tejidos animales. La adición de otra enzima hialuronidasa (actúa sobre los residuos de carbohidratos en la superficie celular) promueve la disgregación.

Se ha encontrado que la colagenasa en combinación con hialuronidasa es muy eficaz para disociar el hígado de rata o conejo. Esto se puede hacer mediante la fusión de todo el órgano in situ. Algunos trabajadores usan colagenasa junto con tripsina, una formulación desarrollada en suero de pollo, para la desagregación de ciertos tejidos.

Uso de otras enzimas en desagregación:

La tripsina y la colagenasa son las enzimas más utilizadas para la desagregación. Ciertas proteasas bacterianas (por ejemplo, pronasa, dispasa) se han utilizado con éxito limitado. Además de la hialuronidasa, la neuraminidasa también se usa junto con la colagenasa para la degradación eficaz de los carbohidratos de la superficie celular.

Técnica # 3. Técnica de explante primaria:

La técnica de explante principal fue, de hecho, el método original, desarrollado por Harrison en 1907. Esta técnica ha sufrido varias modificaciones y todavía se utiliza. El procedimiento simplificado adoptado para el cultivo de explantes primarios se muestra en la figura 36.4 y se describe brevemente a continuación.

El tejido en solución de sal basal se pica finamente y se lava por sedimentación. Luego se retira la solución de sal basal. Los trozos de tejido se distribuyen uniformemente sobre la superficie de crecimiento. Después de la adición del medio apropiado, la incubación se lleva a cabo durante 3-5 días. Luego, el medio se cambia a intervalos semanales hasta que se observa un crecimiento sustancial de células. Ahora, los explantes se retiran y se transfieren a un recipiente de cultivo nuevo.

La técnica de explante primario es particularmente útil para la desagregación de pequeñas cantidades de tejidos (por ejemplo, biopsias de piel). Las otras dos técnicas de desagregación mecánica o enzimática, sin embargo, no son adecuadas para pequeñas cantidades de tejidos, ya que existe el riesgo de perder las células.

La limitación de la técnica del explante es la escasa adherencia de ciertos tejidos a la superficie de crecimiento y la selección de células en el crecimiento. Sin embargo, se observa que la técnica de explante primario se puede utilizar para la mayoría de las células embrionarias, p. fibroblastos, mioblastos, células epiteliales, células gliales.

Separación de células viables y no viables:

Es una práctica común eliminar las células no viables mientras se prepara el cultivo primario a partir de las células desagregadas. Esto se suele hacer cuando se realiza el primer cambio de medio. Las pocas células no viables que quedan se diluyen y desaparecen gradualmente a medida que comienza la proliferación de células viables.

Sometimes, the non-viable cells from the primary cultures may be removed by centrifugation. The cells are mixed with ficoll and sodium metrizoate, and centrifuged. The dead cells form a pellet at the bottom of the tube.

Medical Ethics and Safety Measures in Culture Techniques:

Since the culture techniques involve the use of animal or human tissues, it is absolutely necessary to follow several safety measures and medical ethics. In fact, in some countries there are established legislation/norms for selection and use of tissues in cultures. For example, in United Kingdom, Animal Experiments (Scientific Procedures) Act of 1986 is followed.

The handling of human tissues poses several problems that are not usually encountered with animal tissues. While dealing with fetal materials and human biopsies, the consent of the patient and/his or her relatives, besides the consent of local ethical committee is required. Further, taking any tissue (even in minute quantities) from human donors requires the full consent of the donor in a prescribed format.

The following issues need to be fully considered while dealing with human tissues:

1. The consent of the patient and/or relatives for using tissues for research purposes.

2. Ownership of the cell lines developed and their derivatives.

3. Consent for genetic modification of the cell lines.

6. Patent rights for any commercial use of cell lines.

In the general practice of culture techniques using human tissues, the donor and/or relatives are asked to sign a disclaimer statement (in a prescribed pro-forma) before the tissue is taken. By this approach, the legal complications are minimized.

Handling of human tissues is associated with a heavy risk of exposure for various infections. Therefore, it is absolutely necessary that the human materials are handled in a biohazard cabinet. The tissues should be screened for various infections such as hepatitis, tuberculosis, HIV, before their use. Further, the media and apparatus, after their use must be autoclaved or disinfected, so that the spread of infections is drastically reduced.


Assessment of Future Scientific Needs for Live Variola Virus.

As noted earlier, smallpox was eradicated prior to the modem age of cell and molecular biology, virology, and immunology. Therefore, the basics of viral replication, determinants of viral virulence, and pathogenesis of the disease are not as well understood as they are for other pathogens.

Since variola virus is a pathogen that is uniquely adapted to cause severe, widespread human illness, it is highly likely that it has evolved to specifically thwart an effective immune response to infection. Poxviruses are the largest of the viruses and produce many proteins that are not necessary for virus replication, but presumably enhance the ability of the virus to cause disease. The multiple mechanisms used by poxviruses to evade host immune responses, the unique proteins these viruses produce, and their interactions with the host are just beginning to be identified. As the database expands, questions about the interactions of variola virus with human cells and immune responses and about the functions of these disease-producing variola proteins will become more obvious and pressing. The ability to identify the interactions between variola virus and host proteins would likely provide new insights into important aspects of the human immune system that would not be apparent from studies of other viruses.


Finding ways to recycle

Even when plastics have outlived their usefulness in the lab, researchers and institutions are finding ways to keep them out of the trash heap. Currently, after being thrown away, most lab plastics go to a landfill, or, if they’re contaminated with anything potentially dangerous, into biohazardous waste streams, where they are typically incinerated, explains Allison Paradise, executive director of My Green Lab, a California-based nonprofit that promotes lab sustainability.

Paradise recalls being shocked by how much laboratory plastic ware is wasted while completing a summer internship at a pharmaceutical lab during high school. She remembers diligently collecting her pipette tips after an experiment, and asking her PI where the recycling bin was. “She was just looking at me like I [was] crazy,” Paradise says.

Yet many lab plastics can, in principle, be recycled—an option that some institutions are now exploring. Anne Krieghoff, manager of the sustainability program at the University of California, Irvine, was able to work out a recycling program in 2013 by coordinating with the university’s waste transfer station. Before then, plastics were going from UC Irvine labs straight into landfills. Now, many of the institution’s lab plastics, including polypropylene pipette tip boxes and even pipette tips, are recycled, provided they were only used for harmless reagents and water. Recycling represents a major economic bonus for the university, Krieghoff explains, as in the Irvine region, landfill waste costs more to take away, whereas the institution receives money from their waste hauler for recycling.

Even when traditional recycling services for certain plastics aren’t available, lab managers and university administrators often find bespoke solutions. For example, many biology labs go through copious amounts of Styrofoam, which researchers use to transport reagents and biological materials that need to be maintained at controlled temperatures. To find a sustainable avenue for this material at Irvine, Krieghoff initially cut a deal with surfboard manufacturing company Marko, which compressed it to form the buoyant cores of surfboards. However, the university’s labs collected so much Styrofoam through the program that Krieghoff later had to switch to a larger, Styrofoam-manufacturing company to accept the material, she says.

Establishing such deals is easier in some states than in others. “If you go to places in Texas and Alabama and Oklahoma, or even Missouri, they [often] don’t even have basic recycling for their homes, let alone the lab,” Paradise says.

Nevertheless, Nick Ciancio, a neuroscience undergraduate at the University of Alabama at Birmingham (UAB), was able to find one recycling company in Albertville last year that was willing to accept polypropylene and Styrofoam. About 70 of the university’s 2,000 science labs now recycle their waste through this scheme.

However, UAB made the decision to exempt pipette tips from the program over concerns that researchers might accidentally throw tips contaminated with hazardous waste into the recycling bin, posing a health risk to workers at the recycling facility. This was a precautionary decision, Ciancio explains. “If anything is improperly disposed of, it would be a pipette tip. The first time someone outside of the institution is contaminated with biohazardous material will be the last time we recycle lab material.”

Although the Environmental Protection Agency provides rudimentary guidelines on hazardous waste disposal, it’s up to institutions to take the initiative to go further. And because they are responsible for any eventual contamination of their waste, Paradise explains, many prefer to err on the side of caution.


Agradecimientos

This work was funded by the ERC, BBSRC and Wellcome Trust (ERC_STG 337066, BB/L023776/1 and IA 212304/Z/18/Z to C.L.C. PhD studentship 105398/Z/14/Z to M.L.R.H.). A.M.B. was funded by the MRC (NIRG MR/N00227X/1). S.W. was funded by an MRC studentship. T.C.L. was funded by a Sir Henry Dale Fellowship (210424/Z/18/Z). Work by the Göttgens group is funded by the Wellcome Trust, Bloodwise and Cancer Research UK, with core funding from the Wellcome–MRC Cambridge Stem Cell Institute. C.L.C. and K.R.D. were supported in part by the Royal Irish Academy–Royal Society International Exchange Program (IECR1180061). We thank M. Tunnicliff for passaging parasites and preparing mosquitos, F. Angrisano and K. Sala for technical assistance and advice with infections, I. Kucinski for support creating the interactive website, Imperial College DoLS Flow Cytometry and Central Biomedical Services and Crick Biological Research Facilities for support, and H. Fletcher, A. Cunnington and all of the Lo Celso group members for constructive discussions.


Trypsin-Free Detachment of cells using EDTA - (Jun/20/2006 )

I am trying to detach T84 cells without trypsin, however these cells are especially hard to lift. Can anyone tell me how long cells can incubate in EDTA before it harmful effects set in (ie apoptosis, membrane damage, etc)? So far 10 minutes is not enough to lift all the cells. Gracias por adelantado.

Why don't you want to use trypsin?

if u need to detach cells, i have a protocol with citric saline.

I am interested in studying cell surface proteins via flow cytometry, which trypsin would eat up. I am very interested in your citric saline protocol. You can email to me if that's easier. Thanks so much!

thanks so much scolix - i will try it.

can u send citric saline method for detaching. i am also intrested.

If possible, I too would be interested in a copy of the non-trypsin based protocol. Thank you in advance if you may offer any assistance

Me too, pleasssseee. Gracias.

Here are two different approaches I have been recommended:

Make a solution of 1mM EDTA (can be increased all the way up to 10-15mM EDTA if your cells are extremely adherent). The EDTA solution acts to chelate calcium. Flood flask with the solution and incubate for 1 minute. Remove most of solution (not as dangerous for cells to sit in EDTA as it is to sit in trypsin) and allow to incubate at 37degrees for 5-10 minutes. Time may be increased if necessary.

I found that the EDTA solution at 10mM worked well for 10 minutes with Hep2 epithelial cells, but I had difficulty with clumping for my T84 cell line. Normally this would not be terrible, but for flow cytometry it is very problematic.

For 500mL 10x solution: 50.3 g KCl, 22.06 g Sodium Citrate.

Flood flask with prewarmed citric saline (1x) and incubate at 37 degrees for 4 minutes. Remove cells be gently tapping or pipetting up and down several times.

I have not had the chance to try this yet, so please let me know how this works for you!


Biology of taste buds and the clinical problem of taste loss

Taste buds are the anatomical structures that mediate the sense of taste. They comprise taste cells and nerve fibers within specialized epithelial structures. Taste cells are traditionally described by histologic methods as basal, dark, intermediate, and light cells, with the nerve fibers surrounding and infiltrating the taste buds. By means of immunohistochemical methods, taste cells and gustatory nerve fibers can be classified in functional groups based on the expression of various cell adhesion molecules and other proteins. When taste buds become damaged, the loss of the ability to taste results. This loss is not uncommon and can impact health and quality of life. Patients who receive radiation therapy for head and neck cancer often experience taste loss, which leads to compromised nutritional intake and a worse outcome than patients who do not experience taste loss. The mode of radiation damage to taste cells and nerve fibers has been investigated using cell adhesion molecules, synaptic vesicle proteins, and other cell markers. The light and intermediate cells are preferentially affected by ionizing radiation, whereas the nerve fibers remain structurally intact. Experimental studies of radiation-induced taste loss are performed via a unique animal/human model.


Abstracto

Recent discoveries are redefining our view of cellular senescence as a trigger of tissue remodelling that acts during normal embryonic development and upon tissue damage. To achieve this, senescent cells arrest their own proliferation, recruit phagocytic immune cells and promote tissue renewal. This sequence of events — senescence, followed by clearance and then regeneration — may not be efficiently completed in aged tissues or in pathological contexts, thereby resulting in the accumulation of senescent cells. Increasing evidence indicates that both pro-senescent therapies and antisenescent therapies can be beneficial. In cancer and during active tissue repair, pro-senescent therapies contribute to minimize the damage by limiting proliferation and fibrosis, respectively. Conversely, antisenescent therapies may help to eliminate accumulated senescent cells and to recover tissue function.


2.2: Using the spectrophotometer to evaluate your pipetting skills

  • Contribuido por Clare M. O & rsquoConnor
  • Profesor asociado emérito (biología) en Boston College

Since you will be using micropipettes for all of your experiments, the quality of your results will depend on proper operation of the micropipette. Today&rsquos laboratory will lead you through some exercises that will show you how to use micropipettes correctly and point out some common pitfalls associated with their use. Your results will also provide information about whether the pipettes are functioning properly.

In these exercises, you will be using the spectrophotometer to determine if your pipetting is accurate and precise. Vas a
be using micropipettes to combine various volumes of water and solutions of a blue dye, bromophenol blue (BPB). You will measure the absorbance of the resulting solutions at 590 nm (A590), which is close to the absorbance maximum of bromophenol blue at neutral pH. Measuring errors will be reflected in the spectrophotometer readings.

The spectrophotometer readings provide an indirect measurement of pipette performance. The proper way to calibrate the micropipettes would be to weigh out volumes of water, which
has a specific gravity of 1.0 g/mL. Unfortunately, we do not have enough balances with sufficient accuracy for the class to perform the measurements. If you suspect inaccuracies in the micropipettes that you are using, refer them to the teaching staff, who will test them properly.


Calcium in Living Cells

David L. Armstrong , . Jody A. White , in Methods in Cell Biology , 2010

B Making Pipettes

Commercial programmable pipette pullers are now available, but some experimentation is required inevitably to find the settings that produce pipettes with the desired overall shape: long and narrow tapers for cell-attached patch recordings to minimize capacitance with the bath and short stubby tapers for perforated patch whole-cell recordings to speed antibiotic diffusion to the tip and minimize access resistance. Handling the capillaries with wet or greasy hands on the portion that is heated contributes to variability, but before pulling the pipettes, both ends of the capillaries should be fire polished gently to increase the longevity of the silver chloride coating on the wire in the pipette holder. Otherwise, the sharp glass edge at the back of the pipette scrapes off a little silver chloride every time you insert a new pipette. Also make sure the pipette holders and their internal rubber gaskets are designed to hold capillaries of the same outer diameter as your pipettes, or they will not fit snugly.

For most low-noise applications, the pipette must be coated with “Sylgard” (Corning 184), an elastomer that is cured with heat, which insulates the pipette walls from the bath solution. The reported curing time for Sylgard is 10 min at 150 °C however, a brief exposure (< 1 min) to a heating element followed by 10–20 min at room temperature should be adequate for curing before moving on to shaping of the tip. The Sylgard is most effective when it is applied thickly, but prevents giga-ohm seal formation if it gets on the tip. Our method of applying Sylgard is illustrated in Fig. 1 . We use gravity by mounting the pipette vertically inside a loop of tungsten wire across the prongs of an outlet plug. We control the heat transiently with a rheostat and observe the pipette through an inexpensive, low power, dissecting scope mounted horizontally on a boom arm. The Sylgard is precured to a viscous consistency at room temperature when it is first made and then stored in small 1 ml aliquots in the freezer. We apply it with a bent hypodermic needle by taking up a dollop onto the needle, touching the dollop to the pipette, and slowly winding it on to the glass by turning the pipette from below. Care must be taken to avoid touching Sylgard to the heating/curing wire, or the Sylgard vapors will quickly coat the tip. You will know when you get Sylgard too close to the tip because when you try to polish it, the Sylgard contracting around the thin glass walls at the tip literally wrinkles the glass.

Figura 1 . Application of Sylgard. Sylgard (Corning 184), a heat-cured polymer, is applied to patch pipettes after pulling but before polishing to reduce the capacitance between the glass walls and the bath. (A) Sylgard is stored in small 1-ml plastic tubes in the freezer until it is ready for use. Room temperature Sylgard is applied using a 25-gauge hypodermic needle that is bent for ease of application. The needle hub is affixed to a plastic tube for ease of handling. (B) The pipettes are placed into a hand-made holder that holds the pipette upright and allows it to be positioned easily so that the heating element made of tungsten wire surrounds the tip. (C) The pipette is positioned so that the area from the first narrowing of the glass to the tip is placed above the heating element. (D) Sylgard is applied in consecutive rings or “donuts” starting at the area where the glass first narrows. This lower ring helps protect against noise if your bath height changes between perfusions. (E) Between applications of consecutive rings, apply heat to cure each ring. Remember that heat goes up, so the hottest area near the heating wire is above it. (F) The final ring should also coat the taper of the pipette and can be placed as close as 50–100 nm from the tip. Be careful not to get Sylgard on the tip or on the heating element!

Everybody has their own favorite glass that they believe forms the tightest seals, but their relative intrinsic noise can be tested empirically using the Sylgard hemispheres. The lowest noise is produced by quartz glass capillaries ( Levis and Rae, 1993 ), but they require a special laser puller to create the pipettes. On real cells, the size and shape of the tip also influence success. It is extremely difficult to make pipettes that will routinely make > 10 GΩ seals when you cannot clearly see the tip while you polish it. An extra long working distance (ELWD) objective with at least 40× magnification is essential but they are expensive, so they must be mounted below the polishing element that is heated to prevent cracking the lens from repeated heating. Our polishing strategy is illustrated in Fig. 2 . We find that it is also critical to melt a small bead of the pipette glass onto the apex of the heating element, usually a small loop of platinum wire, presumably because it prevents the tip from being coated with metal. We find that pipettes with bullet-shaped tips and initial resistances between 3 and 5 MΩ make the best seals.

Figura 2 . Fire-polishing pipettes. Fire polishing the tip allows the user to narrow the tip opening to gain the desired shape and resistance. (A) The pulled pipettes are placed horizontally in a 2D holder mounted on the stage of an inverted microscope with a long working distance objective ≥ 40×. On the opposite side of the stage, a 3D manipulator is placed with a small platinum wire loop on which a bead of pipette glass has been melted. (B) The unpolished pipette tip is brought into the same plane of view as the glass bead, but at opposite sides of the periphery. (C) When current is passed through the wire, the bead gets hot and expands into the center of the field. The tip of the pipette is transiently manipulated closer to the bead until the opening at the tip starts to close. (D) When the tip narrows and attains rounded edges, the pipette is withdrawn and the heat is turned off. (E) A finished, polished pipette tip.

Filling the pipettes also requires some attention to detail. All pipette solutions should be filtered through 0.2 or 0.45-μm filter disks but do not use filter disks prepared with wetting agents. To avoid bubbles and washing the dirt inside the capillaries down into the tip, both of which reduce seal success, one must first fill the tip separately by immersing it in a small vial of pipette solution and allowing the first 20–50 μm to fill by capillary action. Then the rest can be backfilled. Usually bubbles are visible to the naked eye, and they can be removed by gently flicking the pipette while it is held between the thumb and the forefinger.


Ver el vídeo: Lavado de Células (Febrero 2023).