Información

¿Existe una fuente confiable de almacenamiento y estabilidad de agentes reductores como el DTT?

¿Existe una fuente confiable de almacenamiento y estabilidad de agentes reductores como el DTT?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Al leer la literatura sobre TDT, uno se enfrenta a una confusa masa de artículos; algunos afirman que una solución 1 M en agua es estable, otros artículos dicen que no lo es. Utilizo la reacción con DTNB para mostrar que la DTT sigue siendo buena, pero eso es engorroso.

¿Existe alguna fuente de información confiable (basada en datos) sobre cómo almacenar compuestos como DTT y otros agentes reductores?


Agentes reductores a base de tiol

La inestabilidad de los agentes reductores a base de tiol en solución se debe a su propensión a formar enlaces disulfuro mediante la siguiente semirreacción:

$$ ce {2RSH -> RSSR + 2H + + 2e -} $$

Está claro que la formación de disulfuro requiere:

  • Desprotonación de los tioles para formar tiolatos (RS-).
  • Un aceptor de electrones.

Por lo tanto, las soluciones de agentes reductores a base de tiol serían más estables cuando:

  • El pH se amortigua hasta donde predomina la forma tiol. El pKa del tiol en β-mercaptoetanol es 9,5 y en ditiotreitol es 9,2 y 10,1 (Whitesides et al., 1977). Amortiguar el pH por debajo de este debería aumentar la estabilidad.
  • Se eliminan los aceptores de electrones. En solución acuosa, el aceptor de electrones es oxígeno molecular. La desgasificación del tampón y el almacenamiento de las soluciones bajo un gas inerte como el argón deberían aumentar la estabilidad.
  • Se eliminan los catalizadores de reacción. Cationes de metales divalentes, especialmente cobre (II) (Cu2+), catalizan la formación de disulfuro dependiente de oxígeno, incluso en cantidades traza (Smith et al., 1994). Por tanto, un quelante como el EDTA debería aumentar la estabilidad.
  • La temperatura es baja. Como ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad aumenta con la temperatura.

Las estabilidades de los agentes reductores a base de tiol β-mercaptoetanol (β-ME), ditiotreitol (DTT) y glutatión (GSH) se han determinado en solución en función del pH a 20 ° C (Stevens et al., 1983):

... y temperatura a pH 8,5:

… Así como en presencia de cobre (II) y EDTA a pH 8,5 y 20 ° C:

A continuación se muestran los datos brutos tabulados (estos son los datos reales del documento que utilicé para crear los gráficos anteriores, pero tenga en cuenta que me resultó difícil trazar "> 100"):

Vida media (h) pH Temp (° C) Aditivo β-ME DTT GSH 6.5 20 -> 100 40 16 7.5 20 - 10 10 9 8.5 20 - 4.0 1.4 1.3 8.5 0 - 21 11 8 8.5 40 - 1.0 0.2 0.2 8.5 20 Cu (II) 0,6 0,6 1,2 8,5 20 EDTA> 100 4 70

Como era de esperar, la estabilidad disminuyó al aumentar el pH y la temperatura, y también con la adición de cobre. La estabilidad aumentó con la adición de EDTA.


Agentes reductores no basados ​​en tiol

Han y Han (1994) estudiaron el efecto del pH y la composición del tampón sobre la estabilidad de la solución de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP). Aunque este no es un agente reductor a base de tiol, todavía está sujeto a oxidación. Sin embargo, es bastante estable en solución:

pH soluto / tampón% TCEP oxidado después de 3 semanas 7,5 Tris-HCl 18,7 ± 0,6 8,5 Tris-HCl 16,8 ± 0,5 9,5 Tris-HCl 14,5 ± 0,5 8,2 borato 6,6 ± 0,2 10,2 borato 5,3 ± 0,1 6,8 HEPES 14,8 ± 0,4 8,2 HEPES 13,6 ± 0,3 9,7 CAPS 9,8 ± 0,3 11,1 CAPS 4,3 ± 0,1

La estabilidad aumentó al aumentar el pH, aunque el efecto no fue grande. Curiosamente, la composición del tampón tuvo un efecto mayor sobre la estabilidad que fue especialmente pronunciado con el fosfato:

% TCEP oxidado después de 72 horas pH 0,15 M fosfato 0,35 M fosfato 6,0 no determinado 11,2 ± 0,3 6,8 8,1 ± 0,4 56,8 ± 2,3 7,0 23,5 ± 0,9 100 7,2 33,4 ± 1,0 100 7,4 56,5 ± 1,4 100 7,6 56,8 ± 2,1 100 7,8 48,9 ± 2,5 100 8,0 36,6 ± 1,7 100 10,6 no determinado 11,7 ± 0,5 11,6 no determinado 9,1 ± 0,4

Referencias

Han JC, Han GY. 1994. Un procedimiento para la determinación cuantitativa de tris (2-carboxietil) fosfina, un agente reductor inodoro más estable y eficaz que el ditiotreitol. Anal Biochem 220 (1): 5-10.

Smith RC, Reed VD, Hill WE. 1994. Oxidación de tioles por cobre (II). Fósforo Azufre Silicio Relat Elem 90 (1-4): 147-154.

Stevens R, Stevens L, Price NC. 1983. Estabilidades de varios compuestos de tiol utilizados en purificaciones de proteínas. Educación bioquímica 11 (2): 70.

Whitesides GM, Lilburn JE, Szajewski RP. 1977. Tasas de reacciones de intercambio de tiol-disulfuro entre mono y ditioles y el reactivo de Ellman. J Org Chem 42 (2): 332-338.


Estabilidad de tdt en solución

Estabilidad de tdt en solución Después de analizar la palabra clave, el sistema enumera la lista de palabras clave relacionadas y la lista de sitios web con contenido relacionado, además puede ver qué palabras clave más interesan a los clientes en este sitio web.


Resultados

Trx reducido no es un agente reductor eficiente para hMsrB2 y hMsrB3.

En el curso del desarrollo del ensayo colorimétrico DABS para la actividad de Msr (ver Materiales y métodos), se confirmó que eMsrA y eMsrB podrían usar DTT o Trx para suministrar el poder reductor, con actividad similar o mayor observada con Trx in vitro. Sin embargo, aunque tanto hMsrB2 como hMsrB3 podrían usar DTT como agente reductor, estas proteínas mostraron muy poca actividad con Trx. La Tabla 1 compara la actividad de varias proteínas Msr recombinantes usando DTT o Trx. Puede verse que eMsrA, MsrA bovino (bMsrA) y eMsrB son activos con DTT o Trx como sistema reductor. De hecho, eMsrB fue mucho más activo con Trx que con DTT. Por el contrario, hMsrB2 y hMsrB3 funcionan muy mal con Trx, teniendo & lt10% de la actividad observada con DTT. Una posibilidad era que las proteínas hMsrB requirieran específicamente Trx de mamífero y no la Trx bacteriana que se usó en estos experimentos. Por lo tanto, probamos hMsrB3, así como eMsrA y eMsrB, con Trx de mamífero y Trx reductasa de mamífero. La Trx de mamífero reducida, como la Trx bacteriana, dio una actividad muy pobre con hMsrB3, pero tanto eMsrA como eMsrB usaron eficientemente Trx de cualquier fuente (datos no mostrados). Cabe señalar que no pudimos probar MsrB1 de mamífero, que difiere de MsrB2 y MsrB3 en ser una selenoproteína, porque todos los intentos de obtener cantidades suficientes de esta proteína recombinante no tuvieron éxito.

Trx y DTT como agentes reductores con diversas proteínas Msr

La débil actividad de hMsrB2 y hMsrB3 con Trx sugirió que puede haber otro sistema reductor para estas proteínas en células de mamíferos que funcione en lugar de Trx o sea un portador de hidrógeno intermedio entre Trx y las proteínas MsrB humanas.

Zn-MT en presencia de EDTA puede servir como agente reductor para Msr.

En nuestros intentos de buscar un factor biológico que fuera más eficiente que Trx en el suministro del sistema reductor para hMsrB2 y hMsrB3, inicialmente probamos un S-100 de hígado bovino. Usando hMsrB3, pudimos detectar una actividad reductora significativa en la fracción S-100 del hígado, pero solo en presencia de EDTA. El material activo fue estable al calentamiento a 80 ° C durante 10 min. La Fig. 1 muestra el efecto de la concentración de proteína del extracto S-100 calentado y la dependencia casi completa de EDTA para la actividad de hMsrB3. Se observó una actividad óptima con niveles de EDTA & gt2,5 mM (datos no mostrados). De forma rutinaria, se ha utilizado EDTA 5 mM en los experimentos. El EDTA por sí solo no tuvo un efecto significativo sobre la actividad de hMsrB3, aunque hMsrB3 contiene zinc. Se probaron otros agentes quelantes en lugar de EDTA con Zn-MT. La 1,10-fenantrolina (5 mM) dio ~ 40% de la actividad de EDTA, mientras que EGTA (5 o 20 mM), deferoxamina (5 mM) y zincon (500 µM) estaban inactivas. Por tanto, se utilizó EDTA en todos los estudios presentes. Una serie de sales metálicas no pudo reemplazar al EDTA o al S-100 calentado en la reacción (datos no mostrados).

Efecto de la concentración de S-100 en hígado calentado y EDTA sobre la actividad de MsrB3. La actividad se midió sin EDTA (○) o con EDTA 5 mM (●) en la mezcla de reacción. Se incubó MsrB3 (2 μg) con la cantidad indicada de S-100 calentado en ausencia de un sistema reductor (DTT o Trx) como se describe en Materiales y métodos.

La estabilidad térmica y el requisito de EDTA sugirieron que el factor activo podría ser una metalotioneína (MT), y el factor termoestable se purificó adicionalmente como se describe en Materiales y métodos. Figura 2 A muestra el perfil de elución de una columna de celulosa DE-52, último paso de la purificación. Se observaron dos picos distintos de actividad reductora, y las fracciones en ambos picos fueron activas en el ensayo de Msr usando hMsrB3 solo en presencia de EDTA. El perfil de purificación sugirió que los dos picos corresponden a MT-1 y MT-2, basándose en su elución de la columna DE-52.

Purificación y propiedades del factor activo. (A) Perfil de elución de una columna DE-52 del factor que muestra actividad Msr y contenido de zinc. Se pudieron separar dos picos de actividad reductora con hMsrB3, y se etiquetaron como MT-1 y MT-2. La actividad (●) se expresa como nanomoles totales de DABS-Met formados por fracción de 1 ml en la reacción de Msr usando hMsrB3. La concentración de zinc (μM) también se muestra (○). (B) Espectros de factor purificado a pH 7,4 (línea continua) y pH 2,0 (línea discontinua). Un coeficiente de extinción de ε220 = 48.600 M −1 · cm −1 a pH 2,0 se utilizó para calcular la cantidad de MT en las fracciones.

Debido al requisito de EDTA para que la fracción sea activa con hMsrB3, los análisis de metales se realizaron inicialmente en preparaciones purificadas utilizando EM de plasma acoplado inductivamente. Se encontró zinc en cantidades significativas [60,795 partes por billón (ppb)], con niveles traza de cobre y plata (688 y 739 ppb, respectivamente). Además de utilizar agua nanopura, no se tomaron precauciones especiales para eliminar los metales traza, por lo que se desconoce la fuente de estos metales traza en la muestra de proteína. Como se muestra en la Fig.2 A, las fracciones activas altamente purificadas de la columna DE-52 contenían altos niveles de zinc que coeluían con las fracciones activas en el ensayo Msr. La cantidad de MT podría determinarse espectrofotométricamente (ε220 = 48,600 M −1 · cm −1 a pH 2.0), y análisis de zinc usando el reactivo 4- (2-piridilazo) resorcinol (PAR) (ver Materiales y métodos) mostró que había cerca de siete átomos de zinc por mol de MT en cada fracción. Aunque el zinc parece ser el principal metal asociado con el factor activo, no podemos eliminar la presencia de niveles más bajos de otros metales en la muestra. Figura 2 B muestra el espectro UV de una fracción del pico 2 de la columna DE-52 (ambos picos mostraron características espectrales similares). Puede verse que el factor activo tiene una alta absorción en el rango de 200 a 250 nm pero esencialmente no tiene absorbancia a 280 nm, lo que indica la ausencia de aminoácidos aromáticos. Tras la acidificación, la alta absorción de UV disminuye notablemente. En SDS / PAGE, la proteína purificada, así como una preparación comercial MT de hígado de conejo, migraron como una banda difusa en el rango de 13 a 16 kDa (datos no mostrados), el doble del tamaño de Zn-MT, que es ≈ 6 kDa. Este patrón de migración de gel podría deberse a la forma única de la proteína o la presencia de dímeros a través de la formación de enlaces intermoleculares. La MT de hígado obtenida de una fuente comercial también apoyó la actividad de hMsrB3 en presencia de EDTA (datos no mostrados). La presencia de zinc así como las características espectrales y otras de las fracciones activas indicaron que los dos picos de la columna DE-52 eran Zn-MT-1 y Zn-MT-2. Estas fracciones máximas se analizaron adicionalmente mediante electropulverización MS, y los pesos moleculares coincidieron con los de MT-1 y MT-2 bovinos (5.987 y 6.013, respectivamente). EDTA eliminó & gt90% del zinc de Zn-MT en & lt10 min, medido por la aparición de grupos SH libres (datos no mostrados). Concluimos que el factor purificado es un Zn-MT, que, en presencia de EDTA, se convierte en la T reducida libre de metales, y que la T, debido al alto contenido de residuos de cisteína, es capaz de suministrar al sistema reductor. para la reacción de Msr. Los resultados que se muestran a continuación utilizaron Zn-MT-2, aunque se obtuvieron resultados similares con Zn-MT-1.

Como se ve en la Tabla 2, el Zn-MT purificado no es un agente reductor específico para hMsrB3 porque también es compatible con eMsrA, eMsrB y bMsrA, dependientes de EDTA. Sin embargo, para nuestra sorpresa, el factor hepático mostró muy poca actividad con hMsrB2 en las condiciones utilizadas en la Tabla 2.

Comparación de la actividad de las proteínas Msr en presencia de Zn-MT o DTT

T Puede funcionar en el sistema Msr en ausencia de EDTA.

Aunque parecía probable que el requisito de EDTA fuera liberar zinc de Zn-MT para formar T, este sistema era obviamente artificial, y era importante demostrar directamente que T podría servir como agente reductor para el sistema Msr. T se preparó como se describe en Materiales y métodos y probado con hMsrB3 como se muestra en la Fig. 3. Puede verse que la actividad de hMsrB3 fue apoyada tanto por T como por Zn-MT, aunque T era activo en ausencia de EDTA, mientras que Zn-MT requería EDTA para su actividad. Se utilizaron incubaciones más cortas para estos experimentos para minimizar la oxidación de T que se produjo a pH neutro. T también fue activo con MsrA en ausencia de EDTA (datos no mostrados). Estos resultados apoyan la opinión de que el requisito de EDTA con Zn-MT es liberar el zinc de Zn-MT y formar T y que T es capaz de proporcionar el sistema reductor para las enzimas Msr.

T puede suministrar el sistema reductor para la actividad de hMsrB3 en ausencia de EDTA. Las incubaciones contenían 4,5 μg de MsrB3, 20 nmol de T o 20 nmol de Zn-MT. Las incubaciones con T no contenían EDTA, pero se añadió EDTA 5 mM a las incubaciones con Zn-MT. A los 20 min, Zn-MT en ausencia de EDTA formó 1,3 nmol, mientras que T en presencia de EDTA 5 mM formó 23,5 nmol. ●, T ○, Zn-MT más EDTA.

Trx puede reducir la T oxidada [T (o)].

El mecanismo de reacción tanto para MsrA como para MsrB implica la formación de un intermedio enzimático oxidado que debe reducirse para que la proteína Msr actúe catalíticamente (6, 7, 11, 21, 22). Si T es capaz de reducir el Msr oxidado, el T se oxidaría parcial o totalmente a T (o) e, idealmente, debería haber un sistema enzimático que pudiera regenerar T y permitir que se recicle. T (o) se preparó como se describe en Materiales y métodos. En general, este material había perdido entre el 50% y el 60% de sus grupos SH libres, pero seguía siendo mayoritariamente soluble (ver Materiales y métodos). Cualquier material insoluble que se formó se eliminó mediante centrifugación. Trx se consideró un posible candidato para reducir T (o), lo que podría mostrarse directamente midiendo la oxidación de NADPH en presencia del sistema reductor Trx y T (o). Como se muestra en la Fig. 4, la oxidación de NADPH dependía de Trx, Trx reductasa y T (o). Además, como se muestra en la Tabla 3, T (o) podría soportar la actividad de hMsrB3 en presencia del sistema reductor de Trx completo (fila 1) pero no en ausencia de Trx, Trx reductasa o NADPH (filas 3-5). Como se discutió anteriormente, el sistema Trx solo mostró una actividad muy baja (fila 2). También es evidente a partir de los resultados de la Tabla 3 que los grupos SH libres que quedan en T (o) no pueden soportar la reacción Msr, lo que indica que los grupos SH en T no son todos equivalentes con respecto a su capacidad para funcionar como un agente reductor. para el sistema Msr. Los resultados de la Fig. 4 y la Tabla 3 indican que los enlaces disulfuro en T (o) pueden reducirse mediante el sistema Trx. Por tanto, Trx puede ser uno de los agentes celulares que pueden permitir que T (o) se recicle y funcione como un sistema reductor metabólico.

Reducción de T (o) por Trx. La preparación de T (o) y las condiciones de incubación se describen en Materiales y métodos. Se siguió la oxidación de NADPH a 340 nm. ■, sistema completo □, menos Trx ○, menos Trx reductasa ●, menos T (o).

Trx estimula la actividad de MsrB3 en presencia de T (o)

En contraste con los resultados con hMsrB3, hMsrB2, que tenía baja actividad con Trx o Zn-MT (ver Tabla 2), tampoco se estimuló cuando estaban presentes tanto T (o) como el sistema reductor Trx (datos no mostrados).


Introducción

Las enfermedades crónicas como la diabetes, la hipertensión, la obesidad o la enfermedad renal crónica se han estudiado durante muchos años mediante enfoques fisiológicos, bioquímicos y genéticos, lo que contribuye a la comprensión de la fisiopatología de estas enfermedades (1 & # x020133). En la última década, la proteómica ofreció conocimientos sobre la traducción de información biológica de ADN a ARN a proteínas (4) y modificaciones postranscripcionales causadas por diferentes enfermedades.

En la práctica clínica, las biopsias de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) es una técnica específica que se utiliza para preparar y conservar muestras de tejido utilizadas en la investigación, el examen, el diagnóstico y el desarrollo de fármacos. (5 & # x020139). Estas muestras representan un depósito biológico casi infinito para análisis de ADN, ARN y proteínas. Sin embargo, uno de los principales problemas es intentar extraer proteínas de muestras de FFPE, debido a la naturaleza de los enlaces cruzados formados después del tratamiento con formalina (10 & # x0201312) (ver Figura 1). Estas reticulaciones moleculares dificultan la extracción de proteínas y son necesarias técnicas de extracción más agresivas que las utilizadas para tejidos frescos o congelados (7, 11, 12).

Figura 1. Formación de enlaces cruzados de proteínas Pasos: (1) reacción de formaldehído con proteínas / péptidos para generar grupos metilol inestables (2) interacción de grupos metilol con proteínas / péptidos para formar bases de Schiff a través de la eliminación de agua (3) interacción de bases de Schiff con proteínas / péptidos para formar puentes de metileno & # x0201C intra o intermoleculares estables & # x0201D.

Sin embargo, en los últimos años, se reportaron diferentes análisis proteómicos de muestras de FFPE (13). El primer desafío encontrado en la proteómica FFPE es la adaptación de los métodos de recuperación de antígenos inducidos por calor, utilizados para inmunohistoquímica (IHC), a la extracción de proteínas del tejido FFPE para lograr aproximaciones proteómicas (7). En los últimos años se han realizado avances considerables en el análisis proteómico de muestras FFPE (9), mejorando la cobertura y el número de proteínas identificadas, estudiando modificaciones postraduccionales (9, 14), utilizando proteómica basada en etiquetas iTRAQ o & # x0201Ensayos sin etiqueta & # x0201D para el análisis cuantitativo (8, 15). Por ejemplo, recientemente, utilizando un método libre de xileno para el paso de desparafinización y una combinación de SDS o urea como tampones para el paso de extracción de proteínas, fue posible la identificación y cuantificación de un conjunto de proteínas de tejidos FFPE utilizando una etiqueta de masa en tándem ( TMT) enfoque de etiquetado (16).

En algunos casos, la literatura es confusa y contradictoria (6, 17), siendo necesaria la estandarización de algunos parámetros como tampones de extracción, pH, temperatura y presión antes del análisis por espectrometría de masas de proteínas de muestras FFPE (9).

En relación con las muestras de tejido renal FFPE, el primer estudio informó sobre un método de mejora para la tinción inmunohistoquímica basado en el calentamiento en horno de microondas de secciones de tejido en presencia de tampones que contienen SDS (18).Dos años más tarde, un estudio desarrollado con muestras de tejido renal de ratón FFPE muestra buenos resultados después de reemplazar el tampón de extracción SDS con otros tampones compatibles con la posterior digestión con tripsina y análisis LC-MS / MS (13). En 2009, se informó sobre una nueva estrategia de recuperación de antígenos inducida por calor utilizando tampón Laemmli que contiene SDS para la recuperación eficaz de proteínas intactas de tejidos fijados con formalina para el análisis posterior mediante transferencia de Western (19). Unos años más tarde, se probaron diferentes tampones de extracción de proteínas en FFPE y muestras de tejido congeladas. Entre ellos, el kit RapiGest permite la identificación de un alto porcentaje de proteínas comunes en muestras de tejido tanto frescas como FFPE (58% del total de proteínas identificadas) (20).

Según resultados anteriores (21), Perroud et al. (22) desarrollaron un método para la extracción de proteínas de muestras de tejidos de carcinoma de células renales (CCR) congeladas y FFPE que permitió la identificación de 105 proteínas significativamente alteradas en el CCR frente al tejido normal. Sprung y col. (23) utilizaron el mismo método con modificaciones menores para probar la reproducibilidad de la cuantificación de péptidos basada en espectrometría de masas de monitorización de reacciones múltiples (MRM) en digestiones trípticas de muestras de tejidos de carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) congeladas y FFPE. Se identificaron un total de 1971 proteínas comunes en muestras de tejidos congelados y FFPE que muestran que el efecto de la fijación de formalina en las proteínas de los tejidos no es un obstáculo para el desarrollo del análisis de espectrometría de masas MRM (23).

También se desarrolló y optimizó un procedimiento eficiente y reproducible para la extracción de proteínas de tejidos renales FFPE (24). Este enfoque produce resultados confiables y perfiles proteómicos biológicamente significativos generados por matrices de proteínas de fase inversa RPPA, una tecnología de alto rendimiento, que puede detectar cambios en los niveles de proteínas y la funcionalidad de las proteínas en numerosos tejidos y fuentes celulares.

Un año después, Craven et al. (15) desarrollaron un análisis sistemático de tejidos renales FFPE normales y malignos para examinar el efecto de las muestras bloqueadas con parafina & # x00027 almacenamiento por edad / tiempo y los niveles de variabilidad técnica y biológica. El análisis proteómico cuantitativo reveló que el porcentaje de proteínas comunes en tejidos normales y malignos era notablemente alto (alrededor del 60%).

En 2014, un estudio reveló que la combinación de microdisección y espectrometría de masas en tándem podría usarse para investigar el proteoma de glomérulos aislados de tejido FFPE en el riñón no recortado de ratas hipertensas de dos riñones con un clip (2K1C) (25).

En 2015, la dimetilación isotópica estable de aminas primarias se utilizó por primera vez para el análisis proteómico cuantitativo de muestras de tejido de carcinoma de células renales de células claras FFPE sin interferencia de la formalina empleada en el proceso FFPE (8). Los cambios en los perfiles de proteomas en muestras de tejido de carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) FFPE se compararon con los de tejido renal no maligno adyacente, encontrando diferencias en los niveles de enzimas glucolíticas, anexinas y proteínas ribosomales y proteasómicas.

En el mismo año, Shen et al. (26) probaron diferentes tampones de extracción de proteínas como tampón basado en Zwittergent, tampón que contiene SDS con / sin polietilenglicol 20000 (PEG20000), tampón que contiene urea y kit de preparación de proteínas FFPE-FASP en diferentes tipos de tejidos FFPE de rata, incluido el corazón , cerebro, hígado, pulmón y riñón. Sus resultados muestran que el tampón Zwittergent era el tampón más eficaz para identificar péptidos y proteínas, compatible con la espectrometría de masas, en estos diferentes tejidos.

Y finalmente, en 2019, otro trabajo (27) muestra nuevamente el uso del tampón SDS como un método eficaz para obtener una buena identificación por espectrometría de masas en varios tejidos. Giusti et al. en el mismo año (28).

En resumen, el método para obtener proteína a partir de muestras de FFPE no está bien establecido y se deben abordar varios temas importantes para asegurar la precisión científica de la proteómica de tejidos de FFPE. Además, la selección del método de desparafinización y el tampón de extracción de proteínas depende del tejido analizado. Por lo tanto, es importante considerar que estos métodos pueden variar en función del propósito del procedimiento y también presentan algunas limitaciones, como la dificultad para identificar proteínas poco abundantes y modificaciones postraduccionales (PTM) (29).

El objetivo principal del presente trabajo es establecer un nuevo protocolo de extracción para la obtención de proteínas no degradadas a partir de muestras de biopsia renal FFPE y ensayar la cantidad mínima de tejido necesaria para obtener suficiente proteína con buena calidad para la posterior espectrometría de masas (LC-MS / MS) análisis. Estas condiciones optimizadas se probarán en glomérulos microdisecados para el futuro descubrimiento de biomarcadores en enfermedades como la glomerulonefritis.


Resultados

Degradación del ARN en estado sólido en presencia o ausencia de una atmósfera húmeda.

Primero evaluamos la estabilidad de dos especies de ARN a temperatura ambiente. Primero, encapsulado βLas muestras de ARNm de -galactosidasa se dejaron hasta 6 meses a temperatura ambiente y se corrieron en un gel de electroforesis (Figura 1a). Sobre la base de las mediciones de la intensidad de fluorescencia de las bandas, se puede concluir que no se produjo una degradación significativa durante este período de tiempo (Figura 1a). A partir de entonces, comparamos la cinética de degradación del ARNr cuando está completamente protegido del aire y cuando se expone al aire. Como se ve en la Figura 1b, el ARN expuesto al aire exhibió una clara degradación: después de 92 semanas a temperatura ambiente, no se pudo ver ninguna molécula de ARNr 28S intacta y el valor de RIN cayó de 7.3 a 2.0. Por el contrario, cuando se protege del aire, el número de RIN se redujo ligeramente de 7,2 a 6,8 después de 23 meses a temperatura ambiente.

Degradación del ARN a temperatura ambiente en presencia o ausencia de atmósfera húmeda. β-Muestras de ARNm de galactosidasa (a) y ARN total (BD) se secaron y encapsularon en atmósfera anóxica y anhidra. Después de la incubación a temperatura ambiente, a -20 ° C oa 90 ° C, se desnaturalizaron alícuotas correspondientes a 500 ng de las cantidades iniciales de ARN durante 3 min a 75 ° C y se procesaron en gel de agarosa. (a) Degradación de HPLC purificado βARNm de -galactosidasa. La proporción de ARNm no degradado en minicápsulas almacenadas a -20 ° C se da debajo de cada carril (los experimentos se realizaron por triplicado, pero se muestra un solo gel representativo). ‘−80 ° C’: ARN almacenado a −80 ° C durante 24 semanas. ‘−20 ° C’: ARN en minicápsulas almacenadas a −20 ° C durante 24 semanas. (B) Degradación del ARN total a temperatura ambiente. La mitad de las cápsulas se abrieron y se expusieron al aire. Las proporciones de las intensidades de fluorescencia del ARNr 28S y el ARNr 18S, así como los valores de RIN, se dan para cada muestra en los carriles respectivos. (C) Degradación total del ARN a 90 ° C en ausencia de aire (condiciones de minicápsula). Las muestras de ARN total se secaron y almacenaron bajo atmósfera anóxica y anhidra en minicápsulas. Se calentaron a 90 ° C bajo 50% de humedad relativa (RH). Se ejecutaron dos cinéticas durante 8 hy 240 h. Se analizaron quinientos nanogramos de muestras de ARN total en geles de electroforesis. La proporción de molécula 28S intacta, medida por el software Bio1D, se indica para cada punto de tiempo (los experimentos se realizaron por triplicado, se muestra un único gel representativo). (D) Igual que en (C), pero con ARN expuesto al aire a 50% de HR (los experimentos se realizaron por triplicado, se muestra un solo gel representativo).

Para cuantificar la diferencia de velocidad de degradación del ARN conservado en presencia o ausencia de una atmósfera húmeda, el envejecimiento del ARN se aceleró mediante calentamiento. La degradación del ARN total se realizó a 90 ° C en cápsulas cerradas o en cápsulas abiertas, y se colocó en una atmósfera de humedad relativa del 50% (era necesario el control de la humedad relativa para mantener el ARN en el mismo estado de hidratación que a temperatura ambiente).

Las Figuras 1c yd muestran que, después de 8 h de exposición al 50% de humedad relativa, la cantidad de banda de ARNr 28S ya no era medible, mientras que, cuando se protegía del aire, todavía estaba presente aproximadamente el 90% de la banda 28S. Las constantes de la tasa de degradación a 90 ° C, k90 ° C, según lo determinado por el ajuste de la curva exponencial fueron 7,7 x 10 −10 / nt / sy 1,9 x 10 −8 / nt / s para el ARN protegido o desprotegido del aire húmedo, respectivamente. Esto corresponde a un aumento de 25 veces en la constante de velocidad de degradación a 90 ° C.

Determinación de la tasa de ruptura de la cadena a temperatura ambiente del ARN de estado sólido protegido con aire

Como la velocidad de degradación del ARN a temperatura ambiente en las minicápsulas fue lenta, no fue posible medirla directamente durante el tiempo del estudio. Sin embargo, se puede estimar utilizando el modelo de Arrhenius sobre datos extraídos de cinéticas ejecutadas a diferentes temperaturas. Para obtener una amplia variedad de muestras, utilizamos muestras de ARN que diferían en su origen (bacterias y líneas celulares humanas) y la naturaleza del tampón de resuspensión utilizado al final de la extracción (Tris-HCl 10 m M pH 7, 10 Tris-HCl m M EDTA 1 mM pH 8 y agua libre de ARNasa pH 7,2). Se realizaron setenta y dos cinéticas a temperaturas que oscilan entre 50 y 130 ° C (no se muestra). La proporción de dos especies de ARN intactas (ARNr 28S humano y E. coli 23S rRNA en muestras de RNA total) se controló a lo largo del tiempo. La Figura complementaria 1, Material complementario, es un ejemplo representativo de esta cinética.

Se utilizó el software R para determinar la constante de velocidad de rotura de hebras. kT de cada una de las cinéticas. los kT Se promediaron los valores y los intervalos de confianza para todas las especies de ARN (28S y 23S). El registro10 de estos valores dio una línea recta cuando se trazó como una función de 1 / T (K −1) (Figura 3). La dependencia de la temperatura de las tasas de ruptura de la cadena de ARN siguió el modelo de Arrhenius. No se encontraron discrepancias entre las constantes de velocidad de rotura de hebras 28S y 23S. Por lo tanto, la tasa de degradación constante a temperatura ambiente en ausencia tanto de agua atmosférica como de oxígeno podría determinarse mediante extrapolación lineal y se estimó en 3,2 10 −13 / nt / sa 25 ° C con un intervalo de confianza del 95% de (2,3– 4,2) 10-13 / nt / s. Este experimento también confirmó la disminución de la estabilidad inducida por la exposición a la humedad (Figura 3, punto de datos de caída).

Dependencia del tamaño de la tasa de degradación del ARN en las minicápsulas

Las constantes de la tasa de degradación a 90 ° C se calcularon para cinco especies de ARNm mediante regresión lineal de los gráficos de Cq valores en función del tiempo (datos no mostrados). Estas constantes de velocidad parecían ser proporcionales a la distancia entre el 5 ′ del terminal poli (A) y el extremo 5 ′ del amplicón (Figura 2) (y= 6,10 −10 * (tamaño en nt), r 2 = 0,84). Esto sugiere que, en las minicápsulas, la velocidad de degradación del ARN depende principalmente de su tamaño y puede considerarse independiente de su secuencia y de la presencia de estructuras locales.

Tasas de degradación en función de la longitud del ARN en varias especies de ARNm. Las muestras de ARN total en minicápsulas se calentaron a 90 ° C para acelerar el envejecimiento. Las reacciones de transcripción inversa se establecieron usando (dT)18 oligonucleótidos. Las reacciones de qPCR se realizaron utilizando un colorante fluorescente SybrGreen y oligonucleótidos de TBP específicos de la transcripción, β2M, GAPDH, TUBA1B y PSMB6 como se describe en Materiales y métodos (ver Tabla 1). Para cada punto de tiempo, el Cq El valor se midió y se representó en función del tiempo. t. La relación Cq= f (t) fue lineal para cada especie de ARNm (no mostrado) y permitió el cálculo de las constantes de velocidad de degradación a 90 ° C, k. k se representó en función de la distancia entre el extremo 3 'de la especie de ARNm (+18 nucleótidos) y el extremo 5' del cebador directo. La línea recta es un ajuste lineal a través de los puntos de datos.

Por fin, el calculado normalizado k los valores para cada especie de ARNm se informaron en el gráfico de Arrhenius (Figura 3, círculos pequeños). Estos valores están de acuerdo con los demás datos resumidos en el gráfico de Arrhenius.

Dependencia de la temperatura de la constante de velocidad de degradación del ARN almacenado en las minicápsulas representadas según el modelo de Arrhenius. Se determinaron las tasas de degradación (k) del ARNr 23S resuspendido después de la purificación en agua (cuadrados abiertos), Tris-HCl-EDTA (diamantes abiertos) o Tris-HCl solo (círculos abiertos) y los del ARNr 28S resuspendido en agua (diamante cerrado). a temperaturas que oscilan entre 50 y 130 ° C con el software R (28S = 5070 nt 23S = 2904 nt, mRNA = 3313 nt). Se calcularon las tasas de degradación de cinco especies de ARNm mediante reacciones RT-qPCR (Figura 2). Tronco10(k) el valor se representó en función de 1 / T. El intervalo de confianza (95%) se calculó con el software R como se describe en Métodos. Como comparación, el registro10También se representó gráficamente (k) correspondiente al ARNr 23S incubado en minicápsulas abiertas al 50% de HR a 90ºC (gota).

Experimentos de validación de QPCR en ARN almacenado en minicápsulas

Dado que las mediciones de RT-qPCR se utilizan ampliamente, en particular para el análisis de la expresión génica, fue necesario realizar este tipo de experimento en muestras de ARN envejecidas. El ARN total humano encapsulado se calentó a 90 ° C durante períodos de tiempo crecientes. Las muestras de ARN rehidratadas se sometieron a una transcripción inversa cebada aleatoriamente y las reacciones de qPCR se ejecutaron en ocho especies de ARN que tienen niveles de expresión muy diferentes en las células HeLa. Como controles, las reacciones de RT-qPCR para amplicones TUBA1B y 18S se realizaron en soluciones de ARN almacenadas a -80 ° C. La figura 4 no muestra cambios significativos o un ligero aumento en la Cq valores para EEF1a1 y βReacciones de qPCR 2M.

Evolución de Cq en función del tiempo a 90 ° C. Reacciones RT-qPCR y Cq Los cálculos se realizaron como se describe en Materiales y métodos en amplicones de las siguientes transcripciones: TUBA1B (diamantes abiertos), PSMB6 (cuadrados abiertos), PPIE (círculos cerrados), TBP (círculos abiertos), EEF1a1 (triángulos abiertos), β2M (cuadrados cerrados), GAPDH (diamantes cerrados) y ARNr 18S (triángulos cerrados). Las pendientes de las regresiones lineales se indican para cada amplicón.

Las eficiencias de PCR de las reacciones de qPCR permanecieron estables sobre la cinética de cada amplicón (las DE de la eficiencia media para cada amplicón estuvieron entre 0,01 y 0,17 y no se correlacionaron con la evolución de la degradación a lo largo del tiempo). Estos datos concuerdan con estudios previos que no muestran cambios en la eficiencia de la PCR con la degradación del ARN. 25

No hay diferencia en Cq Se observaron valores entre la solución de control almacenada a -80 ° C y el ARN encapsulado (TUBA1B: Cq= 20,55 y Cq= 20,54 y ARNr 18S: Cq= 7.7+/−0.15, norte= 4). Estos datos, así como otros (evaluaciones independientes, que se publicarán) sugieren que no hay sesgo en el resultado de RT-qPCR entre el ARN almacenado en las minicápsulas y el ARN almacenado en solución a -80 ° C.

En conclusión, el ARN permaneció compatible con los análisis por RT-qPCR cuando se conservó en minicápsulas (ver Discusión).


Métodos de criopreservación

Congelación frente a vitrificación

La criopreservación se ha convertido en un método bien establecido para preservar células y tejidos [37], incluidos los espermatozoides, los ovocitos y el tejido ovárico y embrionario que ahora se criopreservan a gran escala. Actualmente, los enfoques principales para la crioconservación son la congelación (es decir, la fase líquida cambia a una fase cristalina sólida) y la vitrificación (es decir, la solidificación a un estado similar al vidrio sin formación de hielo), como se ilustra en la Fig. 1. Los métodos de congelación y La vitrificación se distingue comúnmente por si durante el enfriamiento de la muestra se produce o se suprime el crecimiento de los cristales de hielo, respectivamente (Fig. 2). En particular, la congelación se aplica a una amplia gama de volúmenes de muestra, mientras que la vitrificación suele tener un tamaño de aplicación pequeño.

Cómo funcionan los agentes crioprotectores (CPA). A Cuando se enfría una muestra, primero se forma hielo en el espacio extracelular. El hielo excluye los solutos, por lo que la concentración de solutos extracelulares aumenta a medida que el agua extracelular pasa a formar parte de los cristales de hielo. Luego, el agua intracelular se extrae de las células mediante ósmosis. B En células desprotegidas, la concentración de soluto intracelular aumenta y causa daño. C Los CPA penetrantes penetran en la membrana celular y aumentan la concentración de soluto intracelular, lo que evita la pérdida de agua y diluye otros solutos dentro de la célula que pueden causar daño a altas concentraciones. Los bloqueadores de hielo se unen a los cristales de hielo, evitando que crezcan, oa los nucleadores, lo que evita la nucleación heterogénea del hielo. D1, D2 Los CPA penetrantes interfieren con la nucleación homogénea del hielo por interferencia coligativa, que deprime el punto de congelación de la solución. D1 El agua forma una red de hielo regular. D2 Una molécula de CPA interrumpe el enlace de hidrógeno entre las moléculas de agua.

Una sustancia vitrificada (izquierda) se forma cuando el líquido pasa a un estado similar al vidrio altamente viscoso que evita el movimiento molecular de traslación. En la vitrificación, las moléculas permanecen en la posición en la que estaban cuando se vitrificó la sustancia. Esto es diferente a la congelación (derecha), en la que los cristales de hielo crecen progresivamente a medida que disminuye la temperatura, excluyendo los solutos y haciendo que la concentración de solutos aumente.

En la congelación, una velocidad de enfriamiento demasiado baja puede dar lugar a criolesiones debido a los efectos de la solución. Por otro lado, la velocidad debe ser lo suficientemente lenta como para que haya tiempo suficiente para que el agua salga de las células, para evitar la formación de hielo intracelular. La congelación generalmente implica protocolos de enfriamiento lento con velocidades de enfriamiento de aproximadamente 1 ° C / min [38]. Sin embargo, los diferentes tipos de células tienen diferentes velocidades óptimas de enfriamiento [39].

La vitrificación es un proceso físico independiente de la congelación y se produce a la llamada "temperatura de transición vítrea", alrededor de - 80 a - 130 ° C. En la vitrificación, las muestras se solidifican sin formación de cristales de hielo (Fig. 3). Se ha demostrado previamente que la vitrificación de pequeñas muestras biológicas se puede lograr sin CPA utilizando velocidades de enfriamiento extremadamente altas, p. Ej. con esperma humano [40]. En sistemas vivos más grandes donde no se puede lograr una tasa de enfriamiento extremadamente alta, un gran porcentaje del agua en la muestra debe ser reemplazada por un CPA vitrificante para evitar los efectos dañinos de la formación de hielo. La vitrificación finalmente forma un estado similar al vidrio estable, preservando el contenido molecular indefinidamente [41].

Es importante destacar que el calentamiento después de la criopreservación puede provocar lesiones debido a la formación de cristales de hielo, que pueden ocurrir tanto después de la congelación como de la vitrificación. En este sentido, la "recristalización del hielo" denota este proceso dañino de crecimiento de grandes cristales de hielo durante la descongelación de células o tejidos congelados. En particular, y algo contradictorio, "desvitrificación" denota el proceso de cristalización durante el calentamiento y después de la vitrificación. Por lo tanto, la desvitrificación no significa el proceso de calentamiento de una solución vitrificada, sino la formación o recristalización de cristales de hielo durante el recalentamiento.

En la vitrificación, los CPA se utilizan principalmente para inhibir la formación de hielo al reducir el punto de congelación de la solución y aumentar su viscosidad y la temperatura de transición vítrea. De esta manera, los CPA disminuyen la tasa de enfriamiento crítica para la vitrificación (Vccr) [42], lo que permite que la muestra se solidifique antes de que se produzca la formación de hielo [43]. En particular, los CPA también pueden afectar las tasas críticas de calentamiento y, por lo tanto, reducir el riesgo de desvitrificación. ¿Cuáles son los requisitos para que los tejidos vitrifiquen y experimenten una transición al estado de tipo vidrio? Lo más importante es que la velocidad de enfriamiento debe ser lo suficientemente alta para evitar la formación de hielo. En particular, la vitrificación requiere concentraciones muy altas de CPA para reducir Vccr a niveles prácticos. Desafortunadamente, el impacto tóxico en las células causado por estos CPA concentrados es problemático [44]. Este problema puede mitigarse hasta cierto punto, como se explica más adelante en la sección "Agentes crioprotectores (CPA)".

Aunque el enfriamiento lento y la vitrificación están bien establecidos y se utilizan para diversas aplicaciones, cada uno tiene sus ventajas y desventajas. Por ejemplo, el registro de protocolos de enfriamiento lento es práctico, lo que facilita la demostración del cumplimiento de los procedimientos operativos estándar y las buenas prácticas de fabricación. Sin embargo, a menudo requiere equipos relativamente costosos [45]. Además, aunque el enfriamiento lento requiere más tiempo, esta aparente desventaja puede implicar una distribución más homogénea de los CPA [46], que necesitan difundirse e impregnar el espacio extracelular para tener un efecto completo. Además, el proceso de enfriamiento más lento y controlado en enfriamiento lento es más adecuado para protocolos cuantificables y reproducibles. Por lo tanto, la dinámica de la temperatura dentro del volumen de la muestra es más fácil de modelar de manera cuantitativa. Sin embargo, el hielo extracelular formado durante el enfriamiento lento también puede tener efectos adversos. Queda por investigar cómo ese daño depende de las tasas de enfriamiento y descongelación, así como de los CPA.

El enfriamiento rápido por debajo de la temperatura de transición vítrea y / o el calentamiento rápido desde debajo de la temperatura de transición vítrea durante el proceso de calentamiento pueden inducir la fractura del vidrio en el que está incrustado el sistema biológico [43, 47, 48]. Las tasas de enfriamiento y calentamiento por tipo celular o tejido específico pueden potencialmente evitar los problemas de desvitrificación y recristalización, y se requiere más investigación para desarrollar tales soluciones (se puede encontrar más información en Fahy y Wowk, 2015, p. 45). En particular, tales protocolos altamente adaptados pueden ser problemáticos con respecto a la criopreservación de órganos que comprenden diferentes tipos de células o tejidos.

La Tabla 1 resume las diferencias clave entre estos enfoques principales. Es importante destacar que no existe un estándar de oro en la criopreservación, y los diferentes laboratorios a menudo emplean sus propios protocolos de procesamiento criogénico que pueden diferir sustancialmente de los enfoques de otros laboratorios.

Congelación direccional y vitrificación direccional

La congelación direccional (también llamada solidificación direccional) es un método en el que se utiliza un gradiente de temperatura para provocar el crecimiento progresivo del hielo a lo largo del gradiente de temperatura (Fig. 4). Esto se puede lograr moviendo la muestra a lo largo del gradiente a una velocidad controlada o colocando la muestra entre dos bloques termoconductores. En la congelación convencional, el calor latente de fusión liberado durante la congelación se conduce a través de la porción congelada de la muestra, esto puede hacer que se derrita y puede resultar en ciclos repetidos de congelación-descongelación que pueden causar un mayor daño celular. La morfología y la tasa de crecimiento del hielo no están controladas y no son uniformes. En la congelación direccional, el calor se elimina por conducción a través de la parte no congelada de la muestra, evitando daños por los ciclos de congelación-descongelación. El crecimiento direccional del hielo da como resultado la formación de laminillas con células atrapadas entre ellas, lo que reduce el daño mecánico [49]. La congelación direccional también permite un enfriamiento más rápido sin inducir la formación de hielo intracelular [50].

En la congelación direccional, se aplica frío a un lado de la muestra provocando un gradiente de temperatura. Se forman laminillas de hielo uniformes a lo largo de este gradiente y el calor se conduce a través de la parte no congelada de la muestra.

La congelación direccional se ha utilizado para enfriar la extremidad trasera de una rata a - 140 ° C antes de sumergirla en nitrógeno líquido (LN2). A continuación, las extremidades traseras se revivieron con éxito y se trasplantaron de nuevo a las ratas. Si bien estas extremidades no eran funcionales debido a que las neuronas motoras habían sido cortadas durante la amputación, las extremidades eran viables por lo demás [51]. La congelación direccional también se ha utilizado para la crioconservación satisfactoria del hígado de un cerdo a -20 ° C. Posteriormente, el hígado fue revivido y unido a otro cerdo mediante un trasplante auxiliar y demostró una producción de bilis y un flujo sanguíneo normales [52].

Una técnica relacionada es la vitrificación direccional, que se logra utilizando el mismo principio que la congelación direccional, pero con una tasa de enfriamiento muy alta. La información sobre la vitrificación direccional es limitada, sin embargo, esta técnica puede permitir la vitrificación con concentraciones de crioprotector tan bajas como 17,5% PG [53].

Tanto la congelación direccional como la vitrificación direccional son ricas avenidas para la investigación futura. El trabajo adicional sobre la congelación direccional debería tener como objetivo reducir aún más la temperatura a la que los órganos pueden congelarse a - 130 ° C, la temperatura a la que se puede lograr el almacenamiento sin degradación durante siglos o milenios [54].


¿Existe una fuente confiable de almacenamiento y estabilidad de agentes reductores como el DTT? - biología

Se ha observado ampliamente que los tejidos cancerosos tienden a tener acumulación de hierro posiblemente en todos los tipos de cáncer [1]. El conocimiento actual es que en los sitios de inflamación crónica donde el estado de oxidación es alto, los glóbulos rojos atraídos allí pueden tener sus membranas plasmáticas oxidadas y dañadas, lo que lleva a su senescencia prematura debido a su falta de capacidad de reparación de membranas y la absorción por macrófagos. Algunos de los hierros que llevan se transferirán de los macrófagos a las células locales [2]. Una consecuencia importante de la acumulación de hierro en un ambiente de alta concentración de H2O2 es la aparición de la reacción de Fenton: Fe2 + + H2O2 -> Fe3 + +? OH + OH- [3]. Si el ambiente también es rico en moléculas que pueden reducir Fe3 + a Fe2 +, la reacción de Fenton continuará produciendo el radical más reactivo, el radical hidroxilo (? OH) que las células humanas pueden generar. A diferencia de otros radicales como el superóxido o el óxido nítrico, los radicales hidroxilo no tienen un eliminador natural codificado en nuestro genoma, por lo tanto, las células humanas afectadas por tales reacciones pueden utilizar cualquier molécula cercana como sacrificio ¡° ¡± para consumir los radicales y proteger los más esenciales componentes de ser dañados ¨ c por supuesto, esto se logra a través de la selección natural. Numerosos estudios han informado observaciones de reacciones de Fenton en el cáncer [4 - 7]. Esto es de esperar, sabiendo que los cánceres tienden a tener estados de oxidación elevados junto con la acumulación de hierro. Los estudios publicados han identificado Fe2 + en grupos de hierro-azufre (como dominios de proteínas) como una fuente común de Fe2 + para la reacción de Fenton [8]. Varias moléculas pueden reducir Fe3 + a Fe2 +, como glutatión, NADH, ácido ascórbico y S2- en los mismos grupos de hierro-azufre del hierro, lo que puede conducir a reacciones de Fenton continuas. Entre los dos productos de las reacciones de Fenton, alpha OH y OH-, los estudios publicados se han centrado prácticamente todos en el impacto de los radicales hidroxilo, que pueden dañar lípidos, proteínas, ADN, ARN y glicanos. Estos estudios generalmente especulan que los daños en el ADN debido a los radicales hidroxilo son la conexión entre la reacción de Fenton y el cáncer. Hasta donde sabemos, ninguno de estos estudios ha informado sobre el impacto de OH- y su posible vínculo con el cáncer. A primera vista, el OH-, producido a una estequiometría 1: 1 con? OH por reacciones de Fenton, parece ser inofensivo, pero en grandes cantidades, puede alterar estados celulares clave, a saber, el pH y la electroneutralidad de la célula huésped. lo que puede conducir a cambios fundamentales en la química y física celular, incluidos cambios en las conformaciones plegadas de las proteínas y sus funciones. Hemos realizado un análisis estadístico y de modelado de datos transcriptómicos de 14 tipos de cáncer, todos de la base de datos TCGA, que representan todos los tipos de cáncer en TCGA que tienen un número suficientemente grande de tejidos de control y de cáncer, junto con 16 tipos de cáncer crónico no canceroso. enfermedades inflamatorias de la base de datos GEO (véanse las Tablas complementarias S1 y S2) para abordar las siguientes preguntas: ¿Podemos establecer más allá de una duda razonable la aparición de reacciones de Fenton en compartimentos subcelulares específicos en el cáncer a través del análisis de los datos transcriptómicos? En caso afirmativo a (i), ¿cómo se absorben las moléculas de? OH y OH- en las células afectadas por la reacción de Fenton? ¿Cómo se relacionan las respuestas celulares a? OH y OH- con el desarrollo del cáncer?

Hemos observado que todos los cánceres en estudio tienen niveles elevados de H2O2 y hierro en comparación con los controles (consulte las Figuras complementarias S1 y S2). Juntos dan lugar a un aumento de las reacciones de Fenton en el citosol, las mitocondrias y la matriz extracelular (MEC) y el espacio en las células cancerosas y algunas enfermedades inflamatorias crónicas.

Las tres preguntas se abordan estableciendo estadísticamente la aparición de reacciones de Fenton en ubicaciones subcelulares específicas y vinculando funcionalmente las respuestas celulares a? OH y OH- al desarrollo del cáncer. La idea clave para establecer tal ocurrencia es mediante (1) predecir, para cada ubicación, la fuente y el nivel de Fe2 + accesible a las reacciones de Fenton, la fuente y el nivel de H2O2, los sumideros de? OH y sus niveles, y posibles moléculas. para reducir Fe3 + a Fe2 + y sus cantidades (2) evaluar el nivel de concordancia entre los dos lados de la ecuación de reacción, usando estas cantidades estimadas en base a expresiones de genes relevantes y la ecuación de Michaelis-Menten y (3) evaluar la significancia estadística en logrando el nivel de acuerdo observado. La inferencia funcional se centra en cómo las células responden a OH-. A continuación se resume la información fundamental para nuestros análisis. Movimiento del hierro dentro del citosol: los hierros citosólicos se pueden dividir en tres grupos: los que se encuentran en los sitios funcionales de las proteínas, la reserva de hierro lábil (LIP) y las ferritinas, donde cada sitio funcional, un grupo de hierro-azufre o hemo, contiene algunas ferritinas Fe2 +. proteínas de almacenamiento de hierro, cada una con hasta 4500 iones Fe3 + y un LIP es una colección de hierro quelado, en forma Fe2 + o Fe3 + [9]. LIP es el grupo candidato para hierros funcionales y almacenamiento temporal de Fe3 +, del cual se recuperan los iones Fe2 + y luego se agregan a las proteínas ¡¯ sitios funcionales cuando es necesario y en los que se colocan los iones oxidados. El transporte de hierro entre LIP y ferritinas se realiza en lotes, es decir, las ferritinas enteras se mueven y se degradan en los lisosomas cuando se necesitan iones Fe2 + adicionales en LIP, y sus hierros se liberan en el citosol después de reducirse a Fe2 + y quelarse [10] (ver Suplementario Figura S3). Los iones Fe3 + liberados a través de la degradación lisosomal de ferritinas son reducidos por moléculas como glutatión, ascorbato o superóxido (? O2-). Algunas reacciones reductoras pueden producir cada una un H +, es decir, cuando los agentes reductores están en forma de RH2 como el ácido fólico o ascórbico, pero otras no lo harán como en Fe3 + +? O2- -> Fe2 + + O2. Actualmente, no hay datos disponibles para estimar el porcentaje de ocurrencia de cada tipo entre los dos. Entonces asumimos que ambos ocurren cada uno con una fracción sustancial. Cuando un grupo de hierro-azufre se daña oxidativamente, será reemplazado por uno nuevo que contenga iones Fe2 +. Por lo tanto, las reacciones de Fenton pueden tener lugar en la misma proteína repetidamente. Reacción y respuestas de Fenton: si bien las reacciones de Fenton pueden tener lugar con iones Fe2 + quelados en LIP como se informó, nos enfocamos en reacciones que involucran grupos de hierro-azufre solo porque no tenemos una forma confiable de estimar el nivel de dicha reacción de Fenton usando datos transcriptómicos. Nuestro análisis sugiere que esta simplificación no altera los principales resultados del estudio. En reacciones de Fenton repetidas con grupos de hierro-azufre dañados reemplazados por otros nuevos, la reducción de los hierros oxidados tendrá lugar en lugares diferentes de los sitios de reacción de Fenton, es decir, lisosomas de una manera retardada. Por tanto, el OH- producido por las reacciones citosólicas de Fenton puede tener dos destinos posibles: neutralizado por el H + generado por la correspondiente reacción reductora como se discutió anteriormente o por un protón en el tampón de pH intracelular. Esto último se convierte en un estrés cuando la cantidad de tal OH- es lo suficientemente grande como para abrumar el tampón de pH. Por tanto, la pregunta es: ¿cómo responden las células cancerosas a la producción continua de tal OH-? Se observaron fuertes correlaciones entre la tasa estimada de producción de OH y la tasa de síntesis de ATP por glucólisis, o simplemente síntesis de ATP glucolítico, en los 14 tipos de cáncer. Análisis posteriores y revisión de la literatura revelaron: síntesis de ATP glucolítico: glucosa + 2 ADP3- + 2 HPO42- -> 2 lactato- + 2 ATP4- tiene un pH neutro mientras que la síntesis de ATP basada en la respiración: ADP3- + HPO42- -> ATP4- + OH - cada uno consume un H +. Por tanto, el consumo de cada ATP glicolítico genera un H + neto pero no el ATP generado por la respiración, ya que la hidrólisis del ATP: ATP4- + H2O = ADP3- + HPO42- + H + libera un H + [11]. En base a esto, nuestra hipótesis (I) es: la inducción de la síntesis de ATP glucolítico y su consumo son una respuesta celular a la producción de OH- desequilibrado por las reacciones citosólicas de Fenton. Para las reacciones de Fenton mitocondriales, se observan correlaciones entre las tasas de reacción estimadas y la ATP sintasa en los 14 tipos de cáncer. El OH- producido por tales reacciones neutralizará el H + dentro de la membrana interna mitocondrial y, por lo tanto, generará un gradiente de H + en los dos lados de la membrana sin consumir glucosa u otros nutrientes. Por tanto, nuestra hipótesis (II) es: las reacciones de Fenton mitocondriales impulsan la síntesis de ATP. También se observan fuertes correlaciones entre las reacciones de Fenton en el citosol, así como el área extracelular y la progresión del ciclo celular. Estudios previos han establecido que (a)? OH puede dañar las proteínas, el glucano de la superficie celular y la matriz extracelular (b) la ubiquitinación, un proceso que etiqueta las proteínas dañadas para la proteólisis del proteasoma, está estrechamente relacionado con el control del ciclo celular [12], y el aumento de la actividad de ubiquitinación puede impulsar algunas fases de la progresión del ciclo celular (c) las MEC dañadas son señales tempranas para la reparación tisular [13] y (d) los glucanos de la superficie celular unidos a O dañados son oncogénicos [14, 15]. Al integrar todo esto, planteamos la hipótesis (III): las proteínas dañadas, el glucano de la superficie celular y la ECM por reacciones de Fenton generan señales para impulsar la progresión del ciclo celular.

Reacciones de Fenton en el citosol

La hipótesis (I) se valida mediante (a) demostrando la ocurrencia de reacciones de Fenton citosólicas modelando la reacción usando la ecuación de Michaelis-Menten y mostrando que la significancia estadística en la satisfacción del modelo por las cantidades relevantes es alta y (b) enlazando funcionalmente ATP glucolítico síntesis para neutralizar la reacción de Fenton generó OH-. Sabiendo que Fe2 + no es consumido por reacciones de Fenton continuas, reescribimos la reacción como: RA + H_2 O_2¡ú + OH ^ - + X ^ + con Fe2 + como catalizador, donde X + es el RA oxidado más un H + en algunos casos como Discutido antes. Nuestro objetivo aquí es mostrar que la tasa de producción de? OH se puede estimar de manera confiable usando [Fe2], [H2O2] y [RA], cada uno derivado usando datos de expresión génica, a través de la ecuación representada en una ecuación de Michaelis-Menten. Demostramos que (1) [? OH] calculado usando la ecuación anterior está en buen acuerdo con el [? OH] estimado usando mRNA de proteasoma y genes de degradación de mRNA, que están sustancialmente regulados al alza (Figuras complementarias 4 y 5) ( 2) la significación estadística para lograr la concordancia observada en (1) es alta y (3) la significación estadística en los genes regulados positivamente utilizados en el modelo es alta, para los 14 tipos de cáncer. El resultado para (1) se da en la Tabla 1 (¡° valor R2 promediado ¡±) y (2) y (3) se pueden ver en la segunda, tercera y quinta columnas de la tabla, donde la significancia estadística en el ajuste de cada El modelo se evalúa mediante una prueba de permutación en el R2 de cada modelo ajustado. Claramente, los valores de R2 y la significación estadística asociada son altos para los 14 tipos de cáncer, y al menos uno de los otros dos valores de significación estadística es alto para cada tipo de cáncer. Estos datos proporcionan pruebas sólidas de la aparición de reacciones de Fenton citosólicas en los 14 tipos de cáncer. Estimar de manera confiable [OH-], independientemente de la estimación de [? OH], es un desafío. En principio, [OH-] debería ser igual a la cantidad de ATP glucolíticos sintetizados, [GLY-ATP], específicamente los protones liberados cuando se consumen estos ATP, según la hipótesis (I) pero los protones, H + R, producidos por las reacciones reductoras del Fe3 + en las correspondientes reacciones citosólicas de Fenton complican la situación porque solo algunas reacciones reductoras (porcentaje desconocido) liberan protones de manera retardada como se discutió anteriormente. Por lo tanto, bajo la condición de que se liberen H + R después de que todos los OH- hayan sido neutralizados, deberíamos tener [OH-]? [GLY-ATP] y [H + R]? [LAC], siendo [LAC] la cantidad de ácido láctico sintetizado. Es decir: todos los OH- son neutralizados por H + generado al consumir GLY-ATPs cuando se liberan H + R, su correspondiente OH- ya está neutralizado y por lo tanto necesitan ser secretados, posiblemente junto con lactatos, para mantener la estabilidad del pH intracelular. . Por otro lado, si todos los H + R se liberan instantáneamente con la generación del correspondiente OH-, deberíamos tener [OH-]? [GLY-ATP] + [H + R]. En la situación general, si X de H + R se liberan instantáneamente con la generación del correspondiente OH-, deberíamos tener: [OH-]? [GLY-ATP] + [X] y [H + R] ¨C [X] = [LAC]. Si bien no conocemos [H + R] ni [X], notamos que [OH-] (medido usando [? OH]) y [GLY-ATP] + [LAC] están fuertemente correlacionados (ver Figura complementaria S6) . Por lo tanto, predecimos: la síntesis de ATP glucolítico se usa predominantemente para producir H + para neutralizar el OH- generado por las reacciones citosólicas de Fenton y los protones excesivamente producidos para este propósito debido a la liberación retardada de protones a través de la reducción del Fe3 +, se secretan extracelularmente. Múltiples evidencias apoyan esta predicción. Por ejemplo, los 14 tipos de cáncer utilizan la glucólisis y la gluconeogénesis simultáneamente, lo que se correlaciona con las reacciones de Fenton citosólicas previstas. Se sabe que el efecto neto de la ejecución simultánea de estos dos procesos es el consumo de ATP y GTP, es decir, para liberar solo protones. Además, el aumento de la síntesis de ATP glicolítico y la generación de protones mediante el consumo de estos ATP coinciden con la disminución de las expresiones de los genes que codifican las enzimas que limitan la velocidad del ciclo del TCA, el importador de ácido láctico y los intercambiadores múltiples de Na + / H + (véase la Figura complementaria S7).Nuestra pregunta ahora es: ¿qué procesos biológicos utilizan estos ATP glucolíticos en general en los 14 tipos de cáncer? Un análisis de coexpresión reveló que incluyen: síntesis de ARNt de aminoacilo, síntesis de nucleótidos, reparación por escisión de bases y metabolismo de glioxilato y dicarboxilato, que participa en el mantenimiento de la estabilidad del pH (Tabla complementaria S4). Además, también examinamos los datos de expresión génica de 16 tipos de enfermedades inflamatorias crónicas (consulte la Tabla complementaria S3) y detectamos reacciones de Fenton citosólicas en seis de las 16. En estas seis enfermedades, las siguientes se correlacionan con la glucólisis: síntesis de aminoacil tRNA, síntesis de purinas, reparación por escisión de bases y metabolismo del glioxilato y dicarboxilato. Por lo tanto, existe un patrón consistente en términos de procesos activados para consumir ATP glucolíticos a través de las reacciones de Fenton que afectan a los citosoles tanto del cáncer como de la enfermedad inflamatoria crónica y la síntesis de nucleótidos se encuentra entre ellos. Una posible explicación para ¡° por qué la síntesis de nucleótidos? ¡± es: es más exigente de ATP, por lo tanto, capaz de liberar rápidamente protones cuando se utilizan ATP glucolíticos y el conjunto de nucleótidos tiene una capacidad muy grande, es decir, capaz de hacer frente a grandes cantidades de nucleótidos sintetizados. Vale la pena enfatizar que la síntesis de nucleótidos aquí es impulsada por la necesidad de neutralizar el OH producido por las reacciones de Fenton. Una pregunta natural es: ¿adónde van finalmente los nucleótidos sintetizados continuamente? Nuestra hipótesis es: la acumulación de los nucleótidos sintetizados ejerce una fuerte presión sobre las células huésped, a lo que las células responden canalizando los nucleótidos hacia la síntesis de ADN y, en última instancia, extrayendo el ADN a las nuevas células hijas a través de la división celular. Esto, como se analiza a continuación, es una razón clave para la proliferación celular continua observada en el cáncer. En humanos, la división celular es un proceso de arriba hacia abajo impulsado por códigos genéticos preprogramados para el crecimiento o reparación de tejidos. Por el contrario, la proliferación de células bacterianas es un proceso ascendente, impulsado por la disponibilidad de nutrientes basados ​​en carbono. Se ha establecido que todos los eventos clave que conducen a la división celular, a saber, el crecimiento del tamaño celular, la replicación cromosómica y la segregación cromosómica, son impulsados ​​por nutrientes [16]. Especulamos que las células cancerosas (y formadoras de cáncer) pueden haber utilizado un programa similar para activar el proceso de división celular para deshacerse de sus nucleótidos, posiblemente asistido por señales discutidas en la Sección 5. Los estudios publicados sugieren que la abundancia de nucleótidos y ATP puede impulsar la replicación del ADN sin señales descendentes para la división celular humana. Por ejemplo, ciertos nucleótidos como los dNTP pueden impulsar ¡° ¡± replicación incontrolada del ADN [17] la abundancia de ATP y nucleótidos puede conducir a la formación del complejo Pre-RC necesario para el inicio de la replicación del ADN [18] y la apertura doble El ADN de cadena simple [19] y el ADN monocatenario rico en timina pueden activar la helicasa de mantenimiento de minicromosomas y la ATPasa [20], las cuales desempeñan un papel clave en la replicación del ADN. Sin embargo, todavía falta una comprensión a nivel de sistemas de cómo estas condiciones, posiblemente más las discutidas en la Sección 5, pueden impulsar la replicación del ADN. Para investigar más a fondo este tema, hemos realizado un análisis de coexpresión entre la síntesis de nucleótidos y algunas vías posteriores, a saber, reparación de ADN, replicación de ADN, síntesis de ARN POL I, síntesis de ARNt de aminoacilo y ciclo celular, en las seis enfermedades inflamatorias mencionadas anteriormente y todas 14 tipos de cáncer, para obtener información sobre cuáles podrían ser las principales salidas de los nucleótidos sintetizados a medida que evoluciona una enfermedad, como se resume en la Tabla complementaria S5. La información clave obtenida incluye: (1) la síntesis de nucleótidos no está fuertemente correlacionada con la progresión del ciclo celular en las seis enfermedades inflamatorias crónicas (2) mientras que está más correlacionada con el ciclo celular en los cánceres, el nivel de correlación fluctúa entre diferentes cánceres y no es casi tan fuerte como con la reparación del ADN, lo que sugiere que la síntesis de nucleótidos, la síntesis de ADN y la progresión del ciclo celular no están coordinadas a través de la regulación como en las células proliferantes normales y (3) la síntesis de nucleótidos se correlaciona fuertemente con la reparación del ADN tanto en enfermedades inflamatorias como en cánceres, lo que sugiere que la reparación del ADN puede ser un inductor clave de la síntesis de nucleótidos.

Reacciones de Fenton en las mitocondrias

Hemos demostrado la aparición de reacciones de Fenton mitocondriales en los 14 tipos de cáncer de una manera similar a la de la sección anterior. Específicamente, mostramos una fuerte significación estadística en el nivel observado de concordancia entre el nivel de reacciones de Fenton estimado en función de las expresiones de genes de degradación de proteínas mitocondriales y el nivel calculado utilizando el [Fe2], [H2O2] y [RA] estimados y el Michaelis -Ecuación de Menten. Como antes, todos los parámetros se seleccionan de manera óptima utilizando una regresión no lineal sobre ¡¼ [H_2 O¡½_2], [Fe ^ (2+)] y [RA] contra [? OH], cada uno de los cuales se estima como se detalla en Métodos. . La Tabla 1 muestra la calidad de nuestra estimación de los niveles de reacción de Fenton y la significancia estadística relacionada en los 14 tipos de cáncer. En general, los datos sugieren fuertemente la aparición de reacciones de Fenton mitocondriales. La estimación de [OH-] y la predicción de las respuestas relevantes son más complicadas. Una vez que el Fe2 + se oxida a Fe3 + por H2O2 en un grupo de hierro-azufre, se puede reducir a Fe2 + por varias moléculas de al menos tres tipos: (1) superóxido (? O2-) a través de la reacción: Fe3 + +? O2- -> Fe2 + + O2, donde el nivel de? O2- se puede estimar utilizando el nivel de ARNm de la superóxido dismutasa mitocondrial SOD2 (2) NADH, que debería estar disponible si el ciclo de TCA está activo y (3) S2- en el mismo grupo de hierro-azufre a través de cualquiera de las siguientes reacciones. o En cualquier caso, un Fe3 + se reduce a Fe2 + mediante la siguiente reacción combinada: Cada uno de los tres casos contribuye a la neutralización de algo de H + dentro de la membrana interna mitocondrial, pero de diferentes formas. Para (1), la reducción no genera H +, de ahí que el OH- neutralice un H + mitocondrial. Para (2), la reacción tampoco produce protones si NADH / NAD se trata como un sistema cerrado, es decir, el número de electrones que ingresan al sistema es el mismo que el de los que salen de él, por lo tanto, no hay electrones consumidos o generados por su solicitud. (3) es un caso interesante. El SO42- es muy dañino para las mitocondrias del huésped y, por lo tanto, se exporta después de su generación por un antiportador (SLC25A10), que intercambia un SO42- por un di-carboxilato, ya sea malato o succinato [21]. Ambos son electrolitos más débiles en comparación con los sulfatos. En consecuencia, la concentración de H + mitocondrial disminuye a medida que las reacciones de Fenton y este intercambio continúan. Potencialmente, podría haber otras reacciones reductoras de Fe3 +, cada una posiblemente produciendo un protón y, por lo tanto, el OH- correspondiente no contribuye a la neutralización del H + mitocondrial. Los análisis siguientes indican que una fracción sustancial de las moléculas de OH- producidas por la reacción de Fenton no es neutralizada por tales protones. Como antes, las reacciones de Fenton pueden continuar a través de cualquiera de los mecanismos anteriores o al tener un nuevo grupo de hierro-azufre para reemplazar uno dañado. En general, las moléculas de OH- generadas por las reacciones de Fenton mitocondriales reducen la concentración de H + dentro de las mitocondrias internas, creando así un gradiente de H + en los dos lados de la membrana interna y conduciendo a la síntesis de ATP como en un proceso de respiración normal. La razón es: el pH citosólico permanece en el rango normal, es decir, no aumenta por las reacciones de Fenton citosólico, sabiendo que todos los cánceres secretan continuamente protones junto con lactatos. Además, el pH en el área entre las membranas interna y externa es el mismo que el pH citosólico, ya que los protones pueden atravesar la membrana externa mitocondrial libremente. Si bien una estimación precisa de la tasa de producción de OH- por reacciones de Fenton mitocondriales no es realista con los datos que tenemos, es adecuado usar (3) (es decir, la expresión de SLC25A10) anterior para estimar la tasa ya que es un límite inferior de tal OH-. Como era de esperar, la expresión de SLC25A10 se correlaciona con la expresión que refleja el nivel de [? OH] (Tabla complementaria S6). Una desventaja de usar esto para estimar [OH-] es que hace que los valores de correlación en la Tabla S6 sean más bajos que los reales. Para demostrar aún más que el OH generado por las reacciones de Fenton puede contribuir a la producción de ATP, observamos fuertes correlaciones entre las tasas estimadas de genes de síntesis de OH y ATP, como se detalla en la Tabla complementaria S7 y un modelo en la Figura S9. Otro dato de apoyo clave para nuestro modelo es que los 14 tipos de cáncer tienen una mayor expresión de algunos transportadores de UCP, que mueven H + hacia adentro a través de la membrana interna de las mitocondrias sin producir ATP (Tabla complementaria S8). Esto sugiere fuertemente que se consumen cantidades sustanciales de moléculas de H + dentro de las mitocondrias internas, de ahí la necesidad de reposición desde el exterior. Se ha especulado anteriormente que los cánceres parecen tener ATP ilimitados [22, 23], aunque no se han identificado fuentes confiables para los ATP. Nuestro modelo proporciona una explicación de la posible fuente de la gran cantidad de ATP. Especulamos que mientras que los ATP glicolíticos se utilizan para la síntesis de nucleótidos, la mayoría de las necesidades de ATP por otras actividades celulares se satisfacen mediante la síntesis de ATP mitocondrial a través de la reacción de Fenton y / o la respiración. Esta hipótesis podría abordarse rigurosamente mediante análisis detallados de los términos relevantes utilizando modelos como la ecuación de Michaelis-Menten.

Reacciones de Fenton en la matriz y el espacio extracelulares

Se observan actividades de síntesis sustanciales de glucosaminoglicanos y colágenos de ECM, degradación de proteínas y glucanos de superficie celular de manera correlacionada, lo que sugiere fuertemente que estas moléculas están dañadas por fuentes comunes (Tablas complementarias S9 y S10). Este parece ser un patrón común con las células afectadas por la reacción de Fenton, donde las células (re) sintetizan biomoléculas dañadas por las reacciones de Fenton como sacrificio para evitar que los radicales hidroxilo dañen directamente componentes más esenciales de las células. Hemos aplicado un enfoque similar a los de las secciones anteriores para establecer la ocurrencia de reacciones de Fenton en la matriz y el espacio extracelulares y evaluar la significancia estadística asociada con las siguientes diferencias: (1) resulta difícil estimar la concentración extracelular de la elementos reductores [RA], por lo tanto, no incluimos [RA] en nuestros análisis asumiendo que no limita la velocidad (2) también es un desafío encontrar genes marcadores para estimar [OH-], por lo tanto, consideramos el impacto de? OH solo , sabiendo que el impacto de OH- es probablemente limitado en el espacio extracelular donde se sabe que el pH es bajo (3) aquí se usa un enfoque de regresión en lugar de la ecuación de Michaelis-Menten considerando la simplicidad del problema y (4) no Se han identificado proteínas que contienen hierro en ECM que tienen fuertes correlaciones con [? OH] pero, curiosamente, algunas proteínas que contienen cobre son relevantes ¨C cobre o cualquier metal transitorio puede tener rea de Fenton cciones como el hierro cuando el H2O2 es alto. Por lo tanto, usamos [Cu1 +] para establecer estadísticamente la ocurrencia de la reacción de Fenton, como se resume en la Tabla 1. Los análisis detallados se dan en Métodos. También hemos examinado los genes de síntesis del glicano de la superficie celular, tanto ligados a O como a N. Si bien se observa una regulación al alza sustancial de los genes de síntesis para ambos tipos de glucanos, lo que sugiere sus daños, estos genes no muestran correlación con las reacciones de ECM Fenton predichas, lo que indica que el glucano está dañado por otras fuentes. Nuestra búsqueda detectó una serie de proteínas que contienen hierro en el espacio extracelular, pero no en la matriz, cuyas expresiones génicas se correlacionan fuertemente con la expresión total de los genes de síntesis del glicano O-ligado. Por lo tanto, predecimos que los daños al glucano ligado a O se deben a reacciones de Fenton asociadas con estas proteínas, que se correlacionan con los genes de síntesis de glucano ligado a O en los 14 tipos de cáncer (Tabla complementaria S11). Se ha descubierto que los genes de síntesis de glucanos ligados a N no se correlacionan con estas proteínas que contienen hierro, lo que sugiere que están dañadas por otra fuente. Nuestra búsqueda encontró que se correlacionan fuertemente con las reacciones citosólicas de Fenton. Si bien es sorprendente, este resultado tiene sentido, sabiendo que el glicano ligado a N se sintetiza primero en la superficie del RE que apunta al citosol y luego se devuelve al RE después de que se realiza la síntesis, se instala en una proteína objetivo y se coloca en la superficie celular. . Por lo tanto, estos glicanos pueden haber sido dañados por reacciones de Fenton citosólicas cuando se sintetizan, lo que ha desencadenado su resíntesis y daños adicionales por reacciones de Fenton extracelulares pueden no hacer mucha diferencia en términos de que estas moléculas se vuelvan a sintetizar o no. La Tabla complementaria S11 y la Figura S10 resumen la información relevante. Radicales hidroxilo, progresión del ciclo celular y citocinas Se realizó un análisis de coexpresión, guiado por la hipótesis (III), sobre los genes de síntesis de: sulfatos de heparina, condroitina y queratina y colágenos de ECM, glicanos ligados a O y ligados a N, ubiquitina genes y genes marcadores para diferentes fases del ciclo celular. Para comprender los posibles roles que juegan los daños y la resíntesis de estas moléculas en la progresión del ciclo celular, revisamos brevemente la relación entre las dos. El ingreso al ciclo celular puede ser impulsado por la disponibilidad de factores de crecimiento o el cambio en el volumen celular [24], y la progresión continua del ciclo celular puede ser impulsada por la regulación al alza de la ciclina D, pero las células deben pasar con éxito algunos puntos de control para que estén listas para moverse. a la siguiente fase. En el punto de control G1 / S, las células comprueban la disponibilidad de nutrientes y material para las actividades de síntesis en la fase S con la ciclina E regulada al alza que mantiene la progresión del ciclo celular. El paso exitoso de este punto de control está marcado por la regulación positiva de la proteína SKP2, que degrada la ciclina E y mueve las células a la fase S. Este procedimiento se repite en las fases S y G2, mediante la regulación al alza de las ciclinas A y B, cada una de las cuales mantiene la progresión del ciclo en los puntos de control S / G2 y G2 / M, seguida de su degradación por las proteínas SKP2 y BTRC, respectivamente, si tiene éxito. pasando cada puesto de control. En la fase M, la proteína ACP logra la separación entre centrómeros que conectan dos conjuntos de cromosomas. En general, la rica disponibilidad de las proteínas SKP2, BTRC y ACP desempeñan un papel clave en el movimiento del ciclo celular, todos los cuales están regulados positivamente debido al aumento de los daños a las proteínas, ya que son parte del sistema de ubiquitinación. Además, se sabe que las respuestas inmunitarias innatas impulsan la progresión del ciclo celular [25]. Está bien establecido que los fragmentos de ácidos hialurónicos y proteoglicanos de la ECM dañados (por ejemplo, heparán, condroitina y queratina sulfatos) son señales tempranas para la reparación de tejidos [26] y colágenos para el desarrollo general [27]. El glicano ligado a N dañado puede servir como señales de crecimiento [28, 29]. Nuestros análisis han identificado las siguientes coexpresiones fuertes entre las respuestas a? OH y la progresión del ciclo celular: (1) genes marcadores G1 y genes de síntesis de glucanos ligados a N, heparán, condroitina y sulfatos de queratina (2) genes marcadores S y SKP2 (3) genes marcadores G2 y SKP2 (4) genes marcadores M y BTRC y (5) genes ACP y de síntesis de glicanos ligados a O. Además, los genes del colágeno muestran correlaciones con los genes marcadores para G2 y G2 / M, respectivamente. Consulte la Tabla complementaria S12 para obtener más detalles. El análisis también ha detectado fuertes correlaciones entre las expresiones de los genes de ubiquitina y la expresión total del complejo proteasoma. Esto tiene sentido ya que las proteínas dañadas serán etiquetadas con ubiquitina antes de degradarse, por lo tanto, cuanto más proteínas dañadas, mayor será la expresión de los genes de ubiquitina. Además, se encuentra que los genes marcadores (CDC25) para el volumen celular están regulados positivamente y se correlacionan con la progresión del ciclo celular en el cáncer en general. En general, nuestros análisis sugieren fuertemente que las proteínas dañadas, los componentes de la ECM y el glucano de la superficie celular resultan de las reacciones de Fenton en el citosol, la matriz extracelular y el espacio, proporcionan señales clave para impulsar la progresión del ciclo celular cuando no hay señales descendentes para la división celular. Se justifican claramente más estudios sobre cómo estas señales podrían combinarse con la abundante disponibilidad de nucleótidos y ATP para impulsar la progresión del ciclo celular.

[1] Torti SV, Torti FM. Hierro y cáncer: más mineral para extraer. Nat Rev Cancer 201313: 342-55. [2] Cairo G, Recalcati S, Mantovani A, Locati M. Tráfico de hierro y metabolismo en macrófagos: contribución al fenotipo polarizado. Trends Immunol 201132: 241-7. [3] Imlay JA, Chin SM, Linn S. Daño tóxico del ADN por peróxido de hidrógeno a través de la reacción de Fenton in vivo e in vitro. Science 1988240: 640-2. [4] Toyokuni S. Papel del hierro en la carcinogénesis: el cáncer como enfermedad ferrotóxica. Cancer Sci 2009100: 9-16. [5] Valko M, Rhodes C, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Radicales libres, metales y antioxidantes en el cáncer inducido por estrés oxidativo. Interacciones químico-biológicas 2006160: 1-40. [6] Toyokuni S. Hierro y carcinogénesis: de la reacción de Fenton a los genes diana. Informe Redox 20027: 189-97. [7] Babbs CF. Radicales libres y etiología del cáncer de colon. Biología y medicina de radicales libres 19908: 191-200. [8] Johnson DC, Dean DR, Smith AD, Johnson MK. Estructura, función y formación de agrupaciones biológicas de hierro-azufre. Annu Rev Biochem 200574: 247-81. [9] Kakhlon O, Cabantchik ZI. El pool de hierro lábil: caracterización, medición y participación en procesos celulares. Biología y medicina de radicales libres 200233: 1037-46. [10] Veiga N, Torres J, Mansell D, Freeman S, Dominguez S, Barker CJ, et al. "Pool de hierro quelatable": el 1,2,3-trifosfato de inositol cumple las condiciones necesarias para ser un ligando de hierro celular seguro. J Biol Inorg Chem 200914: 51-9. [11] Swietach P, Vaughan-Jones RD, Harris AL, Hulikova A. La química, fisiología y patología del pH en el cáncer. Transacciones filosóficas de la Royal Society B: Biological Sciences 2014369: 20130099. [12] Nakayama KI, Nakayama K. Ubiquitin ligasas: control del ciclo celular y cáncer. Nature Reviews Cancer 20066: 369-81. [13] Midwood KS, Williams LV, Schwarzbauer JE. Reparación de tejidos y dinámica de la matriz extracelular. La revista internacional de bioquímica y biología celular 200436: 1031-7. [14] Hakomori S. Glycosylation que define la malignidad del cáncer: vino nuevo en una botella vieja. Actas de la Academia Nacional de Ciencias 200299: 10231-3. [15] Dube DH, Bertozzi CR. Glicanos en el cáncer y la inflamación ¡ª potencial para la terapéutica y el diagnóstico. Nature Reviews Drug Discovery 20054: 477-88. [16] Wang JD, Levin PA. Metabolismo, crecimiento celular y ciclo celular bacteriano. Nature revisa Microbiology 20097: 822-7. [17] Stillman B.La síntesis y destrucción de desoxinucleósido trifosfato (dNTP) regulan la replicación de los genomas tanto de células como de virus. Proc Natl Acad Sci U S A 2013110: 14120-1. [18] Klemm RD, Bell SP. El ATP unido al complejo de reconocimiento de origen es importante para la formación de preRC. Proc Natl Acad Sci U S A 200198: 8361-7. [19] Wang JC. Desbloqueo y apertura de una puerta de ADN. Proc Natl Acad Sci U S A 2007104: 4773-4. [20] You Z, Ishimi Y, Mizuno T, Sugasawa K, Hanaoka F, Masai H. El ADN monocatenario rico en timina activa la helicasa Mcm4 / 6/7 en horquillas en Y y sustratos en forma de burbujas. The EMBO Journal 200322: 6148-60. [21] Mizuarai S, Miki S, Araki H, Takahashi K, Kotani H. Identificación del portador de dicarboxilato Slc25a10 como transportador de malato en la síntesis de novo de ácidos grasos. Revista de química biológica 2005280: 32434-41. [22] Zhou Y, Tozzi F, Chen J, Fan F, Xia L, Wang J, et al. Los niveles de ATP intracelular son un determinante fundamental de la quimiorresistencia en las células de cáncer de colon. Cancer Res 201272: 304-14. [23] Gottesman MM, Fojo T, Bates SE. Resistencia a múltiples fármacos en el cáncer: papel de los transportadores dependientes de ATP. Nat Rev Cancer 20022: 48-58. [24] Fingar DC, Blenis J. Objetivo de la rapamicina (TOR): un integrador de señales de factores de crecimiento y nutrientes y coordinador del crecimiento celular y la progresión del ciclo celular. Oncogene 200423: 3151-71. [25] Shi H, Wang Y, Li X, Zhan X, Tang M, Fina M, et al. La activación de NLRP3 y la mitosis son eventos mutuamente excluyentes coordinados por NEK7, un nuevo componente del inflamasoma. Nat Immunol 201617: 250-8. [26] Jiang D, Liang J, Noble PW. Hialuronano en la reparación y lesión de tejidos. Annu Rev Cell Dev Biol 200723: 435-61. [27] Berg RA, Silver FH, Pachence JM. Perlas de matriz de colágeno para la reparación de tejidos blandos. Google Patents 1989. [28] Yayon A, Klagsbrun M, Esko JD, Leder P, Ornitz DM. En la superficie celular, se requieren moléculas similares a la heparina para la unión del factor de crecimiento de fibroblastos básico a su receptor de alta afinidad. Celda 199164: 841-8. [29] Lau KS, Partridge EA, Grigorian A, Silvescu CI, Reinhold VN, Demetriou M, et al. El número de N-glicanos complejos y el grado de ramificación cooperan para regular la proliferación y diferenciación celular. Cell 2007129: 123-34. [30] Fischer K, Hoffmann P, Voelkl S, Meidenbauer N, Ammer J, Edinger M, et al. Efecto inhibidor del ácido láctico derivado de células tumorales sobre células T humanas. Blood 2007109: 3812-9. [31] Xu Y, Cui J, Puett D. Bioinformática del cáncer: Springer 2014.


Agradecimientos

Agradecemos a Susanne Kassube por el amable regalo de Hola 5 gránulos de células de insectos que expresan mDna2, Stephen S. Taylor para las células HeLa Flp-In T-REx, y el Functional Genomics Center Zurich para análisis de espectrometría de masas. Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Gari por sus útiles discusiones. Este proyecto ha recibido financiación de la Swiss National Science Foundation (PP00P3_144784 / 1 y PP00P3_172959 / 1), el Human Frontier Science Program (CDA00043 / 2013-C), la fundación Olga-Mayenfisch y la Universidad de Zúrich. L.M. recibió una beca de posdoctorado de la Universidad de Zurich (FK-18-050). El laboratorio de K.G. es parte de la acción COST CA15133. Investigación en el laboratorio de P.C. cuenta con el apoyo de la Swiss National Science Foundation (31003A_175444) y una Beca Consolidadora del Consejo Europeo de Investigación (681630).


¿Existe una fuente confiable de almacenamiento y estabilidad de agentes reductores como el DTT? - biología

LA SERIE ELECTROQUÍMICA

Esta página explica el origen de la serie electroquímica y muestra cómo se puede utilizar para determinar la capacidad de las diversas sustancias incluidas en ella para actuar como agentes oxidantes o reductores.

Importante: Si ha venido directamente a esta página a través de un motor de búsqueda, debe tener en cuenta que esta es la segunda página de una serie de páginas vinculadas sobre potenciales redox. Le resultará mucho más fácil de entender si lee primero la introducción a los equilibrios redox antes de continuar. Un enlace en la parte inferior de esa página lo traerá nuevamente aquí.

También es importante que comprenda las reacciones redox. Siga este enlace si no está seguro acerca de la oxidación y la reducción en términos de transferencia de electrones, y use el botón ATRÁS en su navegador para regresar a esta página.

Construyendo la serie electroquímica

Organizar los equilibrios redox en orden de sus valores E y deg

La serie electroquímica se construye disponiendo varios equilibrios redox en orden de sus potenciales de electrodo estándar (potenciales redox). Los valores de E & deg más negativos se colocan en la parte superior de la serie electroquímica y los más positivos en la parte inferior.

Para esta mirada introductoria a la serie electroquímica, vamos a enumerar el tipo de equilibrio de iones metálicos y metálicos n. ° 47 que vimos en la página anterior (más el equilibrio de hidrógeno) en orden de sus valores de E y grados. Esto se extenderá a otros sistemas en la página siguiente.

La serie electroquímica

equilibrio E y grados (voltios)
-3.03
-2.92
-2.87
-2.71
-2.37
-1.66
-0.76
-0.44
-0.13
0
+0.34
+0.80
+1.50

Una nota sobre el valor del hidrógeno

Recuerde que cada valor de E & deg muestra si la posición del equilibrio se encuentra a la izquierda oa la derecha del equilibrio de hidrógeno.

Esa diferencia en las posiciones de equilibrio hace que el número de electrones que se acumulan en el electrodo metálico y el platino del electrodo de hidrógeno sean diferentes. Eso produce una diferencia de potencial que se mide como voltaje.

Obviamente, si conecta un electrodo de hidrógeno estándar a otro, no habrá diferencia alguna entre las posiciones de los dos equilibrios. El número de electrones acumulados en cada electrodo será idéntico y, por lo tanto, habrá una diferencia de potencial de cero entre ellos.

Oxidación y reducción # 47 y la serie electroquímica

Recordatorios sobre oxidación y reducción.

Oxidación y reducción en términos de transferencia de electrones.

Recuerda que en términos de electrones:

Ahora aplique esto a uno de los equilibrios redox:

Cuando el magnesio sólido forma sus iones, pierde electrones. El magnesio se oxida.

Cuando los iones de cobre (II) ganan electrones para formar cobre, se están reduciendo.

Agentes reductores y oxidantes

A agente reductor reduce algo más. Eso debe significar que le da electrones.

El magnesio es bueno para ceder electrones para formar sus iones. El magnesio debe ser un buen agente reductor.

Un agente oxidante oxida algo más. Eso debe significar que le quita electrones.

El cobre no forma sus iones con mucha facilidad, y sus iones recogen fácilmente electrones de algún lugar para volver a ser cobre metálico. Los iones de cobre (II) deben ser buenos agentes oxidantes.

Resumiendo esto en la serie electroquímica

Los metales en la parte superior de la serie son buenos para regalar electrones. Son buenos agentes reductores. La capacidad reductora del metal aumenta a medida que avanza la serie.

Los iones metálicos en la parte inferior de la serie son buenos para recoger electrones. Son buenos agentes oxidantes. La capacidad de oxidación de los iones metálicos aumenta a medida que avanza en la serie.

Juzgar la capacidad oxidante o reductora a partir de los valores E y deg

Cuanto más negativo sea el valor de E & deg, más a la izquierda se encuentra la posición de equilibrio; más fácilmente el metal pierde electrones. Cuanto más negativo sea el valor, más fuerte será el agente reductor del metal.

Cuanto más positivo sea el valor de E & deg, más a la derecha se encuentra la posición de equilibrio; menos fácilmente el metal pierde electrones y más fácilmente sus iones los recogen de nuevo. Cuanto más positivo sea el valor, más fuerte será el agente oxidante del ion metálico.

Preguntas para poner a prueba su comprensión

Si esta es la primera serie de preguntas que ha hecho, lea la página de introducción antes de comenzar. Deberá usar el BOTÓN ATRÁS en su navegador para volver aquí después.


1.1.8 Enlaces disulfuro, plegamiento incorrecto de proteínas y enfermedades humanas

Las mutaciones en triptófanos y cisteínas tienen la mayor probabilidad de causar enfermedades en humanos entre todas las posibles mutaciones de aminoácidos. 155 Esto puede atribuirse a las funciones reguladoras de las cisteínas (ver, p.ej., Capítulo 2.3 y ref. 156), pero sobre todo a sus funciones estructurales en las proteínas de la vía secretora. El amplio espectro de enfermedades humanas asociadas con mutaciones de cisteína se puede ver en la Tabla 1.1.1, que puede mostrar solo un subconjunto de mutaciones que involucran residuos de cisteína que se han asociado con patologías humanas.

Clasificación Enfermedad Proteínas afectadas Mutaciones Efectos celulares Árbitro.
Pérdida de residuos de cisteína Síndrome de hiper-IgM CD40 C83R en dominio extracelular rico en cisteína Retención de ER y degradación lenta de CD40 C83R 159
Inducción UPR por CD40 C83R
Acromatopsia 2 subunidad α del canal de activación de nucleótidos cíclicos cónicos C191Y / S en TM región 1 Retención de ER de C191Y 160
Enfermedad renal quística medular / nefropatía hiperurémica juvenil familiar Uromodulina Dominios similares a EGF: C148W, C315R, C317Y Defectos de tráfico y retención de ER 161
Parte central de la proteína: C150S, C217R
Dominio zona pelúcida: C347G
Enfermedad de von Willebrand Factor de von Willebrand Intracadena: C1130F, C2671Y Retención de ER y secreción alterada de C1130F y C2671Y 162
Intercadena: C2773S Defectos de multimerización en C2773S
Miopatía MEGF10 MEGF10 Sexto dominio similar a EGF: C326R Cambios en norte-glicosilación de C774R pero tráfico celular normal de ambos mutantes 163
16 ° dominio similar a EGF: C774R Deterioro débil (C326R) / fuerte (C774R) de la fosforilación de Tyr
Trombastenia de Glanzmann subunidad β de αIIbβ3 integrina (glicoproteína plaquetaria) C435A Activación aberrante de αIIbβ3 integrina 164
Neoplasia endocrina múltiple tipo 2A / B (MEN2A / B) / carcinoma medular de tiroides familiar (FMTC) / enfermedad de hirschsprung (HSCR) Tirosina quinasa del receptor RET MEN2A: C364G, C380R / G / Y / S / F, C634R / Y / W Enfermedad HSCR: C142S, C609Y Mayor retención de ER (C142S, C609Y, C634R) 165–169
Fallo en la unión del ligando (C142S)
Dimerización y activación aberrantes del receptor en MEN2A (C634R / Y / W)
Síndrome de fiebre periódica asociado a TNFR1 (TRAPS) Receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1) C30R / S, C33G, C43S, C52F, C88R Oligomerización covalente 170
Retención de ER
Falla en la interacción con TNFR1 de tipo salvaje
Señalización reducida
Hipercolesterolemia familiar Receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL) Repeticiones ricas en cisteína, C297F Fallos en la unión de LDL 171 y 172
Retención de ER
Pérdida o introducción de residuo (s) de cisteína Arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL) Notch3 & gt200 mutaciones en repeticiones extracelulares similares a EGF de deleción de notch3 o introducción de cisteínas individuales, p.ej. C49Y, R90C Formación de complejos resistentes a los detergentes 173 y 174
Degradación más lenta de las variantes de muesca
Demencia frontotemporal familiar Progranulina C105R, C139R, C521Y, R432C Mal plegado covalente 175–178
Mayor retención y degradación de ER
Procesamiento proteolítico aberrante por elastasa
Diabetes neonatal Insulina Cadena A: R89C, G90C, C96Y, Y108C Retención de ER y ERAD (C96Y) 179–181
Cadena B: C43G, F48C Efecto dominante negativo sobre el transporte de insulina de tipo salvaje (C96Y)
Inducción UPR
Enfermedades por almacenamiento lisosómico Varios, p.ej. aspartilglucosaminidasa (AGA), proteína protectora / catepsina A (PPCA) AGA: C163S Falta de enlace disulfuro (AGA) 182 y 183
PPCA: Y395C Actividad enzimática reducida (AGA)
Ausencia de proteína (PPCA)
Introducción de residuo (s) de cisteína Síndrome de Ehlers-Danlos (EDS) Proα1 colágeno tipo I R134C, R396C, R915C Formación de dímeros de colágeno desestabilizados con enlaces disulfuro 184
Retraso en el procesamiento del colágeno por norte-proteinasa (R134C, R396C)
Espondiloartropatía / displasia de Stickler / displasia espondiloepifisaria α1 Colágeno tipo II Espondiloartropatía: R75C, R519C, R1076C Afinidad alterada del colágeno II / IX (R519C) 185 y 186
Displasia de Stickler: R365C, R704C
Displasia espondiloepifisaria: R789C
Α sistémico1subtipos de deficiencia de antitripsina α1-Antitripsina (AAT) F35C, R39C, R223C Oligomerización covalente aberrante 187 y 188
Retención de ER, secreción reducida
Autismo Neuroligina 3 R451C Mal plegado del dominio extracelular 189–192
Mayor retención y degradación de ER
Inducción UPR
Menos unión a ligando
Leucemia Receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos (CSF3R) W341C Dimerización aberrante del receptor 193
Activación del receptor aberrante

Aunque es muy heterogéneo en los tipos de proteínas afectadas, y también en los fenotipos de enfermedad resultantes, algunas características generales se pueden deducir del análisis de las proteínas en la Tabla 1.1.1: Las mutaciones que involucran cisteínas generalmente introducen o eliminan un solo residuo de cisteína, lo que lleva a una número desigual de cisteínas en la proteína. Por un lado, si la cisteína era parte de un enlace disulfuro, esto puede desestabilizar la proteína bajo investigación. Por otro lado, esto conducirá a un residuo de cisteína desapareado en la proteína mutada, que se vuelve libre para interactuar con otras cisteínas en la misma proteína, otra copia de la misma proteína u otras proteínas en el RE. Si las mutaciones en los enlaces disulfuro conducen a un plegamiento parcial, el problema puede agravarse aún más, ya que los estados parcialmente plegados de las proteínas son generalmente particularmente propensos al plegamiento y ensamblaje incorrectos. La mayoría de los mutantes disulfuro enumerados en la tabla 1.1.1 se retienen en el RE y, en muchos casos, se dirigen a la degradación, de acuerdo con el control de calidad del RE que reconoce las proteínas aberrantes. Este control de calidad lo ejercen las chaperonas moleculares, que retienen a sus clientes al unirse a sitios hidrófobos expuestos en proteínas no nativas, 157,158 y por miembros de la familia PDI, que retienen proteínas en el RE al unirse a cisteínas sin pareja (debido a un número impar o plegado incorrecto) (consulte las Secciones 3 y 4 de este libro). Las proteínas mutadas se pueden dividir aproximadamente en dos clases: pérdida de función o ganancia de función. Para cada uno, existen dos escenarios principales. La pérdida de función es causada por la retención y degradación del RE, como se describió anteriormente, o por un control de calidad fallido, que libera mutantes disfuncionales a su ubicación nativa (como, por ejemplo, mutantes de pacientes de clases 3 y superiores en fibrosis quística e hipercolesterolemia familiar ). La ganancia de función es causada por un confórmero con propiedades de señalización aberrantes (como, por ejemplo, los receptores del factor de crecimiento en el cáncer) o por mutantes (disulfuro) que están gravemente mal plegados y no se degradan fácilmente debido a la agregación, lo que lleva a la inducción de la UPR y posiblemente muerte celular o formación de amiloide, que conduce a una enfermedad (neurodegenerativa).

Será importante estudiar cuáles de estas características generales son relevantes para cada enfermedad humana particular que involucra mutaciones de cisteína. Esto proporcionará una idea básica de en qué dirección se pueden desarrollar las terapias.


Ver el vídeo: Agentes oxidantes y reductores (Mayo 2022).