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¿Las transcripciones de Protocadherin Gamma Cluster se consideran genes separados?

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El grupo de genes PDCH @ comparte exones y, por lo tanto, son isoformas entre sí. Sin embargo, tanto HUGO como Ensembl los consideran genes separados.

Un "gen" se define como "un locus de exones cotranscritos" (Venter 2001), y este locus se ajusta claramente a esa definición sin ambigüedad. Entonces ¿Por qué estas transcripciones se consideran genes separados?


Yo diría que se consideran genes diferentes porque cada isoforma está bajo el control de su propio promotor.


Introducción

Los mamíferos marinos son un ejemplo clásico de evolución convergente en términos de adaptación de los mamíferos terrestres al medio marino. Durante la adaptación secundaria al medio marino, los mamíferos marinos experimentaron desafíos ambientales similares, que han resultado en características morfológicas o fisiológicas compartidas en taxones distantes. Por ejemplo, han experimentado cambios similares en la piel y las extremidades y, posteriormente, se han simplificado 1,2. Los rasgos adaptativos relacionados con la hipoxia son características compartidas de los mamíferos marinos 2,3.

Los mamíferos marinos incluyen tres órdenes: cetáceos (ballenas, delfines y marsopas), pinnípedos (focas, leones marinos y morsas) y sirenios (manatíes y dugongos) 4. Han evolucionado para habitar el océano en múltiples linajes. Los cetáceos y los sirenios surgieron hace unos 40-50 millones de años (ma) de Cetartiodactyla y Afrotheria, respectivamente 5. Los pinnípedos surgieron dentro de los carnívoros aproximadamente 20 millones de años después 5. Esto implica que se produjeron diferentes cambios moleculares a través de linajes separados, posiblemente dando como resultado cambios fenotípicos divergentes. Sin embargo, la mayoría de los estudios relacionados con los mamíferos marinos se han centrado en la evolución convergente, aunque algunas de las adaptaciones de los mamíferos marinos a un estilo de vida acuático varían entre las especies 5.

Pinnípedos, que constan de tres familias (Phocidae, Otariidae, y Odobenidae) se distinguen de otros mamíferos marinos 6. La mayoría de los pinnípedos son semiacuáticos, a diferencia de otros mamíferos marinos que pasan toda su vida en el agua 4, y tienen miembros modificados como aletas que los impulsan tanto en el agua como en tierra 7. Además, con la excepción de la morsa, que es la única especie existente de la familia Odobenidae, todos los pinnípedos tienen abrigos de piel 8. Estas características distintas no se han caracterizado suficientemente a nivel molecular. Aunque recientemente se ha reunido un borrador del genoma del lobo fino 9, no se han investigado los aspectos evolutivos y biológicos de los pinnípedos. De hecho, el genoma de la foca de Weddell (familia Phocidae) no se ha completado (http://software.broadinstitute.org/allpaths-lg/blog/?p=647). Además, la mayoría de los estudios filogenéticos de pinnípedos han utilizado secuencias de marcadores limitadas, como la del genoma mitocondrial 10,11,12.

La genómica comparada permite investigar la evolución convergente de especies distantes. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos convergentes para el aprendizaje vocal se identificaron mediante la secuenciación de 48 genomas de aves [13]. Del mismo modo, Parker et al. 14 informaron de casi 200 loci convergentes en los genomas de mamíferos ecolocalizados. Aunque hay más estudios para demostrar la convergencia de secuencias ligadas a la convergencia fenotípica, la convergencia molecular hacia la convergencia fenotípica, al menos en los mamíferos marinos, parece ser poco común. Al analizar 22 genomas de mamíferos, incluidos los de tres mamíferos marinos, Foote et al. 15 sugirió que se podrían utilizar diferentes vías moleculares para alcanzar el mismo fenotipo. En un estudio de la Hox familia de genes en los mamíferos, sólo una fracción de los sitios tenían firmas de selección positivas compartidas por tres linajes independientes de mamíferos marinos [16]. En lugar de a nivel de secuencia, la convergencia a nivel de gen se presentó como firmas generalizadas cuando se utilizaron las tasas evolutivas 2. Por lo tanto, existe convergencia a nivel funcional o superior en linajes de mamíferos separados, y diferentes linajes de mamíferos marinos han utilizado diferentes vías moleculares para lograr la convergencia fenotípica.

Aquí, construimos un borrador de genomas de tres especies de dos familias de pinnípedos: Phoca largha (Phocidae) y Callorhinus ursinus y Eumetopias jubatus (Otariidae) (Fig. S1 y nota complementaria S1). Identificamos genes con una firma de selección positiva que eran comunes a los tres pinnípedos pero ausentes de otros mamíferos, que probablemente estén relacionados con los rasgos únicos de los pinnípedos. Además, se investigaron los cambios moleculares divergentes que probablemente solo ocurran en el linaje pinnípedo durante la convergencia fenotípica de los mamíferos marinos.


Protocadherina-1: disfunción de la barrera epitelial en el asma y el eccema

El asma y el eccema son el resultado de la interacción entre la susceptibilidad genética y las exposiciones ambientales. Durante las últimas dos décadas, los estudios genéticos han llevado a la identificación de múltiples genes de susceptibilidad, aumentando nuestra comprensión de las vías biológicas que conducen a estas enfermedades.

Muchos genes de susceptibilidad al asma y al eccema se expresan en las células epiteliales de la mucosa de las vías respiratorias y la piel [1]. El epitelio constituye la primera línea de defensa contra alérgenos y microbios invasores. Recientemente, la pérdida de la integridad epitelial se ha implicado como un mecanismo importante que conduce tanto al asma [2] como al eccema [3].

En este número de la Revista respiratoria europea, M ortensen et al. [4] informan de la asociación de variantes genéticas en el gen que codifica la protocadherina-1 (PCDH1) con asma, sibilancias y eccema en la niñez (temprana) en el estudio de cohorte de nacimiento danés COPSAC (Estudios de Copenhague sobre el asma en la infancia). Sus estudios también sugieren una interacción gen-ambiente de PCDH1 con exposición pasiva al humo en la primera infancia en el desarrollo del asma. Estos estudios amplían los datos previos que reportan un papel para PCDH1 polimorfismos en la susceptibilidad tanto al asma [4-7] como al eccema [4, 6, 8]. Dada la asociación replicada de PCDH1 con ambas enfermedades, este gen podría contribuir a una vía biológica que constituye una causa compartida para ambas enfermedades. Aquí, resumiremos los datos acumulados sobre PCDH1 polimorfismos en el asma y el eccema, y ​​hacer un intento de interpretar estos datos genéticos a la luz de la expresión de PCDH1 y su función como contribuyente a la integridad epitelial.

En 1993, PCDH1 fue identificado originalmente por S ano et al. [9] como protocadherina-42 y se informó que induce la adhesión celular tras la expresión de la membrana ectópica en un ensayo de células L de fibroblastos de ratón. PCDH1 es un miembro de la subfamilia δ1 de genes de protocadherina no agrupados. PCDH1 se caracteriza por siete repeticiones extracelulares de cadherina (EC), un dominio transmembrana y tres motivos conservados evolutivamente (CM1-3) en la cola intracelular que se ha sugerido que participan en procesos de señalización intracelular [10]. los PCDH1 El gen abarca 25 kb en el cromosoma 5q31-33 y codifica dos transcripciones principales que contienen tres o cinco exones mediante empalme alternativo. La isoforma de tres exones no codifica los dominios citoplásmicos CM1–3 que están presentes en la isoforma de cinco exones. Recientemente, se identificaron un sexto exón y una expresión alternativa del exón 1 en las células epiteliales bronquiales [11], mientras que la expresión epitelial de la piel de PCDH1 no se ha caracterizado ampliamente hasta la fecha.

En 2009, PCDH1 fue identificado como un gen de susceptibilidad para la hiperreactividad bronquial (BHR) y el asma en niños y adultos. Posteriormente, se demostró que PCDH1 se expresaba en las células epiteliales de las vías respiratorias [5, 9] y la piel [12]. En cuatro estudios de asociación genética sobre PCDH1 publicado hasta la fecha, PCDH1 las variantes genéticas se asociaron con BHR, asma, eccema, asma infantil no alérgica y sibilancias tempranas transitorias (tabla 1) [4-6, 8]. Sin embargo, en estudios de asociación del genoma a gran escala del asma, como el estudio del consorcio GABRIEL [7], PCDH1 no se informó que estuviera asociado, a un nivel de significación de todo el genoma, con el asma definido como un diagnóstico de "asma alguna vez" autoinformado. En nuestra opinión, estos resultados contradictorios pueden explicarse por la heterogeneidad del asma.

El asma es una enfermedad crónica heterogénea de las vías respiratorias con diferentes subtipos de enfermedad, caracterizada por la aparición específica de síntomas respiratorios, como tos y sibilancias. M ortensen et al. [4] informan, en un análisis longitudinal de subtipos específicos de enfermedades, que PCDH1 las variantes genéticas se asociaron con episodios temporales específicos de sibilancias y síntomas de tos, y con la aparición de asma. Además, los patrones de síntomas respiratorios característicos en la primera infancia, como los síntomas respiratorios tempranos transitorios y los síntomas problemáticos recurrentes, se asociaron con diferentes PCDH1 polimorfismos. Es posible que estas asociaciones específicas con subfenotipos de la enfermedad se hayan pasado por alto en un análisis de asociación con "¿Alguna vez ha tenido asma?" como parámetro de resultado.

En resumen, aunque los diferentes análisis de asociación identifican una variedad de señales genéticas en el PCDH1 gen, la imagen general que comienza a emerger indica que PCDH1 la función genética está asociada con el asma, la BHR y el eccema en las primeras etapas de la vida. Es importante destacar que se encontró que las interacciones gen por tabaquismo pasivo eran relevantes para la asociación de PCDH1 con asma en dos poblaciones [4, 5]. Estos datos sugieren que la contribución de PCDH1 Las variantes genéticas del asma pueden resultar evidentes cuando se estudian en el contexto ambiental adecuado. Se necesitan metanálisis colaborativos bien potenciados de cohortes con subfenotipos específicos de asma en la vida temprana para proporcionar pruebas más sólidas de estas asociaciones (tabla 1). Finalmente, la falta de asociación con los niveles de IgE específicos o totales o con el asma alérgica [6] sugiere que PCDH1 es relevante para los mecanismos de susceptibilidad a enfermedades no mediados por IgE. En consecuencia, la contribución de PCDH1 la susceptibilidad al asma parece ser independiente de la IgE (tabla 1).

Los datos acumulados recopilados hasta la fecha indican que PCDH1 alberga una complejidad de señales genéticas asociadas con el asma y el eccema que aún no comprendemos por completo, sin un polimorfismo dominante claro asociado con el asma o el eccema en la mayoría de los estudios. Para comprender la interrelación de estas asociaciones observadas para los diferentes PCDH1 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), se consideró la posibilidad de desequilibrio de ligamiento (LD) entre estos SNP. La LD se define como la ocurrencia preferencial de combinaciones específicas de SNP en la población, debido a su co-herencia como resultado de su estrecha proximidad física. En un estudio reciente en una población alemana, T oncheva et al. [6] investigó la posibilidad de que las asociaciones de PCDH1 con asma fueron causadas por LD con el grupo de citocinas cercano en el cromosoma 5q31-33, pero este no fue el caso. Nuestro análisis del patrón de LD en sujetos caucásicos no reveló pruebas sólidas de LD entre los distintos SNP (fig. 1), lo que indica que estos SNP no representan una única señal genética, sino que aparentemente hacen contribuciones individuales e independientes a la susceptibilidad a la enfermedad.

Gen de la protocadherina-1, posiciones del polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) y patrón de desequilibrio de ligamiento (LD): posición en el contig de referencia NT_ AC094107.3 (Homo sapiens) basado en datos genómicos. Los gráficos LD se muestran en valores r 2. Cuanto más fuerte sea el LD, más oscuros serán los cuadrados r 2 = 0 es blanco y r 2 = 1 se representa en negro. Las parcelas LD se construyeron con el software Haploview (versión 4.2) utilizando datos SNP del Proyecto HapMap (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) para la población CEU. Las letras en negrita representan los SNP que también aparecen en la tabla 1.

Otra explicación para la identificación de múltiples PCDH1 Los SNP que se asocian de forma independiente con el asma y el eccema en diferentes estudios es la presencia de múltiples SNP dentro del PCDH1 gen que tiene diversos efectos funcionales. En primer lugar, los SNP muy específicos pueden interactuar con factores ambientales como la exposición pasiva al humo. En segundo lugar, otros SNP pueden tener efectos más genéricos, por ejemplo, regulando PCDH1 la expresion genica. Es importante darse cuenta de que los SNP probados en el estudio original de K oppelman et al. [5] solo estaban situados en regiones codificantes del gen. En los últimos años, ha quedado cada vez más claro que los SNP no codificantes pueden tener importantes efectos reguladores sobre la expresión génica (actuando como loci de rasgos cuantitativos de expresión (eQTL)). La publicación actual de M ortensen et al. [4] agrega la asociación de más no codificación PCDH1 polimorfismos al asma y eccema (tabla 1), mientras que ninguna de las asociaciones iniciales se repitió en este estudio. Por tanto, los estudios de eQTL sobre estos PCDH1 Por tanto, se necesitan con urgencia SNP en tejido pulmonar y cutáneo para evaluar su relevancia funcional. En tercer lugar, los SNP codificadores pueden tener efectos genéricos al afectar la función de la proteína PCDH1. El SNP codificante Ala514Thr se asigna a un dominio EC en la proteína PCDH1, que es compatible con un efecto potencial sobre la adhesión célula-célula que necesita más estudio. Hasta ahora, no hay datos disponibles sobre los efectos funcionales de ninguno de los SNP asociados con el asma y el eccema. Finalmente, añadiendo a la complejidad de PCDH1, su expresión probablemente también está regulada por mecanismos epigenéticos que incluyen la metilación de genes, dada la identificación del exón 1A como una isla CpG potencialmente metilada [11].

Entonces, ¿cómo contribuye PCDH1 tanto al asma como al eccema? Presumimos que la disfunción de PCDH1 contribuye al defecto en la función de barrera epitelial observado tanto en el asma como en el eccema al regular el proceso de diferenciación y / o reparación de las células epiteliales. La expresión de ARNm y proteínas de PCDH1 está sorprendentemente regulada durante la diferenciación de las células epiteliales bronquiales primarias, lo que sugiere un papel de PCDH1 en el logro o mantenimiento de la diferenciación terminal del epitelio de las vías respiratorias [11]. La regulación de la expresión de PCDH1 en la piel durante la diferenciación epidérmica no ha sido caracterizada hasta la fecha, aunque la expresión de PCDH1 está marcadamente inducida en los queratinocitos primarios más tarde durante el proceso de reparación después de una herida por rasguño [12]. Se ha identificado previamente un papel similar en la diferenciación epidérmica para múltiples genes de eccema en estudios genéticos. Con todo, proponemos un papel para PCDH1 en la diferenciación y reparación epitelial tanto en el asma como en el eccema.

PCDH1 es capaz de señalización intracelular. Hasta la fecha, no se han informado vías posteriores o socios de interacción PCDH1 relevantes para el asma o la patogénesis del eccema. Además, los datos sobre la expresión diferencial de PCDH1 en asma o eccema versus Aún faltan controles saludables. Se necesitan estudios futuros que puedan validar el papel funcional de PCDH1 en el asma y el eccema mediante enfoques experimentales controlados, como pequeños ARN de interferencia o modelos de ratón modificados genéticamente, que se están desarrollando actualmente. Estos estudios también deben abordar la posibilidad de que las exposiciones ambientales afecten la expresión de PCDH1, siendo de particular interés la exposición al humo del cigarrillo. Claramente, se necesitan más estudios para resolver los efectos funcionales de PCDH1 SNP y su relevancia para la biología de las células epiteliales de la piel y las vías respiratorias. Estos estudios finalmente validarán los hallazgos genéticos iniciales y quizás proporcionen pistas para futuras intervenciones terapéuticas novedosas en el asma y el eccema.


Resultados

Los astrocitos expresan múltiples γ-Pcdhs

Nos centramos en la médula espinal en desarrollo, que madura antes que el cerebro y en la que se han caracterizado mejor las consecuencias de la interrupción de γ-Pcdh (Wang et al., 2002b Weiner et al., 2005 Prasad et al., 2008). Las 6 repeticiones de cadherina extracelulares, el dominio transmembrana y el dominio citoplásmico proximal de cada proteína γ-Pcdh están codificados por uno de los 22 exones grandes "variables" (V), cada uno de los cuales se empalma en tres exones "constantes" (C) que codifican un dominio C-terminal compartido de 125 aminoácidos (Wu y Maniatis, 1999 Tasic et al., 2002 Wang et al., 2002a). Usando un en el lugar sonda de hibridación (ISH) contra los exones C, encontramos que, además de la expresión ubicua en la materia gris, PcdhLas transcripciones -γ son expresadas por células en la sustancia blanca de la médula espinal neonatal (Fig.1 B). ISH fluorescente de doble etiqueta (Fig.1 B, recuadro) e inmunofluorescencia en la médula espinal neonatal y adulta (Fig.1 C,D) mostró que muchas de estas células eran astrocitos positivos para GFAP, que extienden procesos radiales que contienen γ-Pcdhs. Coexpresión de Pcdh-γ genes con el PLP El gen, un marcador para oligodendrocitos, no se observó en ISH fluorescente de doble marca en secciones neonatales (datos no mostrados). Los astrocitos positivos para GFAP en la materia gris también parecían contener proteínas γ-Pcdh, pero la localización ubicua de γ-Pcdhs neuronales en todo el neuropilo dificultaba determinar su localización subcelular (ver más abajo, y la Fig.2, para análisis posteriores que abordan esta). Astrocitos cultivados de la médula espinal neonatal (Fig.1 GRAMO) y la corteza (datos no mostrados) expresaron múltiples Pcdh-γ, con 20 de las 22 transcripciones empalmadas esperadas detectables por RT-PCR de ARN astrocítico.

Los astrocitos expresan múltiples γ-Pcdh. En el lugar hibridación (ISH) usando un Pcdh-γC ribosonda del exón (diagramado en A) revelaron expresión en células de la sustancia blanca (puntas de flecha), así como la sustancia gris en la médula espinal neonatal ( B). Etiquetado doble con GFAP ribosonda indicó que muchas de estas células eran astrocitos ( B, el recuadro muestra una vista de mayor aumento). La inmunofluorescencia confirmó la expresión de la proteína γ-Pcdh por astrocitos positivos para GFAP en neonatos ( C) y adulto ( D) Médulas espinales. Inmunotinción de astrocitos cultivados ( mi) y secciones de la médula espinal ( F) demostraron que las proteínas γ-Pcdh se colocalizan con ezrin y Glt-1a, ambos marcadores de procesos de astrocitos perisinápticos. Los análisis de transcriptasa inversa (RT) -PCR detectaron la expresión de 20 de las 22 posibles Pcdh-γ transcripciones empalmadas en astrocitos de médula espinal cultivados ( GRAMO). Barras de escala: B, 100 μm (inserción, 10 μm) C, D, 25 micras mi, 3 μm F, 4 µm.

Las proteínas γ-Pcdh se localizan en procesos de astrocitos perisinápticos. A, Diagrama esquemático del Pcdhfcon3 alelo mutante condicional, en el que un exón 3 C fusionado con GFP está flanqueado por sitios loxP. Las subfamilias A – C de exones V están en tonos de azul y los exones 3 C están en rojo. B, En Cre-ER Pcdhfcon3/ + ratones inyectados con tamoxifeno ( B, derecha), la escisión de Cre resultó en la pérdida de la inmunofluorescencia ubicua de γ-Pcdh-GFP observada en ratones no inyectados o Cre-ER-negativos ( B, izquierda). Sin embargo, las γ-Pcdh etiquetadas con GFP permanecieron detectables en un pequeño número de astrocitos protoplásmicos de materia gris positivos para GFAP ( B). C, Se muestra una imagen de mayor aumento de una criosección separada con doble inmunotinción. D, mi, Análisis confocal de inmunotinción Cre-ER Pcdhfcon3/ + secciones de médula espinal demostraron que los puntos astrocíticos γ-Pcdh (teñidos de amarillo para las puntas de flecha cerradas de GFP y γ-Pcdh en imágenes fusionadas) pueden localizarse directamente adyacente a γ-Pcdh neuronal en los puntos sinápticos (teñidos para fagot y γ-Pcdh abiertos puntas de flecha, magenta en imágenes combinadas). F, GRAMO, La inmunotinción para GFP y los marcadores presinápticos y postsinápticos confirmaron que las γ-Pcdhs astrocíticas se apostaron y / o envolvieron con frecuencia las terminales sinápticas. Las imágenes grandes son de planos individuales de z-apila secciones transversales perpendiculares a través de todo z-Las pilas en las ubicaciones indicadas por líneas blancas se muestran a la derecha y a continuación. H, Trazados de varios de estos contactos perisinápticos para las casillas indicadas en F y GRAMO son presentados. Barras de escala: B, 100 μm C, 6 μm D, mi, 1 μm F, GRAMO, 2 µm.

Γ-Pcdhs se localizan en procesos de astrocitos perisinápticos

En cultivos de astrocitos, las proteínas γ-Pcdh se concentraron en las uniones célula-célula y en pequeños procesos similares a filopodios que también contenían ezrina (Fig.1 mi), un marcador de procesos de astrocitos perisinápticos en vivo (Derouiche y Frotscher, 2001). Las proteínas γ-Pcdh se colocalizan extensamente con otro marcador de estos procesos, el transportador de glutamato Glt-1a (Rothstein et al., 1994 Cholet et al., 2002), en la médula espinal. en vivo (Figura 1 F). Para determinar más claramente la localización subcelular de γ-Pcdhs astrocíticos, desarrollamos un método genético utilizando un alelo mutante condicional, denominado Pcdhfcon3 , en el que una fusión del exón C 3-GFP está flanqueada por sitios loxP (Fig.2 A). Escisión homocigótica ubicua de la Pcdhfcon3 alelo da como resultado una fenocopia de Pcdhdel / del -mutantes nulos (Prasad et al., 2008) debido a la fusión de GFP, heterocigotos Pcdhfcon3Los ratones / + también se pueden usar para informar sobre la actividad de Cre en tejidos fenotípicamente normales.

Cruzamos Pcdhfcon3 ratones con una línea transgénica que expresa una proteína de fusión Cre-receptor de estrógeno (Cre-ER) que puede localizarse en el núcleo solo al unirse al ligando sintético tamoxifeno (Guo et al., 2002). Después de la inyección de tamoxifeno de Cre-ER Pcdhfcon3/ + ratones heterocigotos, encontramos que el exón marcado con GFP se eliminó de casi todas las células de la médula espinal. Sin embargo, un pequeño número de células aisladas en la materia gris escaparon a la escisión y, por lo tanto, retuvieron las proteínas γ-Pcdh marcadas con GFP (Fig.2 B). Estas células tenían la morfología de astrocitos protoplásmicos y expresaban GFAP (Fig.2 C) pero no el marcador neuronal NeuN (ver la Fig. S2 complementaria, disponible en www.jneurosci.org como material complementario). Mediante el uso de microscopía confocal para examinar secciones de estos ratones heterocigotos teñidos con anticuerpos contra GFP y marcadores sinápticos excitadores e inhibidores, pudimos visualizar γ-Pcdhs astrocíticos de forma aislada y determinar sin ambigüedad su relación con las sinapsis en tejido fenotípicamente normal.

Estos análisis confirmaron que los γ-Pcdhs astrocíticos a menudo se concentraban en puntos directamente adyacentes a los contactos sinápticos en la médula espinal (Fig.2 F,GRAMO), así como en el hipocampo, donde un subconjunto de astrocitos también escapó a la escisión de Cre (Fig. complementaria S2, disponible en www.jneurosci.org como material complementario). Estos puntos perisinápticos estaban estrechamente opuestos a sinapsis excitatorias (86% de 198 puntos sinápticos opuestos) e inhibitorias (87% de 247 puntos sinápticos opuestos) y, a menudo, parecían envolver o interdigitarse entre ellos (Fig.2 F – H). Análisis similares en los que Cre-ER Pcdhfcon3Las secciones / + se tiñeron triplemente con anticuerpos contra GFP (para detectar γ-Pcdhs astrocíticos), el dominio constante (para detectar todas las γ-Pcdhs) (ver la Fig. S1 complementaria, disponible en www.jneurosci.org como material complementario), y el fagot marcador presináptico identificó puntos sinápticos γ-Pcdh-positivos adyacentes a puntos astrocíticos GFP / γ-Pcdh-doble-positivos (Fig.2 D,mi). Juntos, estos resultados indican que las γ-Pcdhs están situadas apropiadamente para mediar los contactos adhesivos entre las sinapsis neuronales y los procesos de astrocitos perisinápticos.

Los γ-Pcdhs astrocíticos son fundamentales para la sinaptogénesis en las neuronas en desarrollo in vitro

Para determinar si las γ-Pcdhs astrocíticas desempeñan un papel en la sinaptogénesis, comenzamos modificando un sistema de cocultivo utilizado en nuestro trabajo anterior, en el que las interneuronas espinales embrionarias crecen sobre un césped de astrocitos, diferenciando y formando sinapsis completamente maduras durante un período de ∼9 d (Weiner et al., 2005). En lugar de cultivos mixtos preparados a partir de los mismos animales, establecimos por separado una monocapa de astrocitos de médula espinal neonatal, sobre la que posteriormente se sembraron interneuronas de médula espinal E13: esto nos permitió controlar de forma independiente el genotipo de cada tipo celular. Las neuronas no sobreviven a la preparación de astrocitos (datos no mostrados), obviando cualquier preocupación de que las interneuronas del genotipo no deseado puedan ser transferidas en cocultivos. Sin embargo, es posible la complicación contraria (trasladar astrocitos al colocar la preparación de interneuronas). Por lo tanto, para asegurarnos de que no estuvieran presentes astrocitos del genotipo incorrecto, establecimos cocultivos de prueba de astrocitos WT con neuronas de Pcdhfusg/ + ratones, que albergan la misma fusión del exón C 3-GFP que el Pcdhfcon3 alelo (Wang et al., 2002b) (Fig.3 A). En estos cultivos, solo las neuronas positivas para TuJ1 fueron positivas para GFP, lo que confirma que nuestro método permitió la separabilidad completa del genotipo de astrocitos y neuronas. También confirmamos que las γ-Pcdhs pueden localizarse en procesos perisinápticos en estas culturas como lo hacen en vivo, cocultivando a la inversa neuronas de tipo salvaje con astrocitos preparados a partir de Pcdhfusg/ + ratones. La microscopía confocal de estos cocultivos demostró la presencia de puncta γ-Pcdh astrocítica adyacente a muchas sinapsis excitadoras e inhibidoras (Fig.3 B – D).

C.A, Cocultivos de interneuronas de la médula espinal y astrocitos de distintos genotipos. Cocultivos de neuronas de Pcdhfusg Los ratones con astrocitos de tipo salvaje fueron inmunoteñidos con anticuerpos contra las proteínas indicadas ( A). Solo las neuronas positivas para TuJ1 expresaron γ-Pcdh marcadas con GFP, lo que indica que el sistema de cocultivo permitió la separabilidad efectiva de los genotipos de neuronas y astrocitos sin arrastre. Cocultivos de neuronas de tipo salvaje con astrocitos de Pcdhfusg ratones teñidos para GFP e inhibitorios ( B) o excitador ( C) los marcadores sinápticos demostraron que los γ-Pcdhs astrocíticos se localizan en muchos sitios adyacentes a las terminales sinápticas in vitro, como se observó en vivo. Las imágenes grandes son de planos individuales de z-apila secciones transversales perpendiculares a través de todo z-Las pilas en las ubicaciones indicadas por líneas blancas se muestran a la derecha y a continuación. D, Trazados de varios de estos contactos perisinápticos para las casillas indicadas en B y C son presentados. Barras de escala: A, 20 μm B, C, 2 µm.

Luego procedimos a establecer cultivos en los que se prepararon astrocitos o neuronas a partir de mutantes nulos Pcdhdel / del ratones (Wang et al., 2002b Weiner et al., 2005 Prasad et al., 2008) [“astro-null” (astrocyte-null) y “neuron-null,” respectivamente], y compararon la progresión de la sinaptogénesis en estos cultivos a los de cocultivos en los que ambos tipos de células eran normales ("control"). No observamos diferencias aparentes en la supervivencia, la tasa de crecimiento, la morfología o la expresión de GFAP entre las monocapas de astrocitos mutantes y de control. Diferenciación neuronal y excrecencia de neuritas, evaluadas aquí mediante inmunotinción para los marcadores MAP2 (Fig.4 O) y TuJ1 (datos no mostrados) también eran indistinguibles en todos los tipos de cultivos, de acuerdo con nuestra extensa demostración previa de neurogénesis normal, diferenciación y excrecencia de axones en Pcdhratones mutantes nulos -γ (Wang et al., 2002b Prasad et al., 2008).

Las γ-Pcdhs astrocíticas son fundamentales para la sinaptogénesis en el desarrollo de cultivos neuronales. Se prepararon cocultivos de interneuronas espinales embrionarias que crecían directamente sobre una monocapa confluente de astrocitos de tal manera que los astrocitos (astro-nulos), las neuronas (neuronas nulas) o ninguno (control) fueran Pcdh-γ-null, y la sinaptogénesis monitoreada cuantificando la densidad de aposiciones de marcadores presinápticos y postsinápticos (es decir, el número de tales contactos sinápticos por un área definida) a medida que las neuronas maduraron entre 6 y 9 días in vitro (DIV). Cuando los astrocitos eran mutantes, el número de sinapsis excitadoras e inhibidoras se redujo significativamente a 6 DIV ( B, H, METRO, norte) en comparación con cultivos de control ( A, GRAMO, METRO, norte), aunque se produjo cierta recuperación en 9 DIV ( mi, K, METRO, norte). Cuando las neuronas eran mutantes, la densidad de sinapsis se redujo drásticamente tanto en 6 como en 9 DIV ( C, F, I, L – N). La diferenciación neuronal y la supervivencia, monitoreadas cuantificando el área de inmunotinción de MAP2, no difirieron entre las tres condiciones de cultivo ( O). Los datos en M-O se grafican como porcentaje de los valores de control. Gráficos en MES representan medias ± SEM de 22 a 44 campos de 6 cultivos por punto de tiempo. *pag & lt 0.05 ***pag & lt 0,001. Barra de escala (en L): ALABAMA, 2 µm.

En cultivos de control, las sinapsis (definidas por aposición y superposición parcial de puntos presinápticos y postsinápticos) ya eran numerosas a los 6 d in vitro (DIV) y aumentó en número en 9 DIV (Fig.4 A,D,GRAMO,J,METRO,norte). En culturas astro-nulas, sin embargo, pocas sinapsis se habían formado por 6 DIV: las sinapsis excitadoras se redujeron en un 77% (norte = 22 campos de 6 culturas pag & lt 0,001) y sinapsis inhibitorias en un 39% (norte = 33 campos de 6 culturas pag & lt 0.001) (Figura 4 B,H,METRO,norte). Para el 9 DIV, la densidad de sinapsis en cultivos astro-nulos se recuperó hacia los niveles de control, aunque las sinapsis inhibidoras todavía se redujeron significativamente en número (Fig.4 mi,K,METRO,norte). En cultivos sin neuronas, la formación de sinapsis tanto excitadoras como inhibidoras se redujo drásticamente en ambos 6 DIV (en un 67% total combinado de norte = 44 campos de 12 culturas pag & lt 0,001) y 9 DIV (en un 80% del total combinado de norte = 44 campos de 12 culturas pag & lt 0.001) (Figura 4 C,F,I,L – N). Estos resultados indican que las γ-Pcdhs astrocíticas son críticas para la formación o estabilización de sinapsis en cultivos en desarrollo, pero que la sinaptogénesis puede eventualmente continuar, siempre que las propias neuronas expresen las γ-Pcdhs.

El control astrocítico de γ-Pcdh de la sinaptogénesis depende del contacto

Aunque las γ-Pcdhs pueden mediar la adhesión homofílica en líneas celulares no neurales (Obata et al., 1995 Frank et al., 2005), no está claro si este es su único mecanismo de acción en el sistema nervioso. Para preguntar si la pérdida de γ-Pcdhs en los astrocitos podría tener un efecto secundario en su liberación de factores secretados sinaptogénicos, recolectamos medios de cultivo de tejidos que habían sido condicionados por control (WT) o Pcdh-γ-nulos [knock-out (KO)] astrocitos. Los medios acondicionados con astrocitos (ACM) de cultivos de KO contenían niveles de la molécula sinaptogénica conocida TSP-2 (Christopherson et al., 2005) indistinguibles de los de WT ACM (Fig.5 A). De acuerdo con esto, la adición de WT concentrado o KO ACM produjo una promoción cuantitativamente similar de la sinaptogénesis en cultivos de control (Fig.5 B), Indicando que PcdhLa mutación -γ no interrumpe la secreción de factores sinaptogénicos por parte de los astrocitos. Además, el WT ACM concentrado no pudo rescatar por completo la densidad de sinapsis reducida observada en cocultivos astro-nulos (Fig.5 C), sugiriendo que PcdhLa mutación -γ interrumpe otros mecanismos, presumiblemente dependientes del contacto.

Los γ-Pcdhs astrocíticos regulan la sinaptogénesis a través de un mecanismo dependiente del contacto. El medio acondicionado con astrocitos (ACM) se recogió de cultivos de astrocitos derivados de WT o Pcdhdel / del ratones (KO). El análisis de transferencia Western de cantidades iguales de ACM no mostró diferencias detectables entre genotipos en los niveles de trombospondina-2 (TSP-2) secretada ( A). La adición de WT concentrado o KO ACM para controlar cocultivos sobre 6 DIV resultó en aumentos igualmente significativos en la densidad de sinapsis (es decir, el número de contactos sinápticos por un área definida) en comparación con los medios de control ( B) por lo tanto, WT y KO ACM son equivalentes en su potencia sinaptogénica. La adición de WT ACM concentrado no pudo rescatar por completo la disminución en la densidad de sinapsis observada en cultivos astro-nulos ( C). Además, la diferencia en la densidad de sinapsis entre los cocultivos de control y astro-nulos se mantuvo cuando las neuronas se colocaron en placas sobre astrocitos que se habían fijado con paraformaldehído ( D). Los datos se grafican como porcentaje de los valores de control. Los gráficos representan medias ± SEM de 12 campos de 3 cultivos por punto de tiempo.

Para evaluar directamente si los γ-Pcdhs astrocíticos promueven la sinaptogénesis de una manera dependiente del contacto, preparamos cocultivos en los que la monocapa astrocítica se había fijado con paraformaldehído antes de la adición de interneuronas. Razonamos, como lo han hecho otros (Yamagata et al., 1995 Barker et al., 2008), que esta manipulación debería eliminar cualquier diferencia en la señalización celular o en la liberación de factores secretados entre los astrocitos WT y KO. A las 6 DIV en estos cocultivos, las sinapsis tanto excitadoras como inhibidoras permanecieron significativamente reducidas cuando los astrocitos fueron Pcdh-γ-nulo (figura 5 D), lo que respalda aún más el papel de los γ-Pcdhs astrocíticos al proporcionar señales dependientes del contacto para las neuronas que promueven la formación o estabilización de sinapsis.

La pérdida restringida por astrocitos de γ-Pcdhs da como resultado una sinaptogénesis retardada en vivo

A continuación, preguntamos si los γ-Pcdhs astrocíticos son importantes para la sinaptogénesis. en vivo, usando el condicional Pcdhfcon3 alelo flojo y una línea transgénica que expresa la recombinasa Cre bajo el control del ser humano GFAP promotor (Zhuo et al., 2001). Debido a que muchas neuronas se derivan de precursores gliales radiales que pueden expresar transitoriamente GFAP, esta línea Cre da como resultado la escisión de alelos floxados en algunas neuronas así como en astrocitos y, por lo tanto, no se puede usar para mutaciones específicas de astrocitos en gran parte del SNC ( datos no mostrados, ver Zhuo et al., 2001). Sin embargo, existen pruebas de que las neuronas de la médula espinal no se derivan de los precursores de la glía radial GFAP + (Barry y McDermott, 2005), lo que indica que la escisión restringida por astrocitos podría lograrse allí.

Comprobamos esto cruzando GFAP-Cre ratones con Z / EG ratones informadores, en los que la expresión ubicua de una proteína de fusión β-galactosidasa / neo se reemplaza por la de GFP después de la escisión de Cre (Novak et al., 2000) (Fig.6 C.A). En neonatal GFAP-Cre Z / EG médula espinal doble transgénica, la inmunotinción demostró que todas las células positivas para GFP eran positivas para GFAP y negativas para NeuN, mientras que las inclusiones de β-galactosidasa se detectaron solo en neuronas positivas para NeuN (Fig.6 B,C). Para confirmar que el alelo floxed estaba siendo extirpado de manera eficiente en los astrocitos de GFAP-Cre Pcdhfcon3 ratones, inmunoteñimos ratones doble heterocigotos para el exón constante marcado con GFP y observamos que casi toda la colocalización de γ-Pcdh-GFP con el marcador de astrocitos perisináptico Glt1a se perdió (Fig.6 D,mi). Habiendo comprobado que GFAP-Cre efectos de la escisión específica de astrocitos en la médula espinal en desarrollo, cuantificamos las sinapsis en secciones de GFAP-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 ratones y Pcdhfcon3 / fcon3 controlar a los compañeros de camada en E15, E17 y P0, durante la primera ola importante de sinaptogénesis (May y Biscoe, 1975 Vaughn, 1989), cuyo inicio coincide con la aparición de astrocitos GFAP + (Lee et al., 2003 Stolt et al. , 2003 Barry y McDermott, 2005) (datos no mostrados).

Restringido por astrocitos Pcdhmutación -γ en vivo. En GFAP-Cre Z / EG La expresión ubicua de doble transgénico de una proteína de fusión β-galactosidasa / neo se reemplaza por la de GFP después de la escisión de Cre. Las células positivas para GFAP, pero no positivas para NeuN, expresan GFP, mientras que las células positivas para NeuN, pero no positivas para GFAP, expresan β-gal ( A, imágenes de mayor aumento de materia gris en B, C), lo que indica que Cre no se expresa en neuronas o sus progenitores en la médula espinal. En la materia gris de GFAP-Cre Pcdhfcon3/ + médula espinal, hay una colocalización reducida de γ-Pcdh-GFP con Glt1a, lo que confirma que Cre recombinasa es capaz de extirpar de manera eficiente el alelo floxed en astrocitos en estos ratones ( D, mi). Barras de escala: A, 100 μm B, C, 25 micras D, mi, 10 µm.

Debido a que se sabe que los astrocitos individuales ocupan dominios no superpuestos dentro de los cuales entran en contacto con múltiples procesos neuronales y terminales sinápticos (Bushong et al., 2002 Halassa et al., 2007), cuantificamos las sinapsis en campos circulares de 50 μm de diámetro y centrados en GFAP-positivos , Pcdhastrocitos mutantes -γ (Fig.7 ANUNCIO). Tanto las sinapsis excitadoras como inhibitorias se redujeron significativamente en campos de GFAP-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 ratones en comparación con los de los controles en E15 y E17 (Fig.7 mi). Es importante destacar que no se observó ninguna diferencia en el número de células escindidas caspasa-3-positivas entre los mutantes restringidos por astroctio y los controles, lo que indica que la reducción en la densidad de sinapsis no fue causada por un aumento de los niveles de apoptosis neuronal (Fig. S3 complementaria, disponible en www. .jneurosci.org como material complementario). Similar a la recuperación de la densidad de sinapsis observada en cocultivos maduros astro-nulos (Fig.4 METRO,norte), encontramos que en P0, el número de sinapsis en campos de GFAP-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 los ratones habían alcanzado niveles de control (Fig.7 mi Fig. suplementaria S4B,D, disponible en www.jneurosci.org como material complementario). Este resultado mutante restringido por astrocitos contrasta con nuestros experimentos previos usando Pcdhdel / del Bax - / - ratones (Weiner et al., 2005 Prasad et al., 2008), en los que la densidad de sinapsis permanece baja en P0. De acuerdo con esto, y con nuestros experimentos de cocultivo (Fig.4), también encontramos una reducción significativa en la densidad de sinapsis persistente en P0 en Actin-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 ratones, en los que tanto las neuronas como los astrocitos son mutantes (Fig.7 mi Fig. suplementaria S4C,D, disponible en www.jneurosci.org como material complementario). La notable congruencia entre estos en vivo Los datos y nuestros experimentos de cocultivo proporcionan un fuerte apoyo para las funciones reguladas por el desarrollo de las γ-Pcdhs tanto astrocíticas como neuronales en el control de la sinaptogénesis.

Γ-Pcdhs astrocíticos controlan la sinaptogénesis en la médula espinal embrionaria en vivo. La cuantificación de las sinapsis inmunoteñidas se realizó en campos circulares de 50 μm fotografiados en secciones de médula espinal de GFAP-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 mutantes y controles restringidos por astrocitos en E15, E17 ( ANUNCIO) y P0 (ver la Fig. S4 complementaria, disponible en www.jneurosci.org como material complementario). En ANUNCIO', la superposición amarilla entre los canales rojo y verde se ha extraído y convertido en Adobe Photoshop a negro para mayor claridad. mi, La densidad de sinapsis (es decir, el número de tales contactos sinápticos por círculo de 50 μm) se redujo significativamente en GFAP-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 mutantes (barras grises) en comparación con los controles (barras blancas) en edades embrionarias, pero se habían recuperado por P0, en contraste con Actin-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 mutantes (barras negras). Los gráficos representan medias ± SEM de 18 campos de 3 animales por genotipo por punto de tiempo. *pag & lt 0.05 **pag & lt 0.01 ***pag & lt 0,001.


Discusión

Las neuronas serotoninérgicas, al igual que las otras neuronas monoaminérgicas, proyectan sus axones desde el tallo cerebral, incluidos los núcleos del rafe, a la mayoría de las regiones del SNC. Sin embargo, se desconoce en gran medida el mecanismo que controla las proyecciones globales de neuronas serotoninérgicas hacia sus objetivos. Aquí encontramos que Pcdha las transcripciones se expresaron fuertemente en los núcleos del rafe desde las etapas embrionarias hasta la edad adulta y, por lo tanto, examinamos la distribución de las proyecciones serotoninérgicas de estos núcleos en varias líneas de ratón que codifican proteínas Pcdha mutantes.

La supresión de los exones Pcdha-CR (Pcdha ΔCR /ΔCR ratones) condujeron a fibras serotoninérgicas distribuidas anormalmente en muchas regiones del cerebro por P21. Estas anomalías también se detectaron en un mutante knock-out completo del Pcdha, en el que la Pcdha el grupo de genes está completamente eliminado (Okayama A, Hasegawa S, Hirabayashi T, Katori S, Yagi T, datos no publicados). Temprano en la vida posnatal (antes de la formación de cenadores terminales en las regiones objetivo), el patrón de distribución de las fibras serotoninérgicas en el Pcdha ΔCR /ΔCR los ratones fue similar a la de los ratones WT. Sin embargo, en P21, la distribución de axones serotoninérgicos en Pcdha ΔCR /ΔCR los ratones se alteró sustancialmente. Es decir, los axones se acercaron a sus regiones objetivo normalmente, pero no formaron los extensos árboles axonales que se ven en ratones WT adultos a la misma edad, cuando las proyecciones serotoninérgicas están casi completas.

Lidov y Molliver (1982) propusieron que la ontogenia de las proyecciones axonales serotoninérgicas se divide en tres períodos: primero, elongación del axón (E13-E16), segundo, desarrollo de vías selectivas (E15-E19) y tercero, desarrollo del campo terminal (E19– P21). Nuestros resultados indican que las proteínas Pcdha pueden funcionar durante el período final, durante el desarrollo del campo terminal. los Pcdha ΔCR /ΔCR los ratones mostraron bajas densidades de fibras inervantes en la parte central de varias regiones objetivo, como el globo pálido y la sustancia negra, lo que podría explicarse por una arborización terminal insuficiente de las fibras serotoninérgicas, que penetraron en la periferia de los objetivos. A diferencia de los extremos de las fibras, los haces de axones serotoninérgicos, como el haz del prosencéfalo medial, parecían normales en Pcdha ΔCR /ΔCR ratones (Fig.4C,D). Durante el desarrollo del campo terminal, la formación de arborización terminal serotoninérgica depende de la maduración de otros elementos en los circuitos neuronales locales (Lidov y Molliver, 1982), lo que sugiere que las proteínas Pcdha podrían estar involucradas en las interacciones que promueven el desarrollo del campo terminal.

Los estudios sobre la ontogenia de la inervación serotoninérgica han sugerido factores que regulan el crecimiento del axón serotoninérgico y la arborización terminal. S-100β, una proteína de unión a Ca 2+ secretada por la astroglia, funciona como factor de crecimiento in vitro induciendo brotes serotoninérgicos (Azmitia et al., 1990 Haring et al., 1993), pero los ratones sin S-100β muestran proyecciones serotoninérgicas normales (Nishiyama et al., 2002). El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) puede inducir el crecimiento axonal serotoninérgico en la corteza adulta (Mamounas et al., 1995, 2000), y las proyecciones serotoninérgicas son normales en ratones BDNF +/− más jóvenes, pero se observa una pérdida progresiva de fibras serotoninérgicas cuando tienen entre 12 y 18 meses de edad (Lyons et al., 1999). Por tanto, las proteínas S-100β y BDNF secretadas regulan las proyecciones serotoninérgicas, y la pérdida de cualquiera de ellas puede compensarse con otras proteínas extracelulares, al menos al principio del desarrollo. La proteína citoplasmática GAP-43, una proteína asociada al crecimiento, se expresa fuertemente en neuronas monoaminérgicas (Bendotti et al., 1991 Wotherspoon et al., 1997), y es un regulador de proyecciones serotoninérgicas. Los ratones sin GAP-43 tienen proyecciones serotoninérgicas anormales, pero las anormalidades son diferentes a las de nuestro Pcdha ΔCR /ΔCR ratones. En P0, pocas fibras serotoninérgicas en ratones sin GAP-43 han llegado al hipocampo (Donovan et al., 2002), mientras que en Pcdha mutantes, las fibras parecen llegar al objetivo casi normalmente. En P21, en el Pcdha mutantes la cantidad de axones serotoninérgicos que llegaban a la región del hipocampo era normal, aunque su distribución dentro de las subregiones del hipocampo era anormal (Fig.5F). Por el contrario, en ratones sin GAP-43, la densidad de axones serotoninérgicos que llegan a la región del hipocampo fue menor, en comparación con los ratones WT (Donovan et al., 2002). Por lo tanto, en la regulación de las proyecciones serotoninérgicas, la función de GAP-43 puede ser necesaria en las primeras etapas del desarrollo, y las funciones de las proteínas Pcdha pueden ser significativas solo más adelante en el desarrollo.

Recientemente demostramos que los OSN de Pcdha ΔCR /ΔCR los ratones proyectan anormalmente al bulbo olfatorio (Hasegawa et al., 2008). En el bulbo olfativo de Pcdha ΔCR /ΔCR En los ratones, los axones que expresan un solo receptor olfatorio (M71 o MOR23) no se fusionan en un glomérulo a cada lado del bulbo olfatorio, sino que forman múltiples glomérulos pequeños que persisten incluso en P30 y P60. En ratones WT, se observan proyecciones axonales anormales a múltiples glomérulos pequeños en el bulbo olfatorio en desarrollo, sin embargo, estos glomérulos supernumerarios se eliminan gradualmente durante la maduración posnatal. Por lo tanto, la anormalidad de las proyecciones OSN en el Pcdha ΔCR /ΔCR ratones es consistente con la idea de que las proteínas Pcdha funcionan en la etapa de maduración final de las proyecciones axonales.

En el presente estudio, no pudimos proponer modelos adecuados para explicar el fenotipo de las fibras serotoninérgicas en el Pcdha ΔCR /ΔCR ratones porque el mecanismo de cómo las proteínas Pcdha modifican el crecimiento del axón serotoninérgico y la arborización terminal aún no está claro. Este desconocimiento se debe considerablemente a la falta de información sobre las propiedades de adhesión y localización subcelular de las proteínas Pcdha. Aunque se ha sugerido que las proteínas Pcdha interaccionan con la integrina β1 en un trans-heterofílica (Mutoh et al., 2004), trans-No se pudo detectar la adhesión homofílica de las proteínas Pcdha (Morishita et al., 2006). Además, no se pudo determinar la localización subcelular de las proteínas Pcdha en neuronas serotoninérgicas y sus dianas. Durante la formación de árboles terminales serotoninérgicos, la mayoría de las neuronas del cerebro expresan transcripciones detectables de Pcdha. Nuestro examen inmunohistoquímico con los anticuerpos de Pcdha demuestra una intensa inmunorreactividad en los somas serotoninérgicos, pero no logra determinar la localización subcelular de las proteínas Pcdha en las regiones diana de los axones serotoninérgicos La inmunorreactividad de Pcdha se distribuyó de manera bastante homogénea en el neuropilo (datos no mostrados, Hasegawa et al. ., 2008). Para aclarar la localización subcelular de las proteínas Pcdha, serán necesarios más estudios que incluyan microscopía inmunoelectrónica.

Aquí demostramos que la cola citoplasmática de tipo A de las proteínas Pcdha es importante para la distribución normal de las proyecciones serotoninérgicas. Se informa que la cola citoplasmática de tipo A de Pcdhas se asocia con el neurofilamento M (Triana-Baltzer y Blank, 2006). Además, las proteínas Pcdha están sujetas a la escisión de metaloproteasas de la matriz seguida de proteólisis intramembrana dependiente de presenilina, y la porción escindida de la región citoplasmática de tipo A se trasloca al núcleo desde la membrana plasmática (Bonn et al., 2007). Por lo tanto, la región citoplasmática de tipo A puede desempeñar un papel crucial en la transducción de señales.

Aunque no se conocen las señales transducidas por las proteínas Pcdha, hallazgos recientes han sugerido algunas posibilidades. Por ejemplo, se informó un fenotipo similar de axones agrupados anormales para los axones retinianos de Dscam (Molécula de adhesión celular del síndrome de Down) ratones mutantes (Fuerst et al., 2008). El DSCAM de mamíferos, un miembro de la superfamilia de Ig, muestra unión homofílica (Agarwala et al., 2000) promueve la autoevitación (isoneuronal) para los procesos de arborización e inhibe la fasciculación de procesos de diferentes neuronas (heteroneuronal) (Fuerst et al., 2008) . Esta similitud plantea la posibilidad de que la proteína Pcdha pueda funcionar evitando las neuronas serotoninérgicas. La cola citoplasmática de tipo A puede transducir señales repulsivas en las neuronas serotoninérgicas. El defecto de autoevitación puede influir directamente en el crecimiento del axón serotoninérgico y la arborización terminal. Alternativamente, la autoevitación insuficiente puede afectar la configuración de colaterales recurrentes de neuronas serotoninérgicas que regulan la actividad de estas neuronas y luego cambian indirectamente los cenadores terminales mediante mecanismos dependientes de la actividad.

Aquí demostramos que Pcdha Las moléculas juegan un papel importante en el establecimiento de proyecciones serotoninérgicas normales en cada región del cerebro que estudiamos. También encontramos que en Pcdha ΔCR /ΔCR y Pcdha ΔA/ΔA En ratones, los niveles de serotonina del hipocampo aumentaron significativamente, en comparación con WT. Anteriormente, informamos que los ratones mutantes hipomórficos de tipo Pcdha A (Pcdha ΔBneo /ΔBneo ), en el que no se detectan las transcripciones de tipo B de Pcdha y se reduce el nivel de expresión de las transcripciones de tipo A de Pcdha, muestran una mayor cantidad de serotonina en el hipocampo y un condicionamiento del miedo contextual mejorado y un aprendizaje espacial anormal (Fukuda et al., 2008). Juntos, estos datos son consistentes con la idea de que los niveles anormales de serotonina en el hipocampo son el resultado de mutaciones de la cola citoplasmática de Pcdha, y que los niveles alterados de serotonina podrían afectar el comportamiento.

Los grupos de genes de protocadherina humana (Pcdha, Pcdhb, y Pcdhg) se encuentran en el cromosoma 5q31 (Wu y Maniatis, 1999). Este locus está asociado con BD (Lewis et al., 2003 Hong et al., 2004 Herzberg et al., 2006 Kerner et al., 2007). Un estudio reciente demostró un aumento significativo en la homocigosidad del alelo menor, que contiene un polimorfismo de un solo nucleótido en un potenciador putativo de la Pcdha gen, en pacientes con EB (Pedrosa et al., 2008).

Se mantenga o no la asociación con BD, la inervación serotoninérgica anormal está implicada en una serie de trastornos neuropsiquiátricos, que incluyen depresión, ansiedad, esquizofrenia y autismo (Baumgarten y Grozdanovic, 1995 Hen, 1996 Mann, 1998). Aquí, nuestra observación de que Pcdhas contribuyó a proyecciones serotoninérgicas apropiadas en gran parte del cerebro, si no en todo, sugiere que Pcdhas también podría estar involucrado con los mecanismos patogénicos de una serie de trastornos neuropsiquiátricos, a través de su regulación de proyecciones serotoninérgicas.


Materiales y métodos

Identificación y anotación de cadherinas en B. floridae

Se utilizó un enfoque dual para identificar el repertorio de cadherina en el cefalocordato B. floridae (anfioxo o lanceleta). La versión 2 del lanzamiento del ensamblaje de su genoma (mayo de 2008), descargada del DOE Joint Genome Institute (JGI: http://genome.jgi-psf.org/), contiene 398 andamios (Putnam et al. 2008). Primero, se buscó la traducción de seis cuadros del genoma de amphioxus utilizando los cinco modelos de perfil ocultos de Markov (HMM) existentes en la base de datos de Pfam (Finn et al. 2010) y un HMM de perfil recién construido basado en una alineación de la primera repetición de cadherina (EC1), que describimos anteriormente (Hulpiau y van Roy 2009) (tabla complementaria S1, Material complementario en línea). Los 1.050 accesos de dominio significativos, ordenados por andamio, se muestran en la tabla complementaria S2 (Material complementario en línea) y se resumen en la tabla complementaria S3 (Material complementario en línea). En segundo lugar, se alinearon 292 secuencias de cadherina de una amplia variedad de taxones de metazoos con el genoma del anfioxo utilizando tBLASTn (Johnson et al. 2008) para identificar ortólogos potenciales (tabla complementaria S4 y resumida en la tabla complementaria S5, Material complementario en línea). Finalmente, los resultados de ambos análisis se combinaron para producir la lista completa de miembros de la superfamilia de cadherina en anfioxo (figura suplementaria S1, tabla suplementaria S6 y nota suplementaria S1, Material suplementario en línea). En algunos casos, se realizaron predicciones genéticas adicionales utilizando GenScan (Burge y Karlin 1998) en y alrededor de la región genómica en la que se encuentran los genes putativos, y estas predicciones se compararon luego con los datos de RefSeq disponibles y los modelos de genes JGI. Finalmente, los dominios en todos los genes candidatos se anotaron basándose en la búsqueda de CD (Marchler-Bauer et al. 2009) y Phobius (Kall et al. 2007). El inicio y el final de cada repetición de cadherina se corrigieron manualmente. El comienzo se tomó al comienzo del brazo de adhesión que presentaba un residuo de Glu conservado en la posición 11, el final era el motivo DxNDxxPxF, que es, junto con Glu11, importante para la unión del calcio.

Identificación y anotación de cadherinas en N. vectensis

El enfoque descrito anteriormente para la identificación de cadherinas en amphioxus también se utilizó en el genoma de la anémona de mar no bilateral. N. vectensis. los N. vectensis El ensamblaje del genoma 1.0 contiene 10.804 andamios genómicos (Putnam et al. 2007). El análisis del perfil HMM arrojó 1.016 resultados (tabla complementaria S7, Material complementario en línea), que se agruparon por andamio y se resumieron en la tabla complementaria S8 (Material complementario en línea). Los resultados del análisis tBLASTn de 322 secuencias de cadherina bilateral (las 292 secuencias enumeradas en la tabla complementaria S4, Material complementario en línea, más 30 de B. floridae) versus el N. vectensis El genoma se enumeran en Datos complementarios (Material complementario en línea) y se resumen en la tabla complementaria S10 (Material complementario en línea). Todos los resultados se combinaron y anotaron en el N. vectensis repertorio de cadherina, como se describe para anfioxo (figura suplementaria S2, tabla suplementaria S11 y nota suplementaria S2, Material suplementario en línea).

Identificación y anotación de cadherinas en T. adhaerens

Una vez más, se utilizaron los métodos de perfil HMM y tBLASTn para identificar supuestas cadherinas de placozoos codificadas por el T. adhaerens genoma. El borrador de la versión v1.0 de T. adhaerens Grell-BS-1999 se ensambla en 1.415 andamios (Srivastava et al. 2008). Solo se encontraron 196 resultados de HMM de perfil, que se muestran en la tabla complementaria S12 (Material complementario en línea), utilizando los seis HMM enumerados en la tabla complementaria S1 (Material complementario en línea). Este análisis HMM se combinó con un análisis tBLASTn de 338 cadherinas de metazoos frente al T. adhaerens genoma (consulte la lista en la tabla complementaria S13, Material complementario en línea). Las cadherinas de metazoos analizadas fueron las 322 secuencias enumeradas en la tabla complementaria S9 (Material complementario en línea) más 16 de N. vectensis. Los resultados se fusionaron y anotaron en el T. adhaerens repertorio de cadherin como se describe anteriormente (figura suplementaria S3, tabla suplementaria S14 y nota suplementaria S3, Material suplementario en línea).

Estudio comparativo y filogenético de los miembros de la superfamilia Metazoan Cadherin

Para el análisis de homología por pares de dominios de proteínas, utilizamos una "herramienta de búsqueda de alineación local básica de dos secuencias" (bl2seq) (Johnson et al. 2008). El análisis incluyó la comparación de secuencias de bloques EC, análisis EC por EC y comparación de dominios no EC.

Para el análisis de homología de múltiples secuencias, las secuencias se alinearon mediante ClustalX2 (Larkin et al. 2007) usando la matriz de peso de proteína PAM, una penalización por apertura de brecha de 5 y una penalización por extensión de brecha de 0.05 tanto en el par y en los ajustes de parámetros múltiples.Se construyó un árbol de unión de vecinos (NJ) con 1,000 réplicas de bootstrap, y se construyó un árbol de consenso de inferencia bayesiana (BI) utilizando MrBayes 3 (Ronquist y Huelsenbeck 2003) (100,000 generaciones, frecuencia de muestreo 100 y quemado 25%). Ambos tipos de árboles se dibujaron utilizando un dendroscopio (Huson et al. 2007). El árbol NJ se representa como un cladograma radial con valores de arranque y el árbol BI como un filograma radial con probabilidades posteriores bayesianas.

Usamos VectorNTI (Lu y Moriyama 2004) para generar alineaciones Clustal W de los ectodominios 7EC y 6EC de Ciona intestinalis protocadherinas y también de las protocadherinas humanas. Al utilizar el módulo AlignX de VectorNTI, agregamos anotaciones de dominio de proteínas debajo de los bloques de alineación de secuencias relevantes. Para comparar dominios EC individuales de Ciona protocadherinas con las secuencias genómicas correspondientes, realizamos análisis BLAT (Kuhn et al. 2009) en el navegador del genoma de la Universidad de California Santa Cruz (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start). Las secuencias de proteínas completas de miembros seleccionados en cada familia en el árbol filogenético se alinearon de manera similar mediante el algoritmo Clustal W en VectorNTI.


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ELife digest

La vida multicelular depende de que las células puedan mantenerse juntas. El cuerpo humano, por ejemplo, consta de billones de células agrupadas en tejidos y órganos. Solo el cerebro contiene alrededor de 87 mil millones de neuronas organizadas en redes complejas. Para permanecer unidas, las células usan proteínas en su superficie llamadas moléculas de adhesión celular (CAM). Hay cuatro familias principales de CAM, cada una con varios miembros, y las CAM de una célula reconocen e interactúan con las CAM de otra.

Pero, ¿cómo funciona este proceso? Una posibilidad es que diferentes combinaciones de CAM permitan que diferentes células se unan. Bisogni y col. probó esta idea mediante el estudio de una familia de CAM llamadas delta-protocadherinas. Esta familia tiene nueve miembros, cada uno con su propio gen. Antes de que las células puedan usar un gen para producir una proteína, primero deben usar el ADN del gen como plantilla para construir una molécula de ARN. Al contar el número de diferentes tipos de moléculas de ARN dentro de las células individuales, Bisogni et al. demostraron que las neuronas sensoriales del ratón producen cada una hasta siete delta-protocadherinas diferentes.

Otros experimentos revelaron que las células ajustan sus interacciones variando el número, tipo y combinación de delta-protocadherinas en su superficie. Además, las delta-protocadherinas también alteran las interacciones entre los miembros de una familia de genes relacionados, las protocadherinas agrupadas. Esto aumenta aún más su capacidad para regular cómo interactúan las células.

A diferencia de los estudios anteriores que se centraron en moléculas individuales, Bisogni et al. han demostrado cómo las combinaciones de moléculas trabajan juntas para influir en la adhesión celular. Descifrar este código combinatorio es clave para comprender cómo las interacciones entre las células salen mal en la enfermedad.

Las mutaciones en los genes de las MCA a menudo afectan el desarrollo del cerebro. Los hallazgos informados pueden proporcionar información sobre cómo tales mutaciones interrumpen el código combinatorio de CAM y alteran las interacciones de célula a célula.


Seguimiento de la dinámica de las transcripciones de genes después de la muerte del organismo

En la vida, las redes genéticas y epigenéticas coordinan con precisión la expresión de los genes, pero en la muerte, no se sabe si la expresión de los genes disminuye de forma gradual o se detiene abruptamente o si están involucrados genes y vías específicas. Estudiamos esto identificando transcripciones de ARNm que aparentemente aumentan en abundancia relativa después de la muerte, evaluando sus funciones y comparando sus perfiles de abundancia a través del tiempo post mórtem en dos especies, ratón y pez cebra. Encontramos que los perfiles de transcripción de ARNm de 1063 genes se volvieron significativamente más abundantes después de la muerte de animales adultos sanos en una serie de tiempo que abarca hasta 96 h post mortem. Los gráficos de ordenación revelaron patrones no aleatorios en los perfiles por tiempo. Si bien la mayoría de estos niveles de transcripción aumentaron dentro de las 0.5 h post mórtem, algunos aumentaron sólo a las 24 y 48 h post mórtem. La caracterización funcional de las transcripciones más abundantes reveló las siguientes categorías: estrés, inmunidad, inflamación, apoptosis, transporte, desarrollo, regulación epigenética y cáncer. Los datos sugieren que ocurre una parada gradual en la muerte del organismo que se manifiesta por el aparente aumento de ciertas transcripciones con varios máximos y duraciones de abundancia.

1. Introducción

Un vertebrado adulto sano es un sistema biológico complejo capaz de realizar funciones muy elaboradas, como la capacidad de moverse, comunicarse y sentir el medio ambiente, todo al mismo tiempo. Estas funciones están estrechamente reguladas por redes genéticas y epigenéticas a través de múltiples circuitos de retroalimentación que coordinan con precisión la expresión de miles de genes en el momento adecuado, en el lugar adecuado y en el nivel adecuado [1]. Juntas, estas redes mantienen la homeostasis y, por lo tanto, sostienen la "vida" de un sistema biológico.

Si bien se sabe mucho sobre los circuitos de expresión génica en la vida, existe una escasez de información sobre lo que sucede con estos circuitos después de la muerte del organismo. Por ejemplo, no se sabe si la expresión génica disminuye de forma gradual o se detiene abruptamente en la muerte, ni si las transcripciones de genes específicos aumentan en abundancia en la muerte.. En la "muerte" de un organismo, definida aquí como el cese de las funciones altamente elaboradas del sistema en los vertebrados, conjeturamos que hay una desconexión y pérdida gradual de las redes reguladoras globales, así como la activación de genes reguladores implicados en la supervivencia y la compensación del estrés. Para probar esto, examinamos las abundancias post mortem globales de ARNm en dos organismos modelo: el pez cebra, Danio rerio, y el ratón de la casa, Mus musculus. El propósito de la investigación fue investigar el "desenrollamiento del reloj" identificando transcripciones de ARNm que aumentan en abundancia con el tiempo post mórtem y evaluando sus funciones en base a la literatura primaria. Los sistemas biológicos investigados en este estudio son diferentes de los examinados en otros estudios, como las células muertas o lesionadas individuales en organismos vivos, es decir, apoptosis y necrosis (revisado en [2-5]). En contraste con estudios previos, la abundancia de transcripciones de ARNm de todo el D. rerio cuerpo, y los cerebros e hígados de M. musculus fueron evaluados a través del tiempo post mortem. Las transcripciones de ARNm se midieron utilizando el método "Gene Meter" que informa con precisión la abundancia de transcripciones en función de una curva de calibración para cada sonda de microarrays [6-9].

2. Material y métodos

2.1. Muerte inducida e incubación post mortem

2.1.1. Pez cebra

Cuarenta y cuatro mujeres Danio rerio se transfirieron de varios acuarios de flujo continuo mantenidos a 28 ° C a un vaso de precipitados de vidrio que contenía 1 l de agua de acuario. Se sacaron inmediatamente cuatro individuos, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron en tubos Falcon a -80 ° C (dos peces cebra por tubo). Estas muestras se designaron como el primer conjunto de controles vivos. Se sumergió un segundo conjunto de controles en vivo en un cilindro abierto (descrito a continuación). Se utilizaron dos conjuntos de controles en vivo para determinar si devolver al pez cebra a su entorno nativo tenía algún efecto sobre la expresión génica (más tarde no descubrimos efectos significativos).

El resto del pez cebra fue sometido a muerte súbita por inmersión en una cámara de "muerte". La cámara constaba de un recipiente de espuma de poliestireno de 8 l lleno de agua helada. Para sincronizar la muerte del resto de los peces cebra, se transfirieron a un cilindro abierto con un fondo cubierto de malla y el cilindro se sumergió en la cámara de sacrificio. Después de 20-30 s de inmersión, se recuperaron cuatro peces cebra de la cámara, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C (dos peces cebra por tubo Falcon). Estas muestras se designaron como el segundo conjunto de controles vivos. El pez cebra restante se mantuvo en la cámara de muerte durante 5 minutos y luego el cilindro se transfirió a un acuario de flujo continuo mantenido a 28 ° C para que fueran devueltos a su entorno nativo.

El muestreo post mortem del pez cebra ocurrió en: tiempo 0, 15 min, 30 min, 1 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 hy 96 h. Para cada tiempo de muestreo, se recuperaron cuatro peces cebra vencidos del cilindro, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C en tubos Falcon (dos peces cebra por tubo). Se perdió una muestra de pez cebra, pero los volúmenes de extracción se ajustaron a un individuo.

2.1.2. Ratón

La cepa de ratón C57BL / 6JRj (Janvier SAS, Francia) se utilizó para nuestros experimentos. Los ratones eran machos de 20 semanas de aproximadamente el mismo peso. Los ratones eran altamente endogámicos y se esperaba que tuvieran un trasfondo genético homogéneo. Antes de la eutanasia, los ratones se mantuvieron a temperatura ambiente y se les dio ad libitum acceso a alimentos y agua. Cada ratón se sacrificó mediante dislocación cervical y se colocó en una bolsa de plástico individual con orificios para permitir el intercambio de aire / gas. Las canales envasadas en bolsas se mantuvieron a temperatura ambiente en un recipiente grande de poliestireno abierto. El muestreo de los ratones muertos comenzó a las 0 h (tiempo post mortem cero) y continuó a los 30 min, 1 h, 6 h, 12 h, 24 hy 48 h post mortem.En cada tiempo de muestreo, se tomaron muestras de tres ratones (excepto durante 48 h cuando se tomaron muestras de dos ratones) y se extrajeron todo el cerebro (más el tallo) y dos porciones del hígado de cada ratón. Para las muestras de hígado, se tomaron recortes de los lóbulos anteriores y más a la derecha del hígado. Las muestras de cerebro e hígado se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron individualmente en tubos Falcon a -80 ° C.

2.2. Extracción de ARN, etiquetado, hibridación y micromatrices de ADN

El número de individuos fue 43 para el pez cebra y 20 para los ratones. Las muestras de dos peces se combinaron para el análisis, lo que resultó en dos mediciones repetidas en cada punto de tiempo. El número de mediciones replicadas para ratones fue de tres en cada uno de los primeros seis puntos de tiempo y dos a las 48 h. Así, el número total de muestras analizadas fue de 22 para pez cebra y 20 para ratones. Para el pez cebra, las muestras se mezclaron con 20 ml de Trizol y se homogeneizaron usando un TissueLyzer (Qiagen). Para los ratones, se mezclaron 100 mg de muestras de cerebro o hígado con 1 ml de Trizol y se homogeneizaron. Se puso un mililitro de la emulsión de cada muestra en un tubo de centrífuga nuevo de 1,5 ml para la extracción de ARN y el resto se congeló a -80 ° C.

El ARN se extrajo agregando 200 µl de cloroformo, agitando la muestra e incubándola a 25 ° C durante 3 min. Después de la centrifugación (15 min a 12 000gramo a 4ºC), el sobrenadante (aproximadamente 350 µl) se transfirió a un tubo nuevo de 1,5 ml que contenía un volumen igual de etanol al 70%. El tubo se agitó con vórtex, se centrifugó y se purificó siguiendo los procedimientos descritos en el Mini Kit PureLink RNA (Life Technologies, EE. UU.).

El ARN aislado, 400 ng por muestra, se marcó, purificó e hibridó de acuerdo con el análisis de expresión génica basado en micromatrices de un color (etiquetado Quick Amp) con el kit de hibridación Tecan HS Pro (Agilent Technologies). Para el pez cebra, el ARN marcado se hibridó con el Microarray de expresión génica de Zebrafish (v2) (Design ID 019161). Para el ratón, el ARN marcado se hibridó con el diseño de microarrays SurePrint G3 GE 8 × 60K ID 028005 (Agilent Technologies). Los microarrays se cargaron con 1,65 µg de ARNc marcado para cada muestra post mórtem.

2.3. Calibración de microarrays

Las sondas de oligonucleótidos (60 nt) en los microarrays de pez cebra y ratón se calibraron usando ARNc marcado agrupado de todas las muestras postmortem de pez cebra y de ratón, respectivamente. La serie de diluciones para la matriz de pez cebra se creó utilizando las siguientes concentraciones de ARNc marcado: 0,41, 0,83, 1,66, 1,66, 1,66, 3,29, 6,60 y 8,26 µg. La serie de diluciones para las matrices de ratón se creó utilizando las siguientes concentraciones de ARNc marcado: 0,17, 0,33, 0,66, 1,32, 2,64, 5,28, 7,92 y 10,40 µg. La calibración implicó graficar las intensidades de la señal de las sondas contra un factor de dilución y determinar el modelo de isoterma (por ejemplo, Freundlich y / o Langmuir) que mejor se ajusta a la relación entre las intensidades de la señal y la abundancia de genes.

Considere las transcripciones del gen del pez cebra a las que se dirige A_15_P110618 (que resulta ser uno de los perfiles transcripcionales del gen Hsp70.3 se muestra en la figura 1a). El archivo externo FishProbesParameters.txt muestra que un modelo de Freundlich se ajusta mejor a la curva de dilución con R 2 = 0,99. La ecuación de esta sonda es la siguiente:

donde SI es la intensidad de señal media observada para la dilución X. La abundancia de la transcripción GRAMO se calculó invirtiendo esta ecuación. Para cada intensidad de la señal de la sonda en el tiempo post mórtem, SIt, la abundancia de genes GRAMO= (SIt/exp(7.1081)) 1 / 0.67632. Específicamente, considere dos réplicas biológicas de pez cebra postmortem de 15 min, las intensidades de señal de la sonda A_15_P110618 son 770.5 y 576, lo que se traduce en las abundancias 0.50 y 0.33 unidades arbitrarias (unidades arbitrarias), respectivamente. Las abundancias objetivo se convirtieron aún más a log10 y se muestran en el archivo externo Fish_log10_AllProfiles.txt.

Figura 1. Perfiles de transcripción de genes representativos (unidades arb.), Gráficos de ordenación basados ​​en abundancias de transcripciones por tiempo post mórtem (h) con las contribuciones de transcripciones correspondientes (biplots) y abundancias de transcripciones promediadas por grupo. (C.A) Perfiles transcripcionales de (a) los Hsp70.3 gen,B) los Tox2 gen y (C) un gen de transcripción no anotada "NULL" (es decir, sin anotación, se muestra el número de sonda) en función del tiempo post mórtem. (Delaware) Parcelas de ordenación del (D) pez cebra y (mi) ratón se basaron en todos los perfiles de transcripción de genes que se encontró que tenían una abundancia significativamente mayor. Las transcripciones de genes en las biplots se asignaron arbitrariamente a grupos alfabéticos en función de sus posiciones en la ordenación. Se muestran las abundancias de transcripciones promedio para cada grupo.

Se proporcionan más detalles de los protocolos de calibración utilizados para calcular las abundancias relativas de la transcripción de ARN en otro lugar [6, 7].

2.4. análisis estadístico

Los niveles de abundancia se transformaron logarítmicamente para que el análisis estabilizara la varianza. Un Dunnett unilateral T-Se aplicó la estadística para probar el aumento en uno o más tiempos post mortem en comparación con el control vivo (peces) o el tiempo 0 (ratón). Se utilizó un procedimiento de arranque con 10 9 simulaciones para determinar el valor crítico de las estadísticas de Dunnett con el fin de acomodar las desviaciones de los supuestos paramétricos y tener en cuenta la multiplicidad de pruebas. El perfil de transcripción de cada gen se centró restando los valores medios en cada punto de tiempo post mortem para crear perfiles "nulos". Se generaron muestras bootstrap de los perfiles nulos para determinar el percentil 95 del máximo (sobre todos los genes) de las estadísticas de Dunnett. Se consideró que una transcripción tenía una abundancia significativamente mayor cuando uno o más puntos tenían Dunnett T-valores superiores al percentil 95. Los genes correspondientes se conservaron para análisis posteriores.

Se llevó a cabo la transformación ortogonal de las abundancias a sus componentes principales (PC) y los resultados se graficaron en una gráfica de ordenación bidimensional. los m ×norte La matriz de abundancias (tiempos de muestreo por número de transcripciones de genes), que es 10 × 548 para el pez cebra y 7 × 515 para el ratón, se utilizó para producir un metro × metro matriz D de distancias euclidianas entre todos los pares de tiempos de muestreo. El análisis de componentes principales (PCA) se realizó en la matriz de distancias, D. Para investigar y visualizar las diferencias entre los tiempos de muestreo, se creó un diagrama de dispersión de los dos primeros componentes principales (PC1 y PC2). Para establecer las contribuciones relativas de las transcripciones de genes, se calculó la proyección de cada tiempo de muestreo en el plano (PC1 y PC2) y las transcripciones de genes con altas correlaciones (mayores o iguales a 0,70) entre abundancias y cualquiera de los componentes (PC1 o PC2). fueron mostrados como un biplot.

2.5. Anotación genética y categorización funcional

Las secuencias de la sonda de microarrays se anotaron individualmente mediante la realización de una búsqueda BLASTN de las bases de datos del NCBI de ratón y pez cebra (febrero de 2015). Las anotaciones de genes se conservaron si la puntuación de bits era mayor o igual a 100 y las anotaciones estaban en la orientación correcta 5′-3 ′. Los factores de transcripción, los reguladores de la transcripción y los componentes de señalización celular (por ejemplo, receptores, enzimas y mensajeros) se identificaron como genes reguladores globales. El resto se consideró genes de respuesta.

Las categorizaciones funcionales se realizaron consultando las transcripciones de genes anotadas en la literatura primaria y utilizando UniProt (www.uniprot.org). Los genes que no se clasificaron funcionalmente en su organismo nativo (pez cebra o ratón) se clasificaron en genes de organismos relacionados filogenéticamente (por ejemplo, humanos). Los genes relacionados con el cáncer se identificaron utilizando una base de datos construida previamente (ver archivo adicional 1: tabla S1 en [10]).

3. Resultados

La extracción del ARNm total, la calibración de las sondas de microarrays y la determinación de la abundancia de transcripciones en cada tiempo de muestreo post mórtem produjo una serie de datos de transcriptoma de grano fino para el pez cebra y el ratón. Aproximadamente el 84,3% (36 811 de 43 663) de las sondas de pez cebra y el 67,1% (37 368 de 55 681) de las sondas de ratón proporcionaron curvas de dosis-respuesta adecuadas para la calibración (material complementario electrónico, archivos S1-S7 http: // dx. doi.org/10.5061/dryad.hv223).

La Figura 2 muestra la suma de todas las abundancias de transcripciones calculadas a partir de las sondas calibradas en función del tiempo post mórtem. En general, la suma de todas las abundancias disminuyó con el tiempo, lo que significa que menos objetivos de transcripción hibridaron con las sondas de microarrays. En el pez cebra, el ARNm disminuyó abruptamente a las 12 h post mórtem (figura 2a), mientras que para el cerebro del ratón (figura 2B), el ARNm aumentó en la primera hora y luego disminuyó gradualmente. Para el hígado de ratón, el ARNm disminuyó gradualmente con el tiempo post mórtem. El hecho de que el ARNm total que se muestra en la figura 2a, b Refleja los patrones de electroforesis que se muestran en el material complementario electrónico, las figuras S1 y S2 (ignorando las bandas de ARNr 28S y 18S) indican un acuerdo general del enfoque de Gene Meter con el enfoque basado en gel (es decir, Agilent Bioanalyzer). Por lo tanto, la abundancia de ARNm depende del organismo (pez cebra, ratón), órgano (cerebro, hígado) y el tiempo post mortem, lo que está alineado con estudios previos [11-16].

Figura 2. Abundancia total de ARNm (unidades arbitrarias, unidades arbitrarias) por tiempo post mórtem determinado utilizando todas las sondas de microarrays calibradas: (a) extraído de pez cebra entero, (B) extraído de los tejidos del cerebro y del hígado de ratones enteros. Cada punto de referencia representa el ARNm de dos individuos en el pez cebra y un solo individuo en el ratón.

La abundancia de una transcripción está determinada por su tasa de síntesis y su tasa de degradación [17]. Nos centramos aquí en las transcripciones que aumentaron significativamente en abundancia, en relación con los controles vivos, porque estos genes podrían transcribirse activamente después de la muerte del organismo a pesar de una disminución general en el ARNm total con el tiempo. Una transcripción se definió como una abundancia significativamente mayor cuando al menos un punto de tiempo era estadísticamente más alto que el del control (figura 1C.A). Es importante comprender que todos los perfiles, es decir, 22 puntos de datos para el pez cebra y 20 puntos para el ratón, se sometieron a una prueba estadística para determinar la significancia (ver Material y métodos). Encontramos 548 perfiles de pez cebra y 515 perfiles de ratón que habían aumentado significativamente la abundancia de transcripciones.

Con base en las anotaciones de genes de GenBank, encontramos que, entre las transcripciones con abundancia significativamente mayor, para el pez cebra 291 eran genes que codifican proteínas (53%) y 257 mRNA no anotados (47%), y para el ratón 324 eran proteínas conocidas. genes codificantes (63%), 190 ARNm no anotados (37%) y una secuencia de control Agilent de composición desconocida. Por lo tanto, en el pez cebra y el ratón, se conoce aproximadamente el 58% de los genes totales con abundancias de transcripciones significativas y el resto (42%) son ARN supuestamente no anotado.

Ejemplos de genes que producen transcripciones que aumentaron significativamente en abundancia con el tiempo post mórtem son: la proteína de choque térmico (Hsp70.3) gen, el cuadro de grupo de alta movilidad asociado a la selección de timocitos 2 (Tox2) gen, y un desconocido (NULO) gen (figura 1C.A). Mientras que la Hsp70.3 La abundancia de transcripciones aumentó después de 1 h post mórtem para alcanzar un máximo a las 12 h, la Tox2 la transcripción aumentó después de 12 h post mórtem para alcanzar un máximo a las 24 h, y la NULO la transcripción aumentó constantemente con el tiempo de autopsia. Estas figuras proporcionan ejemplos típicos de perfiles de transcripción y representan la alta reproducibilidad de las réplicas de la muestra, así como la calidad de los resultados obtenidos por el enfoque de Gene Meter.

3.1. Patrones no aleatorios en perfiles de transcripción

Los gráficos de ordenación de los perfiles de transcripción que habían aumentado significativamente las abundancias revelaron diferencias prominentes con el tiempo post mórtem (figura 1Delaware), lo que sugiere que los aumentos en la abundancia de transcripciones de genes siguieron un patrón discernible (no aleatorio) en ambos organismos. Los biplots mostraron que 203 perfiles de transcripción de pez cebra y 226 perfiles de ratón contribuyeron significativamente a las ordenaciones. Para identificar patrones en los perfiles de transcripción, los asignamos a grupos según su posición en los biplots. Se asignaron seis grupos de perfil para el pez cebra (A a F) y cinco grupos (G a K) se asignaron para el ratón. La determinación de la abundancia promedio de transcripciones de genes por grupo reveló diferencias en las formas de los perfiles promediados, particularmente el momento y la magnitud de las abundancias máximas, lo que explica el posicionamiento de los puntos de datos en las ordenaciones.

Los genes que codifican las funciones reguladoras globales se examinaron por separado de otros (es decir, genes de respuesta). Los resultados combinados muestran que aproximadamente el 33% de los genes en las parcelas de ordenación estaban involucrados en la regulación global, con el 14% de estos factores de transcripción / reguladores de transcripción codificantes y el 19% de proteínas de señalización celular como enzimas, mensajeros y receptores (material complementario electrónico, tabla S3). Los genes de respuesta representaron el 67% del total.

Los genes se asignaron a 22 categorías (material complementario electrónico, archivo S8) y algunos genes tienen múltiples categorizaciones. Por ejemplo, el factor de iniciación de la traducción eucariota 3 Subunidad J-B (Eif3j2) el gen se asignó a las categorías de síntesis de proteínas y cáncer [18].

Se investigaron genes en las siguientes categorías funcionales: estrés, inmunidad, inflamación, apoptosis, transporte de solutos / iones / proteínas, desarrollo embrionario, regulación epigenética y cáncer. Nos centramos en estas categorías porque eran comunes a ambos organismos, contenían múltiples genes y podrían proporcionar posibles explicaciones para los aumentos post mortem en la abundancia de transcripciones (por ejemplo, regulación de genes epigenéticos, desarrollo embrionario, cáncer). Los perfiles transcripcionales se trazaron por categoría y cada perfil se ordenó por el momento del aumento de abundancia y abundancia máxima. Esto permitió comparaciones de la dinámica de la transcripción en función del tiempo post mórtem para ambos organismos. Para cada categoría, proporcionamos el nombre y la función del gen y comparamos la dinámica de la transcripción dentro y entre los organismos.

3.2. Respuesta al estrés

En la muerte del organismo, se anticipó que las transcripciones de los genes de respuesta al estrés aumentarían significativamente en abundancia porque estos genes se activan en la vida para hacer frente a las perturbaciones, recuperar la homeostasis [19] y estabilizar el citoesqueleto [20]. Los genes de respuesta al estrés se asignaron a tres grupos: proteína de choque térmico (Hsp), respuestas relacionadas con la hipoxia y "otras", como el estrés oxidativo.

3.2.1. Hsp

En el pez cebra Hsp Las transcripciones de genes que aumentaron significativamente en abundancia incluyeron: Región promotora translocada (Tpr), Hsp70.3 y Hsp90 (figura 3). los Tpr gen codifica una proteína que facilita la exportación de la Hsp ARNm a través de la membrana nuclear [21] y se ha implicado en la organización de la cromatina, la regulación de la transcripción, la mitosis [22] y el control de la senescencia celular [23]. los Hsp70.3 y Hsp90 los genes codifican proteínas que controlan el nivel de calcio intracelular [24], ayudan con el plegamiento de proteínas y ayudan en la degradación de proteínas [25].

Figura 3. Aumento de la abundancia de transcripciones de genes de respuesta al estrés por tiempo post mórtem (h) y categoría de estrés: (a) pez cebra y (B) ratón. Verde, valor intermedio rojo, valor máximo.

En el mouse, el Hsp las transcripciones de genes incluyeron: Tpr, Hsp-metiltransferasa asociada (Mettl21) y proteína de choque térmico 1 (Hspe1) (figura 3). los Mettl21 gen codifica una proteína moduladora Hsp funciones [26]. los Hspe1 gen codifica una proteína chaperonina que ayuda con el plegamiento de proteínas en las mitocondrias [27].

El momento y la duración de la Hsp la abundancia de transcripciones variaba según el organismo. En general, el aumento en la abundancia de transcripciones de Hsp los genes aparecieron mucho más tarde en el pez cebra que en el ratón (4 h versus 0,5 h post mórtem, respectivamente). También hubo diferencias en los máximos de abundancia de transcripciones de Hsp genes ya que alcanzaron máximos a las 9-24 h en el pez cebra, mientras que alcanzaron máximos a las 12-24 h en el ratón. Estudios anteriores han examinado el aumento de Hsp70.3 transcripciones con el tiempo en líneas celulares humanas estimuladas con suero vivo [28]. Tanto en el pez cebra como en las líneas celulares humanas (figura 1a), los Hsp70.3 La transcripción del gen alcanzó una abundancia máxima aproximadamente a las 12 h, lo que indica que las mismas reacciones ocurren en la vida y en la muerte.

3.2.2. Hipoxia

En el pez cebra, las transcripciones de genes relacionados con la hipoxia que aumentaron significativamente en abundancia incluyeron: anhidrasa carbónica 4 (Ca4c), Factor nuclear (NF) interleucina-3 (Nfil3), Factor 1-alfa inducible por hipoxia (Hiflab) y arginasa-2 (Arg2) (figura 3). La anhidrasa carbónica 4 (Ca4c) codifica una enzima que convierte el dióxido de carbono en bicarbonato en respuesta a condiciones anóxicas [29]. los Nfil3 El gen codifica una proteína que suprime la apoptosis inducida por hipoxia [30] y activa las respuestas inmunitarias [31]. los Hiflab gen codifica un factor de transcripción que prepara a las células para la disminución del oxígeno [32]. los Arg2 El gen codifica una enzima que cataliza la conversión de arginina en urea en condiciones hipóxicas [33]. Es de destacar que la acumulación de urea presumiblemente desencadenó el aumento de Slc14a2 transcripciones de genes a las 24 h, como se informa en la Sección de Transporte (a continuación).

En el ratón, las transcripciones de genes relacionados con la hipoxia que aumentaron significativamente en abundancia incluyeron: Dominio inducible por hipoxia de metiltransferasa (Methig1) y esfingolípidos delta-desaturasa (Grados2) (figura 3). los Methig1 gen codifica la metiltransferasa que presumiblemente participa en la regulación génica [34]. los Grados2 El gen codifica una proteína que actúa como sensor de oxígeno y regula el metabolismo de las ceramidas [35]. Las ceramidas son moléculas de lípidos cerosos en las membranas celulares que regulan el crecimiento celular, la muerte, la senescencia, la adhesión, la migración, la inflamación, la angiogénesis y el tráfico intracelular [36].

La mayor abundancia de Ca4c Las transcripciones en el pez cebra supuestamente indican una acumulación de dióxido de carbono 0,1 a 1 h post mórtem en el pez cebra, presumiblemente debido a la falta de circulación sanguínea. La mayor abundancia de Nfil3 transcripciones en el pez cebra y Methig1 las transcripciones en el ratón sugieren que existen condiciones hipóxicas dentro de las 0.5 h post mórtem en ambos organismos. El aumento de la abundancia de las otras transcripciones de genes de hipoxia varió con el tiempo post mórtem, con aumentos de Hiflab, Arg2 y Grados2 transcripciones a las 4 h, 12 hy 24 h, respectivamente.

3.2.3. Otras respuestas al estrés

En el pez cebra, las transcripciones de genes que aumentaron significativamente en abundancia incluyeron: ceramidasa alcalina 3 (Acer3), Peroxirodoxina 2 (Prdx2), Inmediatamente temprano (Ier2), Detención del crecimiento y proteína inducible por daños en el ADN (Gadd45a), Dominio CCH de dedo de zinc que contiene 12 (Zcchc12), Receptor 1 de la hormona liberadora de corticotropina (Crhr1) y el dominio 4 del tipo AN1 del dedo de zinc (Zfand4) (figura 3). los Acer3 gen codifica una proteína sensor de estrés que media la detención del crecimiento celular y la apoptosis [37]. los Prdx2 gen codifica una enzima antioxidante que controla los niveles de peróxido en las células [38] y desencadena la producción de Tnfa proteínas que inducen inflamación [39]. los Ier2 gen codifica un factor de transcripción implicado en la respuesta al estrés [40]. los Gadd45a El gen codifica un sensor de proteína de estrés que detiene el ciclo celular [41], modula la muerte y supervivencia celular y es parte de las redes de señalización en las células inmunes [42]. los Zcchc12 gen codifica una proteína involucrada en la respuesta al estrés en el cerebro [43]. los Crhr1 y Zfand4 los genes codifican proteínas de estrés [44, 45].

Mientras que la Acer3, Prdx2 y Ier2 Las transcripciones aumentaron en 0.3 h post mórtem, lo que indica un cambio de estado fisiológico, la Gadd45a la transcripción aumentó a las 9 hy las otras transcripciones (Zcchc12, Crhr1 y Zfand4) aumentó a las 24 h post mórtem.

En el ratón, las transcripciones de genes que aumentaron significativamente en abundancia incluyeron: RING-CH 4 asociado a membrana (4 de marzo), Miembro 2 del dominio similar a ubiquitina residente en retículo endoplásmico sensible a homocisteína (Herpud2), Prohibitin-2 (Phb2), Gadd45a y 2-oxoglutarato y dominio de oxigenasa dependiente de hierro que contiene 1 (Ogfod1) (figura 3). los 4 de marzo gen codifica una proteína de respuesta al estrés inmunológicamente activa [46]. los Herpud2 El gen codifica una proteína que detecta la acumulación de proteínas desplegadas en el retículo endoplásmico [47]. los Phb2 gen codifica un receptor de superficie celular que responde al estrés mitocondrial [48]. los Ogfod1 gen codifica una proteína sensible al estrés [49].

Tenga en cuenta que las transcripciones de genes de estrés en el ratón aumentaron dentro de 1 h post mórtem y permanecieron en alta abundancia durante 48 h.

3.2.4. Resumen de la respuesta al estrés

En ambos organismos, la muerte del organismo aumentó la abundancia de transcripciones de genes de choque térmico, hipoxia y "otro estrés", que variaron en su momento y duración dentro y entre organismos. Considere, por ejemplo, el Tpr y Gadd45a genes, que eran comunes a ambos organismos. Mientras que la abundancia de transcripciones para el Tpr gen aumentó significativamente dentro de 0.5 h post mórtem en ambos organismos, la abundancia de transcripción para el Gadd45a gen aumentó a las 9 h en el pez cebra y 0,5 h en el ratón. Además, el perfil transcripcional del Tpr El gen fue más variable en el pez cebra que en el ratón, ya que las transcripciones aumentaron en abundancia a las 0.3 h, 9 hy 24 h post mórtem, lo que sugiere que podrían estar reguladas a través de un circuito de retroalimentación. Por el contrario, el perfil transcripcional de Tpr gen en el ratón aumentó a las 0,5 h y alcanzó su punto máximo a las 12 y 24 h post mórtem.

Tomados en conjunto, el aumento significativo en la abundancia de transcripciones de genes de estrés en ambos organismos es presumiblemente para compensar la pérdida de homeostasis.

3.3. Respuestas inmunes innatas y adaptativas

En la muerte de un organismo, se anticipó un aumento de las transcripciones de genes de respuesta inmune, ya que los vertebrados han desarrollado formas de proteger al huésped contra la infección en vida, incluso en condiciones absolutamente estériles [50]. Los genes de inflamación se excluyeron de esta sección (aunque son genes inmunes innatos) porque los examinamos en una sección separada (a continuación).

En el pez cebra, las transcripciones de genes que aumentaron significativamente en abundancia incluyeron: Respuesta de crecimiento temprano-1 y -2 (Egr1, Egr2), Interleucina-1b (Il1b), L -aminoácido oxidasa (Laao), Interleucina-17c (Il17c), Miembro 17A.1 de la subfamilia A de 4 dominios que abarca la membrana (Ms4a17.a1), Mucina-2 (Muc2), Gen inmunorespondedor 1 (Irg1), Interleucina-22 (Il22), Ubl hidrolasa carboxilo terminal 18 (Usp18), Tipo ATF 3 (Batf3), Cadena ligera del citocromo b-245 (Cyba) y miembro de la familia de proteínas de caja de grupo de alta movilidad asociada a la selección de timocitos 2 (Tox2) (Figura 4). los Egr1 y Egr2 los genes codifican proteínas que regulan las funciones de las células B y T en la inmunidad adaptativa [51,52]. los Il1b El gen codifica una interleucina que mata las células bacterianas mediante el reclutamiento de otras moléculas antimicrobianas [53]. los Laao gen codifica una oxidasa implicada en la inmunidad innata [54]. los Il17c y Il22 los genes codifican interleucinas que trabajan sinérgicamente para producir péptidos antibacterianos [55]. los Ms4a17.a1 gen codifica una proteína implicada en la inmunidad adaptativa [56]. los Muc2 El gen codifica una proteína que protege el epitelio intestinal de las bacterias patógenas [57]. los Irg1 El gen codifica una enzima que produce ácido itacónico, que tiene propiedades antimicrobianas [58]. los Usp18 gen codifica una proteasa que juega un papel en la inmunidad adaptativa [59]. los Batf3 gen codifica un factor de transcripción que activa genes implicados en la inmunidad adaptativa [60]. los Cyba El gen codifica una oxidasa que se utiliza para matar microorganismos [61]. los Tox2 El gen codifica un factor de transcripción que regula las células asesinas naturales (NK) del sistema inmunológico innato [62].

Figura 4. Abundancia de transcripciones de genes de inmunidad por tiempo post mórtem (h): (a) pez cebra y (B) ratón. Verde, valor intermedio rojo, valor máximo. Algunas transcripciones fueron representadas por dos sondas diferentes (p. Ej. Il1b, Laao).

Los aumentos de las transcripciones de genes de inmunidad en el pez cebra se produjeron en diferentes momentos con duraciones variables. Mientras que las transcripciones de genes implicados en la inmunidad adaptativa aumentaron en abundancia entre 0,1 y 0,3 h (Egr), 9 horas (Ms4a17.a1) y 24 h (Usp18, Batf3) post mortem, las transcripciones de genes implicados en la inmunidad innata aumentaron a las 4 h (Il1b), 9 horas (Laao, Il17c), 12 h (Muc2, Irg1) y 24 h (Il22, Cyba, Tox2), lo que indica un enfoque progresivo y de múltiples frentes para tratar las lesiones y el potencial de invasión microbiana.

En el ratón, las transcripciones de genes que aumentaron significativamente en abundancia incluyeron: 3G similar al polipéptido catalítico (Apobec3g), Endonucleasa asociada a CRISPR (Cas1), Perforin-1 (Prf1), Inmunoglobulina pesada variable 8-11 (Ighv8-11), Proteína de unión a C4b (C4b), Componente de complemento C7 (C7), Receptor de células T alfa y cadena delta (Tcra / Tcrd), Receptor I de inmunoglobulina gamma Fc de alta afinidad (Fcgr1a), Defensina (Defb30), Quimiocina-4 (Ccr4), Interleucina-5 (Il5), Receptor de células NK 2B4 (Cd244), Clúster de diferenciación-22 (Cd22), Proteína citosólica de linfocitos 2 (Lcp2), Locus beta de la región 2 O de histocompatibilidad (H2ob) y la proteína transmembrana inducida por interferón 1 (Ifitm1) (Figura 4). los Apobec3g El gen codifica una proteína que desempeña un papel en la inmunidad antiviral innata [63]. los Cas1 El gen codifica una proteína implicada en la regulación de la activación del sistema inmunológico [64-67]. los Prf1, C7 y Defb30 los genes codifican proteínas que matan a las bacterias formando poros en la membrana plasmática de las células diana [68-70]. los Ighv8-11 gen codifica una inmunoglobulina de función incierta. los C4b gen codifica una proteína implicada en el sistema del complemento [71]. los Tcra / Tcrd los genes codifican proteínas que desempeñan un papel en la respuesta inmunitaria [72]. los Fcgr1a gen codifica una proteína involucrada en respuestas inmunes tanto innatas como adaptativas [73]. los Ccr4 El gen codifica una citocina que atrae a los leucocitos a los sitios de infección [74]. los Il5 El gen codifica una interleucina implicada tanto en la inmunidad innata como en la adaptativa [75,76]. los Cd244 y Cd22 los genes codifican proteínas implicadas en la inmunidad innata [77]. los Lcp2 El gen codifica una proteína adaptadora transductora de señales que participa en el desarrollo y la activación de las células T [78]. los H2ob gen codifica una proteína involucrada en la inmunidad adaptativa. los Ifitm1 gen codifica una proteína que tiene propiedades antivirales [79].

La mayoría de las transcripciones de genes de respuesta inmune aumentaron en abundancia dentro de 1 h post mórtem en el ratón (norte = 14 de 16 genes), lo que indica una respuesta más rápida que la del pez cebra.

3.3.1. Resumen de la respuesta inmune

El aumento en la abundancia de transcripciones de genes de respuesta inmune en ambos organismos incluyó componentes de inmunidad innata y adaptativa. Un fenómeno interesante observado en el ratón (pero no en el pez cebra) fue que cuatro genes (C7, Tcra / Tcrd, Fcgr1a y Defb30) alcanzaron máximos de abundancia de transcripciones en dos tiempos post mórtem diferentes (es decir, 1 hy 12 h) mientras que otros alcanzaron solo uno. La variabilidad en la abundancia de transcripciones de genes sugiere una posible regulación por bucles de retroalimentación.

3.4. Respuesta a la inflamación

Se anticipó la mayor abundancia de transcripciones de genes de inflamación en la muerte del organismo porque la inflamación es una respuesta de inmunidad innata a la lesión. En el pez cebra, las transcripciones de genes de inflamación que aumentaron en abundancia incluyeron: Egr1, Egr2, Il1b, Receptor del factor de necrosis tumoral (Tnfrsf19), Hem oxigenasa 1 (Hmox1), Factor de necrosis tumoral (Tnf), Receptor de proteína G (Gpr31), Interleucina-8 (Il8), Factor de necrosis tumoral alfa (Tnfa), NF kappa B (Nfkbiaa), Serina / treonina quinasa 2b que interactúa con MAP quinasa (Mknk2b) y el receptor 1 del factor liberador de corticotropina (Crhr1) (Figura 5). los Egr1 y Egr2 los genes codifican factores de transcripción que son proinflamatorios y antiinflamatorios, respectivamente [51,52,80]. los Il1b El gen codifica una citocina proinflamatoria que desempeña un papel clave en la inflamación estéril [81,82]. los Tnfrsf19 El gen codifica un receptor que tiene funciones proinflamatorias [83]. los Hmox1 El gen codifica una enzima que tiene funciones antiinflamatorias y participa en el catabolismo del hemo [84,85]. los Tnf y Tnfa los genes codifican proteínas proinflamatorias. los Gpr31 El gen codifica una proteína proinflamatoria que activa la vía de señalización NF-κB [86]. los Il8 El gen codifica una citocina que tiene propiedades proinflamatorias [87]. los Nfkbiaa gen codifica una proteína que integra múltiples vías de señalización inflamatoria que incluyen Tnf genes [88]. los Mknk2b El gen codifica una proteína quinasa que dirige las respuestas celulares y es proinflamatoria [89]. los Crhr1 gen modula las respuestas antiinflamatorias [90].

Figura 5. Abundancia de transcripciones de genes de inflamación por tiempo post mórtem (h): (a) pez cebra y (B) ratón. Inflamación, pro, + anti, -. Verde, valor intermedio rojo, valor máximo. los Il1b y Mknk2b los genes estaban representados por dos sondas diferentes.

La mayor abundancia de proinflamatorios Egr1 transcripción a las 0,1 h fue seguida por un aumento de antiinflamatorio Egr2 transcripción a las 0,2 h, lo que sugiere que el aumento de una transcripción estaba afectando a otra (figura 5). Del mismo modo, la mayor abundancia de proinflamatorios Il1b La transcripción a las 4 h post mórtem fue seguida por: aumento de la abundancia de proinflamatorios Tnfrsf19, Tnf, Gpr31 y Il8 transcripciones y el antiinflamatorio Hmox1 transcripción a las 9 h, el aumento de la abundancia de proinflamatorios Tnfa, Nfkbiaa y Mknk2b transcripciones a las 12 h, y el aumento de la abundancia de antiinflamatorios Crhr1 transcripciones a las 24 h. Es de destacar que, aunque ninguna de las transcripciones de genes proinflamatorios aumentó en abundancia después de las 24 h, el antiinflamatorio Crhr1 el gen se mantuvo en alta abundancia a las 48 h. También debe tenerse en cuenta que el Il1b, Il8 y Tnfa Se ha informado que las transcripciones de genes aumentan en las lesiones por impacto traumático en tejidos post mortem de cerebros humanos [91].

En el ratón, las transcripciones de genes de inflamación que aumentaron en abundancia incluyeron: proteína quinasa activada por mitógenos (Mapa3k2), Receptores de TNF (Tnfrsf9, Tnfrs14), Proteína 6 del linfoma de células B (Bcl6), Receptor de quimiocinas C-C tipo 4 (Ccr4), Procinticina-2 (Prok2) y receptor del factor activador de plaquetas (Pafr) (Figura 5). los Mapa3k2 gen codifica una quinasa que activa genes proinflamatorios NF-κB [89]. los Tnfrsf9 y Tnfrs14 los genes codifican proteínas receptoras que tienen funciones proinflamatorias [83]. los Bcl6 gen codifica un factor de transcripción que tiene funciones antiinflamatorias [92]. los Ccr4 El gen codifica una proteína receptora de citocinas asociada con la inflamación [74]. los Gen Prok2 codifica una molécula similar a una citocina, mientras que el Pafr El gen codifica un mediador lipídico y ambos tienen funciones proinflamatorias [93,94].

La mayoría de las transcripciones de genes asociados a la inflamación aumentaron en abundancia en 1 h post mórtem y continuaron siendo abundantes durante 12 a 48 h. El antiinflamatorio Bcl6 Las transcripciones de genes aumentaron en abundancia en dos momentos diferentes, 0,5 a 6 hy 24 h, lo que sugiere que su abundancia podría estar regulada por un ciclo de retroalimentación. También debe tenerse en cuenta que proinflamatorio Mapa3k2 y Tnfrs14 Las transcripciones de genes no estaban en alta abundancia después de 24 y 12 h, respectivamente, lo que también sugiere la regulación por un bucle de retroalimentación putativo del Bcl6 producto de la transcripción.

3.4.1. Resumen de la respuesta inflamatoria

En ambos organismos, algunas transcripciones que aumentaron en abundancia tienen funciones proinflamatorias mientras que otras tienen funciones antiinflamatorias. Es posible que los aumentos en la abundancia de transcripciones estén regulados por bucles de retroalimentación que implican una reacción inflamatoria inicial seguida de una reacción antiinflamatoria para reprimirla [95]. La variación en la abundancia de transcripciones de genes de estos genes inflamatorios sugiere que la red reguladora subyacente todavía está activa en la muerte del organismo.

3.5. Apoptosis y genes relacionados

Dado que los procesos apoptóticos matan las células dañadas en beneficio del organismo en su conjunto, anticipamos un aumento significativo en la abundancia de transcripciones de genes de apoptosis en la muerte del organismo.

En el pez cebra, las transcripciones del gen de la apoptosis que aumentaron en abundancia incluyeron: Jun (Jdp2, junio), Ceramidasa alcalina 3 (Acer3), Fos (Fosb, Fosab, Fosl1), Proteína A mitocondrial de unión a IAP (Diabloa), Peroxiredoxina-2 (Prdx2), Miembro 1 del canal dependiente de voltaje de potasio (Kcnb1), Cisteína peptidasa 3b relacionada con la apoptosis de caspasa (Casp3b), Transcripción 3 inducible por daños en el ADN (Ddit3), BCL2 (linfomas de células B 2) - asesino que interactúa (Bik) y la familia de dominios de asociación Ras 6 (Rassf6) (figura 6). los Jdp2 gen codifica una proteína que reprime la actividad de la proteína activadora del factor de transcripción 1 (AP-1) [96]. los Acer3 El gen codifica una enzima que mantiene la integridad / función de la membrana celular y promueve la apoptosis [97]. los Fos genes codifican proteínas que se dimerizan con jun proteínas para formar parte de la AP-1 que promueve la apoptosis [98,99]. los Diabloa El gen codifica una proteína que neutraliza los inhibidores de la apoptosis (IAP) -proteína de unión [99] y activa las caspasas [100]. los Prdx2 El gen codifica enzimas antioxidantes que controlan los niveles de peróxido inducidos por citocinas e inhiben la apoptosis [101]. Aunque el Kcnb1 El gen codifica una proteína utilizada para producir canales iónicos, la acumulación de estas proteínas en la membrana promueve la apoptosis a través de una vía de señalización celular [102]. los Casp3b codifica una proteína que desempeña un papel en la fase de ejecución de la apoptosis [103]. los Ddit3 gen codifica un factor de transcripción que promueve la apoptosis. los Bik gen codifica una proteína que promueve la apoptosis [104]. los Rassf6 gen codifica una proteína que promueve la apoptosis [105].

Figura 6. Abundancia de transcripciones de genes de apoptosis por tiempo post mórtem (h): (a) pez cebra y (B) ratón. Apoptosis, pro, + anti, -. Verde, valor intermedio rojo, valor máximo. los Fosb El gen estaba representado por dos sondas diferentes.

En el pez cebra, las transcripciones de ambos anti-apoptosis Jdp2 y pro-apopotosis Acer3 los genes aumentaron en abundancia dentro de las 0.1 h post mórtem (figura 6). Estos aumentos fueron seguidos por aumentos de cinco transcripciones de genes pro-apoptosis y una transcripción de genes anti-apoptosis dentro de 0.3 a 0.5 h. La dinámica transcripcional varió entre los genes. Específicamente, (i) la mayor abundancia de Fosb transcripción del gen se detuvo después de 1 h, (ii) las transcripciones de la Diabloa y Fosab genes alcanzaron el máximo de abundancia a las 0.5-4 h y luego su abundancia disminuyó después de 9 h para el Diabloa y después de 24 h para el Fosab genes, (iii) el jun las transcripciones de genes alcanzaron dos máximos (uno a 0.5 y otro a las 4-12 h), luego su abundancia disminuyó después de 24 h, y (iv) la transcripción de la Prdx2 El gen mostró un aumento continuo en abundancia hasta alcanzar un máximo a las 24 hy luego la abundancia disminuyó. Los genes restantes eran proapoptosis y sus transcripciones aumentaron en abundancia después de 1 a 24 h post mortem. Las transcripciones del Ddit3 y Rassf6 los genes eran muy diferentes de las otras transcripciones porque aumentaron en abundancia en un momento de muestreo (12 hy 24 h, respectivamente) y luego disminuyeron. Aparentemente, ninguna de las transcripciones de genes de apoptosis aumentó en abundancia después de 24 h, a diferencia de los genes de otras categorías (p. Ej.las transcripciones de algunos genes de estrés e inmunidad aumentaron en abundancia hasta 96 h post mórtem).

En el ratón, las transcripciones del gen de la apoptosis que aumentaron en abundancia incluyeron: proteína similar a BCL2 11 (Bcl2L11), Caseína quinasa IIa (Csnk2a1), Subunidad a del receptor de interleucina 15 (Il15ra), Factor potenciador de miocitos 2 (Mef2a), solo proteína 10 de caja F (Fbxo10), Proteína del cuerpo nuclear Sp110 (Sp110), Homeobox 1 del factor inducido por TGFB (Tgif1), Intersectina 1 (Itsm1), el receptor 3 de efrina tipo B (Efb3) y la quinasa 4 activada por proteína p21 (Pak4) (figura 6). los Bcl2L11 gen codifica una proteína que promueve la apoptosis [106]. los Csnk2a1 El gen codifica una enzima que fosforila sustratos y promueve la apoptosis [107]. los Il15ra gen codifica una proteína anti-apoptótica [108]. los Mef2a gen codifica un factor de transcripción que previene la apoptosis [109]. los Fbxo10 gen codifica una proteína que promueve la apoptosis [110]. los Sp110 gen codifica una proteína reguladora que promueve la apoptosis [111]. los Tgif1 gen codifica un factor de transcripción que bloquea las señales del factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) vía, y por lo tanto es proapoptosis [112]. los Itsn1 gen codifica una proteína adaptadora que es anti-apoptosis [113]. los Efb3 El gen codifica una proteína que se une a ligandos en las células adyacentes para la señalización celular y suprime la apoptosis [108]. los Pak4 gen codifica una proteína que retrasa el inicio de la apoptosis [114].

Sin embargo, en el ratón, las transcripciones de los genes pro y anti-apoptosis aumentaron en abundancia dentro de las 0.5 h post mórtem, con la excepción de Bcl2L11, la mayoría alcanzó el máximo de abundancia de transcripciones a las 12–48 h post mortem (figura 6). los Bcl2L11 las transcripciones alcanzaron máximos de abundancia a las 1 y 6 h post mórtem.

3.5.1. Resumen de la respuesta apoptótica

En ambos organismos, las transcripciones de genes pro y anti-apoptosis aumentaron en abundancia en la muerte del organismo. Sin embargo, los tiempos de los aumentos, la abundancia máxima de la transcripción y la duración del aumento de abundancias variaron según el organismo. Los resultados sugieren que los genes apoptóticos y su regulación son claramente diferentes en el pez cebra que en el ratón, con transcripciones de los genes del ratón que tienen una mayor abundancia a 48 h post mortem mientras que las del pez cebra tienen una mayor abundancia a 24 h. No obstante, los genes pro y anti-apoptosis parecen estar interregulándose entre sí.

3.6. Respuesta del gen de transporte

Los procesos de transporte mantienen la homeostasis de iones / solutos / proteínas y están involucrados en la entrada / salida de carbohidratos, proteínas, moléculas de señalización y ácidos nucleicos a través de las membranas. Las transcripciones de genes de transporte deberían aumentar en abundancia en la muerte del organismo en respuesta a la disbiosis.

En el pez cebra, las transcripciones de genes asociados al transporte que aumentaron en abundancia incluyeron: Miembro 4 del intercambiador de aniones de la familia 26 del transportador de solutos (Slc26a4), Subfamilia H de canal de potasio dependiente de voltaje (Kcnh2), Proteína 10 que contiene el dominio emp24 transmembrana (Tmed10), 59 que contienen repeticiones ricas en leucina (Lrrc59), la nucleoproteína TPR (Tpr), Subunidad beta-1 de Importin (Kpnb1), Transportin 1 (Tnpo1), Sintaxina 10 (Stx10) y transportador de urea 2 (Slc14a2) (figura 7). Es de destacar que los cuatro Tmed10 cada una de las transcripciones que se muestran en la figura 7 representa un perfil dirigido por una sonda independiente. Los perfiles de transcripción de este gen eran idénticos, lo que indica una alta reproducibilidad del enfoque del Gene Meter. los Slc26a4 gen codifica prendrina que transporta iones cargados negativamente (es decir, Cl -, bicarbonato) a través de las membranas celulares [115]. los Kcnh2 El gen codifica una proteína que se utiliza para producir canales de potasio y participa en la señalización [116]. los Tmed10 gen codifica una proteína de membrana involucrada en el tráfico de proteínas vesiculares [117]. los Lrrc59, Tpr, Tnpo1 y Kpnb1 los genes codifican proteínas implicadas en el tráfico a través de los poros nucleares [118-121]. los Stx10 El gen codifica una proteína que facilita la fusión de vesículas y el tráfico intracelular de proteínas a otros componentes celulares [122]. los Slc14a2 El gen codifica una proteína que transporta la urea fuera de la célula [123].

Figura 7. Abundancia de transcripciones de genes de transporte por tiempo post mórtem (h): (a) pez cebra y (B) ratón. Verde, valor intermedio rojo, valor máximo. los Tmed10 El gen estaba representado por cuatro sondas diferentes.

Las transcripciones de Slc26a4, Kcnh2, Lrrc59 y Tpr los genes inicialmente aumentaron en abundancia dentro de las 0.3 h post mórtem y permanecieron en alta abundancia durante 12-24 h. Las transcripciones del Tnpo1 gen aumentó en abundancia dos veces, a las 4 y 12 h, lo que sugiere una supuesta regulación por un bucle de retroalimentación. Las transcripciones de los genes restantes aumentaron en abundancia a las 24 h. La mayor abundancia de Slc14a2 La transcripción genética sugiere una acumulación de urea en las células del pez cebra a las 24-96 h post mórtem, lo que podría deberse a la acumulación de urea en condiciones hipóxicas por parte del Arg2 gen (ver Hsp sección de respuesta al estrés).

En el ratón, las transcripciones de genes asociados al transporte que aumentaron en abundancia incluyeron: Proteína transportadora mitocondrial de unión al calcio (Aralar2), Transportador de aminoácidos neutros acoplado a sodio 4 (Slc38a4), El dominio SFT2 contiene 1 (Sft2d1), Factor de interacción Uap56 (Fyttd1), Miembro 10 de la familia de portadores de solutos 5 (cotransportador de sodio / glucosa) (Slc5a10), Subunidad del receptor de importación mitocondrial (Tom5), Región promotora translocada (Tpr), Transportador de casete de unión a ATP 12 (Abca12), Proteína 5 resistente a múltiples fármacos (Abc5), Proteína que contiene el dominio LIM y SH3 (Lasp1), Marco de lectura abierto 62 del cromosoma 16 (C16orf62), Golgi transport 1 homólogo A (Golt1a), Transportador de casete de unión a ATP 17 (Abca17), Factor de intercambio de nucleótidos (Sil1), Translocasa de la membrana mitocondrial interna 8A1 (Timm8a1), Antígeno 1 del endosoma temprano (Eea1) y miembro de la subfamilia V de canal dependiente de voltaje de potasio 2 (Kcnv2) (figura 7). los Aralar2 El gen codifica una proteína que cataliza el intercambio dependiente del calcio de glutamato citoplasmático con aspartato mitocondrial a través de la membrana mitocondrial y puede funcionar en el ciclo de la urea [124]. los Slc38a4 El gen codifica un simportador que media el transporte de aminoácidos neutros e iones de sodio [125]. los Sft2d1 El gen codifica una proteína implicada en el transporte de vesículas desde el compartimento endocítico del complejo de Golgi [126]. los Fyttd1 El gen es responsable de la exportación de ARNm desde el núcleo al citoplasma [127]. los Slc5a10 El gen codifica una proteína que cataliza el transporte de carbohidratos a través de las membranas celulares [128]. los Tom5 El gen codifica una proteína que desempeña un papel en la importación de proteínas destinadas a subcompartimentos mitocondriales [129]. los Abca12, Abca17 y Abc5 los genes codifican proteínas que transportan moléculas a través de las membranas [130-132]. los Lasp1 gen codifica una proteína que regula el transporte de iones [133]. los C16orf62 El gen codifica una proteína involucrada en el transporte de proteínas desde el aparato de Golgi hasta el citoplasma [134]. los Golt1a gen codifica una proteína de transporte de vesículas [126]. los Sil1 El gen codifica una proteína implicada en la translocación de proteínas al retículo endoplásmico [135]. los Timm8a1 gen codifica una proteína que ayuda a la importación de otras proteínas a través de las membranas mitocondriales internas [136]. los Eea1 El gen codifica una proteína que actúa como molécula de unión para el transporte vesicular desde la membrana plasmática hasta los primeros endosomas [137]. los Kcnv2 gen codifica una proteína de membrana involucrada en la generación de potenciales de acción [138].

Dentro de 0.5 h post mórtem, las transcripciones de genes involucrados en: (i) la regulación de iones y urea (Aralar), (ii) aminoácido (Slc38a4), carbohidratos (Slc5a10) y proteína (Sft2d1, Tom5) transporte, (iii) exportación nuclear de ARNm (Fyttd1, Tpr) y (iv) eflujo molecular (Abca12, Abc5) aumentado en abundancia en el ratón. Los perfiles de transcripción de estos genes variaron en términos de máxima abundancia de transcripción y duración. Mientras que las transcripciones de Aralar, Sft2d1, Slc38a4, Fyttd1 y Slc5a10 alcanzaron máximos de abundancia a 1 h, los de Tom5, Tpr, Abca12 y Abc5 alcanzó el máximo a las 12-24 h post mórtem. La duración del aumento de abundancia también varió para estas transcripciones ya que la mayoría permaneció en abundancia alta durante 48 h post mórtem, mientras que la Sft2d1, Fyttd1 y Slc5a10 las transcripciones se encontraban en abundancia elevada de 0,5 a 12+ h. La menor duración del aumento de la abundancia sugiere una rápida represión genética. La abundancia de transcripciones de Lasp1, C16orf62, Golt1a y Abca17 aumentó a 1 h post mórtem y permaneció elevado durante 48 h. Las transcripciones de Sil1, Timm8a1 y Eea1 aumentaron en abundancia a las 6 h, mientras que los de Kcnv2 aumentó a las 24 h post mórtem y permaneció elevado durante 48 h.

3.6.1. Resumen de genes de transporte

La mayor abundancia de transcripciones de genes de transporte sugiere intentos por parte del pez cebra y los ratones de restablecer la homeostasis. Aunque las transcripciones de la mitad de estos genes aumentaron en abundancia dentro de las 0,5 h post mórtem, muchas aumentaron en diferentes momentos y durante diferentes duraciones. Si bien la mayoría de las transcripciones de los genes de transporte en el pez cebra no fueron abundantes después de 24 h, la mayoría de las transcripciones de los genes de transporte en el ratón permanecieron abundantes durante 24 a 48 h post mortem.

3.7. Genes de control del desarrollo

Un hallazgo inesperado en este estudio fue el aumento de la abundancia de transcripciones de genes de control del desarrollo en la muerte del organismo. Los genes de control del desarrollo están involucrados principalmente en la regulación de los procesos de desarrollo desde el embrión temprano hasta el adulto en el pez cebra y el ratón, por lo tanto, no anticipamos que sus transcripciones se vuelvan más abundantes en la muerte del organismo.

En el pez cebra, las transcripciones de genes asociados al desarrollo que aumentaron en abundancia incluyeron: proteína 2 que contiene el dominio LIM (Limd2), Activador de la morfogénesis 1 asociado al despeinado (Daam1b), Meltrina alfa (Adam12), Eclosión de la enzima 1a (He1a), MidnolinMidn), Respuesta temprana inmediata 2 (Ier2), Claudin b (Cldnb), Regulador de la señalización de proteínas G 4-like (Rgs4), Proteína transmembrana rica en prolina 4 (Prrt4), Inhibina (Inhbaa), Precursor del factor inhibidor 1 de Wnt (Wif1), Receptor del factor de crecimiento opioide (Ogfr), Homólogo de muesca de fresa 2 (Sbno2) y Homeobox 2 del cerebro en desarrollo (Dbx2) (figura 8). los Limd2 gen codifica una proteína de unión que desempeña un papel en la embriogénesis del pez cebra [139]. los Daam1b gen regula la endocitosis durante el desarrollo de la notocorda [140]. los Adam12 gen codifica una metaloproteasa-desintegrina involucrada en la miogénesis [141]. los He1a gen codifica una proteína implicada en la digestión de la envoltura del huevo [142]. los Midn El gen codifica una proteína nucleolar expresada en el cerebro que participa en la regulación de la neurogénesis [143,144]. los Ier2 gen codifica una proteína involucrada en el patrón de asimetría izquierda-derecha en el embrión de pez cebra [145]. los Cldnb gen codifica una proteína de unión estrecha en larvas de pez cebra [146]. los Rgs4 gen codifica una proteína implicada en el desarrollo del cerebro [147]. los Prrt4 El gen codifica una proteína que se expresa predominantemente en el cerebro y la médula espinal en las etapas de desarrollo embrionario y posnatal. los Inhbaa El gen codifica una proteína que desempeña un papel en la maduración de los ovocitos [148]. los Wif1 gen codifica un factor inhibidor de WNT que controla el desarrollo embrionario [149]. los Ogfr El gen juega un papel en el desarrollo embrionario [150]. los Sbno2 gen juega un papel en la embriogénesis del pez cebra [151]. los Dbx2 gen codifica un factor de transcripción que juega un papel en el desarrollo de la médula espinal [152].

Figura 8. Abundancia de transcripciones de genes de desarrollo por tiempo post mortem (h): (a) pez cebra y (B) ratón. Verde, valor intermedio rojo, valor máximo. los Cldnb El gen estaba representado por dos sondas diferentes.

Aunque la abundancia de Limd2, Daam1, Adam12 y He1a las transcripciones aumentaron en el pez cebra en 0,1 h post mórtem, otras transcripciones de genes en esta categoría aumentaron de 0,3 a 24 h post mórtem, alcanzando un máximo de abundancia a las 24 h o más.

En el ratón, las transcripciones de genes asociados al desarrollo que aumentaron en abundancia incluyeron: proteína del locus del complejo MDS1 y EVI1 EVI1 (Mecom), Anclaje 2 de glicosilfosfatidilinositol que contiene dominio MAM (Mdga2), FYVE, RhoGEF y PH que contienen dominios 5 (Fgd5), Proteína de motivo de unión a ARN 19 (Rbm19), Promotor aguas arriba de ovoalbúmina de pollo (Golpe), Homólogo 2 decidido (Sim2), Familia de portadores de solutos 38, miembro 4 (Slc38a4), Proteína 6 del linfoma de células B (Bcl6), Dominio sema dominio transmembrana (TM) dominio citoplásmico (semaforina) 6D (Sema6d), Proteína de motivo de unión al ARN 45 (Rbm45), Factor de transcripción E2F4 (E2f4), Ácido graso de cadena larga-CoA ligasa 4 (Lacs4), Peptidasa b3 relacionada con calicreína 1 (Klk1b3), Dominio sema, dominio de inmunoglobulina, TM y dominio citoplásmico corto (Sema4c), Homeobox 1 del factor inducido por TGFB (Tgif1), Similar a proteína de unión al factor 2 regulador de interferón (Irf2bpl), Receptor de efrina tipo B 3 (Efb3), Proteína 3 similar a la codificada en Y específica de testículo (Tspyl3), Ripply de proteínas 3 (Ripply3), Fosfoproteína 2 asociada a la cinasa src (Skap2), Subunidad catalítica de ADN polimerasa zeta (Rev3l), MKL / similar a la miocardina 2 (Mkl2) y la subunidad reguladora A de la proteína fosfatasa 2 (Ppp2r1a) (figura 8). los Mecom El gen juega un papel en la embriogénesis y el desarrollo [153]. los Mdga2 El gen codifica inmunoglobinas implicadas en el desarrollo neural [154]. los Fgd5 El gen es necesario para el desarrollo embrionario, ya que interactúa con las células madre hematopoyéticas [155]. los Rbm19 El gen es esencial para el desarrollo previo al implante [156]. los Golpe El gen codifica un factor de transcripción que regula el desarrollo del ojo [157] y otros tejidos [158]. los Sim2 gen codifica un factor de transcripción que regula el destino celular durante el desarrollo de la línea media [159]. los Slc38a4 El gen codifica un regulador de la síntesis de proteínas durante el desarrollo del hígado y juega un papel crucial en el crecimiento y desarrollo fetal [160,161]. los Bcl6 gen codifica un factor de transcripción que controla la neurogénesis [162]. los Sema6d gen codifica una proteína implicada en el desarrollo de la retina [163]. los Rbm45 El gen codifica una proteína que tiene unión preferencial al poli (C) ARN y se expresa durante el desarrollo del cerebro [164]. los E2f4 El gen participa en la maduración de las células de los tejidos [165]. los Lacs4 El gen juega un papel en la creación de patrones en los embriones [166]. los Klk1b3 gen codifica una proteína que desempeña un papel en el desarrollo de los embriones [167]. los Sema4c El gen codifica una proteína que tiene diversas funciones en el desarrollo neuronal y la morfogénesis del corazón [168,169]. los Tgif1 El gen codifica un factor de transcripción que desempeña un papel en la diferenciación del trofoblasto [170]. los Irf2bpl gen codifica un regulador transcripcional que juega un papel en la reproducción neuroendocrina femenina [171]. los Efb3 El gen codifica una quinasa que desempeña un papel en el desarrollo neural [172]. los Tspyl3 El gen juega un papel en el desarrollo de los testículos [173]. los Ripply3 gen codifica un factor de transcripción implicado en el desarrollo del ectodermo [174]. los Skap2 El gen codifica una proteína implicada en la reorganización de la actina en el desarrollo del cristalino [175]. los Rev3l El gen codifica una polimerasa que puede replicarse más allá de ciertos tipos de lesiones del ADN y es necesaria para el desarrollo embrionario [176]. los Mkl2 El gen codifica un coactivador transcripcional que participa en la formación de tejido muscular durante el desarrollo embrionario [177]. los Ppp2r1a El gen juega un papel en el desarrollo epidérmico embrionario [178].

Las transcripciones de Mecom, Mdga2, Fgd5, Rbm19, Golpe de Estado, Sim2, Slc38a4, Bcl6, Sema6d, Rbm45, E2f4 y Lacs4 los genes en el ratón aumentaron significativamente en abundancia dentro de 0.5 h post mórtem pero las otras transcripciones aumentaron de 1 ha 48 h alcanzando un máximo de abundancia a las 12 ho más.

3.7.1. Resumen de genes de control del desarrollo

En la muerte de un organismo, hay un aumento progresivo en la abundancia de transcripciones de algunos genes de control del desarrollo, lo que sugiere que ya no están silenciados. Una posible razón de este aumento de la abundancia es que las condiciones fisiológicas post mortem se parecen a las de las etapas iniciales del desarrollo.

3.8. Genes del cáncer

Hay una serie de bases de datos dedicadas al cáncer y a los genes relacionados con el cáncer. Al hacer referencias cruzadas de los genes encontrados en este estudio, descubrimos una superposición significativa. Los genes encontrados en esta búsqueda se presentan a continuación.

En el pez cebra, las transcripciones de los siguientes genes del cáncer aumentaron significativamente en abundancia: Jdp2, Xantina deshidrogenasa (Xdh), Egr1, Adam12, Miosina-IIIa (Myo3a), Fosb, junio Integrina alfa 6b (Itga6), Ier2, Tpr, Proteína fosfatasa 2 de especificidad dual (Dusp2), Dominio 28 de desintegrina y metalopeptidasa (Adam28), Tnpo1, Como estimulador de disociación de nucleótidos de guanina ral (Rgl1), Molécula de adhesión celular 5 relacionada con el antígeno carcinoembrionario (Ceacam1), Fosl1, Il1b, Hif1a, Serina / treonina-proteína fosfatasa 2A reguladora (Ppp2r5d), Factor de licencia de replicación del ADN (Mcm5), Gadd45, Miosina-9 (Myh9), Casp3, Tnf, Il8, Factor de transcripción cíclico dependiente de AMP (Atf3), GTPasa pequeña (RhoA), Mknk2, Precursor del receptor 7 de efrina tipo A (Epha7), Factor de transcripción relacionado con ETS (Elf3), Nfkbia, Kpnb1, Wif1, Proteína liberadora de guanilo RAS 1 (Escofina), Proteína 6 que contiene el dominio de asociación Ras (Rassf6), Cyba, Transcripción inducible por daños en el ADN 3 (Ddit3), Serina / treonina-proteína quinasa (Sbk1) y receptor transmembrana de tirosina-proteína quinasa (Ror1) (figura 9).

Figura 9. Abundancia de transcripciones de genes del cáncer por tiempo post mórtem (h): (a) pez cebra y (B) ratón. Verde, valor intermedio rojo, valor máximo. El nombre del gen en negrita significa que se encontró en más de una base de datos de cáncer. los Rgl1 El gen estaba representado por dos sondas diferentes.

En el ratón, las transcripciones de los siguientes genes del cáncer aumentaron significativamente en abundancia: Proteína 1 similar al retinoblastoma (Rbl1), Factor de elongación ARN polimerasa II (Ana), Proteína similar a Bcl-2 11 (Bcl2l11), Proteína similar a la sal 1 (Sal1), Map3k2, Bcl6, Tnfrsf9, Proteína diana CK2 2 (Csnk2a1), Factor de transcripción E2f4 (E2f4), Zinc finger DHHC-type que contiene 14 (Zdhhc14), Tpr, Activador 1 de la proteína RAS p21 (Rasa1), Gadd45, ProhibitinPhb2), Serina / treonina-proteína fosfatasa PP1-gamma catalítica (Ppp1cc), Lasp1, Receptor quinasa 4 acoplado a proteína G (Grk4), Factor de transcripción del dominio LIM (Lmo4), Proteína fosfatasa 1E (Ppm1e), Homólogo de proteína germinada 1 (Spry1), Proteína de múltiples dominios PDZ (Mpdz), Receptor de kisspeptina (Kiss1), Precursor de tirosina-proteína fosfatasa delta de tipo receptor (Ptprd), Tipo proteína efectora pequeña 2 (Cdc42), Proteína 1A que contiene dominio interactivo rico en AT (Arid1a), Proteína citosólica de linfocitos 2 (Lcp2), Subunidad catalítica de la ADN polimerasa zeta (Rev3l), Tnfrsf14, Precursor de integrina beta-6 (Itgb6), Proteína de dominio triple funcional (Trío), ATPase clase VI tipo 11C (Atp11c) y serina / treonina-proteína fosfatasa 2A reguladora (Ppp2r1a) (figura 9).

3.8.1. Resumen de genes del cáncer

Los genes analizados en esta categoría se clasificaron como "genes del cáncer" en una base de datos de genes del cáncer [10] (figura 9). El momento, la duración y la abundancia máxima de transcripciones difirieron dentro de los organismos y entre ellos. Tenga en cuenta que algunas transcripciones de genes tenían dos máximos de abundancia. En el pez cebra, este fenómeno ocurrió durante Adam12, junio, Tpr, Dusp2, Tnpo1 y Hif1a genes y en el ratón, Bcl6, Tnfrs9, Lasp1, Cdc42 y Lcp2 genes, y es consistente con la noción de que las abundancias de transcripciones se regulan a través de ciclos de retroalimentación.

3.9. Genes reguladores epigenéticos

La regulación epigenética de la expresión génica implica la metilación del ADN y las modificaciones de histonas de la cromatina en estados activo y silenciado [179]. Estas modificaciones alteran la condensación de la cromatina y afectan la accesibilidad del ADN a la maquinaria transcripcional. Aunque la regulación epigenética juega un papel importante en el desarrollo, las modificaciones pueden surgir estocásticamente con la edad o en respuesta a estímulos ambientales [180]. Por lo tanto, anticipamos que los genes reguladores epigenéticos estarían involucrados en la muerte del organismo.

En el pez cebra, las transcripciones de los siguientes genes epigenéticos aumentaron significativamente en abundancia: proteína de dimerización Jun 2 (Jdp2), Proteína 3 de cromatina helicasa (Chd3), Proteína 1 que contiene repeticiones WD rica en glutamato (Grwd1), Histona H1 (Histh1l), Grupo de histonas 1, similar a H4 (Hist1h46l3) y el homólogo de Chromobox 7a (Cbx7a) (figura 10). los Jdp2 Se cree que el gen inhibe la acetilación de histonas y reprime la expresión de la c-jun gen [181]. los Chd3 El gen codifica un componente de un complejo de histona desacetilasa que participa en la remodelación de la cromatina [182]. los Grwd1 Se cree que el gen es una proteína de unión a histonas que regula la dinámica de la cromatina en el origen de la replicación [183]. los Histh1l gen codifica una proteína histona que se une al nucleosoma en los sitios de entrada y salida del ADN y el Hist1h46l3 gen codifica una proteína histona que es parte del núcleo del nucleosoma [184]. los Cbx7a El gen codifica una proteína reguladora epigenética que se une al ARN no codificante ya las histonas y reprime la expresión génica de un supresor de tumores [185].

Figura 10. Abundancia de transcripciones de genes epigenéticos por tiempo post mórtem (h): (a) pez cebra y (B) ratón. Verde, valor intermedio rojo, valor máximo. El nombre del gen en negrita significa que se encontró en más de una base de datos de cáncer. los Jdp2 El gen estaba representado por dos sondas diferentes.

Las transcripciones de ambos Jdp2 y Chd3 los genes aumentaron en abundancia dentro de las 0.3 h post mórtem y alcanzaron el máximo de abundancia a las 0.5 h. Tenga en cuenta que dos sondas diferentes apuntaron al Jdp2 transcripción. La transcripción del Grwd1 gen aumentó en abundancia a 1 hy 24 h post mórtem. La transcripción de los genes de las histonas aumentó en abundancia a las 4 h post mórtem, alcanzando un máximo de abundancia a las 24 h. La transcripción del Cbx7a gen aumentó en abundancia a las 12 h, alcanzando un máximo de abundancia a las 24 h. La abundancia de transcripciones de estos genes disminuyó después de 24 h.

En el ratón, las transcripciones de los siguientes genes epigenéticos aumentaron significativamente en abundancia: miembro de la familia de tubulina tirosina ligasa 10 (Ttll10), Grupo de histonas 1 H3f (Hist1h3f), Grupo de histonas 1 H4c (Hist1h4c), YEATS que contiene el dominio 2 (Yeats2), Histona acetiltransferasa (Kat7) y la proteína 2C de desmetilación de histonas que contiene el dominio JmjC probable (Jmjd1c) (figura 10). los Ttll10 El gen codifica una poliglicilasa involucrada en la modificación de la proteína 1 de ensamblaje del nucleosoma que afecta la actividad transcripcional, el reemplazo de histonas y la remodelación de la cromatina [186]. los Hist1h3f y Hist1h4c los genes codifican proteínas histonas que son el núcleo de los nucleosomas [187]. los Yeats2 El gen codifica una proteína que reconoce las acetilaciones de histonas para poder regular la expresión génica en la cromatina [188]. los Kat7 El gen codifica una acetiltransferasa que es un componente del complejo de origen de replicación de unión a histonas, que acetila la cromatina y, por lo tanto, regula la replicación del ADN y la expresión génica [189]. los Jmjd1c El gen codifica una enzima que desmetila específicamente Lys-9 de la histona H3 y está implicada en la reactivación de genes silenciados [190].

Las transcripciones del Ttll10, Yeats2 y los genes de las proteínas histonas aumentaron en abundancia 0,5 h post mórtem y alcanzaron máximos en diferentes momentos, con la Ttll10 la transcripción alcanza un máximo en 1 a 6 h, las transcripciones de histona alcanzan máximos a las 6 y 12 h post mórtem, y la Yeats2 la transcripción alcanza máximos a las 12-24 h post mórtem (figura 10). Las transcripciones del Kat7 y Jmjd1c los genes aumentaron en abundancia a las 24 h, alcanzando un máximo de abundancia a las 48 h post mórtem. Tenga en cuenta que las transcripciones de los genes de histonas ya no eran abundantes después de 24 h post mórtem.

3.9.1. Resumen de genes reguladores epigenéticos

El aumento de la abundancia de transcripciones de genes que codifican proteínas histonas, proteínas modificadoras de histona-cromatina y proteínas involucradas en la regulación de la replicación del ADN en el origen fue común en el pez cebra y el ratón. Estos hallazgos indican que los genes reguladores epigenéticos todavía están modificando la estructura de la cromatina en la muerte del organismo y, por lo tanto, cambian la accesibilidad de los factores de transcripción a las regiones promotoras o potenciadoras.

3.10. Porcentaje de transcripciones de genes con abundancia significativa por tiempo post mórtem

El porcentaje de transcripciones de genes se definió como el número de transcripciones de genes con abundancias mayores que el control sobre el número total de transcripciones con abundancia significativa en una categoría en un momento post mórtem específico. Una comparación del porcentaje de transcripciones de genes por tiempo post mortem de todas las categorías de genes reveló similitudes entre el pez cebra y el ratón. Específicamente, la mayoría de las transcripciones de genes aumentaron en abundancia entre 0,5 y 24 h post mortem, y después de 24 h la abundancia de transcripciones disminuyó drásticamente (figura 11, "Todos los genes"). Cabe señalar que se encontró el mismo patrón en las categorías de estrés, transporte y desarrollo para ambos organismos. Sin embargo, en el pez cebra, las categorías de inmunidad, inflamación, apoptosis y cáncer diferían de las del ratón. Específicamente, las transcripciones de genes en las categorías de inmunidad, inflamación y cáncer aumentaron en abundancia mucho más tarde (1-4 h) en el pez cebra que en el ratón, y la duración de las abundancias elevadas fue mucho más corta. Por ejemplo, mientras que el 90% de las transcripciones de genes en las categorías de inmunidad e inflamación aumentaron en abundancia en el ratón en 1 h post mórtem, menos del 30% de las transcripciones en las mismas categorías fueron abundantes en el pez cebra (figura 11), lo que indica una respuesta inicial más lenta. Cabe señalar que mientras que el número de transcripciones de genes de inmunidad alcanzó el máximo de abundancia a las 24 h post mórtem en ambos organismos, el número de genes de inflamación que alcanzaron el máximo de abundancia se produjo a las 1-4 h en el ratón y a las 24 h en el pez cebra. La importancia de estos resultados es que la respuesta a la inflamación se produce de forma rápida y sólida en el ratón, mientras que en el pez cebra tarda más en establecerse, lo que podría atribuirse a diferencias filogenéticas. Hubo diferencias significativas en la abundancia de transcripciones de genes de apoptosis entre el pez cebra y el ratón. En el ratón, el porcentaje de transcripciones de genes de apoptosis alcanzó el 100% a 1 h post mórtem y se mantuvo durante 48 h post mórtem, mientras que el porcentaje de genes de transcripción con mayor abundancia en el pez cebra nunca alcanzó el 70% y las abundancias disminuyeron abruptamente después de 12 h. .

Figura 11. Porcentaje de transcripciones con mayor abundancia por categoría y tiempo post mórtem. Se muestra el número total de genes por organismo y categoría. "Todos los genes" se refieren a las transcripciones de genes que contribuyeron significativamente a las parcelas de ordenación. El ratón es rojo y el pez cebra es negro.

3.11. ¿Regulación al alza o estabilidad diferencial del ARNm?

Dado que se usaron cantidades iguales de ARN para todos los puntos de tiempo (ver más abajo), aunque la degradación estaba en curso, es teóricamente posible que el aparente aumento en la abundancia de un subconjunto de transcripciones se deba en realidad a una mayor estabilidad de estas transcripciones en comparación con el antecedentes de transcripciones degradantes. Por lo tanto, surge la pregunta de si una mayor abundancia de transcripciones se debe a la regulación positiva después de la muerte del organismo o perfiles de descomposición complejos que conducen a enriquecimientos relativos. Para determinar si los aumentos significativos se debieron a dicho enriquecimiento, se calculó el perfil esperado de un ARNc no degradable estable hipotético para el pez cebra, el hígado de ratón y el cerebro de ratón. En teoría, la abundancia de un transcrito de ARNc estable y no degradante determinado por el enfoque del medidor de genes debería correlacionarse positivamente con la cantidad de ARNc total entregado a la micromatriz de ADN. A continuación se muestra una justificación y el enfoque utilizado para identificar ARNc estables no degradantes en el conjunto de transcripciones.

Como se describe en la sección Material y métodos, la cantidad de muestra tomada de un animal fue aproximadamente la misma y el volumen de homogeneización fue el mismo. El material complementario electrónico, las tablas S1 y S2 muestran la cantidad de ARN total extraído de un tejido (X, ng µl -1). Dado que se tomó una cantidad fija de ARN en el etiquetado, el volumen de la muestra homogeneizada fue proporcional a 1 /X, es decir, la cantidad efectiva de tejido tomada en el análisis de microarrays fue proporcional a 1 /X.

Supongamos que hay un subconjunto de ARN estables, mientras que todas las demás moléculas de ARN se degradan. Por lo tanto, la cantidad de transcripción del gen estable sería directamente proporcional a la cantidad de tejido que se tomó en el experimento, 1 /X. Para proporcionar un perfil de concentración-tiempo esperado para el ARNc estable asumido, se puede comparar (en la escala log2) el 1 /X valores para todos los puntos de tiempo. Para hacerlo relativo al control en vivo, el valor log2 del control se restará de cada punto de tiempo. El perfil obtenido será el perfil esperado (cambio de veces) de un ARNc estable no degradable.

Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, encontramos que el perfil esperado del ARNc de pez cebra estable tendría un aumento de ocho veces a las 96 h post mórtem (figura 12). Por el contrario, a las 48 h post mórtem, encontramos que el perfil esperado del cRNA estable en el hígado de ratón tendría una disminución de aproximadamente cuatro veces, mientras que el cRNA estable en el cerebro de ratón tendría una disminución de aproximadamente el doble, porque se tomó menos tejido en el análisis de microarrays (ya que aumentó el rendimiento total de ARN). Es importante señalar que estos perfiles de ARNm de ratón estables esperados (dos paneles inferiores de la figura 12) no habrían sido seleccionados por el procedimiento estadístico para identificar perfiles transcripcionales que aumentaron significativamente en abundancia en relación con los controles vivos.

Figura 12. Cambio de veces esperado de un ARNc supuestamente estable por tiempo post mórtem. El doble de cambio se determinó restando el log2 de la concentración invertida en µl ng -1 del cRNA extraído de los controles vivos de la concentración invertida de cRNA extraído en cada momento de muestreo.

En el pez cebra, las transcripciones potencialmente enriquecidas (debido a su estabilidad) se identificaron correlacionando sus abundancias con el doble cambio esperado del cRNA estable. En teoría, las transcripciones potencialmente enriquecidas deberían correlacionarse positivamente con el cambio de pliegue esperado de la transcripción supuestamente estable. Alternativamente, las transcripciones que no se enriquecen debido a los efectos de estabilidad deben correlacionarse negativamente o no correlacionarse en absoluto con el cambio de pliegue esperado. Las correlaciones de las transcripciones de 548 genes (es decir, las que aumentaron significativamente en abundancia con el tiempo post mórtem) variaron de muy negativas a muy positivas (figura 13). Tenga en cuenta que las transcripciones de genes de mayor frecuencia en el lado izquierdo del histograma indican que la mayoría de las transcripciones se correlacionaron negativamente con el cambio de pliegue esperado, mientras que la frecuencia más baja en el lado derecho del histograma indica que una pequeña porción de las transcripciones de genes se enriquecieron supuestamente que otras transcripciones . Una tabla estadística estándar, utilizando d.f. = norte - 2 con dirección, reveló que las correlaciones superiores a 0,685 eran estadísticamente significativas en α = 0.01 (tres barras en el lado derecho del histograma). Por lo tanto, se encontró que 45 de las 548 transcripciones de genes estaban significativamente correlacionadas con el cambio de veces esperado del ARNc estable.

Figura 13. Distribución de las correlaciones del cambio de pliegue esperado y la abundancia relativa de la transcripción de genes por tiempo post mórtem para el pez cebra. Solo consideramos las sondas dirigidas a transcripciones de genes que aumentaron significativamente con el tiempo post mórtem en relación con los controles vivos (norte = 548). Las correlaciones por encima de 0,685 fueron significativas en α = 0,01 e indican la posibilidad de enriquecimiento del cRNA estable.

Las 45 transcripciones de genes que supuestamente se enriquecieron se muestran en la tabla 1. La Figura 14 muestra los perfiles de transcripción de tres transcripciones de genes seleccionados en comparación con el perfil de cambio de pliegue esperado como se muestra en los tres paneles superiores. El perfil transcripcional de una transcripción genética correlacionada negativamente sirvió como control. Ninguna de las transcripciones de genes de las muestras de ratón se enriqueció porque la cantidad de ARNc en el extracto de tejido aumentó o permaneció aproximadamente igual con el tiempo post mórtem.

Figura 14. Comparación del cambio de pliegue esperado (gris) basado en el ARNc total extraído en relación con el control vivo frente a los perfiles de transcripción de genes específicos (negro) por tiempo post mórtem. (aC) Abundancias de transcripciones relativas que están altamente correlacionadas con el cambio de pliegue esperado y, por lo tanto, están supuestamente enriquecidas y / o estables. (D) Un perfil de transcripción que se correlaciona negativamente con el cambio de pliegue esperado y, por lo tanto, no está enriquecido ni es estable.

Tabla 1. Sondas de pez cebra correlacionadas positivamente y cambio de pliegue esperado en α = 0,01. -, gen no anotado. Los perfiles de las sondas en negrita se muestran en la figura 14.


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