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Selección de hospedante recombinante por método de selección de color

Selección de hospedante recombinante por método de selección de color


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En tecnología de ADN recombinante, para seleccionar un huésped recombinante de los no recombinantes, tenemos diferentes tipos de técnicas disponibles.

Del que estoy hablando es del selección de color método con el uso de 2 marcadores (un gen resistente a antibióticos por ej. Ampicilinay el otro gen Z). Usamos el gen Z como gen informador. Aquí utilizamos E. coli sin vectores como célula huésped.

Ahora, cuando agregamos ampicilina a la placa de Petri que contiene todas las variantes (transformantes y no transformantes), el los no transformantes morirán. Los transformantes sobreviven.

Ahora, agregamos X-gal a la réplica de esta placa de Petri, y vemos que algunas de las colonias se vuelven azules debido a la acción de la enzima β-galactosidasa, que a su vez es producida por el gen Z intacto en el plásmido. Eso significa que nuestras colonias azules son las no recombinantes.

Mi pregunta es-

El medio que se toma en la placa de Petri también debe contener glucosa, ¿no es así? De lo contrario, los recombinantes también darían la reacción de color (X-gal es un homólogo de lactosa) debido al gen Z presente en su ADN cromosómico (concepto de operón).

La pregunta puede ser tonta, ya que es obvio que tenemos que suplir las necesidades básicas para el crecimiento de bacterias (que obviamente es la glucosa).

¡Solo quería confirmarlo en caso de que no tengamos glucosa disponible! = p


El gen Z del que estás hablando debería ser lacZ que codifica la $ beta- $ galactosidasa, que está hecha de los péptidos $ alpha $ y $ omega $. Ninguno de los péptidos es funcional por sí mismo.

La $ beta- $ galactosidasa escindirá el enlace glicosídico en X-gal y formará galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol. El último producto luego se dimeriza y oxida a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo, un producto azul intenso que es fácil de identificar y cuantificar.

A continuación, debe verificar el genotipo de su cepa bacteriana porque generalmente solo tienen el péptido $ omega $ codificado en su genoma. Por lo tanto, la actividad enzimática de la $ beta- $ galactosidasa solo se recupera cuando el péptido $ alpha $ está en el medio ambiente, y el proceso se denomina $ alpha $ -complementación.

Dos cepas de uso común para clonación y expresión en E. coli son Dh5 $ alpha $ y TOP10.

El genotipo de Dh5a es así:

F- Φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK-, mK +) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1

Aquí, lacZΔM15 indica que el segmento M15 se pierde de lacZ, y la proteína mutante solo tendrá el péptido $ omega $.

El genotipo de TOP10 es así:

F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ (ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

De nuevo, te darás cuenta lacZΔM15, que sigue siendo un segmento peptídico no funcional después de todo.

Finalmente, a tu pregunta. Incluso si no hay glucosa como fuente de energía primaria en el medio y solo está presente X-gal, el operón de la bacteria huésped (supongo que es E. coli) no puede producir la $ beta- $ galactosidasa funcional por sí sola. Además, los recombinantes, con la secuencia del vector que codifica el péptido $ alpha $ alterado, no presentarán complementación $ alpha $. ¡Entonces no hay reacción de color! :D

Referencia:
1.Genotipos de células competentes Invitrogen ™ - TOP10, recuperado de: https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cloning/competent-cells-for-transformation/chemically-competent/top10f-genotypes.html.
2.Genotipos de células competentes Invitrogen ™ - DH5a, recuperado de: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/competent-cells-for-transformation/chemically-competent/dh5alpha-genotypes.html.
3. Langley, K. E .; Villarejo, M. R .; Fowler, A. V .; Zamenhof, P. J .; Zabin, I. (1975). "Bases moleculares de la complementación alfa de beta-galactosidasa". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 72 (4): 1254-1257. doi: 10.1073 / pnas.72.4.1254. PMC 432510 De libre acceso. PMID 1093175. 4.


Identificación de recombinantes y método de inactivación de selección por inserción

Después de la introducción de rDNA en células huésped adecuadas, es esencial identificar aquellas células que han recibido las moléculas de rDNA. Este proceso se denomina cribado o selección.

Generalmente, los métodos de selección se basan en la expresión o no expresión de ciertos rasgos como la resistencia a los antibióticos, la expresión de una enzima como la β-galactosidasa o una proteína como la GFP (Green Fluorescent Protein) y la dependencia o independencia de un requerimiento nutricional como como el aminoácido leucina.

SELECCIÓN DIRECTA DE RECOMBINANTES:

Si las células de E. coli del huésped han absorbido el plásmido pBR322, estas células crecerán en un medio que contenga el antibiótico ampicilina o tetraciclina, mientras que las células normales de E. coli serán destruidas por los antibióticos. Por tanto, sólo se seleccionarán células transformadas, aunque sean pocas, para crecimiento y división.

MÉTODO DE INACTIVACIÓN DE SELECCIÓN INSERCIONAL:

Este es un método más eficaz que la selección directa. En este enfoque, uno de los rasgos genéticos se interrumpe insertando ADN extraño.

Los genes de resistencia a los antibióticos actúan como un buen sistema de inactivación por inserción.

El plásmido pBR322 contiene dos genes de resistencia a antibióticos, uno para ampicilina (gen amp r) y el otro para tetraciclina (gen tet r). Si el ADN diana se inserta en el gen tet r utilizando Bam HI, se perderá la propiedad de resistencia a la tetraciclina. Tales recombinantes serían sensibles a las pruebas.

Cuando dichos recombinantes (que contienen ADN diana en el gen tet r) se cultivan en un medio que contiene tetraciclina, no crecerán porque su gen tet r ha sido inactivado. Pero son resistentes a la ampicilina porque el gen amp r es funcional.

Por otro lado, los recombinantes autoligados mostrarán resistencia a ampicilina y tetraciclina. Por lo tanto, crecerán en un medio que contenga ambos antibióticos.

MÉTODO DE SELECCIÓN AZUL-BLANCO:

Otro método poderoso de cribado de la presencia de plásmido recombinante se denomina selección azul-blanca.

Este método se basa en la inactivación por inserción del gen lac-Z presente en el vector (por ejemplo, PUC19).

Este gen expresa la enzima β-galactosidasa cuya actividad puede escindir un sustrato incoloro llamado X-gal en un producto de color azul.

Si el gen lac-Z se inactiva debido a la presencia del inserto, las enzimas no se expresan. Por lo tanto, si después de un experimento de transformación, las células hospedadoras de E. coli se colocan en una placa de medio sólido que contiene ampicilina y X-gal, las colonias que aparecen en azul son aquellas que tienen células transformadas (resistentes a los antibióticos) pero que no tienen el inserto (expresan activo enzima).

Las colonias que aparecen de color blanco son resistentes a la ampicilina y tienen el inserto de ADNr y, por lo tanto, son las células que se utilizarán para experimentos futuros.


Los 3 métodos principales de formación de ADN recombinante

La enzima de restricción que causa una ruptura en el ADN extraño también causa un corte escalonado en el ADN del vector en un sitio de escisión específico. Los extremos cohesivos del ADN del vector poseen las secuencias de nucleótidos complementarias a los extremos cohesivos del ADN extraño. Esto se puede ilustrar usando un ejemplo de la enzima Eco RI, se producirán extremos pegajosos similares que tienen las mismas secuencias de bases en los extremos monocatenarios.

Cuando los dos extremos del ADN del vector se encuentran con los extremos complementarios del ADN extraño, los dos se mantendrán mediante enlaces H. Este proceso en el que dos cadenas separadas de ácido nucleico interactúan para formar una molécula dúplex mediante la interacción entre pares de bases complementarios presentes en las cadenas individuales se denomina a menudo hibridación (figura 24.9).

El fragmento de ADN extraño con extremos no pegajosos primero se hace estridente mediante la adición de una cola de homopolímero al extremo hidroxilo 3 & # 8242. La cola de homopolímero es esencialmente una secuencia de unos pocos nucleótidos similares, por ejemplo, poli A (AAAAA & # 8230 & # 8230.) O poli T (TTTTT & # 8230 ..).

Ahora, las secuencias de nucleótidos complementarias del fragmento de ADN y las del vector se unen covalentemente con la ayuda de la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (figuras 24.10 y 24.11).

La enzima ADN ligasa sella y estabiliza los extremos cortados de dos moléculas de ADN catalizando enlaces fosfodiéster entre el fosfato 3 & # 82170 H y el fosfato 5 & # 8242 de dos nucleótidos adyacentes. La principal ventaja de esta técnica es que el segmento de ADN extraño puede recuperarse fácilmente de las copias clonadas de ADN quimérico volviendo a extraer utilizando la misma enzima.

Al mismo tiempo, existen dos desventajas de esta técnica:

(i) Los dos extremos del ADN del vector escindido o del ADN extraño pueden unirse de un extremo a otro y pueden volver a circularizarse antes de la inserción,

(ii) El sitio de reconocimiento, particularmente en el segmento que se va a clonar, puede no encontrarse en una posición conveniente. En este proceso, el inserto puede contener un marcador seleccionable que permite la identificación de moléculas recombinantes. A menudo se usa un marcador antibiótico. Entonces, una célula huésped sin un vector muere cuando se expone a ciertos antibióticos y el huésped con el vector vivirá porque es resistente.

La transformación de Escherichia coli con fragmentos relativamente grandes de ADN quimérico se puede facilitar tratando las células con CaCl.2 a baja temperatura para hacerlos permeables. Con este procedimiento, el ADN transformante ingresa intacto a la célula y la bacteria huésped permanece viable. La entrada de rDNA en E. coli también se facilita elevando repentinamente la temperatura a 42 ° C durante 2-5 minutos.

A esta temperatura, la membrana celular de E. coli se vuelve permeable a las macromoléculas. Ahora se han desarrollado cepas de coli que son permeables a las macromoléculas. Luego, durante el crecimiento de la célula de E. coli transformada, el ADN recombinante del plásmido se replica.

La célula bacteriana contiene varios plásmidos y algunos de ellos son de tipo recombinante y los otros solo los vehículos plásmidos. En tales casos, puede que no sea fácil determinar si un clon de una célula de E. coli transformada lleva una molécula de ADN recombinante o simplemente el vehículo plasmídico.

La selección y el aislamiento del hospedador transformado depende de su resistencia a los antibióticos, al cambio de color o algunas otras características. Los diferentes vectores tienen diferentes propiedades para que sean adecuados para diferentes aplicaciones. Algunas propiedades pueden incluir sitios de clonación simétricos, tamaño y alto número de copias.

Para la selección de células transformadas sobre la base de su resistencia a los antibióticos, es importante incubar las células en un medio sin antibiótico durante aproximadamente una hora para permitir que se expresen los genes resistentes a los antibióticos del plásmido.

A continuación, las células se pueden colocar en un medio sólido que contiene antibiótico para la selección de colonias con ADN recombinante. Los plásmidos que poseen un marcador de resistencia a antibióticos formarán una colonia y los que no tengan un marcador de resistencia se matarán. Este procedimiento para detectar la inserción se denomina inactivación intencional.

En la cepa pBR-322, hay dos marcadores antibióticos diferentes: el gen tet-r responsable de la resistencia a la tetraciclina y el gen amp-r para la resistencia a la ampicilina. Uno de los dos genes se inactiva durante la escisión de la enzima de restricción y la inserción de ADN extraño. Ahora bien, si las células se colocan en placas en un medio que contiene ampicilina, todas las colonias supervivientes deben ser resistentes a amp-r.

Formación de ADN recombinante: Método n. ° 2. Introducción o transfección de fagos:

La introducción de fagos es el proceso de transfección que es equivalente a la transformación, excepto que se usa un fago en lugar de un plásmido bacteriano. En el empaquetamiento in vitro, un vector usa fagos lambda o M 13 para producir placas de fagos que contienen ADN recombinante. El ADN recombinante se puede identificar usando varios métodos de selección. Por primera vez, se utilizó un bacteriófago para transferir el ADN extraño a las células de E. coli.

Si el vector es bacteriófago, su replicación en el hospedador bacteriano daría como resultado partículas de fago, cada una con una copia idéntica del gen diana. Cuando se utilizan vectores de fagos, una población de células se infecta con los virus y la replicación del virus procede espontáneamente.

Finalmente, el ADN del fago que contiene el gen diana se inserta en el cromosoma bacteriano donde se replicará como si fuera parte del cromosoma normal. Por tanto, estos vectores junto con los genes diana se introducen en un huésped bacteriano. Esto generalmente se logra con la enzima ADN ligasa. Es importante para la ligación que el ADN del vector y el ADN diana hayan sido cortados por la misma endonucleasa de restricción.

Formación de ADN recombinante: Método n. ° 3. Transformación no bacteriana:

Este proceso es similar a la transformación. La única diferencia entre los dos es que la transformación no bacteriana no utiliza bacterias como E. coli como huésped. En la microinyección, el fragmento de ADN se inyecta directamente en el núcleo de la célula. transformado.

En biolística, las células huésped se bombardean con pistolas de microproyectiles de alta velocidad, como partículas de oro o tungsteno que se han recubierto con ADN (fig. 24.12).


Resultados

El sistema de selección

Para seleccionar la expresión, fusionamos la proteína de membrana dirigida a un marcador seleccionable terminal C & # x02013 que confiere un fenotipo de resistencia al fármaco, de modo que mientras el extremo C-terminal esté en el citoplasma, el crecimiento en medios selectivos indica la expresión de la proteína de membrana diana. Como puede haber muchas formas de que las mutaciones proporcionen resistencia a los medicamentos que no tienen nada que ver con la expresión de la proteína de membrana fusionada, empleamos una estrategia de selección dual en la que la misma proteína de membrana diana se fusiona con uno de los dos marcadores de resistencia a los medicamentos en dos plásmidos separados. La probabilidad de obtener mutaciones que confieran resistencia a ambos fármacos sin incrementar la expresión de proteínas de membrana debería ser extremadamente baja. Los dos plásmidos de selección, denominados pSEL1 y pSEL2, se ilustran en la Figura 1 (A).

Plásmidos del sistema de selección. A: La secuencia codificante de la proteína de la membrana diana se fusiona con dos marcadores seleccionables diferentes en dos plásmidos compatibles, llamados pSEL1 y pSEL2. Ambos plásmidos utilizan la PMALO promotor. El plásmido pSEL1 tiene un origen de replicación p15A y emplea dihidrofolato reductasa de ratón (mDHFR) como marcador seleccionable, que confiere resistencia a trimetoprim. El plásmido pSEL2 tiene resistencia a la kanamicina (KanRes) como marcador seleccionable y tiene un origen de replicación colE1. B: Los dos plásmidos utilizados para seleccionar mutantes mejorados se eliminan mediante en vivo digestión con la endonucleasa autodirigida de corte raro I-CreI. pSEL1 y pSEL2 contienen el sitio de corte I-CreI de 22 pb. I-CreI está codificado en un plásmido pSC101 con resistencia a tetraciclina y un origen de replicación sensible a la temperatura, y esta construcción se denomina pCURE.

Inicialmente probamos el sistema comparando el crecimiento en medios selectivos de células que producen una proteína de membrana bien expresada (GlpF) y aquellas que expresan una proteína de membrana mal expresada (SPP). Como se muestra en la Figura 2, las células que albergan GlpF en pSEL1 y pSEL2 y las que albergan SPP en pSEL1 y pSEL2 sobrevivieron en medio de inducción sin fármacos, lo que indica que la inducción de ninguna de las proteínas es letal para las células. En presencia de la selección de fármacos sin inducción, ninguno de los constructos permitió la supervivencia. En condiciones de inducción y en presencia de selección, solo sobrevivieron las células que expresaban las fusiones GlpF. Por lo tanto, nuestro sistema de selección discriminó de manera efectiva y limpia entre las células que expresan altos niveles de proteína de la membrana diana y las que expresan poca o ninguna proteína.

Efectividad de la selección. Células TOP10 que producen una proteína de membrana bien expresada, el facilitador de glicerol GlpF de E. coli, en pSEL1 y pSEL2 se compararon con células que expresan la proteína de membrana pobremente expresada, péptido señal peptidasa (SPP) de Archaeoglobus fulgidus, en pSEL1 y pSEL2. Solo las células que expresan GlpF pueden sobrevivir en presencia de un fármaco de selección.

Curado de mutantes seleccionados

Después de la selección de mutantes, es necesario eliminar los plásmidos del sistema de selección, pSEL1 y pSEL2, de las cepas. Sin embargo, descubrimos que los métodos de curado tradicionales eran muy ineficaces cuando se aplicaban a nuestras cepas y plásmidos. Por lo tanto, desarrollamos un método de curado rápido y eficiente para este trabajo.

En nuestro método de curado, los plásmidos utilizados durante la selección son eliminados por en vivo digestión con una endonucleasa de corte rara, la endonucleasa autodirigida I-CreI. 16 Como se muestra en la Figura 1 (A), el sitio de reconocimiento para I-CreI se introdujo en pSEL1 y pSEL2. Para eliminar los plásmidos de selección, introducimos un tercer plásmido llamado pCURE, que codifica la endonucleasa I-CreI y contiene un origen de replicación sensible a la temperatura [Fig. 1 (B)]. El I-CreI expresado a partir de pCURE digiere los dos plásmidos pSEL, y pCURE se elimina posteriormente por crecimiento a una temperatura elevada. Con este método, las cepas se pueden curar de manera confiable en solo 2 días.

Selección de cepas que mejoran la expresión de romboide-Rv1337

Con un sistema de selección eficaz y un sistema de curado altamente eficiente, probamos nuestra capacidad para aislar E. coli mutantes que mejoran la expresión de proteínas de membrana. Apuntamos a la proteína de membrana interna de hélice alfa MTb Rv1337, una proteína de la familia romboide, porque es una proteína relativamente grande conocida por trabajos anteriores que se expresa en niveles bajos detectables por transferencia Western. Además, romboide-Rv1337 tiene un C-terminal citoplásmico, que es necesario para la selección con las fusiones de marcadores seleccionables C-terminales utilizadas en pSEL1 y pSEL2. La expresión de Rv1337 parece ser tóxica para las células porque el crecimiento celular se reduce drásticamente después de la inducción.

La selección se realizó en dos pasos. Primero, las células TOP10 que albergan pSEL1 que codifica romboide-Rv1337 se mutagenizaron con el análogo de base 2-aminopurina (2AP) o el gen mutador mutD5, y se seleccionaron las colonias por su capacidad para crecer en medios que contenían el fármaco trimetoprima. En el segundo paso, las colonias resistentes a trimetoprim se combinaron y transformaron con la construcción pSEL2 que codifica romboide-Rv1337. Las células, que ahora albergan dos construcciones de plásmido, se seleccionaron luego en medios que contenían tanto trimetoprima como kanamicina. La ventaja de este procedimiento de dos pasos es que se puede plaquear un gran número de células mutagenizadas en el primer paso sin perder mutantes debido a la baja eficiencia de la transformación del plásmido. El conjunto enriquecido se puede seleccionar en el segundo paso para aislar las células que realmente sobreviven debido a la expresión de la proteína de la membrana diana. Aproximadamente 1 de cada 10,000 células mutagenizadas sobrevivieron a la primera selección de trimetoprima (100 & # x02013200 & # x003bcg / mL), mientras que aproximadamente 1 de cada 1000 de las colonias seleccionadas con trimetoprima sobrevivieron al segundo paso y pudieron crecer tanto con kanamicina (10 & # x0201380 & # x003bcg / mL) y trimetoprima (100 & # x02013200 & # x003bcg / mL).

Examinamos 47 colonias seleccionadas y, en base a la transferencia de Western, 17 demostraron una mayor expresión de romboide-Rv1337. Elegimos cinco clones, todos de cultivos mutagenizados de forma independiente, que mostraron el mayor aumento en la producción de proteínas, y los curamos de los plásmidos de selección utilizando el método descrito anteriormente. Nos referimos a estas cepas como EXP-Rv1337-1, EXP-Rv1337-2, EXP-Rv1337-3, EXP-Rv1337-4 y EXP-Rv1337-5.

Para validar los resultados de la expresión, volvimos a transformar los mutantes curados con pSEL1 y pSEL2 que codifican romboide-Rv1337. El aumento de expresión en los cinco mutantes seleccionados, curados y retransformados se muestra en la Figura 3. El examen cualitativo de la transferencia de Western que se muestra en la Figura 3 (A) muestra una clara mejora de la producción de proteína de membrana dirigida. Este aumento se cuantificó comparándolo con las intensidades de cantidades conocidas de una proteína estándar añadida a los carriles. Como se muestra en la Figura 3 (B), las cepas seleccionadas mejoraron la expresión de las fusiones romboide-Rv1337 hasta 75 veces.

Aumento de la expresión de MTb romboide-Rv1337 en cinco mutantes EXP seleccionados. A: Un western blot que usa un anticuerpo específico para la etiqueta N-terminal 6 & # x000d7His de la proteína de membrana romboide-Rv1337 expresada en pSEL1 y pSEL2 en la cepa de tipo salvaje y en 5 cepas mutantes EXP. La expresión de pSEL1 es generalmente menor que la de pSEL2 porque tiene un número de copia menor. Las muestras se normalizaron en función de la DO600. También se cargó un estándar de concentración de proteína (una serie de diluciones dobles de 1000 ng a 3,9 ng de biotina ligasa purificada marcada con 6 & # x000d7His) en cada gel para cuantificar el aumento de expresión. B: El aumento de veces en la expresión de romboide-Rv1337 en pSEL1 y pSEL2. El aumento de veces se determinó por densitometría y comparación con el estándar de concentración de proteína. Para todos los histogramas, el aumento de veces se promedia en tres ensayos y se informa la desviación estándar.

Expresión sin fusión a un marcador seleccionable

Como nuestro sistema de selección general requiere la unión de la proteína objetivo a un compañero de fusión, queríamos probar si las mutaciones eran efectivas cuando la proteína se expresaba sin una proteína marcadora adjunta. La Figura 4 muestra la expresión de romboide-Rv1337 con o sin fusiones a marcadores seleccionables. Para el tipo salvaje y todas las cepas mutantes, los niveles de expresión con la fusión fueron claramente más bajos que la expresión sin la fusión (ver Fig. 4). No obstante, las cepas EXP mejoraron la expresión de romboide-Rv1337 en comparación con el tipo salvaje, ya sea que estén fusionadas a una proteína marcadora o no.

Rendimiento de expresión sin fusión a un marcador seleccionable. El romboide-Rv1337 se expresó como una fusión en pSEL1 y pSEL2 o sin una fusión en pBAD / HisA y pBAD / HisA / p15A. Las unidades de masa relativa (RMU) son las cantidades de proteína de membrana expresadas en relación con el tipo salvaje, que se establece arbitrariamente en 1,0. Las RMU se determinaron mediante análisis de transferencias de Western que se dirigían a la etiqueta N-terminal 6 & # x000d7His de romboide-Rv1337 y comparación con el estándar de concentración de proteína.

Rendimiento de cepas seleccionadas con un promotor T7

Estábamos interesados ​​en ver si los efectos mutantes eran específicos del sistema promotor de arabinosa que usamos en nuestro proceso de selección o si eran más generalmente efectivos. Por ejemplo, se encontró que los efectos C41 y C43 eran específicos del promotor T7. 7 Por lo tanto, lisogenizamos todas las cepas con & # x003bbDE3 para introducir la ARN polimerasa de T7 y probamos la eficacia de los mutantes en un sistema promotor de T7. Como se muestra en la Figura 5, todos los mutantes mejoraron la expresión de Rv1337 detrás del promotor T7 hasta cuatro veces. Por tanto, la expresión mejorada observada en los mutantes no es completamente específica de ningún tipo de promotor, aunque EXP-Rv1337-5 parece más eficaz para la expresión de un promotor de arabinosa.

Expresión con el promotor T7. Se ensayó la capacidad de las cepas para expresar romboide-Rv1337 fusionado a la resistencia a la kanamicina usando el promotor T7. Se introdujo polimerasa T7 en la cepa de tipo salvaje y cada uno de los mutantes mediante lisogenización con & # x003bb-DE3. El aumento de veces en la expresión se determinó mediante análisis de transferencias Western que se dirigían a la etiqueta 6 & # x000d7His N-terminal de cada proteína de membrana y el estándar de concentración de proteína.

Los mutantes EXP entregan proteína a la membrana

Esperábamos que el método de selección seleccionaría indirectamente para la inserción en la membrana en lugar de los cuerpos de inclusión, ya que el compañero de fusión debe estar plegado y activo para conferir resistencia al fármaco. Para evaluar si el aumento de expresión en los mutantes se correspondía con el aumento de expresión en la membrana, realizamos una centrifugación diferencial. Las fracciones insolubles, solubles y de membrana de cada muestra se aislaron y posteriormente se analizaron mediante transferencia Western. Durante la purificación también se incluyeron proteínas marcadoras para las distintas fracciones: (1) estreptavidina, que se encuentra en los cuerpos de inclusión, (2) proteína de unión a maltosa (MBP), que permanece soluble, y (3) GlpF, una proteína dirigida a la membrana. Los resultados se muestran en la Figura 6. En la cepa de tipo salvaje, el romboide-Rv1337 se expresó casi completamente en la membrana, con una pequeña cantidad de proteína detectada en la fracción insoluble. Sin embargo, en todas las cepas mutantes, el romboide-Rv1337 parecía expresarse exclusivamente en la membrana sin ningún componente detectable en la fracción insoluble. Los mutantes EXP, por lo tanto, conducen a la inserción de la proteína en la membrana en lugar de derivar la proteína a los cuerpos de inclusión y, de hecho, la inserción parece mejorar en los mutantes seleccionados.

Análisis de expresión de membranas. Se realizó el fraccionamiento de las cepas de tipo salvaje y mutantes que expresan Rv1337 en pSEL1 y pSEL2. Para evaluar la efectividad del fraccionamiento, los cultivos se enriquecieron antes de la lisis con células que expresan una proteína de membrana (E. coli GlpF), una proteína soluble (MBP) o una proteína dirigida a los cuerpos de inclusión (estreptavidina). Las fracciones insolubles (IB), solubles (Sol) y de membrana (MF) de cada muestra se analizaron mediante transferencia Western que se dirigía a la etiqueta 6 & # x000d7His de cada proteína. [La figura en color se puede ver en la edición en línea, que está disponible en www.interscience.wiley.com.]:

Aplicación de mutantes seleccionados a otros objetivos de proteínas de membrana

Aunque seleccionamos para mejorar la expresión de romboide-Rv1337, es posible que las cepas aisladas pudieran mejorar la expresión de otras proteínas de membrana. Para probar esta posibilidad, expresamos otras dianas de MTb y una serie de construcciones romboides de varias especies en las cepas mutantes de tipo salvaje y EXP (Tabla I). Con la excepción de Rv2835, todos estos objetivos parecen ser tóxicos para las células basándose en la observación de que el crecimiento celular se redujo drásticamente después de la inducción. Como se muestra en la Figura 7, la expresión de estos objetivos podría mejorarse en uno o más de los mutantes seleccionados. EXP-Rv1337-5 es particularmente eficaz para M. jannaschii romboidal, D. melangaster romboide y MTb Rv2835, mejorando la expresión aproximadamente 10, 20 y 90 veces, respectivamente.

Tabla I

La proteína de membrana se dirige a la expresión probada en mutantes EXP

ObjetivoNúmero de GIOrganismoFunción putativaMETROW (kDa)# TM hélices
Rv133715,608,477M. tuberculosisProteína de la familia romboide25.86
RV274615,609,883M. tuberculosisPGP sintasa22.14
RV283515,609,972M. tuberculosisTransportador ABC34.16
Rv011015,607,252M. tuberculosisProteína de la familia romboide26.97
MJR15,669,882M. jannashiiProteína de la familia romboide21.36
Rho 124,655,197D. melanogasterProteína de la familia romboide39.37

Aumento de la expresión de otras dianas proteicas de membrana. Se ensayó la expresión de diversas dianas de proteínas de membrana en los mutantes EXP seleccionados usando romboide-Rv1337. El aumento de veces en la expresión se determinó mediante análisis de transferencias de Western que se dirigen a la etiqueta 6 & # x000d7His N-terminal de cada proteína de membrana y el estándar de concentración de proteína. los Tuberculosis micobacteriana (MTb) dianas Rv2746 y Rv2835 se expresaron como fusiones a la resistencia a kanamicina en pSEL2. Se expresó una segunda proteasa romboide de MTb (Rv0110) sin fusión. Proteasas romboides de Methanococcus jannaschii (MJR) y Drosophila melanogaster (Rho 1) se expresaron con una fusión N-terminal a SUMO. La desviación estándar del aumento de veces en la expresión de MTb Rv2835 de la cepa EXP-Rv1337-5 es 55.

Número relativo de copias de plásmido de mutantes

Encontramos que la expresión de romboide-Rv1337 fusionado a un marcador seleccionable mejoró cuando se expresó a partir de un solo plásmido en lugar de dos (no se muestra). Por tanto, una forma obvia de aumentar la expresión sería disminuir el número de copias del plásmido. Por lo tanto, evaluamos el número de copias de los mutantes EXP. Como se indica en la Figura 8, todos los mutantes tenían un número de copias de plásmido comparable con la cepa TOP10 de tipo salvaje, excepto EXP & # x02013Rv1337 & # x020134 que mostró un número de copias drásticamente disminuido. Es probable que el número reducido de copias en EXP & # x02013Rv1337 & # x020134 ralentice la expresión a un nivel que las células puedan acomodar más fácilmente, de forma muy similar a como lo hacen las cepas C41 y C43 para la expresión del promotor T7. 7, 13

Análisis del número de copias del plásmido. Las cepas se volvieron a transformar con pSEL1 y pSEL2 que codificaban romboide-Rv1337 y se cultivaron hasta la fase logarítmica media. Las muestras se normalizaron en función de la DO600 y se purificaron en columna junto con el plásmido pUC19 digerido con HindIII como control de purificación interna. A continuación, las muestras se analizaron en un gel de agarosa.


Introducción de ADN recombinante en la célula huésped

El vector recombinante que lleva ADN extraño debe transferirse a la célula huésped adecuada. Estos son varios métodos para introducir vectores recombinantes y estos dependen de varios factores, como el tipo de vector y la célula huésped.

Algunos procedimientos de uso común son los siguientes:

TRANSFORMACIÓN:

En la tecnología de rDNA, el método más común para introducir rDNA en células vivas se llama transformación.

Sin embargo, en la naturaleza, la frecuencia de transformación de muchas células (por ejemplo, células de levadura y de mamífero) es muy inferior. En segundo lugar, todo el tiempo las células huésped no se someten a transformación, porque no están preparadas para ello.

Cuando desarrollan factores de competencia en las células, se produce un fenómeno de transformación.

Hay algunos factores que afectan la transformación, como la concentración de una molécula de ADN extraña, la densidad celular del huésped, la temperatura, etc.

En este procedimiento, las células bacterianas toman ADN del entorno circundante.

En 1970, Mendel y Hugo descubrieron que las células de E. coli se vuelven muy competentes para absorber el ADN externo cuando se suspenden brevemente en cloruro de calcio frío (CaCl2) solución.

TRANSFECCIÓN:

La transfección es la transferencia de ADN extraño a células hospedadoras cultivadas mediada a través de productos químicos.

Las sustancias químicas cargadas como el liposoma catiónico, el fosfato cálcico de DEAE dextrano se toman y se mezclan con moléculas de ADN.

Las células huésped receptoras se superponen con esta mezcla.

ELECTROPORACIÓN:

Se utiliza una corriente eléctrica para crear poros microscópicos transitorios en la membrana de la célula huésped receptora que permite la entrada del ADN recombinante.

MICROINYECCION:

El ADN exógeno también se puede introducir directamente en células animales y vegetales sin el uso de vectores eucariotas.

En el procedimiento de microinyección, el ADN extraño se inyecta directamente en las células receptoras usando una micro jeringa fina bajo un microscopio de contraste de fase para ayudar a la visión.

Las partículas microscópicas de oro o tungsteno se recubren con el ADN de interés y se bombardean sobre las células con un dispositivo muy parecido a una pistola de partículas. De ahí que se utilice el término biolística.

Nota: Otro método para introducir genes extraños es mediante un ingeniero genético natural. Agrobacterium tumefaciens.


Los fundamentos del ADN recombinante


Entonces, ¿qué es el ADNr?
¡Esa es una muy buena pregunta! rDNA significa DNA recombinante. Antes
llegamos a la parte & quotr & quot, necesitamos entender el ADN. Aquellos de ustedes con
un fondo en biología probablemente sepa sobre el ADN, pero muchos ChemE no lo han hecho.
ADN visto desde la biología de la escuela secundaria. El ADN es el guardián de toda la información.
necesario para recrear un organismo. Todo el ADN está formado por una base que consta de
de azúcar, fosfato y una base de nitrógeno. Hay cuatro bases nitrogenadas,
adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C). El nitrógeno
las bases se encuentran en pares, con A & amp T y G & amp C emparejados. La secuencia

de las bases nitrogenadas pueden disponerse de infinitas formas, y su estructura se conoce como

la famosa "doble hélice" que se muestra en la imagen de abajo. El azúcar utilizado en

El ADN es desoxirribosa. Las cuatro bases nitrogenadas son las mismas para todos los organismos. los

la secuencia y el número de bases es lo que crea diversidad. El ADN no

en realidad produce el organismo, solo produce proteínas. El ADN se transcribe

en ARNm y el ARNm se traduce en proteína, y la proteína luego forma la

organismo. Al cambiar la secuencia de ADN, la forma en que la proteína se

cambios formados. Esto conduce a una proteína diferente o una proteína inactiva.

Ahora que sabemos qué es el ADN, aquí es donde entra el recombinante.
ADN recombinante es el nombre general para tomar una parte de un ADN, y
y combinándolo con otra hebra de ADN. Por lo tanto, ¡el nombre recombinante!
El ADN recombinante también se denomina a veces "quimera". Combinando dos o
más diferentes hebras de ADN, los científicos pueden crear una nueva hebra de ADN.
El proceso recombinante más común implica combinar el ADN de dos
diferentes organismos.

¿Cómo se fabrica el ADN recombinante?
Hay tres métodos diferentes mediante los cuales se produce el ADN recombinante. Son
Transformación, introducción de fagos y transformación no bacteriana. Cada
se describen por separado a continuación.

Transformación
El primer paso en la transformación es seleccionar un fragmento de ADN para insertar.
en un vector. El segundo paso es cortar ese trozo de ADN con una restricción
enzima y luego ligar el inserto de ADN en el vector con ADN ligasa. El inserto contiene un seleccionable
marcador que permite la identificación de moléculas recombinantes. Un antibiótico
El marcador se usa a menudo para que una célula huésped sin un vector muera cuando se expone a un cierto
antibiótico, y el huésped con el vector vivirá porque es resistente.

El vector se inserta en una célula huésped, en un proceso llamado transformación. Uno
ejemplo de una posible célula huésped es E. Coli. Las células huésped deben ser especialmente
preparado para tomar el ADN extraño.

Los marcadores seleccionables pueden ser para resistencia a antibióticos, cambios de color o cualquier otro
característica que puede distinguir los hosts transformados de los no transformados.
Los diferentes vectores tienen diferentes propiedades para adecuarlos a diferentes
aplicaciones. Algunas propiedades pueden incluir sitios de clonación simétricos, tamaño y
alto número de copias.

Transformación no bacteriana
Este es un proceso muy similar a la Transformación, que se describió anteriormente. los
la única diferencia entre los dos es que no es bacteriana no usa bacterias como E. Coli
para el anfitrión.

En la microinyección, el ADN se inyecta directamente en el núcleo de la célula que se está
transformado. En biolística, las células huésped son bombardeadas con alta velocidad.
microproyectiles, como partículas de oro o tungsteno que han sido recubiertas
con ADN.

Introducción a los fagos
La introducción de fagos es el proceso de transfección, que es equivalente a la transformación,
excepto que se usa un fago en lugar de bacterias. Se utilizan envases in vitro de un vector.
Esto usa fagos lambda o MI3 para producir placas de fagos que contienen recombinantes.
Los recombinantes que se crean pueden identificarse por diferencias en el
recombinantes y no recombinantes usando varios métodos de selección.


¿Cómo funciona el ADNr?
El ADN recombinante funciona cuando la célula huésped expresa proteínas de los genes recombinantes.

El huésped no producirá una cantidad significativa de proteína recombinante a menos que la expresión
se añaden factores. La expresión de proteínas depende de que el gen esté rodeado por
una colección de señales que proporcionan instrucciones para la transcripción y traducción
del gen por la célula. Estas señales incluyen el promotor, la unión del ribosoma.
site y el terminador. Vectores de expresión, en los que se inserta el ADN extraño,
contienen estas señales. Las señales son específicas de la especie. En el caso de E. Coli, estos

Las señales deben ser señales de E. Coli ya que es poco probable que E. Coli entienda las señales de

promotores y terminadores humanos.

Se encuentran problemas si el gen contiene intrones o contiene señales que actúan
como terminadores de un huésped bacteriano. Esto da como resultado la terminación prematura y el recombinante
la proteína puede no procesarse correctamente, plegarse correctamente o incluso degradarse.

La producción de proteínas recombinantes en sistemas eucariotas generalmente tiene lugar en
levadura y hongos filamentosos. El uso de células animales es difícil debido al hecho
que muchos necesitan una superficie de soporte sólida, a diferencia de las bacterias, y tienen un crecimiento complejo
necesidades. Sin embargo, algunas proteínas son demasiado complejas para ser producidas en bacterias,

por lo que deben usarse células eucariotas.


¿Por qué es importante el ADNr?
El ADN recombinante ha ido ganando importancia en los últimos años, y
El ADN recombinante solo se volverá más importante en el siglo XXI como genética

las enfermedades se vuelven más prevenibles y la superficie agrícola se reduce. Debajo están

algunas de las áreas donde el ADN recombinante tendrá un impacto.

  • Mejores cultivos (sequía y resistencia al calor)
  • Vacunas recombinantes (es decir, hepatitis B)
  • Prevención y curación de la anemia de células falciformes.
  • Prevención y curación de la fibrosis quística.
  • Producción de factores de coagulación.
  • Producción de insulina
  • Producción de productos farmacéuticos recombinantes
  • Plantas que producen sus propios insecticidas
  • Línea germinal y terapia génica somática


¿Qué depara el futuro?
Ahora que hemos descubierto los conceptos básicos detrás de lo que es el ADN recombinante, es
Es hora de ver cómo impactará el ADN recombinante en el futuro. Que industrias
y los campos serán moldeados por rDNA? ¿Cómo afectará el ADNr a la salud y
estilos de vida de los estudiantes de RPI en la próxima generación? Haga clic en nuestro
Declaración de impacto del ADNr para encontrar la respuesta.

¡Hora de hacer preguntas!
Para ayudarlo a determinar qué tan bien conoce el ADN recombinante,
hemos decidido generosamente ofrecerle un cuestionario básico que incluso un
senior ChemE debería poder hacer. Asegúrese de revisar las
información proporcionada a continuación, ¡porque estas preguntas pueden ser complicadas! Todos
la información necesaria para responder las preguntas se puede encontrar en esta página,
o las páginas asociadas. Cuando esté listo, haga clic a continuación.

información adicional
La información presentada anteriormente es solo una introducción a las maravillas de
ADN recombinante. Para satisfacer su deseo de conocimiento, Matt y
Beth ha buscado en la web los mejores sitios web con un conocimiento profundo
en relación con el ADNr. Encontrará los enlaces a continuación y un breve
descripción de lo que describe la página. ¡Disfrutar!

Secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción de uso frecuente.

Información sobre proteínas humanas que se han sintetizado a partir de genes eucariotas y bacterianos.

Información sobre proyectos de adición de genes que se han realizado con plantas.

Information about gene subtraction projects that have been done with plants.

Basic information about what DNA is

A SHOCKWAVE application illustrating DNA replication

A video that illustrates protein synthesis

Information about how gene splicing differs from conventional agriculture

Information about the merits of agricultural gene splicing

Information about treating genetic diseases in the womb

A Question and Answer about gene therapy

The Recombinant DNA chapter of an online textbook

A Recombinant DNA problem set and tutorial

The NIH Guidelines for research involving Recombinant DNA

An online textbook covering the protocols for Recombinant DNA

A clearinghouse of links concerning Clinical Trials

Information about gene therapy for human patients

Recombinant DNA and the synthesis of human insulin

A repository of information concerning Medical Biotechnology

Created by Matthew Kuure-Kinsey and Beth McCooey for Biochemical Engineering Fall 2000


TOOLS OF RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY

Following are the key tools of recombinant DNA technology:
Restriction enzymes, polymerase enzymes, ligases, vectors, and the host organism

Restriction Enzymes

The enzymes which cut the DNA are called restriction enzymes. Hind II was the first restriction endonuclease to be discovered. Hind II always cuts DNA molecules at a particular point by recognizing a specific sequence of six base pairs. This specific base sequence is called the recognition sequence for Hind II. Today, more than 900 restriction enzymes are known. Different enzymes recognize different sequences.

Exonuclease: These enzymes remove nucleotides from the ends of the DNA.

Endonuclease: These enzymes make cuts at specific positions within the DNA.

Nomenclature of Restriction Enzymes: Each enzyme is named after the bacterium from which it was isolated. The naming system is based on bacterial genus, species and strain. Following table shows the name of EcoRI restriction enzyme and the implied naming system.

Derivation of EcoRI name
AbreviaturaSentidoDescripción
miEscherichiaGénero
cocoliespecies
RRY 13Cepa
IFirst identifiedOrder of identification

Palindromes: A group of letters that form the same word when read both forward and backward is called a palindrome. Restriction enzyme cut at the palindrome sequence in a DNA. Following is an example of palindrome sequence:

5' —— GAATTC —— 3'
3' —— CTTAAG —— 5'

Restriction enzymes cut the strand of DNA a little away from the centre of the palindrome sites, but between the same two bases on the opposite strands. This leaves single stranded portions at the ends. There are overhanging stretches called sticky ends on each strand. These are named so because they form hydrogen bonds with their complementary cut counterparts. This stickiness of the ends facilitates the action of the enzyme DNA ligase.

When cut by the same restriction enzyme, the resultant DNA fragments have the same kind of ‘sticky-ends’ and, these can be joined together (end-to-end) using DNA ligases.

Unless, the vector and the source DNA are cut with the same restriction enzyme, the recombinant vector molecule cannot be created.

Separation and isolation of DNA fragments: The cutting of DNA by restriction endonucleases results in the fragmentes of DNA. These fragments can be separated by a technique known as gel electrophoresis. Since DNA fragments are negatively charged molecules they can be separated by forcing them to move towards the anode under an electric field through a medium/matrix.

Agarose is the most commonly used matrix. It is a natural polymer which is extracted from sea weeds.

The DNA fragments separate according to their size through sieving effect provided by agarose gel. So, smaller fragments move farther than longer fragments.

The separated DNA fragments are stained with ethidium bromide. After that, exposure to UV radiation makes them visible. The DNA fragments appear as bright orange bands in this case.

The separated bands of DNA are cut out from agarose gel and extracted constructing recombinant DNA by joining them with cloning vectors.

Cloning Vectors

A small piece of DNA taken from a virus, a plasmid or the cell of a higher organism, that can be stably maintained in an organism, and into which a foreign DNA fragment can be inserted for cloning purposes is called a cloning vector.

The following are the features that are required to facilitate cloning into a vector.

  1. Origin of replication (ori): The sequence from where replication starts in the DNA is called the Origin of Replication (ori). When a piece of DNA is linked to this sequence, it can be made to replicate within the host cell. If you want to recover many copies of the target DNA, it should be cloned in a vector whose ‘ori’ supports high copy number.
  2. Selectable marker: These are the substances which help in identifying and eliminating non-transformants and selectively permitting the growth of the transformants. Generally, the genes which encode resistance to antibiotics (ampicillin, chloramphenicol, tetracycline, kanamycin, etc.) are considered useful selectable markers for E. coli. The normal E. coli cells do not carry resistance against any of these antibiotics.
  3. Cloning sites: All cloning vectors have recognition sites for the commonly used restriction enzymes. But to link the alien DNA, the vector needs to have very few, preferably single, recognition site. Ligation of alien DNA is carried out at a restriction site present in one of the two antibiotic resistance genes.

Ejemplo: A foreign DNA can be ligated at the Bam H I site of tetracycline resistance gene in the vector pBR322. The recombinant plasmids will lose tetracycline resistance due to insertion of foreign DNA but they can still be selected out from non-recombinant ones by plating the tranformants on ampicillin containing medium.

After that, the transformants (growing on ampicillin containing medium) are transferred on a medium which contains tetracycline.

The recombinant will grow in ampicillin containing medium but not in tetracycline containing medium.

But non-recombinants will grow in medium containing both the antibiotics. In this case, one antibiotic resistance gene helps in selecting the transformants, while other antibiotic resistance gene gets inactivated due to insertion of alien DNA. Thus, it helps in selection of recombinants.

Nota: Selection of recombinants due to inactivation of antibiotics requires simultaneous plating on two plates having different antibiotics. Hence, it is a cumbersome process.

Alternate selectable markers have been developed which can differentiate recombinants from non-recombinants on the basis of their ability to produce color in the presence of chromogenic substrate.

In this case, a recombinant DNA is inserted within the coding sequence of an enzyme, α-galactosidase. This results into inactivation of the enzyme. (It is called insertional inactivation).

The presence of chromogenic substrate gives blue-colored colonies if plasmid in bacteria does not have an insert.

Presence of insert results into insertional inactivation of α-galactosidase, and no color is produced by the colonies. Such colonies are identified as recombinant colonies.

Vectors for cloning genes in plants and animals: Bacteria and viruses have been transferring their genes to transform eukaryotic cells in order to force them to do what the bacteria or viruses want. Now, these tools of pathogens can be transformed into useful vectors for delivering beneficial genes to humans. For example the tumor inducing (Ti) plasmid of Agrobacterium tumifaciens has now been modified into a cloning vector which is no more pathogenic to the plants. This vector can now be utilized to transfer beneficial genes into many plants.

Competent Host (For Transformation with Recombinant DNA)

We know that DNA is a hydrophilic molecule. Hence, it cannot pass through cell membranes. In order to force bacteria to take up the plasmid, the bacterial cell needs to be ‘competent’’ to take up DNA. This is done by treating the bacterial cells with a specific concentration of a divalent cation, e.g. calcium. It increases the efficiency with which DNA enters the bacterium through pores in its cell wall.

Recombinant DNA can then be forced into such cells in following steps:

  • Cells along with recombinant DNA are incubated on ice.
  • They are then briefly placed at 42°C (heat shock).
  • Then they are put back on ice.

Micro-injection: In this method, recombinant DNA is directly injected into the nucleus of an animal cell.

Gene Gun: This method is applied for plant cells. In this method, cells are bombarded with high velocity micro-particles of gold or tungsten coated with DNA.

Disarmed Pathogen: When the disarmed pathogen infects the cell, it transfers the recombinant DNA into host.


Yeast protein expression systems – Saccharomyces cerevisiae

The highly developed genetic system, ease of use, reduced time input and costs have made S. cerevisiae an attractive organism for the expression and production of recombinant proteins. Yeasts are able to carry specifically designed plasmids and this ability is valuable in a recombinant protein expression system. The plasmid used consists of restriction sites that can be used to insert the gene sequence of interest. Transformation of yeasts with the plasmid produces the desired protein and can be appropriately scaled up.

Figura 3. Yeast protein expression system – Saccharomyces cerevisiae

Expression of protein using S. cerevisiae involves the following steps:

  • use of competent E. coli cells to take up DNA sequence of interest (Catalog Numbers CMC0001, CMC0004, CMC0014)
  • integration of the DNA into bacterial genome or circularization of the DNA sequence to exist as a plasmid
  • selection of transformed E. coli using a selection marker (antibiotic) (Catalog Numbers L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
  • expansion of selected E. coli in appropriate culture media, such as classic LB options (product numbers L2542, L3522, L3147) or EnPresso™ Y Defined Media (product number Y22001)
  • isolation of DNA or plasmid
  • transformation into yeast (yeast transformation kit, Catalog Number YEAST1)
  • screen the transformants for integration of DNA into yeast chromosome
  • selection and scaling-up of high expressing yeast clones in appropriate culture media (Catalog Numbers Y1375, Y1501, Y1751, Y2001, Y1376, Y0750)
  • isolation and purification of intracellular/secreted proteins

Features

  • low cost culture methods
  • suitable for both intracellular and secreted proteins
  • provides eukaryotic post-translational glycosylation of proteins although it results in high

Community Surveys

William L. Thompson , . Charles Gowan , in Monitoring Vertebrate Populations , 1998

Plot Selection Method

The random selection method used for choosing which plots to survey could have a significant impact on the chance of encountering a given species. One could stratify an area by species’ habitat affiliations ( Fig. 4.3 ). However, this would require prior life history information, or at least historical records of occurrence, for the species in question. Species would have to be grouped by habitat preference with different sampling frames constructed by group. This would obviously remove the possibility of collecting distributional data in a single survey.

Figure 4.3 . Two strata, separated by a thick line, hypothetically based on a habitat affiliation for a given species. The probability of selecting a plot containing an individual of a given species is much greater in the smaller stratum (preferred habitat) than for the larger stratum.

The advantage of using stratified random sampling to increase the chance of selecting a plot that contains a member of a target species is shown in ( Fig. 4.3 .) We use the simplest case of a single species to demonstrate this advantage, but the same principle applies for groups of species as well. Note that there are 50 empty plots out of 100 in the sampling frame so that without stratification the chance of picking an occupied plot would be, on average, 1 in 2 or 50%. However, stratifying by habitat yields one stratum in which 20 of 25 (80%) of the plots contain at least one individual and another stratum that has only 30 of 75 (40%) plots that are occupied. Sampling effort then can be concentrated in the small stratum to increase the probability of selecting occupied units.

Stratification of the sampling frame by some attribute associated with spatial clustering of species may be effective when applied to a single species, but probably cannot be implemented for more than several related species. That is, the greater the number of target species, the greater the possible number of different cluster patterns. One species may be clustered in riparian habitat whereas another may be aggregated in grasslands. There is simply no way to have one optimum and worthwhile stratification design that can account for the many different patterns of distribution the aggregation of a species is a species trait, and cannot be accommodated for all the different species with a single stratification design or plot size. Thus, one ends up with a suboptimal allocation of effort for all species. That is, the reasonable approach under these circumstances is to select a simple random sample of the entire sampling frame, which means there is no stratification and no optimum allocation of sampling effort.


Conclusiones

The D4R dominant host range selection represents a quick and stringent method to generate recombinant MVA viruses. The method represents an alternative to current selection techniques that rely on additional marker genes, chemical agents, and multiple rounds of plaque purification. In contrast to traditional homologous recombination protocols and to the recently described BAC cloning procedure, the less laborious D4R-dominant host range selection approach by principle does not require foreign marker genes, resulting in MVA recombinants that are free from marker gene sequences and that thus meet the state-of-the-art requirements for use as live vaccines.


Ver el vídeo: ordenamiento por seleccion (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Darr

    Felicitaciones, creo que este es un pensamiento maravilloso.

  2. Cutler

    Es interesante. Dígame, por favor, ¿dónde puedo encontrar más información sobre esta pregunta?

  3. Agamedes

    Creo que estás cometiendo un error. Envíeme un correo electrónico a PM, hablaremos.

  4. Elvyn

    Bravo, esta magnífica frase es necesaria por cierto



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