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¿Cuáles son las condiciones óptimas para almacenar reservas bacterianas de glicerol congeladas?

¿Cuáles son las condiciones óptimas para almacenar reservas bacterianas de glicerol congeladas?


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El método común para almacenar bacterias a largo plazo es recolectar cultivos líquidos saturados, como LB, y mezclarlos con glicerol estéril para obtener una concentración final de glicerol del 10-30%. A continuación, la mezcla resultante se congela, normalmente a -80ºC o -20ºC. Se dice que las bacterias almacenadas de esta manera son viables durante años. Tengo curiosidad por saber qué afecta al éxito de una estrategia de almacenamiento de este tipo.

  • Obviamente, la temperatura debería estar por debajo del punto de congelación, pero ¿cómo se ve afectada la viabilidad exactamente? ¿Es más frío siempre mejor (suponiendo que el tubo pueda soportarlo)? ¿Hay rendimientos rápidamente decrecientes después de -80 ° C? ¿Existe una temperatura óptima? Espero algo así como un diagrama de viabilidad después de 1 año de almacenamiento frente a la temperatura, idealmente con varias especies.
  • ¿Cuál es la concentración óptima de glicerol?
  • ¿Cuánto cae la viabilidad por ciclo de congelación-descongelación?
  • ¿Importa qué tan rápido se congela después de agregar glicerol?
  • Si bien se considera desaconsejable dejar descongelar una muestra congelada, una vez descongelada, ¿importa cuánto tiempo? ¿Cuenta cada segundo o hay poca diferencia siempre que no sean varios múltiplos de la duración de la fase de retraso?

Sin embargo, me resultó muy difícil localizar información específica sobre las condiciones óptimas para dicho almacenamiento. Por ejemplo, Addgene afirma que se desconoce la concentración óptima de glicerol. Además, muchos de los artículos más antiguos sobre este tema tienen fondos de pago (incluso de mi institución). Pero el experimento para determinarlo sería tan trivial que no puedo creer que nadie lo haya hecho. Me interesan principalmente los datos de experimentos reales y me interesa el glicerol solo como criopreservante.


Protocolo para congelar bacterias con glicerol

El siguiente protocolo proporciona una alternativa al kit de congelación bacteriana de OPS Diagnostics. Este kit es un producto listo para usar que incluye 162 viales (con perlas y glicerol), dos gradillas criogénicas y etiquetas de inyección de tinta / láser resistentes a los disolventes.

Las bacterias se pueden congelar con una solución de glicerol al 15%. El proceso es simple y requiere tubos de microcentrífuga con tapón de rosca y glicerol estéril. El glicerol se diluye al 30% para que sea fácil de pipetear. Se mezclan cantidades iguales de glicerol al 30% y caldo de cultivo, se distribuyen en tubos y luego se congelan. Un kit está disponible (Bacterial Freezing Kit) a través de OPS Diagnostics que simplifica la preparación de tubos estériles para este proceso.

Prepare una solución de glicerol al 30% (v / v) mezclando 30 ml de glicerol con 70 ml de agua. Transfiera la solución a una botella de vidrio con tapón de rosca y esterilice en autoclave a 121 ° C durante 15 min. Afloje la tapa durante la esterilización en autoclave.

Alícuota de 500 microlitros de glicerol estéril al 30% en tubos de microcentrífuga estériles de 2 ml que contienen perlas de vidrio de 4 mm *.

Agregue 500 microlitros de cultivo bacteriano al tubo y mezcle con el glicerol usando un mezclador vórtex.

Etiquete el tubo con el nombre del organismo, la cepa, la fecha, etc.

Coloque el tubo en el congelador y registre su ubicación.

Para activar las bacterias, solo es necesario extraer un par de perlas del tubo. los el tubo no necesita descongelarse. Abra el tubo y afloje un par de perlas con una punta de pipeta estéril. Vierta las perlas sueltas en una placa de agar y enróllelas. Las colonias que se desarrollan se deben volver a sembrar. Vuelva a colocar el tubo en el congelador inmediatamente. Si el cultivo se descongela, no lo vuelva a congelar, ya que las células suelen ser muy sensibles a la congelación y descongelación. Deseche el cultivo descongelado de forma adecuada.

* Preferimos tubos con tapón de rosca y tapones con juntas tóricas. Una opción es llenar el tubo hasta 1/3 de su capacidad con perlas de vidrio de 4 mm (número de producto BAWG 4000-200-18) antes de esterilizarlo. Cuando recupere las bacterias, retire o saque una perla en una placa de agar y gírela para dispersar las bacterias. Esto evita descongelar todo el caldo.


Almacenamiento a largo plazo de cepas bacterianas

Los métodos de conservación a largo plazo permiten intervalos de meses o incluso años entre subcultivos. Los aislamientos pueden almacenarse indefinidamente si se mantienen congelados a -70 ° C o por debajo de estas temperaturas se pueden lograr en un “ultracongelador” (-70 ° C) o un congelador de nitrógeno líquido (-196 ° C).

La liofilización o el almacenamiento a -70 ° C o menos es el mejor método para la conservación a largo plazo del cultivo bacteriano y no se recomienda el almacenamiento general de los aislados a -20 ° C.

Liofilización

La mayoría de los organismos pueden almacenarse satisfactoriamente después de la liofilización (liofilización). La liofilización implica la eliminación del agua de las suspensiones bacterianas congeladas mediante sublimación a presión reducida. Los cultivos liofilizados se mantienen mejor a 4 ° C o menos. La sublimación ocurre cuando un líquido congelado pasa directamente a un estado gaseoso sin entrar en una fase líquida.

  1. precongelar el producto para formar una estructura congelada,
  2. secado primario para eliminar la mayor parte del agua,
  3. y secado secundario para eliminar el agua unida.

Se recomienda utilizar velocidades lentas de enfriamiento, ya que esto dará como resultado la formación de estructuras verticales de cristales de hielo, lo que permitirá una sublimación más eficiente del agua del producto congelado. Los productos liofilizados son higroscópicos y deben protegerse de la humedad durante el almacenamiento.


Materiales

  • Recipientes de cultivo que contienen células cultivadas en fase logarítmica de crecimiento
  • Medio de crecimiento completo
  • Agente crioprotector como DMSO (use una botella reservada para cultivo celular abierta solo en una campana de flujo laminar) o un medio de congelación como Synth-a-Freeze Cryopreservation Medium o Recovery Cell Culture Freezing Medium
  • Tubos cónicos desechables, estériles de 15 ml o 50 ml
  • Reactivos y equipo para determinar los recuentos de células viables y totales (p. Ej., Contador de células automatizado Invitrogen Countess II FL o hemocitómetro, contador de células y azul tripán)
  • Viales de almacenamiento criogénico estériles (es decir, crioviales)
  • Aparato de congelación de velocidad controlada o cámara de isopropanol
  • Recipiente de almacenamiento de nitrógeno líquido

Para congelar células adherentes, además de los materiales anteriores, necesitará:


INTRODUCCIÓN

Utilizando los postulados de Koch & # x02019s para la identificación de microbios patógenos, Ogston identificó el agente etiológico de los abscesos supurativos (Ogston, 1883). El nombre Staphylococcus aureus fue elegido para distinguir esta especie con su característico pigmento de colonia amarilla de otro comensal estafilocócico que forma colonias blancas (Staphylococcus albus, ahora designado Staphylococcus epidermidis) (Rosenbach, 1884 G & # x000f6tz et al., 2006). S. aureus muestra varias propiedades microbiológicas sorprendentes, por ejemplo, el microbio se une a las inmunoglobulinas y se aglutina o coagula la sangre y el plasma (Loeb, 1903 Much, 1908 Forsgren y Sj & # x000f6quist, 1966 Cheng et al., 2011). Estos rasgos han sido útiles para el diagnóstico temprano y rápido de S. aureus infecciones (para un relato histórico de la prueba de coagulasa, siga el enlace http://www.microbelibrary.org/index.php/library/laboratory-test/3220-coagulase-test-protocol).

Todos Estafilococos crecer en grupos, una característica que se puede visualizar por microscopía y representa el nombre griego & # x003c3 & # x003c4 & # x003b1 & # x003a6 & # x003c5 & # x003bbo & # x003bao & # x003ba & # x003bao& # x003c2 o baya parecida a una uva. El agrupamiento es causado por la separación incompleta de las células hijas después de la división en tres planos perpendiculares alternos (Tzagoloff y Novick, 1977 Giesbrecht et al., 1998). S. aureus las células parecen perfectamente esféricas con un diámetro de

1 & # x003bcm (Giesbrecht et al., 1998).S. aureus también produce catalasa cuando se aplica al material de la colonia, la prueba de catalasa es una prueba rápida y útil para distinguir los estafilococos de otras bacterias grampositivas como los estreptococos.

S. aureus es un anaerobio facultativo que crece por respiración aeróbica o por fermentación, que produce principalmente ácido láctico. La bacteria metaboliza la glucosa a través de la vía de la pentosa fosfato (Reizer et al., 1998). No hay evidencia de la existencia de la vía Entner-Doudoroff; sin embargo, las enzimas del ciclo completo del ácido tricarboxílico y una F0F1-ATPasa típica están codificadas por el genoma de S. aureus (Kuroda et al., 2001). Tras el agotamiento de la glucosa, S. aureus las células que crecen en condiciones aeróbicas oxidan D-galactosa, acetato, succinato y malato. Recientemente se publicó un excelente resumen de estas vías metabólicas (G & # x000f6tz et al., 2006).

PRECAUCIÓN: S. aureus es un patógeno altamente virulento y adaptable con la capacidad de infectar, invadir, persistir y replicarse en cualquier tejido humano, incluida la piel, los huesos, los órganos viscerales o la vasculatura (Lowy, 1998). El organismo se ha colocado en el nivel de grupo de riesgo 2. Todas las manipulaciones con S. aureus Las cepas deben realizarse siguiendo las medidas de nivel 2 de bioseguridad, incluido el trabajo experimental en gabinetes de bioseguridad certificados. Las pautas para la práctica de BSL2 se pueden obtener en la última edición de Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos (BMBL, 5.a edición) a través del siguiente enlace web de los CDC: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/.


Protocolo

Nota: C. difficile es un patógeno humano y animal que puede causar enfermedades gastrointestinales. Experimentos que involucran C. difficile debe realizarse con las precauciones de bioseguridad adecuadas (BSL-2).

1. Uso y mantenimiento de la cámara anaeróbica

C. difficile es un anaerobio estricto y es extremadamente sensible incluso a concentraciones bajas de oxígeno en la atmósfera. Por lo tanto, se necesita un entorno anaeróbico controlado para su manipulación exitosa. El uso de una cámara anaeróbica (Figura 1A) proporciona el entorno más estable y las condiciones ideales para un cultivo eficaz de C. difficile y otras bacterias anaeróbicas 14. Aquí, una atmósfera que contiene una mezcla de gases (5% CO2, 10% H2, 85% N2) se puede mantener de forma estable.

Para introducir cualquier artículo en la cámara sin una contaminación significativa de oxígeno, se debe usar una esclusa de aire (Figura 1B). Este dispositivo funciona como intercambiador de gas y funciona de forma automática, semimanual o manual. La esclusa tiene dos puertas: una que da acceso al exterior de la esclusa y la otra que da acceso al interior de la cámara anaeróbica. Dependiendo del modelo, la esclusa de aire puede tener una puerta adicional, que puede ofrecer acceso a una cámara anaeróbica contigua, ahorrando así el costo de una esclusa de aire separada. A menos que mueva activamente artículos dentro o fuera de la cámara, ambas puertas deben permanecer cerradas en todo momento para evitar la contaminación por oxígeno. La esclusa de aire posee un interruptor de encendido / apagado en la parte frontal y un panel que contiene cuatro botones. Las líneas de gas y la manguera de la bomba de vacío están conectadas en la parte trasera de la esclusa de aire, cerca del panel donde se encuentran los interruptores para el funcionamiento manual completo de la unidad. Se recomienda realizar dos ciclos de purga, utilizando gas nitrógeno (N2), se utilizan antes de llenar el intercambio con mezcla de gases (5% CO2, 10% H2, 85% N2) para reducir la cantidad de oxígeno introducido en la cámara. También es importante no dejar nunca ninguna puerta abierta durante más tiempo del necesario para mover elementos dentro y fuera del intercambio y planificar cuidadosamente los experimentos para reducir la frecuencia de mover elementos dentro y fuera de la cámara. Los diferentes procedimientos operativos para las cámaras anaeróbicas de vinilo se describen a continuación. Antes de seguir estos protocolos, asegúrese de que sean compatibles con las instrucciones del fabricante proporcionadas con la cámara.

Modo automático Este es un modo programable y personalizable y lo realiza en su totalidad la esclusa de aire. Para programar la esclusa de aire, consulte las instrucciones del fabricante. Un programa recomendado para la entrada típica a la cámara implica dos ciclos de purga con gas nitrógeno seguidos de rellenar la esclusa de aire con una mezcla de gases que se asemeje mucho a la atmósfera mantenida dentro de la cámara. Durante cada ciclo de vacío, los procedimientos estándar de fábrica sugieren llevar el vacío a 20 inHg y purgar a 1 inHg.

Asegúrese de que la puerta interior de la esclusa de aire esté completamente cerrada.

Abra la puerta de la esclusa de aire exterior.

Coloque los artículos en la esclusa de aire y cierre la puerta de la esclusa de aire exterior. Si introduce líquidos, desenrosque las tapas hasta la mitad para garantizar un intercambio de gases eficiente. Los paquetes y recipientes sellados deben abrirse antes de comenzar el ciclo; abstenerse de hacerlo puede deformar y dañar los recipientes y recipientes de plástico. Para mantener la esterilidad, abra los paquetes lo suficiente para permitir solo un intercambio de gases eficiente.

Espere hasta que la esclusa de aire haya pasado por el programa y la pantalla muestre "Anaeróbico".

Mueva los artículos a la cámara.

Modo semimanual Este modo se puede usar cuando se mueven artículos dentro o fuera de la cámara y es necesario cuando se requiere ciclar el gas dentro de la cámara.

Asegúrese de que la puerta interior de la esclusa de aire esté completamente cerrada.

Abra la puerta de la esclusa de aire exterior.

Coloque los artículos en la esclusa de aire y cierre la puerta de la esclusa de aire exterior. Si introduce líquidos, desenrosque las tapas hasta la mitad para garantizar un intercambio de gases eficiente. Los paquetes sellados, como los bucles de inoculación y las placas de 96 pocillos, deben abrirse antes de comenzar el ciclo.

Presiona inicio. La esclusa mostrará la función de cada botón y no responderá hasta que se complete:

Flecha hacia arriba: activa la bomba de vacío.

Flecha hacia abajo: inicia el flujo de gas nitrógeno (purga).

Inicio: inicia el flujo de la mezcla de gases.

Menú: vuelve a la pantalla predeterminada.

Presione "Arriba", quitando el gas de la esclusa de aire, hasta que la pantalla muestre 20 inHg.

Presione "Abajo", llenando la esclusa de aire con nitrógeno, hasta que la pantalla muestre menos de 1 inHg. No sobrepase, ya que esto creará una presión positiva dentro de la esclusa de aire, lo que puede afectar su integridad.

Repita los pasos 6 y 7 para realizar un ciclo de purga adicional.

Presione "Arriba" hasta que la pantalla muestre 20 inHg.

Presione "Iniciar", llenando el intercambio con mezcla de gas, hasta que la pantalla muestre menos de 1 inHg.

Mueva los artículos a la cámara.

Modo manual Este modo puede usarse siempre que los modos automático o semimanual no estén funcionando o no haya energía en la esclusa de aire. Este modo no funciona cuando la esclusa está encendida, por lo tanto, es difícil determinar la presión dentro de la esclusa. Debido a que los tiempos de extracción de vacío y de purga de gas dependen de las tasas de flujo de vacío y gas, respectivamente, se requiere el uso de un manómetro dentro del intercambio para monitorear la presión y reducir el riesgo de lesiones personales y daños a la esclusa de aire.

Asegúrese de que la puerta interior de la esclusa de aire esté completamente cerrada.

Abra la puerta de la esclusa de aire exterior.

Coloque los elementos, incluido el manómetro, en la esclusa de aire y cierre la puerta de la esclusa de aire exterior. Si introduce líquidos, desenrosque las tapas hasta la mitad para garantizar un intercambio de gases eficiente. Los paquetes sellados, como los bucles de inoculación y las placas de 96 pocillos, deben abrirse antes de comenzar el ciclo.

Localice los tres interruptores en la parte posterior de la esclusa de aire etiquetados como "Interruptores de control manual". Estos están etiquetados individualmente como:

Mueva el interruptor de palanca al vacío hasta que el manómetro indique aproximadamente 20 inHg.

Mueva el interruptor de palanca de nitrógeno hasta que el manómetro indique aproximadamente 1 inHg.

Mueva el interruptor de palanca al vacío hasta que el manómetro indique aproximadamente 20 inHg.

Mueva el interruptor de palanca de nitrógeno hasta que el manómetro indique aproximadamente 1 inHg.

Mueva el interruptor de palanca al vacío hasta que el manómetro indique aproximadamente 20 inHg.

Mueva el interruptor de palanca de Mezcla de gas hasta que el manómetro indique aproximadamente 1 inHg.

Mueva los artículos a la cámara.

2. Cultivar, enumerar y almacenar C. difficile de muestras de heces

Este procedimiento está diseñado para recuperar C. difficile de muestras fecales que contienen esporas y posteriormente mantienen colonias aisladas como células vegetativas o esporas en almacenamiento a largo plazo como reservas de glicerol. Alternativamente, este procedimiento puede usarse para enumerar el número de C. difficile presente en muestras de hecesp.ej. de estudios en animales). Enriquecer selectiva y diferencialmente para C. difficile, el agar taurocolato-cefoxitina-cicloserina-fructosa (TCCFA) se utiliza para inhibir el crecimiento de la flora fecal normal 15-16. La cicloserina es bacteriostática para las bacterias Gram negativas, mientras que la cefoxitina inhibe más ampliamente el crecimiento de bacterias Gram negativas y positivas, con la excepción de C. difficile y la mayoría entran en cepas de cocos. Se puede incluir un indicador de pH, rojo neutro, en el medio, ya que la fermentación de la fructosa dará como resultado una disminución del pH y un cambio de color posterior de rojo / naranja a amarillo. Para recuperar eficientemente las esporas de C. difficile como bacteria vegetativa, la sal biliar taurocolato de sodio se usa para inducir la germinación 17-18. Porque C. difficile Se pueden utilizar esporas, alcohol o tratamiento térmico de las muestras para reducir o eliminar las células vegetativas, limitando el crecimiento de la flora contaminante, lo que puede aumentar la eficiencia de C. difficile recuperación 19. Como se mencionó anteriormente, es fundamental reducir previamente todas las placas durante al menos 1-2 horas en la cámara anaeróbica antes de su uso para asegurar la eliminación del oxígeno residual. Secar al aire las placas antes de usarlas en la cámara puede reducir la condensación. El medio líquido puede necesitar hasta 24 horas para reducirse según el volumen y la relación superficie-aire del recipiente utilizado.

Antes de comenzar, los siguientes elementos deben colocarse en la cámara anaeróbica:

Asas de inoculación estériles

Placas TCCFA (ver Materiales)

Placas y caldo BHIS (medio de infusión de cerebro y corazón con extracto de levadura) (ver Materiales)

* Alternativamente, las colonias aisladas pueden esparcirse en placas de agar BHIS y, posteriormente, rasparse y resuspenderse en medio líquido BHIS con glicerol al 15% para almacenamiento a largo plazo a -80 ° C. ** Es importante tener en cuenta que la tinción de Gram no es una estrategia eficaz para identificar C. difficile directamente de muestras de heces 23 C. difficile primero debe aislarse de la otra flora presente en las heces.

Resuspenda la muestra de heces en 1x PBS (esto puede realizarse en condiciones aeróbicas) y asegúrese de que la muestra de heces se resuspende completamente en 1x PBS mediante agitación con vórtex. Si enumerando C. difficile de las heces, pese la muestra de heces antes de agregar 1x PBS.

Haga diluciones seriadas de la muestra de heces resuspendida en 1x PBS para el aislamiento apropiado o el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de heces.

Utilizando una técnica aséptica, aplique 100 & # x003bcl de cada dilución en serie a las placas de TCCFA.

Usando una serie de asas de inoculación estériles, raye el cultivo aplicado para colonias aisladas o esparza uniformemente el cultivo aplicado sobre la superficie de la placa TCCFA para enumerar las colonias.

Incube la placa anaeróbicamente durante 48 horas a 37 & # x000b0C. Es posible detectar e identificar C. difficile colonias dentro de las 24 horas basadas en el aspecto plano, irregular, de vidrio esmerilado de las colonias 15, aunque se logra una identificación y enumeración más precisas después de 48 horas.

Usando asas de inoculación estériles, subcultivar las colonias que parezcan estar C. difficile en placas de agar BHIS prerreducidas, suplementadas con L-cisteína al 0,03% 20. Elija una colonia individual y extienda sobre la placa en cuadrantes, utilizando un nuevo asa de inoculación estéril para cada cuadrante, para obtener colonias aisladas. Alternativamente, cuente el C. difficile colonias de cada dilución (esto puede realizarse en condiciones aeróbicas) y calcular el número de unidades formadoras de colonias por gramo de muestra de heces.

Confirmar C. difficile identificación mediante tinción de Gram. Después de la tinción de Gram, C. difficile aparecerá como varillas de color púrpura y algunas células pueden contener endosporas terminales. La identificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los genes que codifican la toxina B puede proporcionar una confirmación adicional de las cepas toxigénicas de C. difficile 21 mientras que la tipificación de secuencia multilocus (MLST) es exitosa para la identificación y tipificación precisa de cepas desconocidas y no toxigénicas de C. difficile 22 .

Para mantener un stock de C. difficile a -80 & # x000b0C, elija una colonia individual aislada de la placa de agar BHIS utilizando un asa de inoculación estéril y resuspenda la colonia en 10 ml de medio líquido BHIS prerreducido suplementado con L-cisteína al 0,03%. *

Incubar durante la noche en condiciones anaeróbicas a 37 ° C o hasta que el cultivo se vuelva turbio.

Agregue 333 & # x003bcl de 50% de glicerol y 666 & # x003bcl del C. difficile cultivo en un tubo criogénico de 1,8 ml para crear una reserva de glicerol al 15% de la cepa aislada.

Tape bien el tubo criogénico, mezcle bien y retire inmediatamente el caldo de la cámara anaeróbica y colóquelo en un congelador a -80 & # x000b0C para almacenamiento a largo plazo.

3. Cultivo C. difficile de existencias de glicerol congeladas

Este procedimiento prevé la recuperación de C. difficile a partir de reservas de glicerol almacenadas a -80ºC. Debido a que los ciclos repetidos de congelación-descongelación pueden matar las células vegetativas, es importante mantener las reservas de glicerol congeladas en todo momento. No recomendamos el uso de hielo seco para transferir cepas dentro y fuera de la cámara, ya que la evaporación del hielo seco puede cambiar el ambiente dentro de la cámara. En su lugar, recomendamos usar rejillas de enfriamiento congeladas para mantener las reservas de glicerol congeladas durante el transporte. Para varios propósitos selectivos y diferenciales, se utilizan comúnmente tres medios para cultivar C. difficile. TCCFA, como se discutió anteriormente, es selectivo para C. difficile y contiene taurocolato de sodio, un germinante. La infusión de cerebro-corazón complementada con extracto de levadura (BHIS) es un medio no selectivo, enriquecido y de uso común que permite el crecimiento de una amplia variedad de organismos (Figura 2A) 24. Con frecuencia, se agrega L-cisteína a BHIS como agente reductor 20. Finalmente, la adición de sangre al medio (Figura 2B) permite una esporulación más eficiente que en TCCFA y proporciona la detección de la fluorescencia verdosa o chartreuse única exhibida por C. difficile bajo luz ultravioleta (UV) de onda larga 15 (Figura 2C). Al cultivar C. difficile a partir de existencias de esporas, es fundamental recordar que se debe agregar taurocolato de sodio al medio para asegurar la germinación.

Antes de comenzar, los siguientes elementos deben colocarse en la cámara anaeróbica:

Caldo de glicerol congelado (en rejilla de enfriamiento)

Asas de inoculación estériles

Placas TCCFA o BHIS (ver Materiales)

Coloque el caldo de glicerol congelado de C. difficile en una rejilla de enfriamiento que se ha almacenado a -80 & # x000b0C antes de su uso para evitar que se descongele.

Lleve el stock de glicerol congelado en hielo seco a la cámara anaeróbica.

Usando una técnica aséptica y un asa de inoculación estéril, coloque una pequeña cantidad de caldo en el plato y raye a lo largo de un cuadrante del plato.

Gire la placa 90 & # x000b0 y, utilizando un nuevo asa de inoculación estéril, continúe trazando líneas a lo largo del segundo cuadrante.

Repita para el tercer y cuarto cuadrantes para asegurar el aislamiento de colonias individuales.

Retire inmediatamente el stock de glicerol congelado de la cámara anaeróbica y vuelva a poner a -80 & # x000b0C.

Incube la placa anaeróbicamente durante la noche a 37 & # x000b0C. Las colonias aisladas individuales deben observarse después del crecimiento durante la noche.

4. Esporas purificadoras de C. difficile

Como la esporulación es necesaria para sobrevivir en ambientes ricos en oxígeno y para la transmisión eficiente de enfermedades 8, la preparación de existencias de esporas es a menudo necesaria para aplicaciones posteriores, no limitadas a estudios de microscopía y animales. Es importante señalar que la enumeración de esporas requiere la repetición para garantizar la reproducibilidad de los recuentos. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces entre diluciones también reduce la pérdida, ya que las esporas se adhieren bien al plástico.

Esporulación de C. difficile no es tan rápido u homogéneo como otras especies esporógenas. Para optimizar la producción y recuperación de esporas, se recomienda el medio de esporulación (SMC) 17,25 o el medio 70:30 26. Otros medios comúnmente utilizados son BHIS, que requiere 4-5 días de crecimiento antes de que se observe una esporulación eficiente 27, y Clospore, un medio líquido que produce altos títulos de esporas (10 7 - 10 8 esporas por mililitro) después de 72 h de crecimiento. Otros protocolos usan agua helada en lugar de 1x PBS 20; sin embargo, el uso de una solución isotónica puede reducir las esporas que se adhieren entre sí y a las superficies de plástico. Alternativamente, algunos investigadores purifican aún más sus esporas utilizando un gradiente de sacarosa para eliminar completamente las células vegetativas y los desechos 29.

Antes de comenzar, los siguientes elementos deben colocarse en la cámara anaeróbica:

Asas de inoculación estériles

Placas BHIS, SMC y / o 70:30 (ver Materiales)

1x PBS, esterilizado por filtro (ver Materiales)

Cultivar cepas de stock de glicerol congelado en placas BHIS prerreducidas e incubar anaeróbicamente durante la noche a 37 & # x000b0C.

Vuelva a romper en varias placas SMC prerreducidas o 70:30 e incube anaeróbicamente a 37 & # x000b0C durante 24-48 horas. La formación de esporas se puede seguir mediante microscopía de contraste de fase. Las esporas aparecerán en fase brillante mientras que las células madre y vegetativas aparecerán en fase oscura. * Como alternativa, las esporas se pueden purificar a partir de medio líquido 70:30 después de 24-48 horas, lo que produce 10 5 -10 6 esporas por mililitro, dependiendo de la cepa utilizada.

Usando un asa de inoculación estéril, raspe las placas y resuspenda las células en 10 ml de PBS 1x estéril.

Deseche las placas y retire la suspensión de esporas de la cámara anaeróbica. Pellet las células a 3000 x g durante 15 minutos. Lave las células dos veces en 1x PBS, resuspendiendo completamente el sedimento celular cada vez.

Incubar durante la noche a 4 & # x000b0C para ayudar en la lisis de las células madre y vegetativas.

Incubar a 70 & # x000b0C durante 20 min para matar las células vegetativas residuales.

Para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro, diluya en serie cada preparación de esporas en 1x PBS y coloque sobre BHIS + taurocolato de sodio al 0,1%. Incubar las placas durante un mínimo de 24 horas antes de enumerar las colonias.

Las esporas se pueden almacenar en 1x PBS a temperatura ambiente o 4 & # x000b0C para almacenamiento a largo plazo. Si se almacena a 4 & # x000b0C, puede ser útil recalentar la preparación de esporas a 55 & # x000b0C durante 15 minutos para restaurar la germinación eficiente.


¿Cuáles son las condiciones óptimas para almacenar reservas de glicerol congeladas de bacterias? - biología

Una discusión exhaustiva sobre el almacenamiento de anticuerpos y la vida útil de los anticuerpos.

La "vida útil" de almacenamiento del anticuerpo puede variar desde varias semanas hasta muchos años, dependiendo tanto de las propiedades intrínsecas del anticuerpo como de las condiciones de almacenamiento. Se ha demostrado que varios anticuerpos de diagnóstico mantienen sus funcionalidades después de 12-26 años de almacenamiento a 4 ° C [2]. Sin embargo, las condiciones óptimas de almacenamiento son únicas para cada anticuerpo. Por ejemplo, Laskowski TJ et al encontraron que sus mezclas de anticuerpos de panel de citometría de flujo de 17 colores permanecieron estables hasta 15 días a 4 ° C mientras que los cócteles de anticuerpos CyTOF tenían un tiempo máximo de almacenamiento de 3 días a 4 ° C [3]. Sin embargo, se pueden aplicar algunas pautas generales para aumentar la vida útil de sus anticuerpos almacenados. Los anticuerpos deben almacenarse a temperaturas y rangos de pH adecuados y, con frecuencia, en presencia de concentrados (

1 M) sustancias como glicerol o sacarosa, para mantener la actividad y prevenir la agregación. Muchos reactivos de anticuerpos disponibles comercialmente contienen uno o más aditivos que se describen a continuación que están destinados a aumentar la estabilidad de los anticuerpos durante el almacenamiento a largo plazo. La Tabla 1 resume las condiciones comunes de almacenamiento de anticuerpos y otras características.

acuoso, 4 & degC25-50% de glicerol o etilenglicol, -20 ° Ccongelado a -20 - -80 & degC o en nitrógeno líquidoliofilizado * 1
vida útil típica1 mes1 añoañosaños
concentración de anticuerpos1-5 mg / ml1-5 mg / ml1-5 mg / ml1-5 mg / ml
proteínas portadoras para diluciónBSABSABSAno
requisito estéril o antibacterianogeneralmentenono
antioxidantesgeneralmente 2-ME, TDT * 2 generalmente 2-ME, TDT * 2 nono
conjugación de fluorescenciaproteger de la luzproteger de la luzproteger de la luzproteger de la luz
valor de pH7.2-7.67.2-7.6ningunoninguno
quelante de metalesEDTAEDTAnono
múltiples usos de una sola alícuotaningún ciclo de congelación-descongelación degrada los anticuerpos [4] no aplicable

Muchos proveedores de reactivos también proporcionan anticuerpos solo para PBS (sin aditivos estabilizantes o proteínas portadoras como BSA, azida sódica o glicerol), que se pueden usar en reacciones de conjugación con colorantes y enzimas, o en ensayos funcionales / celulares, o en vivo. -Experimentos de formación de imágenes de células. Estos anticuerpos que solo contienen PBS tienden a suministrarse en concentraciones más altas.

Al almacenar anticuerpos por debajo de cero, es importante NO utilizar refrigeradores sin escarcha. Muchos refrigeradores domésticos tienen una función antiescarcha que realiza ciclos de congelación y descongelación para evitar la formación de escarcha. Estos ciclos repetidos de congelación-descongelación pueden reducir sustancialmente la vida útil de los anticuerpos.

Muchos anticuerpos destinados a experimentos de marcaje se conjugan con tintes fluorescentes. La exposición a la luz puede blanquear estos tintes y reducir drásticamente su fluorescencia. Dichos anticuerpos conjugados deben protegerse de la exposición a la luz, por ejemplo, almacenándolos en viales oscuros o en viales cubiertos con papel de aluminio.

Las reacciones químicas como la oxidación y la degradación proteolítica de proteínas ocurren a temperaturas moderadas, sin embargo, la frecuencia de estas reacciones es mucho mayor a temperaturas más altas. Los anticuerpos generalmente se almacenan a ≤ 4 ℃ en tubos de polipropileno o cristalería limpios y estériles. El almacenamiento a temperatura ambiente a menudo conduce a la degradación y / o inactividad de los anticuerpos, generalmente como resultado del crecimiento microbiano. Para almacenamiento a corto plazo (1 día a un par de semanas), las soluciones madre de anticuerpos bien preparadas se pueden almacenar a 4 ° C sin pérdida significativa de actividad. En malas condiciones de almacenamiento de 40 ° C durante 2 semanas a un pH de formulación típico de 6,0, residuos de aspartato y asparagina dentro de los "puntos calientes" de degradación de la variable Fv Se encontró que la región estaba modificada en hasta un 39% de las moléculas de anticuerpo [5].

La formación de cristales de hielo puede destruir la estructura de las proteínas y, por lo tanto, hacer que los anticuerpos sean ineficaces. Los crioprotectores como el glicerol y el etilenglicol previenen la formación de cristales de hielo al inhibir los enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua y, por lo tanto, disminuyen los puntos de congelación de las soluciones acuosas. El punto de congelación real depende de las propiedades y la concentración de los crioprotectores (ver Tabla 2).

(Nota: el etilenglicol es tóxico y debe manipularse con cuidado).

Cuando la temperatura de almacenamiento está por debajo del punto de congelación para una solución de anticuerpo crioprotector, la solución se solidificará. Sin embargo, en lugar de la formación de cristales de hielo, se produce típicamente vitrificación, como en la criopreservación de células / embriones con DMSO. Durante la vitrificación, la solución solidifica sin formación de cristales y, por lo tanto, se mantiene la integridad estructural de los anticuerpos.

Para una mayor estabilidad, se puede añadir glicerol o etilenglicol hasta una concentración final del 50% y luego se puede almacenar el anticuerpo a -20 ° C. Esta solución de anticuerpos debe almacenarse en pequeñas alícuotas de trabajo, por ejemplo, 25 ul [6], para que estén sometidas a menos ciclos de congelación-descongelación que puedan desnaturalizar los anticuerpos.

Dado que el glicerol puede estar contaminado por microbios, es fundamental utilizar preparaciones de glicerol estériles cuando se utiliza para el almacenamiento de anticuerpos.

Las preparaciones de anticuerpos siempre deben esterilizarse mediante filtración utilizando un filtro de 0,45 micrones y deben manipularse asépticamente para evitar la contaminación microbiana. Agentes antimicrobianos como azida de sodio (NaN3) a una concentración final de 0,02-0,05% (p / v) o timerosal a una concentración final de 0,01% (p / v) o ProClin 300 al 0,02% también se pueden usar para inhibir el crecimiento microbiano.

El más utilizado de estos agentes antimicrobianos es la azida sódica, que es tóxica para la mayoría de los organismos, incluidos los seres humanos. La mayoría de las bacterias gramnegativas están bien controladas por la azida de sodio (ver figura 1) [7] sin embargo, muchas bacterias grampositivas (estreptococos, neumococos, lactobacilos) son resistentes a la azida de sodio (ver figura 2) [1, 8, 9] . La azida de sodio inhibe la citocromo oxidasa en la cadena de transporte de electrones mitocondrial e induce la apoptosis [10]. Los anticuerpos en solución de azida de sodio NO deben usarse directamente en células vivas o en en vivo estudios. Además, la azida de sodio interfiere con la mayoría de las reacciones de conjugación, específicamente las conjugaciones dependientes de grupos amina. Si se van a realizar conjugaciones, la azida de sodio se puede eliminar con relativa facilidad mediante filtración en gel o diálisis, por ejemplo, DiaEasy Dialyzer MWCO 12-14 kD de BioVision [11].

Thimerosal contains mercury, and is very toxic by inhalation, ingestion, and in contact with skin. It may also cause allergic reactions among a certain population of people. Thimerosal was used as a preservative for medicines and vaccines until it began being phased out in 1999 due to concerns about potential toxicity.

The active ingredients of ProClin 300 are 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one and 2-methyl-4-isothiazolin-3-one, inhibitors of Kreb cycle enzymes α-ketoglutarate dehydrogenase, succinate dehydrogenase, and NADH dehydrogenase. According to Sigma, one of its suppliers, it presents no health hazards, toxicology problems, or disposal issues at recommended usage levels (0.03 – 0.05%), and thus is considered a safe alternative to sodium azide and thimerosal.

Antibody proteolysis by proteases can be an important issue for storing ascitic fluid and serum preparations since both preparations contain proteases. Typically cold storage (≤ -20° for long term and 4° for short term) is sufficient to prevent significant proteolytic degradation of the antibody. However, protease inhibitor cocktails, available from several suppliers, may be added to the antibody solution if proteolytic cleavage becomes a problem.

Dilute antibody solutions are more prone to inactivation and physical losses as a result of low-level non-specific binding to the storage vessel surfaces. Thus, it is advisable to keep antibody concentration high (e.g. >1 mg/mL) during storage.

If the concentration of an antibody is low, stabilizer proteins (sometimes referred to as carrier or filler proteins), such as purified bovine serum albumin (BSA) or gelatin, can be added to a final protein concentration of 1-5 mg/ml (0.1-0.5%). These stabilizer proteins competitively inhibit/reduce surface tension and non-specific absorption to storage tube and pipette surfaces. These added proteins can also help reduce proteolysis of antibodies.

Research has found that use of dry ice during protein storage and transport can cause acidification of the storage solution and potentially protein aggregation (with or without precipitation), especially with acidic proteins (those proteins with pI less than 7) [12]. Polyclonal IgG tends to be acidic, with a pI range of 4.7-7.5 [13]. Gas-sealed vials and/or gas-sealed plastic bags (for bagging the vials) should be used to minimize CO2 reaching the antibody solution. Additionally samples should be re-equilibrated in a -80°C freezer for a couple of days. Dri-Shield Moisture Barrier Bags from 3M, Thermo Scientific™ Nunc™ Cryoflex products, and IMPAK bags like 0203PM56OZETN and 05MP081OZE can be useful.

The effect of oxidation on antibody molecules has been extensively studied, especially for therapeutic antibodies (e.g., [14] ). Several residues of the antibodies, especially methionine and tryptophan, have been found to be susceptible to oxidation in the presence of UV light, elevated temperatures or oxygen radicals [15-18], and oxidation of these residues can alter both the stability and the function of the antibodies.While oxidation does not generally present a problem with antibodies used in research, there are antioxidants, such as 2-ME or DTT, that can slow this oxidation. Recent research suggests free methionine may be a particularly useful antioxidant for protein storage [19].

Freeze-drying (lyophilization) is the method of choice for long term storage of monoclonal antibodies because lyophilized antibodies are much more stable than they are in solution. Lyophilization involves drying antibodies at a very low temperature, reducing the damage to the products and retaining the molecular integrity. It extends the shelf life of antibodies, substantially eases the shipping temperature requirement and preserves their chemical and biological properties. Lyophilized antibodies are stable for 3-5 years without losing activity if stored at -20°C or below. Generally, the antibodies should be stored lyophilized until they are needed and reconstitution performed shortly before use. Lyophilized antibodies can be reconstituted by adding deionized or distilled water and inverting the container 5-6 times at room temperature. The reconstituted antibody can be stored for several weeks at 2-8°C or for up to 1-2 years at ≤ -20°C.

Antibody stability in a dry solid state is sensitive to pH [20], which plays a dominant role in determining the physical stability of the IgG1 in the lyophilized state, with pH 5.0 being the most stable. There are more aggregates and more secondary/tertiary structure changes at lower pH [20]. Thus buffer salts are generally required in a protein formulation to control the pH and minimize protein degradation during freeze-drying. Residual moisture content also plays a key role in maintaining the stability of the antibodies. Chang y col. found that optimal stability of the pure IgG1 antibody was at a water content of 2%-3% [21]. The lowest water content is not necessarily the optimal condition, and the residual moisture should be optimized during formulation development.

Proteins undergo denaturation, often forming intermolecular β-sheet structures, upon lyophilization in the absence of stabilizers. Different stabilizers such as sugars (sucrose and trehalose are the most used stabilizers) or polyols (glycerol and sorbitol) are normally added to the formulations to protect monoclonal antibodies against degradation during lyophilization and storage. However, a recent article indicates that trehalose or maltitol may not be lyoprotective, at least for pure polyclonal antibdies [4]. The presence of sucrose in a formulation can help preserve the native structure of the protein in the solid state and inhibit physical instability during long-term storage [21]. Enhanced protein stability is imparted by the amorphous mannitol due to the inability of mannitol to crystallize during freeze-drying, potentially through hydrogen bonding interaction of the polyol to protein sidechains. Sugars in combination with polyols are more effective at preventing aggregation than sugar or polyol alone, as evidenced by the disaccharide/mannitol formulations maintained native structure better than mannitol only formulations. Addition of a small amount of sorbitol to a sucrose-based formulation resulted in greater retention of native structure and improved stability [21].

The level of stabilization afforded by sugars or polyols generally depends on their concentrations. Increasing sugar/polyol concentration to a certain level may eventually reach a limit of stabilization or even destabilize a protein during lyophilization, so a specific molar ratio of stabilizer to protein is required for storage stability of a lyophilized monoclonal antibody. Many stability studies are performed using iso-osmotic concentrations of sugars (e.g., 275 mM sucrose or trehalose). Jeffrey et al. found a sugar-to-protein molar ratio of 360:1 was sufficient to provide storage stability of rhuMAb HER2, and the sugar concentration was 3-4 fold below the iso-osmotic concentration typically used in formulations [22]. The level of stabilizers used for protein protection during lyophilization depends on the formulation composition, concentration and physical properties of the stabilizer, and its compatibility with the protein. Long-term storage for antibodies at room temperature or above may be achieved by lyophilization via proper selection of the molar ratio and sugar mixture.

The mechanism of stabilization by sugars during drying is either that sugars produce a glassy matrix to restrict mobility (glass dynamics mechanism) and/or act as a water substitute (water substitute mechanism). Most studies supported the latter mechanism. The interaction between water and proteins is critical to the conformational stability of the proteins. When water is removed during drying, the stabilizers can form hydrogen bonds with the protein, as water molecules do, thereby preserving the native protein structure during the lyophilization process.

Lyophilization is a good choice to achieve the desired long term storage for antibodies at room temperature. However, problems still exist [4]. Proteins can become unstable during lyophilization processes and/or long term storage. Lyophilization is a method with poor efficiency, high energy consumption and large investment in equipment. There is no simple, universal protocol in formulating antibodies, and trial-and-error is still required on most occasions.

Aromatic amino acid residues in proteins can absorb UV-light, and light was shown to induce conversion of Trp to Gly and Gly hydroperoxide in IgG1 [23]. Chemicals, such as detergents like Tween 80, in antibody solutions, may introduce additional photosensitivity to antibodies [24]. Additionally, some antibodies are conjugated to fluorescent labels that can quickly bleach with light exposure. Thus prolonged exposure of antibody products to light (especially UV light) is not advisable [25].

Proteins, including antibodies, can aggregate and degrade when subjected to mechanical stresses incurred during vortexing, shaking and vial-dropping [26-28]. This is at least partially due to the cavitation and exposure of proteins in the air [28]. For this reason it is best to treat antibody samples relatively gently. For example, lyophilized antibodies can be reconstituted by gentle inversion rather than vortexing.

Very little loss of activity may occur when serum is directly stored for a decade at ≤ -20°C. However, once the polyclonal antibody is purified, some loss of activity occurs slowly over the years. It also seems that glycerol may not be necessary for storage at -20°C for years or even decades if the antibodies do not go through repeated freeze/thaw cycles. Repeated freeze/thaw cycles damage antibodies [4]. However it is important that the stored polyclonal antibodies should be in high concentration.

Monoclonal antibodies can be stored at -20°C in 50% glycerol.

It is also reported that monoclonal antibodies can be stored under saturated ammonia sulfate as pellets at 4°C or -20°C for many years without loss of activity, bacterial outgrowth or oxidation.

Lyophilization (freeze-drying, or drying from the frozen state) provides an alternative method of stabilizing antibodies that are not freeze-labile. In most situations, freeze-dried proteins can be stored at -20°C.

Conjugated antibodies, especially those with fluorescent labels, should be stored in dark containers or covered in aluminum foil.

Alkaline phosphatase and other enzyme conjugates are particularly sensitive to freezing, and should in general be stored at 4°C for short term after conjugation .

Antibody conjugates are best stored at -20°C with glycerol or ethylene glycol at a final concentration of 50% for the long term. Although some enzyme conjugates may be stored at -20°C without cryoprotectants, frozen stocks must be single-use aliquots to prevent repeated freeze-thaw cycles.

HRP-conjugated antibodies can be stored in 20-30% serum from horse, adult bovine, calf, or rabbit, or in one of many commercial stabilizers or in a combination of both (Oded Babai, Savyon Diagnostics, Israel).

As with any reagents conjugated with fluorescent tags (not just antibodies), fluorescence-conjugated antibodies must be protected from light. Fluorescence can photobleach when exposed to light. Exposure to light may render poor performance and vial-to-vial variation. Fluorophore-conjugated antibodies also should be stored at 4°C and should never be frozen. For example, BD Biosciences issued a rare recall of fluorophore-conjugated antibody reagents due to high-intensity lighting in its warehouse in 2017.


Freezing bacteria pellet protocol

Hi, I'm interested in learning how best to store E. coli pellets at -20° or -80°C. Looking online I can only find stuff about "flash freezing the pellet" or "make a glycerol stock" but I can't seem to find any protocols about how to actually do that (i.e. go from harvested cell pellet --> test tube of cells that can be frozen). Specifically, I'm looking to sonicate + extract/purify protein from these cells. Any advice is appreciated, thank you :)

Just sticking the cells in the freezer might be ok, depending on the stability of your protein, but I suspect in the end you'll want to flash-freeze them.

Done when you don't want cells to die. Briefly, you would resuspend the pellet in fresh media with 30-50% glycerol, then simply place in -80 freezer. The glycerol protects the cells by preventing ice crystal formation, which will lyse the cells. An added advantage is that the glycerol gives the frozen sample an "ice cream" like texture, meaning that when you want to take some live cells out of the freezer for further cell culture, you don't have to thaw the tube at all, just poke in a sterile toothpick or pippette tip and grab some "ice cream"


Antibody storage guide

​Please always check datasheets for specific storage recommendations. We are not able to guarantee antibodies that have not been stored correctly. With proper storage and handling, most antibodies should retain activity for months, if not years.

You can also access our most popular protocols straight from your phone with the Abcam app, which features protocols, scientific support and a suite of useful tools that are handy for any bench scientist. Aprende más.

Storage temperatures

For many of our antibodies, freezing at -20°C or -80°C in small aliquots is the optimal storage condition. Aliquotting minimizes damage due to freezing and thawing, as well as contamination introduced by pipetting from a single vial multiple times. Aliquots should be frozen and thawed once, with any remainder kept at 4°C.

Upon receiving the antibody, centrifuge at 10,000 x g for 20 seconds to pull down solution that is trapped in the threads of the vial, and transfer aliquots into low-protein-binding microcentrifuge tubes. The size of the aliquots will depend on how much you typically use in an experiment. Aliquots should be no smaller than 10 μL the smaller the aliquot, the more the stock concentration is affected by evaporation and adsorption of the antibody onto the surface of the storage vial.

In most cases storage at 4°C upon receipt of the antibody is acceptable for one to two weeks. It is important to follow the recommendations on the datasheet.

Enzyme-conjugated antibodies should not be frozen at all and should instead be kept at 4°C. Freezing and thawing will reduce enzymatic activity in addition to affecting the antibody binding capacity.

Conjugated antibodies – whether conjugated to fluorochromes, enzymes, or biotin – should be stored in dark vials or wrapped in foil. Exposure to light will compromise the activity of conjugates. Fluorescent conjugates in particular are susceptible to photo-bleaching and should be protected from light during all phases of an experiment.

Antibodies of the IgG3 isotype are unique in their tendency to form aggregates upon thawing and should always be stored at 4°C.

Ascites fluid may contain proteases, and should be frozen as soon as possible after receipt.

​Contamination

To prevent microbial contamination, sodium azide can be added to an antibody preparation to a final concentration of 0.02% (w/v). Many of our antibodies already contain this preservative at concentrations ranging from 0.02 to 0.05%. This will be indicated on the datasheets in the storage buffer section.

When not to use sodium azide

If staining or treating live cells with antibodies, or if using antibodies for in vivo studies, be sure to use preparations that do not contain sodium azide. This antimicrobial agent is toxic to most other organisms as well: it blocks the cytochrome electron transport system.

Sodium azide will interfere with any conjugation that involves an amine group, and should be removed before proceeding with the conjugation. After conjugation, antibodies can be stored in sodium azide. The exception is HRP-conjugated antibodies which should not be stored in buffers containing sodium azide, since the same inhibits HRP. An acceptable alternative is 0.01% thimerosal (merthiolate), which does not have a primary amine.

Sodium azide can be removed from antibody solutions by dialysis or gel filtration. The molecular weight of IgG is 150,000 daltons (IgM is

600,000) the molecular weight of sodium azide is 65 daltons. A micro-dialysis unit with a cut off at 14,000 daltons will retain the antibody as the azide diffuses out.

In a beaker on a magnetic stirrer kept at 4°C, use at least a liter of cold PBS per mL of antibody and stir the dialysis unit for 6 hrs. Change the PBS twice, stirring at least 6 h for each change. If possible, all materials should be sterilized and the resulting preparation should be handled aseptically.

​Freeze/thaw damage

Repeated freeze/thaw cycles can denature an antibody, causing it to form aggregates that reduce its binding capacity.

Storing at -20°C should be adequate for most antibodies there is no appreciable advantage to storing at -80°C. The freezer must not be of the frost-free variety. These cycle between freezing and thawing (to reduce frost-build-up), which is exactly what should be avoided. For the same reason, antibody vials should be placed in an area of the freezer that has minimal temperature fluctuations, for instance towards the back rather than on a door shelf.

Some researchers add the cryoprotectant glycerol to a final concentration of 50% to prevent freeze/thaw damage glycerol will lower the freezing point to below -20°C. While this may be acceptable for many antibodies, only a small percentage of the antibodies we offer have been tested for stability in this storage condition and our guarantee only applies to antibodies stored as recommended on the datasheet. Storing solutions containing glycerol at -80°C is not advised since this is below the freezing point of glycerol. Please be aware that glycerol can be contaminated with bacteria. If adding glycerol or any cryoprotectant, care should be taken to obtain a sterile preparation.

Protein concentration and stability

Diluting antibodies to working concentration and storing at 4°C for more than a day should be avoided. Proteins in general are less susceptible to degradation when stored at higher concentrations, ideally 1 mg/mL or higher. This is the rationale for including proteins such as BSA to the antibody solution as stabilizers. The added protein also serves to minimize loss of antibody due to binding to the vessel wall. Do not add stabilizing protein to antibodies that you intend to conjugate, because they will compete with the antibody and reduce the efficiency of the conjugation.


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