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Adaptación al frío en proteínas, a nivel secuencial y estructural

Adaptación al frío en proteínas, a nivel secuencial y estructural


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Al buscar la adaptación al frío en eucariotas unicelulares, no se ha encontrado mucho trabajo. La mayoría de las veces, el análisis de secuencia comparativo de secuencia general entre mesófilos marinos y psicrófilos tampoco arroja resultados claros. Si planeo estudiar a nivel estructural (modelado de homología), ¿obtendré respuestas? ¿Qué tipo de parámetros puedo buscar estudiar? ¿Qué proteínas se espera que proporcionen adaptación al frío además de las proteínas de unión al hielo o anticongelantes porque IBP y AFP no se pueden encontrar por comparación de secuencias? ¿Es posible dar algunas ideas al respecto?

Gracias


Hay grupos de investigación que trabajan en esta misma cuestión; comprensión de la adaptación al frío en las enzimas. Puede leer sobre esto en varios artículos como 'Cálculo de la adaptación enzimática al frío' o 'Bases estructurales moleculares para la adaptabilidad al frío de la β-glucosidasa psicrófila BglU en Micrococcus antarcticus', o 'Aminoácidos específicos responsables de la adaptación al frío de Micrococcus antarcticus β-glucosidasa BglU '

A nivel general, hay varias características estructurales que se encuentran típicamente. Suelen ser mucho más flexibles (es decir, menos puentes de sal y otros enlaces estabilizadores similares). La flexibilidad proviene de tener menos enlaces fuertes entre y dentro de la cadena polipeptídica, e incluso de contener regiones desordenadas. La flexibilidad también significa que generalmente son mucho menos estables y más difíciles de trabajar. Son interesantes desde el punto de vista industrial, ya que el desarrollo de enzimas que pueden funcionar a bajas temperaturas puede reducir el costo de las reacciones en ejecución. Este es esencialmente un paso hacia una industria más verde. También hay especulaciones sobre varias proporciones y abundancia de los tipos de aminoácidos y dónde se encuentran. Tendría que leer artículos sobre proteínas específicas para investigar esto.

Desde un punto de vista práctico, las enzimas adaptadas al frío generalmente se aíslan de los microorganismos árticos y se caracterizan en el laboratorio para determinar su tolerancia a la temperatura. La estructura de tales enzimas se resuelve (después de mucho trabajo) y forman la base para comprender la adaptación al frío.

Para responder a la pregunta de manera más específica, no, no es realista saber si algo está adaptado en frío directamente mirando la secuencia de la proteína (por sí sola), esto debe determinarse experimentalmente en el laboratorio. Sin embargo, si la proteína proviene de un organismo adaptado al frío (típicamente bacterias árticas), hay razones para asumir que está adaptado al frío antes de probarlo en el laboratorio. También puede aplicar alguna bioinformática (por ejemplo, búsqueda de explosiones) para determinar si está relacionada con proteínas adaptadas al frío. Además, si ese tipo específico de proteína que está viendo está bien estudiado, también podría intentar hacer modelos de homología y ver si es estructuralmente similar a los parientes adaptados al frío o si es más estructuralmente similar a su mesófilo o incluso termófilo. contrapartes. Sin embargo, esto es muy especulativo, y no pondría demasiado peso en las adaptaciones asumidas teóricamente; como mínimo, debe saber que la proteína de interés proviene de un organismo adaptado al frío, para incluso comenzar a ver (computacionalmente) por qué y cómo podría estar adaptado al frío.


Caracterización molecular de la adaptación al frío basada en secuencias de proteínas ortológicas de Vibrionaceae especies

Un conjunto de 298 familias de proteínas de psicrofílicos. Vibrio salmonicida fue compilado para identificar características genotípicas que lo distinguen de secuencias ortólogas de la rama mesófila Vibrio / Photobacterium de la gamma-Proteobacteria (Vibrionaceae familia). En nuestra exploración comparativa empleamos métodos bioinformáticos y estadísticos basados ​​en alineación. Se encontró información interesante en las matrices de sustitución y el patrón de asimetrías en el proceso de sustitución de aminoácidos. Junto con la diferencia de composición, identificaron los aminoácidos Ile, Asn, Ala y Gln como los que tienen la mayor participación psicofílica. Ile y Asn se mejoran mientras que Gln y Ala se suprimen. El residuo de Pro inflexible también se suprime en las regiones de bucle, como se esperaba en una estructura flexible. El conjunto de datos también se clasificó y analizó de acuerdo con la ubicación subcelular predicha, y realizamos un estudio adicional de 183 proteínas intracelulares y 65 de membrana. Nuestros resultados revelaron que las proteínas psicrófilas tienen contribuciones hidrófobas y de carga similares en el núcleo de la proteína como las proteínas mesófilas, mientras que la superficie expuesta al disolvente es significativamente más hidrófoba. Además, las proteínas psicrofílicas intracelulares (pero no las de membrana) tienen una carga significativamente más negativa en la superficie. Nuestro análisis apoya la hipótesis de preferencia por aminoácidos más flexibles en la superficie molecular. La vida en climas fríos parece obtenerse a través de muchas modificaciones estructurales menores en lugar de ciertas sustituciones de aminoácidos.

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Fondo

Los microorganismos que viven en condiciones extremas se denominan extremófilos, cuyo descubrimiento señala la adaptabilidad única de las formas de vida primitivas. Estos microorganismos se agrupan de acuerdo con sus condiciones óptimas de crecimiento en las que existen, tales como acidófilos (que exhiben un crecimiento óptimo en condiciones de pH ácido), alcalófilos (prosperan en condiciones de pH alcalino), barófilos (que sobreviven a grandes presiones), endolitos (que viven en el interior profundo). rocas), halófilos (que prosperan en altas concentraciones de sal), psicrófilos (temperatura óptima por debajo de 20 ° C) y los termófilos (temperatura óptima entre 45 y 80 ° C), hipertermófilos (temperatura óptima por encima de 80 ° C) [1]. La mayor cobertura de condiciones extremófilas conocidas de la biosfera terrestre está por debajo de los 10 ° C. Por ejemplo, tres cuartas partes de la tierra están cubiertas por océanos, que mantienen una temperatura promedio de uno a tres grados centígrados. Además, las vastas áreas terrestres del Ártico y la Antártida están congeladas permanentemente durante todo el año [1]. Otros pocos ejemplos de hábitats criogénicos incluyen desiertos fríos, suelos alpinos altos, hielo marino, cuevas frías, sedimentos marinos, suelos de permafrost, glaciares, nieve, etc.

La mayoría de los psicrófilos conocidos pertenecen a variedades de arqueas y bacterias, y algunas especies de levaduras, hongos y algas [2]. La capacidad de prosperar con los efectos que ponen en peligro la vida de las bajas temperaturas, cerca del punto de congelación del agua, requiere una amplia gama de adaptaciones de todos sus componentes celulares, incluidas sus membranas, sistemas de generación de energía, maquinaria de síntesis de proteínas, enzimas biodegradativas y los componentes. responsable de la absorción de nutrientes, etc., para mantener el metabolismo, mantener el crecimiento y la reproducción compatibles con la vida en estas condiciones de baja temperatura [3, 4]. Habiendo evolucionado con mecanismos especiales, los psicrófilos colonizaron con éxito estos nichos [2, 5]. Las proteínas psicrófilas presentan secuencias y estructuras comparables con las de sus homólogos meso e (hiper) termófilos, especialmente enzimas con su capacidad para funcionar eficazmente como catalizadores a bajas temperaturas [6]. La termolabilidad de estas proteínas a temperaturas moderadas justifica tremendas aplicaciones industriales en biotecnología, biorremediación, alimentos, textiles, biocatálisis de detergentes en condiciones de escasez de agua y detergentes, etc. [5-9].

Debido a los hechos anteriores, históricamente a partir de mediados de la década de 1970, se prestó mucha atención principalmente a la secuencia y los atributos estructurales que contribuyen a la adaptación de proteínas (principalmente enzimas) a condiciones de alta temperatura. Muchos investigadores han comparado parámetros basados ​​en la secuencia y la estructura entre proteínas termófilas y mesófilas [10]. Con el advenimiento de los esfuerzos pioneros a fines de la década de 1990 en la resolución de estructuras tridimensionales de enzimas criófilas como la alfa-amilasa [11] proteasa alcalina [12] triosa fosfato isomerasa [13] malato deshidrogenasa [14] de microorganismos antárticos, y debido a un puñado de estructuras disponibles en el banco de datos de proteínas (PDB), los grupos se han centrado en abordar la base estructural de las proteínas en la adaptación al frío [4, 15-20].

El aumento constante en la secuenciación de proteomas de extremófilos ha abierto muchas nuevas vías para comprender las adaptaciones a condiciones extremas [16, 21-25]. Ahora es posible una comparación completa de las preferencias de aminoácidos globales y los patrones de sustitución deducidos de los proteomas de diferentes organismos [26-28]. Usando secuencias homólogas, agrupando junto con varios métodos estadísticos, llevamos a cabo un análisis extenso de proteomas de microorganismos psicrófilos, mesófilos, termófilos e hipertermófilos para examinar una posible correlación de los patrones de sustitución de aminoácidos con la adaptación a sus respectivas condiciones óptimas de crecimiento. En este manuscrito discutimos los resultados del análisis comparativo de proteomas completamente secuenciados de seis miembros de cada uno de los organismos psicrófilos y mesófilos.


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Adaptación estructural de la lipasa RTX activa en frío de Pseudomonas sp. Cepa AMS8 revelada a través de enfoques de simulación de homología y dinámica molecular

La enzima psicrofílica es un tema interesante de estudio debido a su especial capacidad para adaptarse a temperaturas extremas, a diferencia de las enzimas típicas. Utilizando software asistido por computadora, la estructura y función predichas de la enzima lipasa AMS8 (LipAMS8) (aislada del psicrófilo Pseudomonas sp., obtenidas del suelo antártico). La enzima muestra similitudes de secuencia significativas con las lipasas de Pseudomonas sp. MIS38 y Serratia marcescens. Estas similitudes ayudan a predecir la estructura molecular 3D de la enzima. En este estudio, la simulación MD de 12 ns se realiza a diferentes temperaturas para análisis de estabilidad y flexibilidad estructural. Los resultados muestran que la enzima es más estable a 0 ° C y 5 ° C. En términos de estabilidad y flexibilidad, el dominio catalítico (N-terminal) mantuvo su estabilidad más que el dominio no catalítico (C-terminal), pero el dominio no catalítico mostró mayor flexibilidad que el dominio catalítico. El análisis de la estructura y función de LipAMS8 proporciona nuevos conocimientos sobre la adaptación estructural de esta proteína a bajas temperaturas. La información obtenida podría ser una herramienta útil para aplicaciones industriales de baja temperatura y con fines de ingeniería molecular, en un futuro próximo.

1. Introducción

Una lipasa (también conocida como triacilglicerol acilhidrolasa (E.C 3.1.1.3)) es una serina hidrolasa, que actúa en condiciones acuosas sobre el enlace éster carboxílico del triacilglicerol para producir ácidos grasos y glicerol [1]. Las lipasas son comunes α/βpliegues de hidrolasa que también están presentes en otras hidrolasas [2]. Una lipasa típica consiste en un sitio activo compuesto por la tríada catalítica de serina, glutamina / aspartato e histidina [3].

Las lipasas se distribuyen ampliamente entre los organismos vivos, incluidas bacterias, eukarya y arqueas, como han informado Jaeger et al. [4]. Recientemente, se han estudiado las lipasas producidas por bacterias psicrófilas debido a sus bajas temperaturas óptimas y sus elevadas actividades a muy bajas temperaturas. Según se informa, esto se debe a la mayor flexibilidad inherente en comparación con las enzimas mesófilas y termófilas. Estas enzimas se ven gravemente afectadas por un exceso de rigidez. Además, las propiedades peculiares de las enzimas psicrofílicas las hacen particularmente útiles como herramientas valiosas para propósitos biotecnológicos y para investigar las posibles relaciones entre estabilidad, flexibilidad y actividad específica [5, 6].

Sin embargo, la adaptación de la enzima a bajas temperaturas no se comprende completamente porque se han realizado pocos estudios sobre las enzimas psicrófilas. Algunas características descubiertas por los científicos incluyen un número reducido de puentes salinos, relaciones [Arg / (Arg + Lys)] ligeramente más bajas, números reducidos de residuos no polares y números más altos de residuos no polares expuestos [7]. En términos de estabilidad, las enzimas psicrofílicas son en su mayoría inestables, como ha sido probado por diversas demostraciones, incluida la espectroscopia de fluorescencia y otras técnicas. La enzima tiende a desplegarse a temperaturas más bajas y entalpías calorimétricas [8]. Los investigadores sugieren que una característica de estas enzimas es un mayor número de residuos apolares en sus superficies, lo que es responsable de la desestabilización de la estructura del agua que rodea a las enzimas. También hay menos residuos de arginina y prolina, lo que puede aumentar la flexibilidad de la columna vertebral. Tenga en cuenta que la investigación sobre la flexibilidad de las enzimas psicrófilas (utilizando análisis espectroscópico, extinción dinámica de fluorescencia y simulaciones de dinámica molecular) ha apoyado la idea de que una mayor flexibilidad de las enzimas psicrófilas contribuyó a la evolución de las enzimas psicrófilas [9].

La importancia de comprender las adaptaciones estructurales de las extremozimas se subraya por su utilidad en diversas aplicaciones industriales. Hasta ahora, solo unos pocos organismos extremófilos, en particular los psicrófilos, se han caracterizado y utilizado como fuentes de enzimas para procesos industriales. Anteriormente, una nueva cepa de bacterias psicrófilas (denominada cepa AMS8) de suelo antártico se examinó para detectar la actividad de la lipasa extracelular y se analizó en mayor profundidad utilizando un enfoque molecular. El análisis de rDNA 16S mostró que la cepa AMS8 era similar a Pseudomonas sp. Un gen de la lipasa llamado LabioAMS8 se aisló con éxito de la cepa AMS8 con un marco de lectura abierto de 1.431 pb que codificaba un polipéptido que constaba de 476 aminoácidos. Esta lipasa cruda exhibió una actividad máxima a 20 ° C. Estudios genéticos adicionales revelaron que LabioAMS8 carecía de un péptido señal N-terminal y contenía una secuencia de nonapéptidos rica en glicina y aspartato en el extremo C-terminal (datos experimentales).

En este estudio, la estructura y función de la lipasa aislada de Pseudomonas sp. cepa AMS8 se estudian utilizando la estructura predicha mediante el uso de software apropiado. La adaptación estructural de la enzima a bajas temperaturas también se estudia mediante simulación dinámica molecular (simulación MD). Debido a que es una enzima recientemente aislada, se necesitan más estudios para proporcionar una mayor comprensión y revelar el potencial de esta enzima psicrófila, que puede usarse para fines industriales, biotecnológicos y fundamentales.

2. Materiales y métodos

2.1. Software

El modelado y la simulación de la estructura prevista de la enzima se ejecutó en una sola PC (CPU Intel (R) Core RM i5, 650 @ 3.2 GHz Co, 4.0 GB de RAM) con el sistema operativo Windows 7 Ultimate. El programa de software Yet Another Scientific Artificial Reality Application (YASARA) [10] se instaló en la PC y se utilizó para el modelado molecular y la simulación de dinámica molecular (MD) de la estructura molecular predicha de LipAMS8.

2.2. Alineación de secuencia de LipAMS8

La secuencia de aminoácidos de la enzima LipAMS8 obtenida de NCBI con el número de acceso ADM87309 consta de 476 residuos de aminoácidos con un peso de 50 kDa que se utiliza para el análisis de la secuencia y el modelado. El programa BLAST [11] identificó la secuencia homóloga que tiene una alta identidad de secuencia con la enzima LipAMS8. La secuencia con la puntuación más alta de identidad de secuencia se eligió en función de ciertas características, incluido el tipo de origen y la disponibilidad de las estructuras 3D resueltas. Posteriormente, se llevó a cabo una alineación de secuencias múltiples utilizando el software abierto Biology Workbench [12] con las secuencias de proteínas de Serratia marcescens [13] y Pseudomonas sp. MIS38 [14] ya que ambas plantillas cumplían los criterios necesarios como se mencionó anteriormente.

2.3. Modelado y validación comparativos

Las plantillas utilizadas para el modelado fueron las estructuras cristalinas de las lipasas obtenidas de Serratia marcescens [13] y Pseudomonas sp. MIS38 [14]. Las coordenadas atómicas de las lipasas. Serratia marcescens (ID de PDB: 2qua) y Pseudomonas sp. MIS38 (ID de PDB: 2z8x) se obtuvieron del Protein Data Bank. El modelo 3D se generó utilizando YASARA [10]. La validación se realizó con VERIFY3D [15] (para evaluar la idoneidad de la secuencia de proteínas en su estructura 3D actual) y la gráfica de Ramachandran [16] (para evaluar los aspectos geométricos de la estructura).

2.4. Simulaciones de dinámica molecular (MD) a diversas temperaturas

Una simulación MD proporcionó más información para el modelado microscópico detallado a escala molecular. El método sigue el enfoque constructivo imitando el comportamiento de las moléculas con el uso de sistemas modelo. Las computadoras más potentes permiten estudiar una mayor complejidad con una expectativa realista de obtener información significativa y útil [17].

En este estudio, la simulación de MD se realizó en agua. Esto implicó la simulación del modelo predicho dentro de una caja de trayectoria llena con 6940 moléculas de solvente (incluyendo NaCl y agua) y 467 residuos de aminoácidos LipAMS8 a temperaturas de 0 ° C, 5 ° C, 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C y 100 ° C. La densidad del agua varía con la temperatura porque la densidad teórica del agua depende de la temperatura.

El parámetro de campo de fuerza AMBER03 [18] que se implementó en el software YASARA se utilizó para la simulación de MD. En cada simulación, el modelo inicial se minimizó para reducir la diferencia del área de contacto (CAD) entre el modelo de proteína y la molécula de disolvente. Durante la minimización, se emplearon algoritmos de descenso conjugado y descenso más pronunciado.

2.5. Análisis de simulación

La enzima se estudió utilizando 240 pasos guardados para cada simulación, lo que representa hasta 6 nanosegundos del período de producción. El análisis proporciona una mejor comprensión de las propiedades dinámicas de la enzima en el agua a diferentes temperaturas. Se calculó la desviación cuadrática media (RMSd) de la columna vertebral de la proteína y los residuos con el fin de comprobar la estabilidad de las trayectorias. Además, se calculó la fluctuación cuadrática media (RMSf) por residuo para estudiar la flexibilidad de las trayectorias. Se realizaron análisis adicionales calculando el radio de giro (Rgyration) y el área superficial accesible al solvente (SASA) de la enzima dentro de los 6 nanosegundos (ns) del tiempo de producción.

3. Resultados y discusión

3.1. Modelado comparativo de LipAMS8
3.1.1. Modelado de LipAMS8

La alineación de secuencias busca plantillas adecuadas para construir la estructura 3D de la lipasa AMS8 (LipAMS8), utilizando modelos comparativos. En este estudio, las estructuras cristalinas de Pseudomonas sp. Lipasa MIS38 y Serratia marcescens Se eligió LipA (que puntúa 80% y 69% para la identidad de secuencia) como plantillas para el modelado porque ambos tienen puntuaciones más altas de identidad de secuencia cuando se alinean con la secuencia de LipAMS8. Ambas plantillas también tienen estructuras resueltas que se pueden obtener del RSCB PDB Data Bank, que es importante para predecir la estructura 3D de la enzima.

Se utilizaron dos plantillas en el modelado de LipAMS8 de tal manera que se formó un modelo a partir de cada plantilla, así como un modelo híbrido que se formó en base a la mejor configuración de proteína utilizando las dos plantillas elegidas. Sin embargo, el puntaje Z de cada modelo es el parámetro más crucial, ya que el mejor valor de puntaje Z obtenido de cada modelo obtenido indicará la precisión y la calidad del modelo en sí. Posteriormente, la estructura híbrida que se espera sea el mejor modelo para LipAMS8 se rechaza debido a puntuaciones Z pobres en comparación con la obtenida utilizando solo Pseudomonas sp. MIS38 como plantilla.

El modelo se validó mediante el diagrama de Ramachandran (Figura 2). El modelo tenía el 89,5% de los residuos residiendo en la región permitida más favorecida. Aunque las mejores puntuaciones son del 90,0% o más, la puntuación obtenida se considera aceptable porque el modelo es un modelo de predicción y no una estructura cristalina (es decir, la estructura cristalina es una estructura completamente resuelta en comparación con la predicha). En un estudio anterior, la serina de la tríada catalítica, que reside en la región negativa / no permitida del diagrama de Ramachandran, se propuso para la conformación activa de la enzima [19]. Sin embargo, a partir de este estudio, el Ser 207 de la tríada catalítica de LipAMS8 reside en la región permitida del diagrama de Ramachandran. Esto sugiere que la enzima está en la conformación no activa, que está respaldada por la estructura de la tapa observable de la enzima (conformación cerrada). La predicción de la conformación activa de la enzima también se puede realizar observando la estructura del párpado.

En comparación con la estructura de la plantilla utilizada para modelar LipAMS8 como se muestra en la imagen superpuesta en las Figuras 1 (b) y 1 (c), el modelo predicho de LipAMS8 también muestra dos regiones principales: los dominios catalítico (verde) y no catalítico (azul), como se muestra en la Figura 1 (a). El dominio catalítico en el N-terminal es rico en α hélices, mientras que el dominio no catalítico en el C-terminal está dominado por β-hebras. El dominio catalítico también exhibe la presencia de un α/β-hidrolasa pliegue y tríada catalítica, que incluye los residuos Ser 207, His 255 y Asp 313. El Ser 207 aparece en el pentapéptido de los motivos G-X-S-X-G (donde X representa His 206 y Leu 208) y está ubicado en el giro brusco entre el β-strand y α-hélice que se asemeja al codo nucleofílico (normalmente presente en la familia estructural de α/β-hidrolasas) [20]. Esto sugiere que la serina catalítica es ayudada por un agujero de oxianión que estabiliza la carga negativa generada durante un ataque nucleofílico por Ser Oγ [19].


(a)
(B)
(C)
(a)
(B)
(C) (a) LipAMS8 predijo la estructura 3D. La estructura está compuesta de dominios catalíticos (verde) y no catalíticos (azul). La tapa está coloreada en (rojo). (b) y (c) son la superposición de la estructura LipAMS8 (violeta) con 2QUA (plateado) y 2Z8X (amarillo).


Gráfico de Ramachandran de la estructura 3D de LipAMS8. La estructura puntúa 89,5%, lo que significa que el 89,5% de los residuos residen en la región más favorecida.

Generalmente, una lipasa puede existir en 2 estados conformacionales: activo e inactivo. La conformación de la tapa (abierta o cerrada) determina si la enzima está en la conformación activa o inactiva. La conformación activa de la lipasa es necesaria para la actividad catalítica [19]. En este estudio, hay una estructura en forma de tapa que cubre el sitio catalítico en el dominio catalítico, lo que sugiere la conformación inactiva de la enzima. Estudios anteriores sugirieron que la forma activa de la enzima tiene la tapa abierta, lo que permite la entrada del sustrato en el sitio de unión para la catálisis [21]. Por lo tanto, la conformación cerrada de la tapa en este estudio significó que el Ser 207 nucleófilo no podía atacar el sustrato.Para abrir la tapa, se requiere una interfaz agua-aceite para que la tapa pueda ser modulada para descubrir el sitio catalítico, proporcionando acceso a la bolsa catalítica para los sustratos [19]. Esto mejora la actividad de LipAMS8. La tapa número 1 de LipAMS8 tiene un alto número de residuos hidrófobos, incluidos Ala 51, Leu 53, Val 54, Val 57 y Val 58. Esto puede permitir una interacción eficiente entre los residuos hidrofóbicos del párpado con la interfaz lipídica y contribuir a una apertura más fácil del párpado.

A partir de este estudio, LipAMS8 consta de motivos RTX en el dominio no catalítico, lo que sugiere que LipAMS8 es una de las lipasas RTX que pertenecen a la subfamilia I.3. Esto se demuestra aún más por la ausencia de residuos de cisteína [22]. Tenga en cuenta que el motivo RTX está presente en una variedad de microorganismos Gram-negativos [6]. Este motivo (compuesto por secuencias nonapeptídicas ricas en glicina) generalmente se encuentra en la porción carboxi-terminal de una enzima [22]. En la estructura 3D de LipAMS8, la secuencia de motivos RTX constituyó el paralelo β-rollo, que forman los primeros 6 residuos de cada motivo para unir iones de calcio (Ca 2+). Los 3 residuos restantes se acumulan cortos β-hebras, que resultan en la hélice derecha de la β-strand en el dominio no catalítico. La función exacta de los motivos RTX permanece oscura. Sin embargo, podrían ser dominios de unión a receptores, potenciadores de la secreción y acompañantes internos [6].

En el modelo predicho de LipAMS8, hay iones metálicos, incluidos 6 átomos de Ca 2+ y 1 átomo de Zn 2+. Tenga en cuenta que los iones metálicos son necesarios para una fracción sustancial de enzimas para realizar la actividad catalítica. Los iones metálicos también pueden contribuir a la activación del sustrato y la estabilización electrostática de la estructura de la enzima. En este estudio, Asp 128, Asp 130 y el ligando interactúan en los sitios de unión de Zn 2+. El Zn 2+ presente en este LipAMS8 no se encuentra en el sitio catalítico, por lo que es posible que no contribuya a la actividad catalítica de la enzima. Junto con su contribución a la actividad catalítica, los iones pueden asegurar la estabilidad estructural local y general, similar a la función de los disulfuros [23]. Para concluir, hay iones metálicos en la estructura prevista de LipAMS8, que pueden contribuir a la estabilidad estructural general. Sin embargo, se observa que la enzima tiene pocas o ninguna arginina en comparación con las lisinas, un bajo contenido de prolina y una falta de puente salino, lo que, según se informa, contribuye a la adaptación de las enzimas psicrófilas a bajas temperaturas. Además, se prevé que la enzima tenga una mayor flexibilidad en comparación con las enzimas mesófilas o termófilas, lo que permite que las enzimas psicrófilas estén activas a un bajo coste energético [7].

3.1.2. Simulaciones de dinámica molecular (MD)

La simulación de MD se realizó para revelar cambios en la estructura, flexibilidad y dinámica de LipAMS8 cuando se simula a temperaturas elevadas. El muestreo conformacional se limitó a 12 ns. Se ha sugerido que LipAMS8 es una enzima activa en frío. Por lo tanto, la estructura debe desnaturalizarse o desplegarse a medida que la temperatura aumenta de 25 ° C a 100 ° C debido a la ruptura de las fuerzas intermoleculares, debido al aumento de la energía cinética a temperaturas elevadas. Sin embargo, en este estudio, no hubo mucho despliegue de la estructura secundaria incluso cuando la enzima se simula a una temperatura más alta. Esto podría deberse a la limitación del muestreo conformacional, que es un máximo de 12 ns. Es posible que sea necesario prolongar el tiempo de simulación para ver los cambios estructurales.

3.1.3. Análisis de datos de simulación de dinámica molecular

Los valores de la desviación cuadrática media (RMSd) de los átomos de la columna vertebral en los modelos iniciales evalúan la convergencia del sistema de proteínas. En este estudio, los valores de RMSd de la estructura del modelo predicho minimizado durante la simulación de MD a 0 ° C, 5 ° C, 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C y 100 ° C se muestran en la Figura 3. A 5 ° C, la proteína permanece como nativa y se equilibra con un promedio de 1,83 Å de la estructura minimizada. Esto indica la estabilidad de la enzima a 5 ° C. En comparación con 5 ° C, el valor RMSd a 0 ° C demostró que la estructura 3D de la proteína se vuelve inestable cuando alcanza 1000 ps. El valor RMSd comienza a fluctuar a valores superiores a 2 Å e incluso alcanza el valor de 3,45 Å a 2525 ps. El valor cayó a 1,807 Å a 3675 ps y se elevó a más de 2 Å a 4000 ps. La fluctuación inestable del RMSd es consistente con la diferencia en los elementos de la estructura secundaria observada durante la simulación. Sin embargo, la estabilidad estructural se observa después de 5500 ps, ​​ya que el patrón de fluctuación de RMSd se mantiene y no diverge más de 2 Å hacia el final de la simulación a 12 ns.


La tendencia de fluctuación para la estabilidad de la enzima a 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C y 100 ° C aumentó en valor a lo largo de la simulación con valores de RMSd que permanecieron por encima de 4.0 Å a 3000 ps durante el resto del período de simulación. El estado inestable de esta enzima está respaldado por datos experimentales, que encontraron que la actividad enzimática de LipAMS8 se redujo cuando la temperatura se incrementó por encima de los 25 ° C. Del estudio, deducimos que a 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C y 100 ° C, la estructura 3D global de la proteína pierde su estructura nativa para adaptar la molécula a los cambios de temperatura y densidad del agua ( el solvente). Por tanto, este resultado indica que los cambios en las coordenadas geométricas y el despliegue de la proteína son el resultado de la reducción de la estabilidad del sistema.

Deducimos que las temperaturas más estables para LipAMS8 simuladas en agua son 0 ° C y 5 ° C, ya que la temperatura baja promueve un menor movimiento conformacional manteniendo la integridad y estabilidad estructural. Por otro lado, para temperaturas entre 25 ° C y 100 ° C, la estructura de la enzima es inestable y se desvía mucho de su estructura inicial. La mayor desviación de la estructura de la enzima cuando se simula en agua a 25 ° C a 100 ° C puede estar relacionada con la ruptura de las fuerzas moleculares, lo que conduce a una mayor actividad cinética de las moléculas. Sin embargo, los cambios estructurales de la enzima simulada en agua no son tan críticos en comparación con los cambios estructurales que ocurren cuando la enzima se simula en un disolvente orgánico [24].

Curiosamente, se observó que las puntuaciones promedio de RMSd para 0 ° C y 5 ° C eran estables durante toda la simulación. Sin embargo, la estabilidad solo se adaptó al dominio catalítico de la enzima que se cree que es promovida por la presencia de iones metálicos tales como Zn 2+ y Ca 2+. En otras manos, el estado inestable de esta enzima que se debe a la alta flexibilidad del dominio no catalítico a baja temperatura, como 0 ° C y 5 ° C, sin embargo, es de alguna manera predecible ya que la enzima tiene que ajustarse hacia la baja temperatura por lo que la cinética la energía se reduce lentamente. Si la enzima no aumenta su flexibilidad en este punto, la estructura puede volverse demasiado rígida y no podría compensar la disminución de la temperatura de catálisis.

La Figura 4 muestra las fluctuaciones cuadráticas medias (RMSf) por residuo para LipAMS8 simulado en agua a temperaturas de 0 ° C a 100 ° C. Las puntuaciones de RMSf promedio por residuo para todas las temperaturas varían de 1,12 Å a 4,1 Å. La puntuación de fluctuación más alta está a 100 ° C. Este resultado es equivalente al efecto de una temperatura más alta sobre la flexibilidad de la enzima. Sin embargo, al comparar la flexibilidad de la enzima a 0 ° C y 5 ° C, el valor de RMSf disminuyó de 1,43 a 1,12 Å. La mayor flexibilidad de la enzima a la temperatura más baja puede sugerir una adaptación de la enzima para contrarrestar el "efecto de congelación" a medida que bajan las temperaturas.


En el sitio catalítico, las puntuaciones de RMSf no indican una mayor flexibilidad de los residuos simulados en agua a diferentes temperaturas. La flexibilidad se mantiene en un valor por debajo de la puntuación media de RMSf a diferentes temperaturas. Esto sugiere que la estabilidad de la tríada catalítica está respaldada por la cifra de RMSd por residuo.

En general, el patrón de fluctuación por residuo fue similar al patrón mostrado en la figura de RMSd por residuo. Ambas figuras muestran que se produce una mayor fluctuación en el dominio no catalítico. La fluctuación más constante entre las temperaturas se produjo en los residuos 393–476, que residen en el dominio no catalítico en el que están presentes las repeticiones RTX. La flexibilidad del dominio puede ocurrir debido a la presencia de residuos altos en glicina, que se sabe que introducen flexibilidad en la estructura de la proteína porque carecen de cadenas laterales [25]. La mayor flexibilidad de LipAMS8 (que se originó a partir de la baja estabilidad del dominio no catalítico) puede implicar que el dominio no catalítico es la parte crucial de la estructura molecular de LipAMS8. Este dominio puede contribuir a una alta actividad enzimática a baja temperatura.

Un examen de la flexibilidad estructural de la estructura de la tapa revela que la tapa número 1, compuesta por los residuos 51–58, no tiene una puntuación RMSf superior a la media a ninguna temperatura. Sin embargo, la tapa número 2, que consta de los residuos 148-167, tiene fluctuaciones en los residuos 148-153 en la mayoría de las temperaturas. Esto demuestra la flexibilidad del residuo de la tapa cuando se simula en agua a varias temperaturas. Este resultado llevó a la hipótesis de que el párpado número 2 de LipAMS8 podría experimentar una transición conformacional en las condiciones adecuadas, como la presencia de sustratos. Los residuos 148-153 en la tapa número 2, que es más flexible, pueden actuar como un soporte que abre la estructura de la tapa para exponer el sitio de unión en la activación interfacial. A diferencia de la tapa número 1, la tapa número 2 es más flexible. Por tanto, la tapa número 2 puede ser la primera tapa en abrirse cuando hay sustratos presentes. La interfaz agua-aceite alrededor de la abertura de la primera tapa es menos flexible para unir el sustrato al sitio catalítico. Tenga en cuenta que la apertura de la tapa es un paso crucial en una lipasa con estructura parecida a una tapa. La flexibilidad de los residuos que residen en la estructura de la tapa es importante para determinar la velocidad de movimiento de la tapa, que juega un papel importante en la adaptación de la función enzimática a bajas temperaturas [7].

La flexibilidad estructural observada en la estructura de LipAMS8, simulada en agua a varias temperaturas, puede disminuir si se simula en un solvente orgánico. Un estudio anterior sugiere una mayor rigidez de la enzima en solución orgánica [26]. Sin embargo, no hay mucha información disponible a nivel molecular para aceptar o rechazar la propuesta. Para comprobar la flexibilidad estructural de la enzima en entornos tanto acuosos como no acuosos, se necesitan más simulaciones para comparar la base estructural de la enzima.

El análisis de la fluctuación cuadrática media (RMSf) por residuo y la desviación cuadrática media por residuo (RMSd) de los átomos de la columna vertebral se utilizan para analizar las fluctuaciones atómicas del modelo predicho de LipAMS8. La Figura 5 muestra la RMSd por residuo a 0 ° C, 5 ° C, 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C y 100 ° C. El RMSd promedio para todos los residuos, incluido el residuo terminal, mide cualitativamente la flexibilidad de la proteína para la relación entre la dinámica y la flexibilidad conformacional de la proteína.


A partir de los datos, los valores medios de RMSd de los residuos son casi los mismos entre 0 ° C y 5 ° C. Sin embargo, a 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C y 100 ° C, los valores medios de RMSd aumentan a 6,29 Å. El patrón de los valores promedio de RMSd de residuos es similar a los valores promedio de la fluctuación cuadrática media (RMSf) a todas las temperaturas.

La desviación de la geometría estructural de la enzima se produjo principalmente en el dominio no catalítico. Los valores de RMSd por residuo en los residuos 412–425 y 436–470 son más altos que la puntuación media de RMSd a cada temperatura. A partir de esto, la desestabilización de la enzima no involucra a toda la proteína como propone un estudio [19]. En cambio, la desestabilización de la enzima puede involucrar una porción de la enzima (como se observa en este estudio). Además, los datos también rechazaron el postulado de que la desestabilización de la enzima ocurre principalmente en el dominio catalítico [8]. La desestabilización de la enzima se produce principalmente en el dominio no catalítico, esto puede deberse a la presencia de residuos que provocan una pérdida de estabilidad de la estructura 3D de la enzima. Curiosamente,

-Se propone enrollar para mantener la estabilidad de Pseudomonas sp. MIS38. La deleción, alteración y mutación en este rollo que está formado por la presencia de motivos RTX y Ca 2+ causaría cambios de conformación estructural y desnaturalización de la enzima. Sin embargo, propusimos que en realidad un número más corto / menor de repeticiones RTX, menos número de iones metálicos en esta contraparte de Pseudomonas sp. MIS38, puede ser la razón por la que LipAMS8 es capaz de adaptarse en ambientes extremadamente fríos.

El estudio del dominio catalítico muestra que Asp 128 y Asp 130, que interactúan con el Zn 2+, tienen valores de RMSd por residuo más altos que las puntuaciones medias de RMSd a cada temperatura. Así, Asp 128 y Asp 130 se encuentran entre esos residuos que fluctúan y movilizan la adaptación a la temperatura. Sin embargo, las relaciones de fluctuación de Asp 128 y Asp 130 con respecto a las puntuaciones medias del RMSd en cada temperatura disminuyen a medida que aumenta la temperatura. Esto implica una mayor interacción entre los metales y Asp 128 y Asp 130 a temperaturas más altas. Este resultado concuerda fuertemente con un estudio anterior, que sugirió que el Zn 2+ promueve la estabilización estructural en una conformación activa de la enzima a temperaturas elevadas [27]. Este resultado sugiere una mayor probabilidad de adaptación de la enzima a temperaturas más altas, especialmente en el dominio catalítico porque Zn 2+ estabiliza la estructura de la enzima.

Como se muestra en la Figura 4, se mantienen las puntuaciones para aquellos residuos que interactúan con Ca 2+ en el dominio catalítico. Esto indicó que el metal contribuye a estabilizar el dominio catalítico para que la estructura no se desvíe de su estructura inicial. Este resultado concuerda con la función del Ca 2+ en la estabilidad estructural de la lipasa propuesta en un estudio previo de la B. glumas lipasa [28]. Los datos experimentales, sobre el efecto del calcio sobre la actividad de LipAMS8, también apoyaron la idea de que el Ca 2+ puede promover la estabilidad estructural de la enzima. Así, se mantienen las propiedades enzimáticas y se mejora la actividad catalítica para proporcionar un mayor rendimiento. En contraste con los residuos que interactúan con Ca 2+ en el dominio catalítico, Ca 2+ en el dominio no catalítico tiene valores más altos de RMSd y RMSf, lo que indica desestabilización y flexibilidad del residuo. La contribución de Ca 2+ a la estabilidad del residuo no está de acuerdo con la sugerencia de que promueve la estabilidad. Las puntuaciones de RMSd y RMSf del residuo que interactúa con Ca 2+ en el dominio no catalítico pueden deberse al proceso de adaptación del Ca 2+ de modo que el dominio catalítico permanece estable. Esto evita que el dominio catalítico, que es responsable de la actividad catalítica, se despliegue y no funcione debido a cambios en la estabilidad y configuración estructural.

El radio de giro (Rgyration) de la enzima a diferentes temperaturas dentro de las trayectorias a 12 ns se muestra en la Figura 6. El parámetro proporciona información sobre la tendencia de las estructuras de proteínas a expandirse durante una simulación dinámica. A 5 ° C, la puntuación de Rgyration se mantiene durante toda la simulación en comparación con la puntuación de Rgyration de la enzima cuando se simula a temperaturas más altas y más bajas. La puntuación más alta del radio de giro de LipAMS8 es a 25 ° C, la puntuación aumentó a 27,128 Å dentro de los 12 ns de simulación. A esto le siguen las puntuaciones de otras temperaturas, excepto la puntuación a 5 ° C. Esto indica la adaptación de la estructura de la enzima para evitar la pérdida de la compacidad nativa de la estructura a baja temperatura. En general, el resultado es proporcional a la desviación de la estructura de la enzima, como se indica en la Figura 3. Mientras que SASA indica la transferencia de energía libre requerida para mover una proteína de disolvente acuoso a no polar [29], como se muestra en la Figura 7, la Las puntuaciones SASA a 5 ° C y 0 ° C muestran el patrón de fluctuación, que se mantiene durante los 12 ns de simulación. En comparación con 25 ° C, la cifra aumenta, lo que indica el despliegue de la enzima dentro del período de simulación. El despliegue de la enzima a esta temperatura es proporcional a los cambios estructurales de la estructura secundaria de la enzima. El aumento en la puntuación SASA también se observa a temperaturas de 37 ° C, 50 ° C y 100 ° C.


Materiales y métodos

Sobreexpresión y purificación de proteínas

los EaEl vector de expresión BglA-pET28a se transformó en Escherichia coli Células BL21 (DE3) (Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU.). Las células se cultivaron en 1 l de medio LB a 37ºC y se indujo la expresión de proteínas con isopropil-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,4 mM a 37ºC durante 3 h. Las células se recolectaron por centrifugación a 7.000 xg (20 min, 4 ° C), se resuspendió en tampón A (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM, pH 7,5), se suplementó con PMSF 1 mM y se lisó mediante tratamiento con lisozima seguido de sonicación. El extracto celular se clarificó por centrifugación (20.000 xg, 30 min, 4 ° C) y el sobrenadante se aplicó en una columna HP quelante Hi-Trap de 5 ml (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, EE. UU.) Acoplada a un sistema ÄKTA (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, EE. UU.) Y preequilibrada con tampón A. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente no lineal de tampón B (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM, pH 7,5). Las fracciones con actividad de β-glucosidasa se combinaron, se concentraron a 5 ml utilizando unidades centrífugas Amicon Ultra y se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna Superdex 75 16/60 (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, EE. UU.) Previamente equilibrada con fosfato de sodio 20 mM. , NaCl 150 mM, pH 7,5, a un caudal de 0,5 ml / min. Las formas tetraméricas y monoméricas se separaron con éxito en dos picos diferentes mediante esta etapa cromatográfica y mostraron una alta pureza según el análisis SDS-PAGE. La concentración de proteína se estimó mediante A280 nm utilizando el coeficiente de extinción de 110.030 M −1 cm −1.

Ensayos de enzimas bioquímicas

La actividad enzimática se midió utilizando el sustrato colorimétrico 4-nitrofenil β-D-glucopiranósido (pagNPG, Sigma-Aldrich Co, St. Louis, EE. UU.). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en reacciones de 100 μL en condiciones de saturación del sustrato (0,5 mM pagNPG) en tampón de fosfato de sodio 40 mM pH 7,0. La concentración final de enzima fue de 20 nM. Las reacciones se incubaron durante 10 min en condiciones óptimas para la actividad catalítica (30 ° C y pH 7,0) y se detuvieron con 100 μL de carbonato de sodio 1 M (Na2CO3).La actividad enzimática se midió espectrofotométricamente a 405 nm monitoreando la liberación de pag-initrofenol utilizando un lector de microplacas Infinite® 200 PRO (TECAN Group Ltd., Männedorf, Suiza). Las medidas se expresaron como actividad relativa (%) considerando la actividad catalítica máxima observada para la unidad biológica de la enzima (tetrámero).

Dicroísmo circular

Se empleó espectroscopía de dicroísmo circular para evaluar la conformación global de EaBglA en conformaciones tetraméricas y monoméricas. Las mediciones de CD se adquirieron en un espectrómetro de CD JASCO J-815 controlado por un sistema de control de temperatura Peltier CDF-426S / 15 (Jasco Analytical Instruments, Oklahoma, EUA). Se usó una cubeta de cuarzo con una longitud de camino de 1 cm para todos los experimentos de CD y cada espectro fue un promedio de al menos tres exploraciones. La concentración de proteína fue 5,8 µM (para tetrámero y monómero) en fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Todos los espectros se obtuvieron a 20 ° C en el rango de 200-260 nm con un ancho de banda de 2 nm y un tiempo de respuesta de 4 s / nm. Los datos de CD se restaron en tampón y se normalizaron a la elipticidad residual molar permitiendo la comparación entre las formas.

Dispersión dinámica de la luz

Radio hidrodinámico (Rh) de la forma monomérica de EaBglA se determinó mediante dispersión dinámica de luz (DLS). Los datos se registraron a 20 ° C en un Malvern Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) con un láser de 633 nm, en una celda de cuarzo con un ángulo de dispersión de 90 °. Las muestras purificadas de la cromatografía de exclusión por tamaño se analizaron en diferentes concentraciones (0,3 a 1,2 mg / mL) y los radios hidrodinámicos se obtuvieron después del promedio de 20 corridas de la extrapolación del coeficiente de difusión traslacional (Dt) según el Stokes– Ecuación de Einstein.

Ultracentrifugación analítica (AUC)

Los experimentos de velocidad de sedimentación (SV) se realizaron utilizando una ultracentrífuga analítica Beckman Optima XL-A (Beckman Coulter Inc, Brea, EUA). Los datos se recogieron a 35.000 rpm y 20 ° C utilizando el sistema óptico de absorbancia para detecciones de 220 y 280 nm. EaSe preparó BglA en diferentes concentraciones (0,2, 0,4 y 1 mg / ml) en fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Las exploraciones de SV se analizaron utilizando el método c (s) en el programa SEDFIT (v14.4d) 36 para determinar la masa molecular de la proteína. Se aplicó una distribución c (s) convencional con un nivel de confianza de regularización fijo de 0,95 y la relación de fricción (ƒ / ƒ0) utilizado como parámetro de regularización. Los coeficientes de sedimentación estándar (s20, w) fueron determinados por el máximo de los picos de las curvas c (S) continuas después de correcciones para eliminar las interferencias causadas por la viscosidad, densidad y temperatura del buffer (ρ = 1.0039 g / mL y η = 0.0102643 Poise se obtuvieron mediante el programa SEDNTERP ). El s °20, w El valor a dilución infinita se obtuvo mediante la regresión lineal de s20, w en función de la concentración de proteínas 37.

Dispersión de rayos X de ángulo pequeño

Las mediciones de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) se realizaron utilizando un haz de rayos X monocromático (λ = 1.488 Å) de la línea de luz D01A-SAXS2 en el Laboratorio Brasileño de Luz Sincrotrón (LNLS, Campinas, Brasil). EaSe prepararon muestras de BglA en fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a las concentraciones de 1 y 2 mg / ml. Las muestras se centrifugaron durante 30 min a 23.000 xg y 4 ° C para eliminar los posibles agregados antes de todos los experimentos de SAXS. La distancia de la muestra al detector se estableció en 1000 mm para obtener el rango del vector de dispersión (q) de 0.013 a 0.33 Å −1, donde q significa la magnitud del vector q definido por q = 4π sinθ / λ ( 2θ es el ángulo de dispersión). Las muestras se analizaron a 20 ° C en células de mica de 1 mm de longitud de trayectoria y los perfiles de dispersión se registraron en diez fotogramas sucesivos (cada uno de 10 s de duración) para controlar el daño por radiación y la estabilidad del haz. Las curvas SAXS obtenidas se restaron en búfer y se integraron utilizando el programa FIT2D 38. El radio de giro (Rgramo) se determinó a partir de la ecuación de Guinier 39 y mediante el método indirecto de la transformada de Fourier utilizando el paquete GNOM 40. El programa GNOM también se utilizó para generar la distribución de la distancia de partículas p (r) y el diámetro máximo, Dmax. Se aplicó el programa DAMMIN 41 para obtener ab initio modelos para EaBglA (modelo de átomo ficticio), mediante una rutina de optimización de recocido simulado que mejor se ajusta a los datos de dispersión experimentales. La forma de la proteína se reconstruyó promediando 20 diferentes ab initio modelos que utilizan el paquete DAMAVER 42. El modelo de baja resolución obtenido y la estructura cristalina se superpusieron utilizando el programa SUPCOMB 43. La curva de dispersión teórica se generó a partir de coordenadas atómicas cristalográficas usando el programa CRYSOL 44 y se comparó con los datos de dispersión experimentales.

Calorimetría diferencial de barrido

Estabilidad térmica de EaBglA se investigó mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). EaBglA, a una concentración de 2 mg / ml en fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM y pH 7,4, se escaneó a una velocidad de 1 ° C / min en un dispositivo VP-DSC (Microcal, GE Healthcare, Northampton, EE. UU.) en el rango de 15 a 90 ° C en incrementos de 0,5 ° C. El perfil de DSC se resta del tampón, se normaliza la concentración y se integran los endotermos resultantes después de la asignación de las líneas de base anteriores y posteriores a la transición. Como el desdoblamiento inducido térmicamente de EaBglA fue irreversible en las condiciones probadas, el análisis se centró en los valores de las temperaturas de transición (Tmetro).

Cristalización de proteínas

Los experimentos de cristalización se realizaron mediante el método de difusión de vapor en placas de 96 pocillos utilizando un sistema automatizado Honeybee 963 (Digilab, Marlborough, MA). EaBglA cristalizó a 18 ° C en gotas que contenían 0,5 μl de solución de proteína a 15 mg / ml y 0,5 μl de la condición de cristalización. C2221 Los cristales se cultivaron en una condición que contenía CAPS 0,1 M (pH 10,5), sulfato de litio 0,2 M y sulfato amónico 2 M usando en el lugar proteólisis (1: 1000 (p / p) proporción de tripsina:EaBglA). PAG21 Los cristales se obtuvieron en un medio que contenía TRIS 0,1 M (pH 8,5), 2% (v / v) PEG400 y sulfato de litio 1,45 M.

Recopilación de datos y determinación de estructura

Datos de difracción de rayos X de C2221 y PAG21 cristales (crioprotegidos con 20% (v / v) glicerol) en la línea de luz MX2 de LNLS (Campinas, Brasil) y en la línea de luz I03 de Diamond Light Source (Oxfordshire, Reino Unido), equipados con detectores PILATUS 2M y PILATUS3 6M, respectivamente. Los datos se indexaron, integraron y escalaron utilizando el paquete XDS 45. La estructura cristalina se resolvió mediante métodos de reemplazo molecular utilizando el programa PHASER con las coordenadas atómicas de la β-glucosidasa de H. orenii (ID de PDB: 4PTV) como modelo de búsqueda. Las estructuras se refinaron alternando ciclos de TLS, refinamiento gemelo (PAG21 crystal) y refinamiento restringido (incluidas las restricciones NCS locales) usando REFMAC5 46 y construcción de modelos manuales usando COOT 47. Los dos últimos residuos estaban desordenados en todas las cadenas de ambos cristales y no se modelaron. Las estructuras finales se validaron utilizando MOLPROBITY 48. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en la Tabla 3. Los factores de estructura y las coordenadas atómicas de ambas formas cristalinas, P21 y C2221, se depositaron en el AP con los códigos de acceso 5DT5 y 5DT7, respectivamente.

Análisis estructurales

Las superposiciones estructurales se realizaron utilizando el servicio de comparación de estructuras de proteínas PDBeFold (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm) 49. Las interacciones intramoleculares y las interfaces de proteínas se analizaron utilizando los servidores PIC (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/) 50 y EPPIC (http://www.eppic-web.org/ewui/) 51, respectivamente. El volumen de las cavidades proteicas se calculó utilizando KVFinder 52 y CASTp 53. Las figuras se prepararon utilizando PYMOL 54.

Simulaciones de dinámica molecular

Se crearon sistemas de simulación que utilizan solvatación explícita para las unidades biológicas de EaBglA y HoBglA (ID de PDB: 4PTX). Se llevó a cabo una simulación de dinámica molecular de 100 nanosegundos utilizando el campo de fuerza YAMBER3 con un intervalo de tiempo de 5 femtosegundos guardando una instantánea cada 250 picosegundos utilizando YASARA 55. Cada uno de los sistemas se simuló a 10 y 30 ° C utilizando el termostato Berendsen para el control de la temperatura. La presión se controló utilizando la densidad del disolvente como sonda y se mantuvo constante durante la simulación redimensionando isotrópicamente la celda de simulación para que coincidiera con los valores adecuados de densidad del disolvente, cuando fuera necesario.

Análisis de dinámica molecular

La fluctuación cuadrática media, así como los enlaces de hidrógeno, los puentes de sal y el área accesible al solvente se calcularon utilizando scripts personalizados y las coordenadas de los últimos 80 nanosegundos de las simulaciones de 100 nanosegundos. Los enlaces de hidrógeno se identificaron considerando la energía de enlace de 6,25 kJ / mol como umbral, dado que la energía de enlace es función de la distancia del aceptor de hidrógeno. Se consideraron pares electrostáticos cuando sus átomos (no hidrógeno) estaban más cerca de 4 Å entre sí. La superficie accesible al solvente se calculó usando rutinas implementadas en el software YASARA.

Análisis filogenético

Las secuencias de proteínas de β-glucosidasas de bacterias psicrotróficas se utilizaron como cebos en búsquedas BLASTp contra la base de datos no redundante NCBI. Se seleccionaron un máximo de cuatro aciertos de proteínas con una identidad de secuencia que oscilaba entre el 60 y el 95% para cada consulta. A efectos comparativos, las proteínas homólogas de HoTambién se recuperaron BglA utilizando los mismos criterios. Todas las secuencias de proteínas se alinearon utilizando el software MUSCLE 56. Las posiciones que contenían lagunas o datos faltantes se excluyeron parcialmente de la alineación de secuencia múltiple utilizando un límite de cobertura del sitio del 80%. Con base en el subconjunto de datos resultante, se infirió un árbol evolutivo utilizando el método de máxima verosimilitud (ML) y el mejor modelo de sustitución de aminoácidos indicado por el software MEGA (versión 6.0) 57, que era la matriz LG asumiendo que la tasa varía entre sitios según una distribución Gamma (+ G) y teniendo en cuenta la presencia de sitios invariantes (+ I). La confianza de la topología del árbol se evaluó mediante el análisis de Bootstrap basado en 1000 réplicas de bootstrap. La taxonomía de las especies de bacterias se recuperó de la base de conocimientos de Uniprot 58. Las bacterias se clasificaron según su temperatura de crecimiento óptima, cuando estaba disponible, o en la temperatura mínima a la que pueden crecer como psicrófilas / psicrotróficas (Toptar & lt 20 ° C Tmin & lt 5 ° C), mesófilo (20 ° C & lt Toptar & gt 40 ° C Tmin & gt 5 ° C) y termofílico (Toptar & gt 40 ° C Tmin & gt 40 ° C) (Tabla S5).


Adaptación al frío en proteínas, a nivel secuencial y estructural - Biología

Instantánea de datos experimentales

  • Método: & nbspDIFRACCIÓN DE RAYOS X
  • Resolución: & nbsp2,09 Å
  • Sin valor R: & nbsp0.236 & nbsp
  • Trabajo con valor R: & nbsp0.184 & nbsp
  • Valor R observado: & nbsp0.184 & nbsp

Validación de wwPDB& nbsp & nbspInforme 3D & nbspInforme completo

Adaptaciones estructurales de la citrato sintasa activa en frío de una bacteria antártica.

(1998) Estructura & nbsp6: 351-361

  • PubMed: & nbsp9551556 & nbsp Buscar en PubMed
  • DOI: & nbsp10.1016 / s0969-2126 (98) 00037-9
  • Cita principal de estructuras relacionadas: & nbsp
    1A59
  • Resumen de PubMed: & nbsp

La base estructural de la adaptación de las enzimas a bajas temperaturas es poco conocida. Se ha utilizado citrato sintasa dimérica como enzima modelo para estudiar la base estructural de la termoestabilidad, habiéndose determinado previamente la estructura de la enzima de organismos que viven en hábitats a 55 grados C y 100 grados C.

La base estructural de la adaptación de las enzimas a bajas temperaturas es poco conocida. Se ha utilizado citrato sintasa dimérica como enzima modelo para estudiar la base estructural de la termoestabilidad, habiéndose determinado previamente la estructura de la enzima de organismos que viven en hábitats a 55 grados C y 100 grados C. Aquí, el estudio se amplía para incluir una citrato sintasa de una bacteria antártica, lo que nos permite explorar la base estructural de la actividad del frío y la termoestabilidad en todo el rango de temperatura en el que se sabe que sale la vida.


PREGUNTAS COMUNES DE RECUPERACIÓN DE BIOLOGÍA

1.Forma helicoidal / espiral tan compacta
2.La molécula es insoluble, tan osmóticamente inactiva (no afecta el potencial hídrico)
3. Ramificado para que la glucosa sea fácilmente accesible por enzimas para descomponerla para la respiración.
4.Molécula grande, por lo que no puede dejar la superficie de la célula / cruzar la célula
membrana

2. unido por condensación para formar un enlace glicosídico

4. & quot; voltear & quot; de moléculas alternativas

5. enlaces de hidrógeno que unen largas cadenas rectas

6. la celulosa fortalece las paredes celulares

7.Puede resistir la presión de turgencia / presión osmótica

8. vínculo difícil de romper

2. Unidos por enlaces peptídicos

3. Que se forman por condensación

4. La estructura primaria es el orden de los aminoácidos.

5. La estructura secundaria es el plegamiento de la cadena polipeptídica debido al enlace de hidrógeno.

6. La estructura terciaria es un plegamiento tridimensional debido a los enlaces de hidrógeno y los iónicos / disulfuro.
cautiverio

2. Desglosado en una reacción de un solo paso que asegura que la energía esté disponible rápidamente

3. Fosforila sustancias para hacerlas más reactivas.

AZÚCAR NO REDUCTOR
1. Haz la prueba de Benedict y permanece azul / negativo
2. Hervir con ácido y luego neutralizar con álcali.
3. Calentar con Benedict's y se vuelve rojo / naranja (precipitado)

2. (Causando) cambio en la secuencia de aminoácidos

3.Las mutaciones se acumulan con el tiempo

4.Más mutaciones / más diferencias (en aminoácidos / base / secuencia de nucleótidos / primaria
estructura) entre especies relacionadas lejanamente
O
Pocas (más) mutaciones / diferencias (en aminoácidos / base / secuencia de nucleótidos / estructura primaria) en
especies estrechamente relacionadas

IONES DE SODIO
1. Co-transporte de glucosa / aminoácidos (hacia las células)
2. (Porque) el sodio se extrae mediante transporte activo / bomba de sodio y potasio
3. Crea un gradiente de concentración / difusión de iones de sodio
4. Afecta la ósmosis / potencial hídrico

El sitio activo es flexible y puede moldearse alrededor del sustrato

2. El sitio activo solo es complementario a la maltosa

3. Descripción del ajuste inducido

4. La enzima es un catalizador que reduce la energía de activación requerida para la reacción.

(Inhibición competitiva),
2. El inhibidor tiene una forma similar al sustrato
3. Se une al sitio activo (de la enzima)
4. La inhibición se puede superar agregando más sustrato

Mantener una concentración baja de sodio en la célula epitelial en comparación con la
lumen

La glucosa se mueve hacia la célula epitelial con sodio.
Vía proteína transportadora / canal
La glucosa pasa a la sangre

2. Las endopeptidasas rompen los polipéptidos en cadenas de péptidos más pequeñas.

3. Las exopeptidasas eliminan los aminoácidos terminales

2. Muchas mitocondrias producen ATP para el transporte activo.
3. Proteínas portadoras presentes para el transporte activo

4. Canales / proteínas transportadoras para facilitar la difusión

5. Co-transporte de sodio y glucosa logrado a través de la proteína transportadora de sodio (iones) y glucosa.

2. El fosfolípido (bicapa) previene el movimiento / difusión de sustancias polares / insolubles en lípidos

3. Las proteínas transportadoras permiten el transporte activo

4. Las proteínas de canal / transportador permiten una difusión / cotransporte facilitado

5. La forma / carga del canal / portador determina qué sustancias se mueven

6. La cantidad de canales / portadoras determina la cantidad de movimiento

7. El área de la superficie de la membrana determina la cantidad de difusión / movimiento

2. Molécula larga / grande, por lo que puede almacenar mucha información.

3. Hélice / enrollada tan compacta

4. La secuencia de bases permite almacenar información (formación de proteínas)

5. De doble hebra para que la replicación pueda producirse de forma semiconservadora como ya existe
las hebras pueden actuar como plantillas a través del emparejamiento de bases complementarias

2. emparejamiento de bases unidas por enlaces de hidrógeno

3. Los enlaces de hidrógeno son débiles y se rompen fácilmente, lo que permite que las hebras se separen.

4. bases expuestas y actúan como plantilla
5. A con T, C con G

2. Rompe los enlaces de hidrógeno entre pares de bases, exponiéndolos

3. Solo una hebra de ADN actúa como plantilla

4. Nucleótidos de ARN atraídos por bases expuestas

5. (Atracción) según la regla de emparejamiento base (A-U & amp C-G)

6. La ARN polimerasa une los nucleótidos de ARN para formar pre-ARNm.

3. Las moléculas de ARNt llevan aminoácidos al ribosoma.

4. Existe una molécula de ARNt específica para un aminoácido específico

5. Anticodon de tRNA complementario al codon en mRNA

6. Se forman enlaces peptídicos entre aminoácidos adyacentes.

7. El ARNt se desprende y se va para recolectar otro aminoácido.

2. Cambio en la secuencia de aminoácidos

3. Esto altera la posición de los enlaces hidrógeno / iónico / disulfuro.

2. cromosomas hechos de dos cromátidas idénticas, debido a la replicación en interfase

3. los cromosomas se mueven hacia el ecuador de la célula

4. Los cromosomas se adhieren a las fibras individuales del huso.

5. Las fibras del huso se contraen y los centrómeros se dividen

6. Las cromátidas hermanas se mueven a polos opuestos

7. Cada polo recibe toda la información genética.

2. Los cromosomas se asocian en sus pares homólogos

3. El cruce entre cromosomas se produce mediante la formación de un quiasma.

4. Los cromosomas se unen a las fibras del huso, a través de sus centrómeros.

6. Los cromosomas homólogos se mueven a polos opuestos

2. Surtido independiente (segregación de cromosomas homólogos) en la meiosis I

3. Surtido independiente (segregación de cromátidas) en la meiosis II

+ Tres cualquiera de:
4. Hace que los individuos tengan diferentes adaptaciones, lo que hace que algunos se adapten mejor.

7. Estos transmiten el gen / alelo

2. Obtenga una sección delgada de tejido vegetal y colóquela en un portaobjetos.

3. Teñir con yodo en yoduro de potasio.

2. Filtrar para eliminar residuos grandes / células enteras

3. Use una solución isotónica para prevenir daños a las mitocondrias / orgánulos

4. Manténgase frío para reducir el daño de las enzimas / use tampón para evitar la desnaturalización de las enzimas

5. Centrifugar a menor velocidad para separar núcleos / fragmentos celulares / orgánulos pesados

2. Las moléculas pequeñas / no polares / solubles en lípidos pasan a través de fosfolípidos / bicapa
O
Las moléculas grandes / polares / solubles en agua atraviesan las proteínas

3. El agua se mueve por ósmosis de alto potencial hídrico a bajo potencial hídrico.

4. Transporte activo contra gradiente de concentración

5. El transporte activo / difusión facilitada involucra proteínas / portadores

6. El transporte activo requiere energía / ATP

2. No se puede cruzar la bicapa lipídica

3. Iones de cloruro transportados por difusión facilitada utilizando
proteína de canal / portadora

4. Oxígeno no cargado / no polar

2. Muchas mitocondrias producen ATP / liberación o proporcionan energía para actividades
transporte

3. Proteínas portadoras para el transporte activo

4.Proteínas de canal / portadoras para una difusión facilitada

5. Co-transporte de iones de sodio y glucosa utilizando una proteína transportadora / simportadora

2. Activo implica la producción de anticuerpos por células plasmáticas / células de memoria.

3. Pasivo implica la introducción de anticuerpos en el cuerpo desde el exterior.

4. Activo a largo plazo, porque el anticuerpo se produce en respuesta al antígeno.

5. Pasivo a corto plazo, porque el anticuerpo administrado se descompone

2. Patógeno engullido / ingerido

3. Encerrado en una vacuola, formando un fagosoma

4. Vacuola se fusiona con lisosoma

5. El lisosoma contiene enzimas que se vacían en la vacuola.

Las células plasmáticas producen anticuerpos

2 antígeno se une a receptores complementarios en linfocitos B

3 linfocitos se activan

4 (B) los linfocitos se reproducen por mitosis

2. El antígeno se muestra en las células presentadoras de antígeno (macrófagos).

3. La célula T colaboradora con proteína receptora complementaria se une al antígeno

4. El linfocito T colaborador estimula el linfocito B

5. Con el anticuerpo complementario en su superficie

6. Las células B secretan grandes cantidades de anticuerpos.

3. En la segunda exposición, las células de memoria se activan y producen anticuerpos.

4. Produce anticuerpos rápidamente / produce más anticuerpos

2. La forma de la estructura terciaria del sitio de unión.

3. Complementario a los antígenos

La enzima utiliza el ARN del VIH para hacer una copia del ADN

ADN unido al ADN / cromosoma de la célula huésped

ADN utilizado para hacer copias de ARN del VIH

Y proteínas / enzimas de la cápside del VIH

Ensamblaje de nuevas partículas de virus.

2. El ventrículo ahora tiene una presión más alta que la aurícula (debido al llenado / contracción).
Esto hace que las válvulas auriculoventriculares se cierren.

3. El ventrículo tiene una presión más alta que la aorta, lo que hace que la válvula semilunar se abra.

4. Esto conduce a una presión más alta en la aorta que en el ventrículo (ya que el corazón
se relaja) haciendo que la válvula semilunar se cierre

2. Paredes gruesas de celda única: reduce la distancia de difusión

3. Células aplanadas (endoteliales): reduce la distancia de difusión

4. Fenestraciones: permiten el paso de moléculas grandes.

5. Diámetro pequeño / estrecho: da una gran superficie al volumen / corto.
distancia de difusión

6. Lumen estrecho: reduce la velocidad de flujo, lo que da más tiempo para la difusión.

2. Las moléculas líquidas y solubles se desmayan

3. Las proteínas y las moléculas grandes se quedan atrás

4. Esto reduce el potencial hídrico

5. El agua regresa al extremo venoso del capilar.
por ósmosis

2. el piso de la boca está bajado

3. el agua entra debido a una presión disminuida y un
aumento de volumen

4. la boca se cierra, el opérculo / la válvula opercular se abre

5. El piso elevado da como resultado un aumento de la presión y una disminución del volumen.

placas branquiales o laminillas secundarias

gran número de capilares - & gt para eliminar oxígeno / para mantener un gradiente

epitelio delgado - & gt vía de difusión corta

cambios de presión - & gt para traer más agua / para mantener el gradiente

2. Las paredes de los alvéolos se adelgazan para proporcionar una vía de difusión corta

3. Las paredes de los capilares son delgadas entre los alvéolos, por lo que proporciona una vía de difusión corta.

4. Las paredes de los capilares / alvéolos tienen células aplanadas.

5. Membrana celular permeable a los gases

6. Muchos capilares sanguíneos proporcionan una gran superficie

7. Músculos intercostales y músculos del diafragma amp utilizados para ventilar los pulmones para mantener la difusión.
degradado

8. Amplia tráquea y ramificación de bronquios / bronquiolos para un flujo de aire eficiente


MATERIALES Y MÉTODOS

Coleccion de muestra

Pareledone sp., Robson 1932, fue recolectado durante enero desde debajo del hielo en la estación McMurdo, Antártida. El espécimen recogido fue amablemente proporcionado por el Dr. Chris DeVries. Pulpo bimaculatus, Verrill 1883, fue recolectado por buceo SCUBA del Wrigley Marine Lab, Two Harbors, Catalina Island, CA, EE. UU. Pulpo defilippi, Vérany 1851, fue recolectado en Rio Grande, Puerto Rico. Pulpo digueti, Perrier y Rochebrune 1894, fue recolectado en Ensenada San Lucas, Santa Rosalía, Baja California Sur, México. Bathypolypus arcticus (Prosch 1847) y Benthoctopus piscatorum (Verrill 1879) fueron recolectados en la costa norte del archipiélago de Svalbard, Noruega. De todas las muestras, los ganglios estrellados se disecaron, se conservaron en ARN más tarde (Ambion, Austin, TX, EE. UU.) Y se congelaron a –80 ° C.

Clonación molecular

Se extrajo el ARN total de cada ganglio estrellado utilizando el kit RNAqueous-Micro (Ambion) y se utilizó como plantilla para la síntesis de cDNA con el kit de síntesis de cDNA de primera hebra SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las subunidades α de Na + / K + -ATPasa de longitud completa se amplificaron mediante PCR utilizando polimerasa Taq (para O. bimaculatus y Pareledone sp.) o Phusion polimerasa (O. defilippi, O. digueti, B. arcticus y B. piscatorum) y cebadores basados ​​en las UTR de un Loligo opalescens Clon de subunidad α de Na + / K + -ATPasa [GenBank: EF467998 (Colina et al., 2007)]. Para obtener una secuencia consenso, se secuenciaron múltiples clones de ADNc hasta su finalización.

Expresión funcional en Xenopus ovocitos

La región codificante de la subunidad α de Na + / K + -ATPasa para cada especie se clonó en el Xenopus vector de expresión pBSTA (Liman et al., 1992) y utilizado como plantilla para la síntesis de cRNA con kits basados ​​en el promotor T7 (mMessage mMachine T7 Ultra, Ambion o sistema de producción de mRNA mScript, Epicenter, Madison, WI, EE. UU.). También se preparó ARNc para la subunidad β nativa del sistema de axones gigantes de calamar [GenBank: EF467996 (Colina et al., 2007)]. Los ovocitos se inyectaron con 80 ng de una mezcla equimolar de ARNc de las subunidades α y β. Los experimentos se realizaron 3-4 días después de la inyección. Los ovocitos se extrajeron quirúrgicamente y se desfolicularon mediante un tratamiento enzimático con colagenasa. Se seleccionaron ovocitos en estadio V y VI para inyección. Después de la inyección, los ovocitos se mantuvieron durante 3 a 4 días a 18 ° C en una solución de ND-96 (en mmol l -1: 96 de NaCl, 2 KCl, 1,8 CaCl2, 1 MgCl2 y 5 Hepes pH 7,6). Inmediatamente antes del registro, los ovocitos se cargaron con Na + durante 45 min en una solución de carga de Na + (en mmol l -1: 100 de glutamato de sodio, citrato de sodio 2,5 y 5 Hepes pH 7,5) (Rakowski et al., 1991 ).

Soluciones experimentales para medidas electrofisiológicas

Las soluciones extracelulares empleadas para evaluar la función de la bomba a lo largo de este estudio fueron solución de 5 mmol l –1 K + (en mmol l –1: 100 glutamato de sodio, glutamato de 5 K, 5 de BaCl2, 2 NiCl2, 5 Hepes, 2 MgCl2 y 0,3 ácido niflúmico) y una solución libre de K + (igual que una solución de 5 mmol l –1 K + excepto que 5 mmol l –1 norte-metil d -glucamina se sustituyó por 5 mmol l –1 K +). Ouabain se utilizó a una concentración de 100 μmol l –1 tanto en las soluciones de 5 mmol l –1 K + como libres de K +. Cuando se utiliza la técnica de "brecha de vaselina de ovocitos con corte abierto" (ver más abajo), la solución interna contenía (mmol l –1): 80 glutamato de sodio, 20 de TEA-glutamato, 10 MgSO4, 10 Hepes, 5 EGTA y 5 MgATP. Para obtener acceso eléctrico al interior, los ovocitos se permeabilizaron con saponina al 0,2% (p / v) en la solución interna. El pH de todas las soluciones experimentales se ajustó a 7,5 con norte-metild -glucamina a temperatura ambiente y se determinó que variaba en 0,2 unidades entre 30 y 5 ° C.

Niveles de expresión de Na + / K + -ATPasa

Los niveles de expresión se evaluaron como la corriente total sensible a la ouabaína registrada de los ovocitos completos que expresan cualquier construcción. Los ovocitos se pinzaron usando un amplificador de pinza de tensión de dos microelectrodos convencional (GeneClamp 500B Axon Instruments, Foster City, CA, EE. UU.). Las señales analógicas se filtraron a 1 kHz y se digitalizaron utilizando un conversor A / D Innovative Integrations SBC6711 (Simi Valley, CA, EE. UU.). El software GPATCH fue proporcionado amablemente por el Dr. Francisco Bezanilla. Los ovocitos se mantuvieron a 0 mV y las bombas se activaron por completo con la solución de 5 mmol l –1 K +, seguido de la adición de ouabaína. La expresión de la bomba endógena se registró a partir de ovocitos no inyectados. Todos los experimentos para evaluar el nivel de expresión se realizaron a temperatura ambiente (~ 22 ° C).

Estudios de dependencia del voltaje y tasa de rotación

Se llevaron a cabo experimentos de dependencia del voltaje y tasa de rotación utilizando la técnica de "brecha de vaselina de ovocitos abierta" (Taglialatela et al., 1992). Los ovocitos se pinzaron con una pinza para ovocitos de alto rendimiento Dagan CA-1B (Dagan Corporation, Minneapolis, MN, EE. UU.), Tomando muestras exclusivamente del polo del animal para minimizar la señal de las bombas endógenas (Holmgren y Rakowski, 1994). En estos experimentos, los ovocitos se mantuvieron a 0 mV y se escalonaron a varios potenciales que van desde –200 a +50 mV con incrementos de 10 mV. La duración de los pulsos fue de 35 o 60 ms. Se utilizó una placa A / D de Innovative Integrations SBC6711 con software GPATCH para controlar los protocolos de voltaje y digitalizar señales analógicas. Los registros en una base de tiempo lenta ("registros de gráficos") se recopilaron utilizando una placa MiniDigi 1A y el software AxoScope 9.0 (Axon Instruments). Las señales se adquirieron a 100 kHz y se filtraron a 10 kHz. El voltaje intracelular se midió con una pipeta de 0,2-0,3 MΩ llena con 1 mol l -1 de NaCl y puentes llenos de 3 mol l -1 de Na-MES (sal sódica del ácido 4-morfolinetanosulfónico) en agarosa al 3% (p / v). En todos los experimentos, la estabilidad de las grabaciones se evaluó mediante controles de tiempo, obtenidos a partir de la diferencia entre corriente-voltaje (IV) relaciones obtenidas en las mismas condiciones experimentales a intervalos de tiempo equivalentes. Estos experimentos se realizaron a ~ 22 ° C.

La dependencia del voltaje de la corriente de Na + / K + -ATPasa se evaluó realizando el protocolo de voltaje en soluciones de 5 mmol l –1 K + antes y después de la adición de 100 µmol l –1 de ouabaína. La diferencia entre estos registros produjo la corriente de bomba sensible a la ouabaína. Se midió y representó la corriente en estado estacionario producida en cada voltaje. El potencial para la mitad de la corriente máxima (media del punto medio ± s.e.m.) para cada construcción de Na + / K + -ATPasa se midió a partir de la IV trazar para cada experimento y luego promediar. La significancia de los valores del punto medio se probó utilizando un análisis de dos poblaciones. t-prueba con α = 0,05.

Sensibilidad a la temperatura de la tasa de renovación de Na + / K + -ATPasa

La sensibilidad a la temperatura de las bombas se estudió en ovocitos completos utilizando una pinza de voltaje de dos microelectrodos. Los ovocitos se mantuvieron a 0 mV en una cámara donde se controló la temperatura mediante dispositivos Peltier. Las bombas se activaron con 5 mmol l –1 K + a 30 ° C. Una vez activado por completo, la temperatura se redujo progresivamente a ~ 5 ° C y luego volvió a 30 ° C. Este protocolo se repitió luego en presencia de ouabaína para evaluar las corrientes de fuga. Durante los registros actuales, la temperatura se registró simultáneamente colocando un termopar inmediatamente adyacente al ovocito. La salida del termopar se calibró y recopiló a 1 kHz en línea. La fuga dependiente de la temperatura fue insignificante en comparación con la corriente de la bomba. Para cada experimento, la cantidad de corriente sensible a la ouabaína a cada temperatura se normalizó al valor a 22 ° C. A continuación, se promediaron los valores normalizados obtenidos de experimentos individuales para múltiples ovocitos. Se hicieron estimaciones de la cantidad de corriente de bomba endógena a cada temperatura utilizando la magnitud de la corriente endógena en los ovocitos no inyectados a 22 ° C y la sensibilidad a la temperatura de la corriente endógena (ver material suplementario Fig. S1). A continuación, se restaron los valores endógenos de los datos de los ovocitos inyectados con clon. Estos valores (medias ± s.e.m.) se convirtieron a tasas de rotación basadas en tasas de rotación determinadas a 22 ° C. En algunos casos, los datos se normalizaron al valor actual a 28 ° C.


Figura S1. Valores ΔB 'de la serina proteasa psicrofílica (PDB:

Archivo adicional 1: 1ELT) y serina proteasa mesofílica (PDB:1EAI) en cada posición de aminoácido en una alineación por pares. Gráfico de los valores de ΔB 'de las proteínas emparejadas 1ELT y 1EAI. En la parte superior está la estructura secundaria de la enzima psicrófila. Se obtienen una región rígida visible de (aminoácidos 1-110) y una región flexible (aminoácidos 111-235) utilizando la metodología del valor ΔB '. Figura S2. Tabla de número de posiciones encontradas en cada estructura secundaria en par psicro / mesófilo. Tabla de número de posiciones encontradas en cada estructura secundaria en los 20 pares psicro / mesófilos. Figura S3. Gráfico de aguas cristalográficas enterradas de cada par psicro / mesófilo. Parcela de aguas cristalográficas enterradas de los 20 pares psicro / mesófilos. En los casos en que estaban presentes múltiples cadenas en la estructura cristalina, se promediaron los valores. Nota: 1a59 no contiene aguas cristalográficas registradas. (PDF 1 MB)


Ver el vídeo: TestLab: Qué es la desnaturalización de las proteínas? (Febrero 2023).