Información

En las transferencias Western, ¿los controles de carga tienen que ser proteínas que estén en cantidades iguales en cada carril?

En las transferencias Western, ¿los controles de carga tienen que ser proteínas que estén en cantidades iguales en cada carril?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Recientemente hice un Western Blot y estoy haciendo análisis de datos en mis blots. Estoy estudiando la proteína GSK3, que es una fosfoproteína.

He etiquetado mi membrana contra GSK3 activo y GSK3 inactivo. También he etiquetado la membrana contra GSK3 total. He utilizado Ponceau S como control de carga. De mi tinción Ponceau S, he visto que hay variaciones en las cantidades de proteína cargadas por carril. Por lo tanto, hay variaciones en las cantidades de GSK3 total por carril (las intensidades de las bandas no son todas iguales).

Me pregunto si las intensidades de banda del GSK3 total no son consistentes entre los carriles, en este caso, ¿usar el GSK3 total sería un buen control de carga para normalizar mis datos? He leído para el caso de las fosfoproteínas, se puede normalizar a la proteína total (usando un anticuerpo que reconozca todas las formas de la proteína de interés).

He leído que los controles de carga son proteínas endógenas que no se ven afectadas por las condiciones experimentales y se utilizan como indicador de la concentración de la muestra. Pero si las cantidades de GSK3 total varían entre los carriles, ¿cómo puede ser esto un buen control de carga? De manera similar, ¿por qué muchos investigadores usan Ponceau S como control de carga, si las intensidades de banda entre los carriles varían (si no carga cantidades iguales de muestra)?

En otras palabras, para que una proteína sea un control de carga, ¿tiene que estar en cantidades iguales para todas sus muestras / carriles?

Se agradece cualquier información.


No es necesario que los controles se carguen en cantidades iguales por decir, pero sí deben expresarse de manera relativamente equitativa entre los carriles. Necesitan una expresión igual, de modo que los controles se puedan utilizar para normalizar los valores de las proteínas experimentales.

Es común usar genes de mantenimiento, como la beta actina, que generalmente se expresan por igual entre tratamientos para controlar la carga. Es importante asegurarse de que los tratamientos no afecten a esas proteínas.

Para obtener ejemplos y justificación, consulte:

https://www.abcam.com/anticuerpos-primarios/guía-control-de-carga

https://www.bio-rad-antibodies.com/western-blot-loading-controls-antibodies.html

https://www.labome.com/method/Loading-Controls-for-Western-Blots.html


Western Blot: preparación de muestras

Nuestra nueva guía de bolsillo contiene una serie de pasos que le ayudarán con su diseño experimental.

Regístrese para recibir nuestros correos electrónicos

Sea el primero en saber cuándo lanzamos nuevos productos y recursos para ayudarlo a lograr más en el laboratorio.


7 consejos para optimizar sus experimentos de Western Blot

El Western blot no es una ciencia exacta: obtener resultados perfectos y listos para la publicación de inmediato no es exactamente la norma. Sin embargo, hay pasos que puede seguir para perfeccionar sus experimentos de transferencia y asegurarse de que tengan el mejor comienzo posible. Este proceso de ajuste fino se conoce como optimización y se pueden someter a él varias etapas del protocolo de transferencia Western.

1. SDS-PAGE

Sus experimentos de Western Blot comienzan mucho antes de que comience a trabajar con su membrana. Podríamos ir tan atrás como la preparación de la muestra, pero en aras del espacio, comencemos con la muestra separación. Con esto, obtiene lo que pone; sin un buen gel SDS-PAGE, no obtendrá una buena membrana y a partir de ahí se desenredará todo. Si echas tus propios geles, ten mucho cuidado para asegurar la uniformidad en su composición. Seleccione el porcentaje de acrilamida correcto (consulte el protocolo de transferencia Western de Proteintech [PDF]). Evite ese efecto de "sonrisa" de frente de tinte resistiendo la tentación de ejecutar sus geles a altos voltajes y llenar los pozos vacíos con un volumen equivalente de tampón de muestra 1x.

Sobre todo, cargue una cantidad uniforme de proteína, determine la concentración de proteína por ensayo y prepárese para reducir la cantidad de carga si obtiene manchas “rayadas”. El laboratorio de validación de Proteintech encuentra que 30 μg de proteína por carril generalmente dan bandas libres de rayas y bien separadas.

2. Membrana

Su elección de membrana puede marcar una gran diferencia en el resultado de sus experimentos de transferencia Western. Los dos tipos principales de membranas son PVDF y nitrocelulosa, pero ahora hay varias versiones de cada uno en el mercado de consumibles, incluidas, por ejemplo, membranas optimizadas para inmunodetección basada en fluorescencia o proteínas de bajo peso molecular.

El PVDF es valorado por su dureza, estabilidad y resistencia a la mayoría de los ácidos y álcalis (lo que significa que es la membrana de elección para aquellos de ustedes que desean quitar y volver a probar sus manchas). Las membranas de PVDF también ofrecen una mejor retención de proteínas que la nitrocelulosa.

Las membranas de nitrocelulosa se bloquean fácilmente y generalmente proporcionan una alta relación señal / ruido. Sin embargo, no podrá quitarlos y volver a probarlos, y también prestar atención al tamaño de los poros de la membrana de nitrocelulosa.

Finalmente, unas palabras sobre la tradición del laboratorio: no tenga miedo de cambiar los tipos de membranas debido a las normas del laboratorio. Probar algo diferente puede ser la clave para el Western blot óptimo.

3. Concentración de anticuerpos

Suponiendo que haya realizado el esfuerzo necesario para seleccionar su anticuerpo, su próximo paso debería ser determinar la concentración óptima de anticuerpos de trabajo.

La tasa de unión entre el anticuerpo y el antígeno (la constante de afinidad) se ve afectada por sus concentraciones relativas en la solución (entre otras variables, como la temperatura y el pH). Las cantidades de antígeno generalmente se fijan en la transferencia Western (es decir, su proteína se fija a la membrana), por lo que a menudo necesitará ajustar la concentración de anticuerpos para obtener mejores transferencias. Hacer esto de manera organizada, probando varias diluciones de anticuerpos mientras se mantienen constantes todos los demás parámetros, lo ayudará a determinar la concentración óptima de anticuerpos para sus experimentos.

Este paso se denomina titulación de anticuerpos y debe realizarse cada vez que utilice un nuevo anticuerpo o un conjunto de condiciones experimentales. También debe hacerse si alguna vez nota que un nuevo lote de anticuerpo policlonal no tiene el mismo rendimiento que el anterior.

Cómo titular un anticuerpo

Muchas empresas proporcionan las diluciones recomendadas en sus hojas de datos de anticuerpos, y estas suelen ser cifras aproximadas para empezar, sin embargo, es recomendable valorar los anticuerpos, ya que las condiciones utilizadas para obtener las diluciones recomendadas pueden ser muy diferentes de las que usted necesita. estás usando. Si una hoja de datos del producto sugiere usar una dilución de 1: 1000, pruebe con una serie de 1: 250, 1: 500, 1: 1000, 1: 2000 y 1: 4000.

En general, si coloca entre paréntesis la dilución recomendada con una duplicación y una reducción a la mitad (y una dilución entre cada una de estas), debería estar en el camino correcto. Si no hay una dilución recomendada para comenzar, pruebe con 1 μg / ml de anticuerpo purificado como punto de partida (las concentraciones deben estar en la hoja de datos) y continúe desde allí. Recuerde mantener todos los demás parámetros del protocolo iguales, como el tipo de muestra, los tiempos de incubación, los tiempos de lavado y las temperaturas.

Una nota sobre anticuerpos secundarios

Es posible que también deba probar diferentes concentraciones de anticuerpos secundarios, especialmente en el caso de la detección quimioluminiscente. La concentración del anticuerpo secundario marcado con HRP afecta directamente la apariencia de las bandas. Muy poca enzima HRP dará como resultado una señal quimioluminiscente baja y luz o bandas faltantes. Por otro lado, una concentración demasiado alta producirá bandas "quemadas". Esto se debe a un rápido agotamiento del sustrato en el centro de las bandas. La duración de la incubación del reactivo quimioluminiscente también marcará la diferencia (consulte el n. ° 6, Detección, a continuación).

4. Condiciones de bloqueo

Hay varios búferes de bloqueo disponibles y no todos funcionan en todas las situaciones. Es importante probar varios tampones de bloqueo para cada par anticuerpo-antígeno. Recuerde que los tampones de bloqueo a base de leche contienen elementos como biotina endógena, glicoproteínas y enzimas que pueden interferir con la señal. Los tampones a base de leche, por ejemplo, contienen fosfatasas activas que sabotearán tu detección de proteínas fosforiladas en estos casos, prueba alternativas como los bloqueadores a base de albúmina de suero bovino.

5. Lavado

En su mayor parte, siempre que he tenido una señal de fondo alta, revisar los pasos de lavado en el siguiente ensayo ha resultado útil. Por lo general, lo hago aumentando la concentración de Tween-20 del 0,05% al ​​0,1%. También puede alterar la intensidad del lavado utilizando cualquiera de las siguientes tácticas: aumentar los tiempos y volúmenes de lavado, realizar cambios de tampón adicionales o usar detergentes más fuertes (por ejemplo, SDS en lugar de Tween 20). No se exceda.

6. Detección

La etapa de detección es fundamental para obtener una buena señal de transferencia Western. Existen muchos reactivos quimioluminiscentes y alternativas quimioluminiscentes, como la detección fluorescente, por lo que hay muchas opciones si su método de detección actual no cumple con los estándares del laboratorio. Puede elegir reactivos con más sensibilidad o aquellos que producen una señal más duradera, por ejemplo. La última opción aumentará enormemente la reproducibilidad de sus borrones.

En un nivel más simple, la detección quimioluminiscente se puede optimizar con los tiempos de exposición de la película. Este es probablemente el paso de optimización que se realiza con más frecuencia, ya que es rápido y fácil. Siempre exponga sus manchas para un rango de puntos de tiempo individuales (pero recuerde que después de aproximadamente 10 a 15 minutos, todo el sustrato de HRP se agotará). Su elección de película también marcará la diferencia. Siempre he encontrado películas diseñadas específicamente para la detección quimioluminiscente, en lugar de cualquier película radiosensible estándar, como la opción óptima.

7. ¡Corta un paso!

Tiene sentido que si tiene menos pasos que realizar, habrá menos que puedan salir mal con su experimento y que haya menos pasos para optimizar en primer lugar. Los avances tecnológicos y las modificaciones simples de los reactivos, como los reactivos de imágenes de fluorescencia y conjugados con HRP, respectivamente, pueden ayudar aquí.

Aunque es posible que los sistemas de imágenes de fluorescencia aún no estén disponibles para todos los laboratorios individuales, es posible que haya instalaciones centrales en su institución que ofrezcan esta tecnología. Una ventaja inmediata de los sistemas de detección basados ​​en fluorescencia es que permiten la detección de más de un anticuerpo de forma simultánea, lo que elimina la necesidad de eliminar y volver a sondear las transferencias. (Sin embargo, recomendamos encarecidamente que no realice sus intentos iniciales de transferencia Western utilizando varios anticuerpos primarios en la misma incubación, especialmente si no se dispone de imágenes de fluorescencia y está optando por utilizar la detección por quimioluminiscencia. Si desea hacer esto eventualmente, déjelo hasta que conozca mucho mejor sus proteínas y anticuerpos).

Alternativamente, puede omitir la detección secundaria de anticuerpos primarios por completo y optimizar su protocolo de transferencia Western, utilizando anticuerpos primarios conjugados con HRP. Es cierto que estos no están disponibles para todas las proteínas objetivo, sin embargo, aquellos que reconocen los controles de carga comunes y las etiquetas de proteínas podrían ahorrarle mucho tiempo y podrían ser una buena inversión. ¡Proteintech tiene varios de estos!

En resumen

Los principales objetivos de la optimización son aumentar la relación señal / ruido de bandas específicas y disminuir las bandas no específicas (si están presentes). Es cierto que si elige optimizar todas las variables anteriores, le llevará un tiempo considerable, sin embargo, incluso una o dos alteraciones pueden marcar la diferencia y, de hecho, ahorrarle tiempo a largo plazo. En general, considero que la optimización es una empresa sumamente valiosa y una estrategia necesaria si desea lograr transferencias Western con calidad de publicación.


Western Blot: cuantificación de proteínas

Después de la lisis de las células, es importante determinar la concentración de proteína total de la muestra. La cuantificación precisa de la muestra le permitirá cargar la cantidad adecuada de proteína en cada carril. Esto evita sobrecargar el carril pero aún permite la detección adecuada de la proteína de interés. La cuantificación adecuada también es fundamental al realizar Westerns semicuantitativos o cuantitativos. Para una determinación precisa de las cantidades relativas de expresión de proteínas, se debe cargar la misma cantidad de proteína en cada carril.

Existen varios métodos diferentes para cuantificar la concentración de proteínas en las muestras. Algunos (por ejemplo, la medición del contenido de nitrógeno o el etiquetado radiactivo de las células) no se basan en las propiedades de absorción de la muestra de proteína. Si bien estos pueden ser ensayos sensibles y precisos, los ensayos más comúnmente utilizados se basan en la determinación espectrofotométrica de la concentración de proteínas y estos serán el foco de esta guía.

Los métodos espectrofotométricos para medir la concentración de proteínas son ensayos populares. Por lo general, son fáciles de aliviar, sensibles y no dependen del uso de agentes peligrosos. Hay varios métodos y kits disponibles para emplear un espectrofotómetro para determinar la concentración de proteínas. La elección del mejor método depende de varios factores. Un ensayo de cuantificación de proteínas debe ser fácil de usar y no tener un costo prohibitivo. El rango del ensayo debería permitirle cuantificar con precisión todas las muestras de proteínas. Generalmente se desea una respuesta lineal en un amplio rango. La sensibilidad del ensayo determinará el nivel más bajo de proteína que se puede detectar. Los ensayos también tienen diferentes componentes tampón de especificidades, como los detergentes, que pueden interferir con el ensayo.

Las diferentes capacidades y limitaciones de varios ensayos se analizan a continuación.

Absorbancia a 280 nm

Una medida rápida, pero menos específica, de la concentración de proteínas es la absorbancia de la muestra a 280 nm. La mayoría de las proteínas tienen un máximo de absorbancia a 280 nm en contraposición a los ácidos nucleicos que absorben a 260 nm. Los residuos aromáticos, como el triptófano, la tirosina y la fenilalanina, son responsables de la absorbancia observada, por lo que las proteínas que carecen de estos residuos no se pueden medir con este ensayo. Requiere aproximadamente 50 μg para lecturas precisas.

Aunque la contaminación por ácido nucleico puede interferir con la medición de la concentración de proteína a 280 nm, se puede tomar una medida más precisa midiendo la absorbancia de la muestra tanto a 260 nm como a 280 nm y utilizando el siguiente cálculo:

Proteína mg / mL = 1,55 A280 - 0,76 A260

  • Bueno para muestras que contienen una sola proteína de absortividad molar conocida
  • Útil en cromatografía para determinar el perfil de elución de proteínas.
  • Ensayo fácil y rápido
  • Sensibilidad moderada

Desventajas:

  • Necesita un espectrofotómetro capaz de leer en la región UV
  • Necesita usar cubetas de cuarzo
  • No se puede utilizar con proteínas que no contengan residuos aromáticos.
  • La contaminación por ácidos nucleicos puede ser un problema

Método Biuret

La prueba de biuret es una prueba para detectar la presencia de enlaces peptídicos. En condiciones alcalinas, Cu2 + forma un complejo de color violeta. La concentración de proteínas es directamente proporcional a la intensidad del color, absorbida a 540 nm.

El reactivo de Biuret contiene hidróxido de sodio, sulfato de cobre (II) hidratado y tartrato de sodio y potasio (para estabilizar los complejos). La reducción del cobre da como resultado un cambio de color, que se puede leer a 550 nm. El rango lineal es típicamente de 0,5 a 20 mg de proteína.

  • No depende de la composición de aminoácidos de la proteína.
  • No requiere un espectrofotómetro capaz de medir en la región UV
  • Bueno para muestras de tejido completo y otras fuentes de alta concentración de proteínas
  • Relativamente pocos materiales interfieren con el ensayo.

Desventajas:

  • Los tampones, como Tris y amoníaco, pueden interferir con la reacción.
  • No se puede medir la concentración de proteínas precipitadas con sulfato de amonio
  • No es tan sensible como otros métodos; requiere mayores cantidades de proteína
  • Necesita configurar una curva estándar
  • La contaminación por ácidos nucleicos puede ser un problema
  • Las proteínas con un porcentaje anormalmente alto o bajo de aminoácidos aromáticos darán lecturas altas o bajas.

El método Lowry

El desarrollo del método Lowry (llamado así por Oliver Lowry) introdujo un ensayo más sensible para determinar la concentración de proteínas. El método de Lowry es sensible, altamente reproducible, económico y fácil de realizar.

Una modificación de la prueba de Biuret, el método de Lowry se basa en la reacción del cobre con las proteínas, pero la muestra también se incuba con el reactivo de Folin-Ciocalteu. La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu en condiciones alcalinas da como resultado un color azul intenso (azul de heteropolimolibdeno) que se absorbe a 750 nm. El método de Lowry se utiliza mejor con concentraciones de proteínas de 0,01 a 1,0 mg / ml.

  • Fácil de usar
  • Altamente reproducible
  • Barato
  • Rango lineal amplio y sensible

Desventajas:

  • Necesita hacer una curva estándar para cada ensayo.
  • El tiempo y la mezcla de los reactivos deben ser precisos.
  • La sensibilidad depende de la composición de la proteína, ya que la reacción depende en parte de los aminoácidos polares.
  • Interferencia de algunos tampones, particularmente detergentes
  • Más adecuado para determinar la concentración de muestras de la misma proteína que como medida absoluta
  • El ensayo puede ser largo

Ensayo de ácido bicinconínico (BCA)

BCA es similar a Lowry, excepto que se usa ácido bicinconínico (BCA) en lugar del reactivo de Folin-Ciocalteu. Después de la reducción de los iones Cu2 +, dos moléculas de BCA se quelatan con cada ión Cu + dando como resultado la formación de un color púrpura intenso que se absorbe a 560 nm.

El BCA es tan sensible como el método de Lowry y funciona bien con concentraciones de proteína de 0.5 μg / mL a 1.5 mg / mL. Aunque los detergentes no interfieren con tanta fuerza como en el método Lowry, otros contaminantes pueden interferir con la reacción. Además, los aminoácidos aromáticos pueden influir en la reacción. Sin embargo, a temperaturas más altas (37-60 ° C), los enlaces peptídicos también pueden contribuir a la formación del producto. Por lo tanto, se recomienda realizar la reacción a temperaturas más altas para aumentar la sensibilidad y disminuir la variabilidad debido a la composición de aminoácidos.

  • Fácil de usar
  • Altamente reproducible
  • Barato
  • Rango lineal amplio y sensible

Desventajas:

  • Necesita hacer una curva estándar para cada ensayo.
  • Interferencia de carbohidratos, catecolaminas, triptófano, lípidos, rojo fenol, cisteína, tirosina, sacarosa o glicerol impuro, ácido úrico, hierro y peróxido de hidrógeno.
  • El color continúa desarrollándose con el tiempo, pero es estable para la medición después de 30 minutos a 37 ° C

Ensayos de unión a colorantes

Los ensayos de unión de tinte se basan en un cambio de absorbancia que ocurre cuando un tinte se une a proteínas. Se pueden utilizar varios tintes diferentes: Coomassie Brillant Blue G-250, verde bromocresol, rojo pirogalol y eosina y. El ensayo de unión de colorantes más utilizado es el ensayo de Bradford.

Ensayo de Bradford

El ensayo de Bradford, llamado así por su desarrollado, Marion M. Bradford, es un método fácil, sensible y preciso para la cuantificación de proteínas. La unión de Coomassie Brillant Blue G-250 a proteínas provoca un cambio del tinte del rojo (465 nm) al azul (595 nm) en condiciones ácidas. Es compatible con los reactivos más comunes, aunque los detergentes pueden causar interferencias. Las proteínas con una concentración de 20-2000 μg / mL se pueden medir utilizando el ensayo de Bradford.


Varias bandas en Western Blots: causas y soluciones

El ensayo de transferencia Western proporciona información valiosa sobre una proteína, incluida la abundancia, la masa molecular aparente, las modificaciones postraduccionales y las variantes de corte y empalme. Sin embargo, el análisis de la proteína puede resultar difícil si aparecen múltiples bandas en la mancha. Cuando se trata de múltiples bandas en transferencias Western, es importante determinar si se deben a artefactos técnicos o si representan verdaderas variantes de la proteína de interés. Esta guía describe varias causas de múltiples bandas debido a artefactos técnicos y cómo determinar si múltiples bandas representan verdaderas variantes de la proteína de interés.

Varias bandas causadas por artefactos técnicos

Los artefactos técnicos pueden causar la aparición de bandas que tienen pesos moleculares más altos o más bajos que la proteína real. Los tipos de bandas que se observan pueden ayudar a determinar la causa del artefacto.

Bandas de peso molecular más bajo y más alto

Concentración de anticuerpo primario o secundario demasiado alta

Si la concentración del anticuerpo primario o secundario es demasiado alta, el anticuerpo puede unirse de manera no específica a proteínas distintas de la proteína de interés. La unión no específica puede ocurrir con cualquier proteína, por lo que se pueden observar bandas de peso molecular más alto y más bajo.

Valorar el anticuerpo

Para determinar si las concentraciones altas de anticuerpos dan como resultado múltiples bandas, titule los anticuerpos. Ambos anticuerpos pueden titularse simultáneamente usando un dot blot en forma de tablero de ajedrez.

Sin control primario de anticuerpos

Para determinar rápidamente si el anticuerpo primario es responsable de producir múltiples bandas en la transferencia, realice todo el procedimiento de transferencia de Western pero omita el anticuerpo primario. Si aún se observan múltiples bandas, entonces el anticuerpo secundario es responsable de los artefactos.

Cantidad excesiva de lisado cargado en gel

Si se carga demasiado lisado en un gel, los anticuerpos pueden unirse de manera no específica a proteínas de abundancia excesiva, lo que da como resultado múltiples bandas.

Disminuir la cantidad de lisado utilizado

Para determinar la cantidad apropiada de lisado para cargar en el gel, cargue diluciones decrecientes de lisado en el gel.

Incrementar lavados

Si la proteína de interés no es muy abundante, entonces puede ser necesario cargar grandes cantidades de proteína para detectar la proteína. Para disminuir la unión no específica a proteínas de mayor abundancia, aumente el número y la duración de los lavados.

El anticuerpo está "sucio"

Los sueros policlonales o los anticuerpos no purificados también pueden contener anticuerpos menos abundantes que se unen a proteínas celulares comunes abundantes.

Utilice un anticuerpo purificado por afinidad

Cuando sea posible, compre anticuerpos purificados por afinidad. Alternativamente, los antisueros policlonales pueden purificarse por afinidad usando Proteína A, G o L inmovilizada para purificar moléculas de IgG o pueden usarse antígenos inmovilizados para purificar anticuerpos específicos de antígeno. Hay kits comerciales disponibles para la purificación por afinidad de anticuerpos.

Bandas de menor peso molecular

Degradación de la proteína diana

Por lo general, surgen múltiples bandas de peso molecular más bajo debido a una mala manipulación de los lisados ​​/ muestras antes del análisis y pueden ser indicativas de la degradación de la muestra.

Inhibidores de la proteasa

Para disminuir la degradación de proteínas por proteasas celulares, incluya inhibidores de proteasa en la solución de lisis utilizada para la preparación de muestras.

Mantenga las muestras frías

Mantenga las muestras en hielo durante la preparación y durante todas las manipulaciones para limitar la actividad de la proteasa.

Limite el congelamiento / descongelamiento

Coloque las muestras en alícuotas en varios tubos y congele / descongele cada tubo solo 1-2 veces para limitar la degradación inducida por los cambios de temperatura.

Bandas de mayor peso molecular

Las bandas de mayor peso molecular solas también pueden deberse a artefactos técnicos.

La proteína diana puede formar multímeros

Los multímeros de proteínas no resueltos pueden dar como resultado bandas de peso molecular que son más altas que el peso molecular predicho de la proteína diana.

Hervir en tampón SDS-PAGE durante 10 minutos.

Para reducir las proteínas por completo, hierva la muestra en tampón SDS-PAGE que contenga un agente desnaturalizante como ditiotreitol o β-mercaptoetanol durante 10 minutos en lugar de los 5 minutos habituales.

Compare el gel reductor con el no reductor

Para determinar si la proteína de interés está formando multímeros, prepare las muestras en condiciones reductoras y no reductoras antes de cargar el gel.

Determinar si varias bandas son científicamente relevantes

Se pueden observar múltiples bandas que son científicamente relevantes durante el análisis de transferencia Western. Se observan bandas de mayor peso molecular cuando las proteínas se unen a modificadores, mientras que se observan bandas de menor peso molecular cuando se empalman las proteínas.

Determinar si las bandas son reconocidas específicamente por el anticuerpo.

Uno de los criterios para determinar si las bandas múltiples se deben a artefactos técnicos o si son científicamente relevantes, es determinar si las bandas son reconocidas específicamente por el anticuerpo primario. Esto se puede lograr usando muestras de control y / o inhibiendo específicamente la interacción del anticuerpo con la proteína.

Muestras de control

Incluya controles en el gel que contengan o carezcan de la proteína de interés. Por ejemplo, incluya líneas celulares que sean idénticas en todos los aspectos excepto en la expresión de la proteína para identificar bandas que aparecen debido a interacciones no específicas.

Péptidos bloqueantes

Cuando estén disponibles, los péptidos de bloqueo (aquellos que coinciden con el epítopo reconocido por el anticuerpo) se pueden usar para determinar qué bandas son reconocidas específicamente por el anticuerpo. Incubar previamente el anticuerpo primario con concentraciones crecientes de péptidos bloqueantes antes de la incubación de la mancha con el anticuerpo. El péptido de bloqueo evitará la interacción del anticuerpo con la proteína diana y la banda "desaparecerá" en la mancha.

Bandas de mayor peso molecular

A menudo se observan bandas de mayor peso molecular cuando la proteína diana se modifica postraduccionalmente. La acetilación, metilación, miristoilación, fosforilación, glicosilación y ubiquitinación son todas modificaciones que aumentan el peso molecular de una proteína. Se pueden usar varias técnicas para determinar si una proteína se modifica postraduccionalmente.

Software de análisis de proteínas

Utilice software de análisis de proteínas para predecir los tipos de modificaciones que una proteína puede adquirir después de la traducción. Utilice el software para predecir el peso molecular de la proteína con y sin modificaciones.

Anticuerpos específicos para modificación

Se encuentran disponibles anticuerpos primarios comercialmente disponibles que reconocen modificaciones postraduccionales específicas (por ejemplo, anticuerpos específicos para la fosforilación de tirosina). Estos anticuerpos pueden usarse para confirmar modificaciones postraduccionales. Para usar estos anticuerpos, inmunoprecipite la proteína de interés usando el anticuerpo primario específico de la proteína. Ejecute la fracción inmunoprecipitada en un gel y luego realice una transferencia de Western usando el anticuerpo primario específico de la modificación.

Tratamientos químicos para eliminar modificaciones

Las proteínas y los extractos de proteínas se pueden tratar con productos químicos que eliminarán las modificaciones (por ejemplo, PNGasa F se usa para eliminar las glicosilaciones). La eliminación completa de todas las modificaciones debería dar como resultado una sola banda del peso molecular predicho en el análisis de transferencia Western. Al tratar con productos químicos para eliminar modificadores, es importante incluir también muestras no tratadas en el mismo gel para observar los cambios en el patrón de bandas.

Bandas de menor peso molecular

Pueden observarse bandas de peso molecular más bajo si se generan formas adicionales de la proteína de interés mediante corte y empalme alternativo o escisión de la proteína postraduccionalmente. Se puede utilizar software de análisis de ARN y proteínas para predecir estos eventos, sin embargo, estas modificaciones deberán determinarse empíricamente para cada proteína.

Variantes de empalme

El corte y empalme alternativo de un ARNm puede generar múltiples productos proteicos. Si el epítopo que reconoce el anticuerpo se comparte entre las proteínas, se observarán múltiples bandas.

La proteína se escinde

Podrían observarse bandas de peso molecular más bajo si la proteína se escinde postraduccionalmente. Los anticuerpos policlonales pueden reconocer múltiples bandas de menor peso molecular debido a su capacidad para reconocer múltiples epítopos. Los anticuerpos monoclonales solo reconocerán una banda de los productos de escisión.


Captura de datos

La señal de western blot quimioluminiscente se puede capturar con una película de rayos X, instrumentos de imágenes digitales basados ​​en cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) y fotógrafos de fósforo que detectan la quimioluminiscencia. Aunque la película de rayos X proporciona datos cualitativos y semicuantitativos y es útil para confirmar la presencia de proteínas diana, los instrumentos de imágenes basados ​​en cámaras CCD ofrecen las ventajas de análisis cualitativo, captura y análisis instantáneos de imágenes, mayor sensibilidad, mayor resolución y mayor rango dinámico que la película. Además, no hay necesidad de un espacio de cuarto oscuro dedicado ni de equipos de desarrollo. Los instrumentos de imágenes se pueden colocar directamente en un banco junto con otros equipos de laboratorio.

Cámaras CCD para captura de imágenes quimioluminiscentes

VentajasLimitaciones
Rango dinámico con & gt4 órdenes de magnitudLas exposiciones prolongadas (& gt60 minutos) pueden resultar en un aumento de fondo debido al ruido de la cámara
Los algoritmos inteligentes ayudan a determinar el tiempo de exposición óptimo
Análisis y almacenamiento de imágenes optimizados
Visualización instantánea de resultados
Cuantitativo
Los sistemas iBright Imaging cuentan con una cámara CCD refrigerada de 9.1 MP que proporciona alta sensibilidad y rango dinámico para ayudar a permitir la detección de diferencias sutiles en las muestras.

A menudo, es necesario exponer varias películas durante diferentes períodos de tiempo para obtener el equilibrio adecuado entre la señal y el fondo. El objetivo es cronometrar la exposición de las membranas a la película para que la señal deseada sea claramente visible mientras el fondo permanece bajo. Esto es difícil de lograr ya que el proceso no se puede observar y detener cuando se alcanza el punto final deseado. Si la película no se expone el tiempo suficiente (subexpuesta), la señal no será visible. Si la película se expone demasiado tiempo (sobreexpuesta), la señal puede perderse en el fondo o las bandas separadas pueden volverse borrosas juntas. Además, juzgar el tiempo de exposición óptimo es muy subjetivo, ya que es difícil determinar visualmente el punto preciso en el que se logra el mejor equilibrio entre señal y ruido. A menudo se realizan episodios repetidos de exposición de la película y revelado de la película, lo que puede suponer una inversión considerable de tiempo. Una vez que los datos se capturan en una película, la película a menudo se escanea para hacer una copia digital de los datos, que luego se exporta a un software de análisis para facilitar el análisis adicional, como la densitometría y la estimación del peso molecular.

Uno de los mayores beneficios de los sistemas de imágenes digitales es la capacidad de ajustar el tiempo de exposición (algunos sistemas ofrecen la capacidad de ajustar el tiempo de exposición a la milésima de segundo). Además, muchos sistemas ofrecen una configuración de exposición automática específica que emplea algoritmos que determinan automáticamente el tiempo de exposición óptimo, que no solo captura una imagen con una relación señal-ruido óptima, sino que también ahorra una cantidad considerable de tiempo en comparación con las exposiciones múltiples que a menudo se requieren. con película. Dado que los datos se capturan digitalmente, se pueden exportar fácilmente al software de análisis (eliminando el paso de escaneo con película). Algunos de los sistemas más modernos ofrecen la posibilidad de realizar análisis directamente en el instrumento. Estas comodidades están convirtiendo a las imágenes digitales en un reemplazo popular de la captura de datos basada en películas.


Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

Después de estos pasos de preparación de la muestra, se realiza PAGE para separar las proteínas desnaturalizadas y cargadas negativamente en función de su peso molecular. La separación de las muestras de proteínas dentro de los geles de poliacrilamida se produce debido a la resistencia a la fricción de una proteína cuando migra a través de los poros formados entre las cadenas de polímero dentro del gel (Ornstein, 1964). Los geles de poliacrilamida comprenden monómeros de acrilamida polimerizados junto con monómeros de N, N'-metilenbisacrilamida reticulantes (Raymond & Weintraub, 1959), creando poros de tamaño uniforme, dependiendo tanto de la concentración de monómero como de la relación de reticulante. As an electrical current is passed, proteins move through pores within the gel structure as such, altering the bis-acrylamide concentration regulates pore size and consequently the ability of larger proteins to migrate. Gels with a higher acrylamide concentration (e.g., 20%) impede the movement of larger proteins to a greater degree than those of a smaller molecular weight but better resolve those of lower molecular weights (e.g., 4EBP1

20 kDa) (Chrambach & Rodbard, 1971 ). Similarly, if the desired target is a large protein (e.g., mTOR

289 kDa), a lower concentration gel (e.g., 7.5%) may be required for optimal resolution. Alternatively gradient gels (e.g., 4–12%) provide uniform resolution across the molecular-weight spectrum (Rath et al., 2013 ). Other gel types such as agarose may be used, but are less common as they are predominantly used for very large molecular-weight proteins (e.g., titin isoforms 700–4200 kDa) giving superior separation when compared to polyacrylamide gels (Warren et al., 2003 ). Agarose gels may be hand-cast but require storage at 4°C to prevent drying out. Other hand-cast gels may also require use soon after casting and may vary between runs due to the short shelf life of some chemicals. The choice between commercial and hand-cast gels is generally the preference of the user, but commercial gels are generally more consistent. Ultimately, the concentration of the cross-linking molecules and the molecular weight of the protein(s) of interest are the determining factors for gel choice as taken together these will allow for efficient migration and optimal band resolution. The choice of gel concentration and composition is mainly determined by the molecular weight of the protein(s) of interest, as it will allow efficient migration and optimal band resolution.

Whereas electrophoresis of nucleic acids utilizes a constant pH within the buffer and gel to achieve discernable separation (Westermeier, 2005 ), protein samples require a discontinuous buffer system (Ornstein, 1964 ). Discontinuous systems utilize gels separated into two regions, comprising a “stacking gel” above a “resolving or separating gel” with larger and smaller pores, respectively. Discontinuous systems are designed to focus protein samples and allow clear resolution of proteins. Initially, proteins migrate quickly through the large pore stacking gel until they reach the resolving gel, whereupon the smaller pore size slows migration, causing the proteins to stack together into compact bands (Ornstein, 1964 ). The second principle utilizes the electrophoretic migration of both ions and proteins through a pH-buffered solution. Chloride ions present within the gel have a higher mobility and therefore migrate faster than denatured proteins, establishing a leading ion boundary (Ornstein, 1964 ). Within traditional Tris-HCl stacking gels (pH 6.8), a trailing boundary of glycinate ions form behind migrating proteins due to reduced mobility at a low pH (Walker, 1994 ). Ultimately, migrating proteins are sandwiched between the two ion boundaries, stacking the sample into tightly focused bands, whereupon they migrate into the resolving gel containing smaller pores, slowing the progression of proteins dependent on their size as previously mentioned. Tris-HCl resolving gels are typically formed at pH 8.8 this higher pH allows the ionization of the trailing glycinate, increasing its mobility (Ornstein, 1964 ). Consequently, both chloride and glycinate boundaries will migrate past the protein samples, no longer constricting them into focused bands, allowing the unimpeded separation of proteins. Alternative gels and discontinuous buffer systems are available that may be better suited to the resolution of either larger or smaller molecular-weight proteins depending on sample composition. For example, Bis-Tris systems utilize different buffers containing either 3-(norte-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) or 2-(norte-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), which function as trailing boundary ions instead of glycinate (Hachmann & Amshey, 2005 ). These allow greater resolution of mid-sized (

75 kDa) or smaller (<36 kDa) proteins with MOPS or MES, respectively. Bis-Tris gels are cast at pH 6.8, offering significantly longer shelf life compared with Tris-HCl gels as they do not undergo acrylamide hydrolysis due to their acidic nature. Generally, electrophoresis is undertaken using a constant voltage, rather than a constant current, due to the linear relation of protein migration and voltage. As current is dependent on the voltage and resistance, a constant current will not control protein migration as changes in resistance (i.e., warming of the buffer) will cause the voltage to fluctuate. Depending on the apparatus, electrophoresis is typically performed for 60 min with a constant voltage of 200 V to give a suitable separation of protein lysates however, less time may be required for smaller molecular-weight proteins.


Contenido

The western blot is extensively used in biochemistry for the qualitative detection of single proteins and protein-modifications (such as post-translational modifications). At least 8-9% of all protein-related publications are estimated to apply western blots. [5] It is used as a general method to identify the presence of a specific single protein within a complex mixture of proteins. A semi-quantitative estimation of a protein can be derived from the size and color intensity of a protein band on the blot membrane. In addition, applying a dilution series of a purified protein of known concentrations can be used to allow a more precise estimate of protein concentration. The western blot is routinely used for verification of protein production after cloning. It is also used in medical diagnostics, e.g., in the HIV test or BSE-Test.

The confirmatory HIV test employs a western blot to detect anti-HIV antibody in a human serum sample. Proteins from known HIV-infected cells are separated and blotted on a membrane as above. Then, the serum to be tested is applied in the primary antibody incubation step free antibody is washed away, and a secondary anti-human antibody linked to an enzyme signal is added. The stained bands then indicate the proteins to which the patient's serum contains antibody. [6] A western blot is also used as the definitive test for variant Creutzfeldt-Jakob Disease, a type of prion disease linked to the consumption of contaminated beef from cattle with Bovine spongiform encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow disease'). [7]

Another application is in the diagnosis of tularemia. An evaluation of the western blot's ability to detect antibodies against F. tularensis revealed that its sensitivity is almost 100% and the specificity is 99.6%. [8]

Some forms of Lyme disease testing employ western blotting. [9] A western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis B infection and HSV-2 (Herpes Type 2) infection. [10] [11] In veterinary medicine, a western blot is sometimes used to confirm FIV+ status in cats. [12]

Further applications of the western blot technique include its use by the World Anti-Doping Agency (WADA). Blood doping is the misuse of certain techniques and/or substances to increase one's red blood cell mass, which allows the body to transport more oxygen to muscles and therefore increase stamina and performance. There are three widely known substances or methods used for blood doping, namely, erythropoietin (EPO), synthetic oxygen carriers and blood transfusions. Each is prohibited under WADA's List of Prohibited Substances and Methods. The western blot technique was used during the 2014 FIFA World Cup in the anti-doping campaign for that event. [13] In total, over 1000 samples were collected and analyzed by Reichel, et al. [14] in the WADA accredited Laboratory of Lausanne, Switzerland. Recent research utilizing the western blot technique showed an improved detection of EPO in blood and urine based on novel Velum SAR precast horizontal gels optimized for routine analysis. [15] With the adoption of the horizontal SAR-PAGE in combination with the precast film-supported Velum SAR gels the discriminatory capacity of micro-dose application of rEPO was significantly enhanced.

The western blot method is composed of a gel electrophoresis to separate native proteins by 3-D structure or denatured proteins by the length of the polypeptide, followed by an electrophoretic transfer onto a membrane (mostly PVDF or Nitrocellulose) and an immunostaining procedure to visualize a certain protein on the blot membrane. SDS-PAGE is generally used for the denaturing electrophoretic separation of proteins. SDS is generally used as a buffer (as well as in the gel) in order to give all proteins present a uniform negative charge, since proteins can be positively, negatively, or neutrally charged. This type of electrophoresis is known as SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis). Prior to electrophoresis, protein samples are often boiled to denature the proteins present. This ensures that proteins are separated based on size and prevents proteases (enzymes that break down proteins) from degrading samples. Following electrophoretic separation, the proteins are transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF). The membrane is often then stained with Ponceau S in order to visualize the proteins on the blot and ensure a proper transfer occurred. Next the proteins are blocked with milk (or other blocking agents) to prevent non-specific antibody binding, and then stained with antibodies specific to the target protein. [4] [16] Lastly, the membrane will be stained with a secondary antibody that recognizes the first antibody staining, which can then be used for detection by a variety of methods. The gel electrophoresis step is included in western blot analysis to resolve the issue of the cross-reactivity of antibodies.

Gel electrophoresis Edit

The proteins of the sample are separated using gel electrophoresis. Separation of proteins may be by isoelectric point (pI), molecular weight, electric charge, or a combination of these factors. The nature of the separation depends on the treatment of the sample and the nature of the gel.

By far the most common type of gel electrophoresis employs polyacrylamide gels and buffers loaded with sodium dodecyl sulfate (SDS). SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) maintains polypeptides in a denatured state once they have been treated with strong reducing agents to remove secondary and tertiary structure (e.g. disulfide bonds [S-S] to sulfhydryl groups [SH and SH]) and thus allows separation of proteins by their molecular mass. Sampled proteins become covered in the negatively charged SDS, effectively becoming anionic, and migrate towards the positively charged (higher voltage) anode (usually having a red wire) through the acrylamide mesh of the gel. Smaller proteins migrate faster through this mesh, and the proteins are thus separated according to size (usually measured in kilodaltons, kDa). The concentration of acrylamide determines the resolution of the gel – the greater the acrylamide concentration, the better the resolution of lower molecular weight proteins. The lower the acrylamide concentration, the better the resolution of higher molecular weight proteins. Proteins travel only in one dimension along the gel for most blots.

Samples are loaded into pozos in the gel. One lane is usually reserved for a marcador o escalera, which is a commercially available mixture of proteins of known molecular weights, typically stained so as to form visible, coloured bands. When voltage is applied along the gel, proteins migrate through it at different speeds dependent on their size. These different rates of advancement (different electrophoretic mobilities) separate into bands Dentro de cada carril. Protein bands can then be compared to the ladder bands, allowing estimation of the protein's molecular weight.

It is also possible to use a two-dimensional gel which spreads the proteins from a single sample out in two dimensions. Proteins are separated according to isoelectric point (pH at which they have a neutral net charge) in the first dimension, and according to their molecular weight in the second dimension.

Transfer Edit

To make the proteins accessible to antibody detection, they are moved from within the gel onto a membrane, a solid support, it’s an essential part of the process. There are two types of membrane: nitrocellulose (NC) or polyvinylidene difluoride (PVDF). NC membrane has high affinity for protein and its retention abilities. however, NC is brittle, and does not allow the blot to be used for re-probing. whereas, PVDF membrane allows the blot to be re-probed. [17] The most commonly used method for transferring the proteins is called electroblotting. Electroblotting uses an electric current to pull the negatively charged proteins from the gel towards the positively charged anode, and into the PVDF or NC membrane. The proteins move from within the gel onto the membrane while maintaining the organization they had within the gel. An older method of transfer involves placing a membrane on top of the gel, and a stack of filter papers on top of that. The entire stack is placed in a buffer solution which moves up the paper by capillary action, bringing the proteins with it. In practice this method is not commonly used due to the lengthy procedure time.

As a result of either transfer process, the proteins are exposed on a thin membrane layer for detection. Both varieties of membrane are chosen for their non-specific protein binding properties (i.e. binds all proteins equally well). Protein binding is based upon hydrophobic interactions, as well as charged interactions between the membrane and protein. Nitrocellulose membranes are cheaper than PVDF, but are far more fragile and cannot withstand repeated probings.

Total protein staining Edit

Total protein staining allows the total protein that has been successfully transferred to the membrane to be visualised, allowing the user to check the uniformity of protein transfer and to perform subsequent normalization of the target protein with the actual protein amount per lane. Normalization with the so-called "loading control" was based on immunostaining of housekeeping proteins in the classical procedure, but is heading toward total protein staining recently, due to multiple benefits. [18] At least seven different approaches for total protein staining have been described for western blot normalization: Ponceau S, stain-free techniques, Sypro Ruby, Epicocconone, Coomassie R-350, Amido Black, and Cy5. [18] In order to avoid noise of signal, total protein staining should be performed before blocking of the membrane. Nevertheless, post-antibody stainings have been described as well. [19]

Blocking Edit

Since the membrane has been chosen for its ability to bind protein and as both antibodies and the target are proteins, steps must be taken to prevent the interactions between the membrane and the antibody used for detection of the target protein. Blocking of non-specific binding is achieved by placing the membrane in a dilute solution of protein – typically 3–5% bovine serum albumin (BSA) or non-fat dry milk (both are inexpensive) in tris-buffered saline (TBS) or I-Block, with a minute percentage (0.1%) of detergent such as Tween 20 or Triton X-100. Although non-fat dry milk is preferred due to its availability, an appropriate blocking solution is needed as not all proteins in milk are compatible with all the detection bands. [20] The protein in the dilute solution attaches to the membrane in all places where the target proteins have not attached. Thus, when the antibody is added, it cannot bind to the membrane, and therefore the only available binding site is the specific target protein. This reduces background in the final product of the western blot, leading to clearer results, and eliminates false positives.

Incubation Edit

During the detection process the membrane is "probed" for the protein of interest with a modified antibody which is linked to a reporter enzyme when exposed to an appropriate substrate, this enzyme drives a colorimetric reaction and produces a color. For a variety of reasons, this traditionally takes place in a two-step process, although there are now one-step detection methods available for certain applications.

Primary antibody Edit

The primary antibodies are generated when a host species or immune cell culture is exposed to the protein of interest (or a part thereof). Normally, this is part of the immune response, whereas here they are harvested and used as sensitive and specific detection tools that bind the protein directly.

After blocking, a solution of primary antibody (generally between 0.5 and 5 micrograms/mL) diluted in either PBS or TBST wash buffer is incubated with the membrane under gentle agitation for typically an hour at room temperature, or overnight at 4°C. The antibody solution is incubated with the membrane for anywhere from 30 minutes to overnight. It can also be incubated at different temperatures, with lesser temperatures being associated with more binding, both specific (to the target protein, the "signal") and non-specific ("noise"). Following incubation, the membrane is washed several times in wash buffer to remove unbound primary antibody, and thereby minimize background. [20] Typically, the wash buffer solution is composed of buffered saline solution with a small percentage of detergent, and sometimes with powdered milk or BSA.

Secondary antibody Edit

After rinsing the membrane to remove unbound primary antibody, the membrane is exposed to another antibody known as the secondary antibody. Antibodies come from animal sources (or animal sourced hybridoma cultures). The secondary antibody recognises and binds to the species-specific portion of the primary antibody. Therefore, an anti-mouse secondary antibody will bind to almost any mouse-sourced primary antibody, and can be referred to as an 'anti-species' antibody (e.g. anti-mouse, anti-goat etc.). To allow detection of the target protein, the secondary antibody is commonly linked to biotin or a reporter enzyme such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. This means that several secondary antibodies will bind to one primary antibody and enhance the signal, allowing the detection of proteins of a much lower concentration than would be visible by SDS-PAGE alone.

Horseradish peroxidase (HRP) is commonly linked to secondary antibodies to allow the detection of the target protein by chemiluminescence. The chemiluminscent substrate is cleaved by HRP, resulting in the production of luminescence. Therefore, the production of luminescence is proportional to the amount of HRP-conjugated secondary antibody, and therefore, indirectly measures the presence of the target protein. A sensitive sheet of photographic film is placed against the membrane, and exposure to the light from the reaction creates an image of the antibodies bound to the blot. A cheaper but less sensitive approach utilizes a 4-chloronaphthol stain with 1% hydrogen peroxide the reaction of peroxide radicals with 4-chloronaphthol produces a dark purple stain that can be photographed without using specialized photographic film.

As with the ELISPOT and ELISA procedures, the enzyme can be provided with a substrate molecule that will be converted by the enzyme to a colored reaction product that will be visible on the membrane (see the figure below with blue bands).

Another method of secondary antibody detection utilizes a near-infrared (NIR) fluorophore-linked antibody. The light produced from the excitation of a fluorescent dye is static, making fluorescent detection a more precise and accurate measure of the difference in the signal produced by labeled antibodies bound to proteins on a western blot. Proteins can be accurately quantified because the signal generated by the different amounts of proteins on the membranes is measured in a static state, as compared to chemiluminescence, in which light is measured in a dynamic state. [21]

A third alternative is to use a radioactive label rather than an enzyme coupled to the secondary antibody, such as labeling an antibody-binding protein like Estafilococo Protein A or Streptavidin with a radioactive isotope of iodine. Since other methods are safer, quicker, and cheaper, this method is now rarely used however, an advantage of this approach is the sensitivity of auto-radiography-based imaging, which enables highly accurate protein quantification when combined with optical software (e.g. Optiquant).

One step Edit

Historically, the probing process was performed in two steps because of the relative ease of producing primary and secondary antibodies in separate processes. This gives researchers and corporations huge advantages in terms of flexibility, reduction of cost, and adds an amplification step to the detection process. Given the advent of high-throughput protein analysis and lower limits of detection, however, there has been interest in developing one-step probing systems that would allow the process to occur faster and with fewer consumables. This requires a probe antibody which both recognizes the protein of interest and contains a detectable label, probes which are often available for known protein tags. The primary probe is incubated with the membrane in a manner similar to that for the primary antibody in a two-step process, and then is ready for direct detection after a series of wash steps.

Detection and visualization Edit

After the unbound probes are washed away, the western blot is ready for detection of the probes that are labeled and bound to the protein of interest. In practical terms, not all westerns reveal protein only at one band in a membrane. Size approximations are taken by comparing the stained bands to that of the marker or ladder loaded during electrophoresis. The process is commonly repeated for a structural protein, such as actin or tubulin, that should not change between samples. The amount of target protein is normalized to the structural protein to control between groups. A superior strategy is the normalization to the total protein visualized with trichloroethanol [22] [23] or epicocconone. [24] This practice ensures correction for the amount of total protein on the membrane in case of errors or incomplete transfers. (see western blot normalization)

Colorimetric detection Edit

The colorimetric detection method depends on incubation of the western blot with a substrate that reacts with the reporter enzyme (such as peroxidase) that is bound to the secondary antibody. This converts the soluble dye into an insoluble form of a different color that precipitates next to the enzyme and thereby stains the membrane. Development of the blot is then stopped by washing away the soluble dye. Protein levels are evaluated through densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry.

Chemiluminescent detection Edit

Chemiluminescent detection methods depend on incubation of the western blot with a substrate that will luminesce when exposed to the reporter on the secondary antibody. The light is then detected by CCD cameras which capture a digital image of the western blot or photographic film. The use of film for western blot detection is slowly disappearing because of non linearity of the image (non accurate quantification). The image is analysed by densitometry, which evaluates the relative amount of protein staining and quantifies the results in terms of optical density. Newer software allows further data analysis such as molecular weight analysis if appropriate standards are used.

Radioactive detection Edit

Radioactive labels do not require enzyme substrates, but rather, allow the placement of medical X-ray film directly against the western blot, which develops as it is exposed to the label and creates dark regions which correspond to the protein bands of interest (see image above). The importance of radioactive detections methods is declining due to its hazardous radiation [ cita necesaria ] , because it is very expensive, health and safety risks are high, and ECL (enhanced chemiluminescence) provides a useful alternative.

Fluorescent detection Edit

The fluorescently labeled probe is excited by light and the emission of the excitation is then detected by a photosensor such as a CCD camera equipped with appropriate emission filters which captures a digital image of the western blot and allows further data analysis such as molecular weight analysis and a quantitative western blot analysis. Fluorescence is considered to be one of the best methods for quantification but is less sensitive than chemiluminescence. [25]

Secondary probing Edit

One major difference between nitrocellulose and PVDF membranes relates to the ability of each to support "stripping" antibodies off and reusing the membrane for subsequent antibody probes. While there are well-established protocols available for stripping nitrocellulose membranes, the sturdier PVDF allows for easier stripping, and for more reuse before background noise limits experiments. Another difference is that, unlike nitrocellulose, PVDF must be soaked in 95% ethanol, isopropanol or methanol before use. PVDF membranes also tend to be thicker and more resistant to damage during use.


Opciones de acceso

Obtenga acceso completo a la revista durante 1 año

Todos los precios son precios NETOS.
El IVA se agregará más adelante en el proceso de pago.
El cálculo de impuestos se finalizará durante el pago.

Obtenga acceso completo o por tiempo limitado al artículo en ReadCube.

Todos los precios son precios NETOS.


Información adicional

Conflicto de intereses

The authors have no competing interests to declare.

Contribuciones de los autores

EZ performed the proteomic analysis and contributed to its design, the 2-DE and gel image analysis, and the statistical analysis on the proteomic data, and drafted the manuscript. AM contributed to the overall experimental design of the proteomic analysis and to the preparation of the manuscript. ST and MP performed the LC-MS/MS analyses and identified the relevant spots MP and ART ran the Western blot analyses. SY and CG conceived the overall experimental design, and managed the chicken growth and sampling phases. MC generally coordinated the study, contributed to the proteomic experiment design, and was involved in fund raising and manuscript preparation. All authors have read and approved the final manuscript.