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¿Los alérgenos tienen similitudes estructurales con los patógenos?

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La explicación popular convencional de las alergias es que el sistema inmunológico confunde alérgenos con patógenos y reacciona a ellos como tales. ¿Tiene algún mérito esta explicación? Si es así, esperaría que fuera posible predecir qué proteínas serían alérgenos por su similitud estructural con los patógenos. ¿Lo es? Si no es así, ¿de qué otra manera podríamos explicar qué proteínas son alérgenos y cuáles no?


Biología 171

Al final de esta sección, podrá hacer lo siguiente:

  • Describe el citoesqueleto
  • Compare las funciones de los microfilamentos, los filamentos intermedios y los microtúbulos.
  • Comparar y contrastar cilios y flagelos
  • Resumir las diferencias entre los componentes de células procariotas, células animales y células vegetales.

Si eliminara todos los orgánulos de una célula, ¿serían la membrana plasmática y el citoplasma los únicos componentes que quedarían? No. Dentro del citoplasma, todavía habría iones y moléculas orgánicas, además de una red de fibras proteicas que ayudan a mantener la forma de la célula, aseguran algunos orgánulos en posiciones específicas, permiten que el citoplasma y las vesículas se muevan dentro de la célula y habilitan a las células. dentro de los organismos multicelulares para moverse. En conjunto, los científicos llaman citoesqueleto a esta red de fibras proteicas. Hay tres tipos de fibras dentro del citoesqueleto: microfilamentos, filamentos intermedios y microtúbulos ((Figura)). Aquí examinaremos cada uno.


Microfilamentos

De los tres tipos de fibras proteicas del citoesqueleto, los microfilamentos son los más estrechos. Funcionan en movimiento celular, tienen un diámetro de aproximadamente 7 nm y se componen de dos hebras entrelazadas de proteínas globulares, que llamamos actina ((Figura)). Por esta razón, también llamamos filamentos de actina a los microfilamentos.


El ATP impulsa a la actina a ensamblar su forma filamentosa, que sirve como pista para el movimiento de una proteína motora que llamamos miosina. Esto permite que la actina participe en eventos celulares que requieren movimiento, como la división celular en células eucariotas y la transmisión citoplasmática, que es el movimiento circular del citoplasma celular en las células vegetales. La actina y la miosina abundan en las células musculares. Cuando los filamentos de actina y miosina se deslizan uno al lado del otro, los músculos se contraen.

Los microfilamentos también proporcionan cierta rigidez y forma a la celda. Pueden despolimerizarse (desmontarse) y reformarse rápidamente, lo que permite que una célula cambie de forma y se mueva. Los glóbulos blancos (las células de su cuerpo que luchan contra las infecciones) hacen un buen uso de esta capacidad. Pueden trasladarse a un sitio de infección y fagocitar el patógeno.

Para ver un ejemplo de un glóbulo blanco en acción, observe cómo el glóbulo blanco persigue bacterias en un breve lapso de tiempo de la célula capturando dos bacterias. Engulle a uno y luego pasa al otro.

Filamentos intermedios

Varias hebras de proteínas fibrosas que se enrollan juntas comprenden filamentos intermedios ((Figura)). Los elementos del citoesqueleto reciben su nombre del hecho de que su diámetro, de 8 a 10 nm, se encuentra entre los de los microfilamentos y los microtúbulos.


Los filamentos intermedios no tienen ningún papel en el movimiento celular. Su función es puramente estructural. Soportan tensión, manteniendo así la forma de la célula y anclan el núcleo y otros orgánulos en su lugar. (Figura) muestra cómo los filamentos intermedios crean un andamio de apoyo dentro de la celda.

Los filamentos intermedios son el grupo más diverso de elementos citoesqueléticos. Varios tipos de proteínas fibrosas se encuentran en los filamentos intermedios. Probablemente esté más familiarizado con la queratina, la proteína fibrosa que fortalece el cabello, las uñas y la piel y la epidermis.

Microtúbulos

Como su nombre lo indica, los microtúbulos son pequeños tubos huecos. Los dímeros polimerizados de α-tubulina y β-tubulina, dos proteínas globulares, comprenden las paredes de los microtúbulos y # 8217s ((Figura)). Con un diámetro de aproximadamente 25 nm, los microtúbulos son citoesqueletos & # 8217 componentes más anchos. Ayudan a la célula a resistir la compresión, proporcionan una pista a lo largo de la cual las vesículas se mueven a través de la célula y tiran de los cromosomas replicados hacia los extremos opuestos de una célula en división. Al igual que los microfilamentos, los microtúbulos se pueden desmontar y reformar rápidamente.


Los microtúbulos son también los elementos estructurales de los flagelos, cilios y centriolos (estos últimos son el centrosoma y dos cuerpos perpendiculares). En las células animales, el centrosoma es el centro organizador de microtúbulos. En las células eucariotas, los flagelos y los cilios son muy diferentes estructuralmente de sus contrapartes en los procariotas, como discutimos a continuación.

Flagelos y cilios

Los flagelos (singular = flagelo) son estructuras largas, similares a pelos, que se extienden desde la membrana plasmática y permiten que una célula entera se mueva (por ejemplo, espermatozoides, Euglenay algunos procariotas). Cuando está presente, la célula tiene solo un flagelo o algunos flagelos. Sin embargo, cuando hay cilios (singular = cilio), muchos de ellos se extienden a lo largo de toda la superficie de la membrana plasmática. Son estructuras cortas, similares a pelos, que mueven células enteras (como los paramecios) o sustancias a lo largo de la superficie exterior de la célula (por ejemplo, los cilios de las células que recubren las trompas de Falopio que mueven el óvulo hacia el útero, o los cilios que recubren el células del tracto respiratorio que atrapan las partículas y las mueven hacia las fosas nasales).

A pesar de sus diferencias en longitud y número, los flagelos y los cilios comparten una disposición estructural común de microtúbulos denominada "matriz 9 + 2". Este es un nombre apropiado porque un solo flagelo o cilio está formado por un anillo de nueve dobletes de microtúbulos, rodeando un solo doblete de microtúbulos en el centro ((Figura)).


Ahora ha completado una amplia encuesta de componentes de células procariotas y eucariotas. Para obtener un resumen de los componentes celulares de las células procariotas y eucariotas, consulte la (Figura).

Componentes de células procariotas y eucariotas
Componente de celda Función ¿Presente en procariotas? ¿Presente en células animales? ¿Presente en las células vegetales?
Membrana de plasma Separa la célula del ambiente externo controla el paso de moléculas orgánicas, iones, agua, oxígeno y desechos dentro y fuera de la célula.
Citoplasma Proporciona presión de turgencia a las células vegetales en forma de líquido dentro del sitio de la vacuola central de muchos medios de reacciones metabólicas en los que se encuentran los orgánulos.
Nucleolo Área oscurecida dentro del núcleo donde se sintetizan las subunidades ribosómicas. No
Núcleo Orgánulo celular que alberga el ADN y dirige la síntesis de ribosomas y proteínas. No
Ribosomas Síntesis de proteínas
Mitocondrias Producción de ATP / respiración celular No
Peroxisomas Oxida y descompone los ácidos grasos y aminoácidos, y desintoxica los venenos. No
Vesículas y vacuolas Función digestiva de almacenamiento y transporte en células vegetales No
Centrosoma Papel no especificado en la división celular en células animales fuente de microtúbulos en células animales No No
Lisosomas Digestión de macromoléculas reciclado de orgánulos desgastados No Algunos
Pared celular Protección, soporte estructural y mantenimiento de la forma de la celda. Sí, principalmente peptidoglicano No Sí, principalmente celulosa
Cloroplastos Fotosíntesis No No
Retículo endoplásmico Modifica proteínas y sintetiza lípidos No
Aparato de Golgi Modifica, clasifica, etiqueta, empaqueta y distribuye lípidos y proteínas No
Citoesqueleto Mantiene la forma de la célula, asegura los orgánulos en posiciones específicas, permite que el citoplasma y las vesículas se muevan dentro de la célula y permite que los organismos unicelulares se muevan de forma independiente.
Flagelos Locomoción celular Algunos Algunos No, a excepción de algunos espermatozoides vegetales.
Cilios Locomoción celular, movimiento de partículas a lo largo de la membrana plasmática y la superficie extracelular # 8217s y filtración Algunos Algunos No

Resumen de la sección

El citoesqueleto tiene tres tipos de elementos proteicos diferentes. De más estrecho a más ancho, son los microfilamentos (filamentos de actina), los filamentos intermedios y los microtúbulos. Los biólogos a menudo asocian los microfilamentos con la miosina. Aportan rigidez y forma a la célula y facilitan los movimientos celulares. Los filamentos intermedios soportan tensión y anclan el núcleo y otros orgánulos en su lugar. Los microtúbulos ayudan a la célula a resistir la compresión, sirven como pistas para las proteínas motoras que mueven las vesículas a través de la célula y empujan los cromosomas replicados hacia los extremos opuestos de una célula en división. También son el elemento estructural de centriolos, flagelos y cilios.

Respuesta libre

¿Cuáles son las similitudes y diferencias entre las estructuras de centriolos y flagelos?

Los centríolos y los flagelos se parecen en que están formados por microtúbulos. En los centríolos, dos anillos de nueve "tripletes" de microtúbulos están dispuestos en ángulo recto entre sí. Esta disposición no ocurre en los flagelos.

¿En qué se diferencian los cilios y los flagelos?

Los cilios y los flagelos se parecen en que están formados por microtúbulos. Los cilios son estructuras cortas, similares a pelos, que existen en grandes cantidades y generalmente cubren toda la superficie de la membrana plasmática. Los flagelos, por el contrario, son estructuras largas, parecidas a pelos, cuando los flagelos están presentes, una célula tiene solo uno o dos.

Describe cómo los microfilamentos y microtúbulos están involucrados en la fagocitosis y destrucción de un patógeno por un macrófago.

Un macrófago engulle a un patógeno reordenando sus microfilamentos de actina para doblar la membrana plasmática alrededor del patógeno. Una vez que el patógeno está sellado en un endosoma dentro del macrófago, la vesícula se recorre a lo largo de los microtúbulos hasta que se combina con un lisosoma para digerir el patógeno.

Compare y contraste los límites que utilizan las células vegetales, animales y bacterianas para separarse del entorno que las rodea.

Los tres tipos de células tienen una membrana plasmática que bordea el citoplasma en su lado interior. En las células animales, el lado exterior de la membrana plasmática está en contacto con el entorno extracelular. Sin embargo, en las células vegetales y bacterianas, una pared celular rodea el exterior de la membrana plasmática. En las plantas, la pared celular está hecha de celulosa, mientras que en las bacterias la pared celular está hecha de peptidoglicano. Las bacterias gramnegativas también tienen una cápsula adicional hecha de lipopolisacáridos que rodea su pared celular.

Glosario


Los seres humanos y las plantas comparten una vía reguladora común

En hallazgos que algunos podrían encontrar que recuerdan a la ciencia ficción, los científicos del Instituto de Investigación Scripps han demostrado por primera vez que los humanos y las plantas comparten una vía común de reconocimiento de patógenos como parte de su sistema inmunológico innato. Los datos podrían ayudar a arrojar luz sobre cómo funcionan las proteínas de reconocimiento de patógenos y el papel que desempeñan en ciertas enfermedades inflamatorias crónicas.

El estudio proporciona nueva evidencia de que Nod1, un miembro de la familia de proteínas Nod-like Receptor (NLR), es activado por la proteína SGT1, que también activa las proteínas Resistance (R) en las plantas. Las proteínas R protegen a las plantas de varios patógenos. El estudio también confirma similitudes estructurales entre la proteína Nod1, que desempeña un papel fundamental en el reconocimiento y la respuesta del sistema inmunológico innato a la infección bacteriana y los miembros de la familia de proteínas R.

"Ha habido mucha especulación de que las proteínas R y Nod1 están relacionadas, pero nuestro estudio proporciona el primer vínculo directo entre las plantas y los humanos", dijo Richard Ulevitch, científico de Scripps Research cuyo laboratorio llevó a cabo el estudio. "Las plantas tienen receptores tipo Nod y respuestas inmunes similares a las bacterias y otros patógenos; las proteínas R evolucionaron para contrarrestar estos efectos patógenos. Nuestro estudio proporciona una nueva perspectiva sobre la vía Nod1 en células de mamíferos, así como el valor de basarse en estudios de plantas. de las vías de la proteína R para comprender mejor las funciones de reconocimiento de patógenos de estas proteínas ".

Las proteínas Nod reconocen bacterias invasoras, específicamente subestructuras distintas que se encuentran en organismos Gram-negativos y Gram-positivos. Una vez activado, Nod1 produce una serie de respuestas que incluyen la activación de vías de señalización intracelular, producción de citocinas y apoptosis o muerte celular programada. A pesar de que se han descrito varios modelos de activación de Nod1, se sabe poco sobre otras proteínas que podrían afectar la activación de la proteína. Por el contrario, se han vinculado varias proteínas adicionales a las vías de activación de la proteína R en las plantas.

"La familia NLR tiene vínculos claros con las enfermedades humanas", dijo Ulevitch. "De las más de 20 proteínas de la familia NLR, varias mutaciones están relacionadas con enfermedades que involucran inflamación crónica o consecuencias autoinmunes. Hasta ahora, ha habido una comprensión limitada de las vías reguladoras de Nod1. Al identificar SGT1 como un proteína reguladora, nuestro estudio ofrece nuevos conocimientos sobre toda la familia ".

SGT1 es una proteína que se encuentra en levaduras, plantas y mamíferos tanto en el núcleo como en el citosol. Funciona en varios procesos biológicos a través de la interacción con diferentes complejos de proteínas múltiples. Una gran cantidad de evidencia también sugiere que la proteína juega un papel en la regulación de la resistencia a los patógenos en las plantas. Varios estudios genéticos han identificado SGT1 como un componente crucial para la resistencia a patógenos en plantas a través de la regulación de la expresión y actividades de algunas proteínas R.

Aunque existe un cruce genético significativo entre plantas y mamíferos, se sabe muy poco acerca de esta vía reguladora común entre humanos y plantas. Ulevitch especuló que ciertas estructuras reguladoras de proteínas podrían existir tanto en plantas como en humanos simplemente porque hacen lo mismo de la misma manera.

"En realidad", dijo, "hay un número limitado de formas de lograr respuestas biológicas relacionadas".

El estudio también mostró que una proteína de choque térmico, HSP90, ayudó a estabilizar Nod1.

"La inhibición de HSP90 resultó en una reducción significativa de los niveles de proteína Nod1", dijo Ulevitch. "Eso sugiere claramente que esta proteína juega un papel clave en la estabilización de Nod1 y la protección de la degradación. Por el contrario, apagar SGT1 no alteró los niveles de Nod1".

En un estudio anterior, el laboratorio de Ulevitch informó que Nod1 también interactuó con el complejo COP9, un complejo multiproteico que se sabe que juega un papel en una serie de vías de desarrollo en las plantas y que tiene una contraparte en los mamíferos. Esta interacción, anotó Ulevitch, proporciona un segundo vínculo entre las vías de la proteína R de la planta y Nod1.

"La asociación de Nod1 con SGT1 y el complejo COP9 sugiere que una posible función de SGT1 podría ser apuntar a proteínas reguladoras de la resistencia para su degradación", añadió. "En esta hipótesis, la proteína objetivo sería un regulador negativo de las respuestas inmunitarias".

Los estudios futuros, dijo Ulevitch, se centrarán en la extensa literatura que existe que describe la inmunidad dependiente de la proteína R en las plantas para comprender mejor las vías humanas de NLR, especialmente las que dependen de Nod1.

El estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud y Novartis. El estudio fue publicado en una edición avanzada en línea de las Actas de la Academia Nacional de Ciencias durante la semana del 9 de abril de 2007.

Otros autores del estudio, "SGT1 es esencial para la activación de NOD1", son Jean da Silva Correia, Yvonne Miranda y Nikki Leonard.

Fuente de la historia:

Materiales proporcionados por Instituto de Investigación Scripps. Nota: El contenido puede editarse por estilo y longitud.


La biología celular del asma

Las manifestaciones clínicas del asma son causadas por la obstrucción de las vías respiratorias conductoras del pulmón. Dos tipos de células de las vías respiratorias son fundamentales para la patogénesis del asma: las células epiteliales y las células del músculo liso. Las células epiteliales de las vías respiratorias, que son la primera línea de defensa contra los patógenos y las partículas inhaladas, inician la inflamación de las vías respiratorias y producen moco, un contribuyente importante a la obstrucción de las vías respiratorias. La otra causa principal de obstrucción de las vías respiratorias es la contracción del músculo liso de las vías respiratorias. Los enfoques experimentales complementarios que involucran células cultivadas, modelos animales y estudios clínicos en humanos han proporcionado muchos conocimientos sobre los diversos mecanismos que contribuyen a la patología de las células epiteliales de las vías respiratorias y del músculo liso en esta compleja enfermedad.

Introducción

El asma es una enfermedad común que afecta hasta al 8% de los niños en los Estados Unidos (Moorman et al., 2007) y es una de las principales causas de morbilidad en todo el mundo. Las principales manifestaciones clínicas del asma son episodios repetidos de disnea y sibilancias que son al menos parcialmente reversibles, tos recurrente y producción excesiva de moco en las vías respiratorias. Debido a que el asma implica una respuesta integrada en las vías respiratorias conductoras del pulmón a desencadenantes conocidos o desconocidos, es una enfermedad multicelular que implica respuestas anormales de muchos tipos de células diferentes en el pulmón (Locksley, 2010). Aquí nos enfocamos en los dos tipos de células que son responsables en última instancia de la principal patología sintomática del asma: las células epiteliales que inician la inflamación de las vías respiratorias en el asma y son la fuente del exceso de moco de las vías respiratorias, y las células del músculo liso que se contraen excesivamente para causar un estrechamiento sintomático de las vías respiratorias. El pensamiento actual sobre las comunicaciones célula-célula que impulsan el asma (Fig.1) es que los estímulos inhalados conocidos y desconocidos (es decir, proteasas y otros componentes de alérgenos inhalados, virus respiratorios y contaminantes del aire) estimulan a las células epiteliales de las vías respiratorias para que secreten las citocinas TSLP , interleucina (IL) -25 e IL-33, que actúan sobre células dendríticas subepiteliales, mastocitos y células linfoides innatas (iLC) para reclutar células hematopoyéticas tanto innatas como adaptativas e iniciar la liberación de citocinas T helper 2 (Th2) (principalmente IL-5 e IL-13 Locksley, 2010 Scanlon y McKenzie, 2012 Bando et al., 2013 Barlow et al., 2013 Nussbaum et al., 2013). Los estímulos ambientales también activan los nervios aferentes en el epitelio de las vías respiratorias que por sí mismos pueden liberar mediadores peptídicos biológicamente activos y también desencadenar la liberación refleja de acetilcolina de las fibras eferentes en el nervio vago. Esta respuesta inicial se amplifica por el reclutamiento y diferenciación de subconjuntos de células T que mantienen la secreción de estas citocinas y, en algunos casos, secretan otra citocina, IL-17, en sitios estratégicos específicos en la pared de las vías respiratorias. Las citocinas liberadas actúan sobre las células epiteliales y las células del músculo liso e impulsan las respuestas patológicas de estas células que contribuyen a la enfermedad sintomática. La biología celular que subyace a las respuestas de los linajes hematopoyéticos relevantes no es específica del asma y se ha discutido en otra parte (Locksley, 2010 Scanlon y McKenzie, 2012). Centramos nuestra discusión en las contribuciones de las células epiteliales y las células del músculo liso de las vías respiratorias.

Biología celular del epitelio de las vías respiratorias

Las vías respiratorias están cubiertas con una lámina continua de células epiteliales (Crystal et al., 2008 Ganesan et al., 2013).Dos tipos principales de células de las vías respiratorias, las células secretoras y las ciliadas, establecen y mantienen el aparato mucociliar, que es fundamental para preservar la permeabilidad de las vías respiratorias y defenderse de los patógenos y alérgenos inhalados. El aparato consta de una capa de gel de moco y una capa periciliar subyacente. Cada una de las células ciliadas proyecta alrededor de 300 cilios móviles hacia la capa periciliar que son fundamentales para impulsar la capa de moco hacia arriba por las vías respiratorias. Además, los cilios están recubiertos con mucinas que atraviesan la membrana y mucopolisacáridos unidos que excluyen el moco del espacio periciliar y promueven la formación de una capa mucosa distinta (Button et al., 2012). Las células secretoras producen una clase diferente de mucinas, las mucinas poliméricas formadoras de gel. Las dos principales mucinas formadoras de gel de las vías respiratorias son MUC5AC y MUC5B. Algunas células secretoras, conocidas como células mucosas o caliciformes, producen mucinas y las almacenan dentro de colecciones de gránulos de mucina que se pueden visualizar fácilmente, mientras que otras células producen y secretan mucinas (especialmente MUC5B) pero carecen de gránulos prominentes. Las mucinas formadoras de gel se secretan en la luz de las vías respiratorias y son responsables de las propiedades viscoelásticas características de la capa de gel mucoso.

Lesión y remodelación del epitelio de las vías respiratorias en el asma

Una variedad de cambios estructurales en el epitelio y otras partes de las vías respiratorias, denominados "remodelación de las vías respiratorias", se observan con frecuencia en personas con asma (Elias et al., 1999). Estos cambios incluyen engrosamiento de la pared de las vías respiratorias, hipertrofia epitelial y metaplasia mucosa, fibrosis subepitelial, hiperplasia de miofibroblastos e hiperplasia e hipertrofia de las células del músculo liso. Se cree que la remodelación de las vías respiratorias representa una respuesta a la lesión tisular en curso causada por agentes infecciosos, alérgenos o partículas inhaladas y por las respuestas del huésped a estos estímulos. En algunos estudios se han identificado signos de lesión epitelial franca, incluida la pérdida de la integridad epitelial, la interrupción de uniones estrechas, el deterioro de la función de barrera y la muerte celular, que pueden correlacionarse con la gravedad del asma (Laitinen et al., 1985 Jeffery et al., 1989 Barbato et al., 2006 Holgate, 2007). Sin embargo, en muchas personas los síntomas del asma y las características de la remodelación de las vías respiratorias, incluida la metaplasia mucosa y la fibrosis subepitelial, se observan en ausencia de signos de infección activa de las vías respiratorias o lesión tisular manifiesta (Ordoñez et al., 2000), lo que sugiere que otros procesos explican la persistencia del asma en estos individuos. Evidencia sustancial sugiere que la persistencia del asma es impulsada por respuestas inmunes en curso del huésped que generan mediadores que impulsan la remodelación de las vías respiratorias y la disfunción de las vías respiratorias. El epitelio es tanto un sitio de producción de estos mediadores como una fuente de células que responden a los mediadores producidos por las células inmunes y otras células dentro de las vías respiratorias. La forma en que las células epiteliales de las vías respiratorias reconocen y responden a virus, alérgenos y otros estímulos se ha revisado exhaustivamente en otro lugar (Lambrecht y Hammad, 2012). Aquí nos centraremos en la contribución del epitelio a la producción y las respuestas a las citocinas Th2.

Contribuciones del epitelio de las vías respiratorias a las respuestas Th2.

Las citocinas Th2, especialmente la IL-13, desempeñan un papel fundamental en el asma. Múltiples citocinas, incluidas TSLP, GM-CSF, IL-1, IL-25 e IL-33, son producidas por el epitelio y promueven la producción de citocinas Th2 por las células inmunes (Cates et al., 2004 Hammad et al., 2009 Locksley, 2010 Nagarkar et al., 2012). Los estudios de asociación de todo el genoma implican a múltiples genes relacionados con Th2, que incluyen IL13, IL33, y TSLP, en el asma (Moffatt et al., 2010 Torgerson et al., 2011). La IL-13 es producida por células linfoides innatas (Neill et al., 2010 Price et al., 2010 Saenz et al., 2010 Hasnain et al., 2011) y células Th2 (Grünig et al., 1998 Wills-Karp et al. ., 1998) durante la inflamación alérgica y por macrófagos en un modelo de ratón de enfermedad de las vías respiratorias inducida por virus (Kim et al., 2008). IL-13 induce cambios característicos en los patrones de expresión del ARNm del epitelio de las vías respiratorias (Kuperman et al., 2005b Woodruff et al., 2007 Zhen et al., 2007) y de los patrones de expresión de miARN (Solberg et al., 2012) en las células epiteliales de las vías respiratorias. La "firma" transcripcional de IL-13 se puede utilizar para identificar a los individuos con asma "Th2 alta" y "Th2 baja" (Woodruff et al., 2009). La proteína periostina inducida por IL-13 se secreta basalmente a partir de las células epiteliales de las vías respiratorias y puede usarse como un biomarcador para el asma alta Th2 (Jia et al., 2012 Parulekar et al., 2014). Aproximadamente la mitad de las personas con asma tienen Th2 alta y estas personas tienen mejores respuestas al tratamiento con corticosteroides inhalados (Woodruff et al., 2009) o con anticuerpos anti-IL-13 (Corren et al., 2011). Los factores clave del asma baja Th2 siguen siendo poco conocidos, aunque las citocinas de la familia Th17 pueden ser importantes (Newcomb y Peebles, 2013).

Metaplasia mucosa.

Aunque el moco es fundamental para la defensa del huésped, la producción patológica de moco es un factor importante que contribuye a la morbilidad y mortalidad por asma. En el asma fatal, las vías respiratorias a menudo están obstruidas con tapones de moco tenaces que obstruyen el movimiento del gas (Kuyper et al., 2003). Este fenómeno catastrófico probablemente refleja un aumento de la producción y secreción de mucina, así como cambios en la reticulación de la mucina, la hidratación del gel de moco y la eliminación del moco. Las anomalías en el moco no se limitan a exacerbaciones graves del asma porque se observa un aumento en las reservas de mucina intracelular (metaplasia mucosa) incluso en individuos con asma estable, leve a moderada (Ordoñez et al., 2001). En modelos de asma con enfermedad alérgica de las vías respiratorias en ratones, la metaplasia mucosa es el resultado de una mayor producción y almacenamiento de mucinas (especialmente MUC5AC) en células secretoras preexistentes, incluidas las células club (Evans et al., 2004), en lugar de la transdiferenciación de células ciliadas (Pardo-Saganta et al., 2013). Sin embargo, en modelos de asma impulsados ​​por virus, las células mucosas pueden surgir de la transdiferenciación de células ciliadas (Tyner et al., 2006). Se ha demostrado que una variedad de estímulos y vías de señalización regulan la producción y secreción de mucina en las células epiteliales de las vías respiratorias.

IL-13 estimula la producción de mucina en el asma alta Th2.

Los efectos directos de IL-13 en las células epiteliales de las vías respiratorias inducen metaplasia mucosa en células epiteliales de las vías respiratorias humanas en cultivo (Laoukili et al., 2001 Zhen et al., 2007) y en células epiteliales de las vías respiratorias de ratón in vivo (Kuperman et al., 2002) . La IL-13 es necesaria para la metaplasia mucosa en muchos modelos de asma en ratones (Grünig et al., 1998 Wills-Karp et al., 1998 Tyner et al., 2006). Las personas con asma Th2 alta tienen niveles elevados de células epiteliales bronquiales MUC5AC ARNm en comparación con controles sanos o individuos con asma baja Th2 (Woodruff et al., 2009). Estudios recientes con ratones transgénicos demuestran el papel de MUC5AC en la eliminación de infecciones por nematodos entéricos (Hasnain et al., 2011) y la protección contra la infección por influenza (Ehre et al., 2012). Aumentado MUC5AC Por lo tanto, la expresión es parte de una respuesta inmune integrada que contribuye a la defensa del huésped contra patógenos o partículas inhaladas. Una característica menos reconocida del asma con niveles elevados de Th2 es la disminución sustancial en la expresión de MUC5B (Woodruff et al., 2009). El descubrimiento reciente de que se requiere MUC5B para el aclaramiento mucociliar normal y la defensa contra la infección de las vías respiratorias (Roy et al., 2014) sugiere que se debe prestar más atención a la posibilidad de que una reducción de MUC5B pueda contribuir de manera importante a la disfunción de las vías respiratorias en el asma.

La IL-13 es reconocida por los receptores de la superficie celular expresados ​​en casi todos los tipos de células, incluidas las células epiteliales de las vías respiratorias (Fig. 2). El receptor de IL-13 de células epiteliales de las vías respiratorias que es fundamental para la metaplasia mucosa es un heterodímero compuesto de IL-13Rα1 e IL-4Rα. La eliminación de este receptor en las células secretoras del epitelio de las vías respiratorias (impulsada por el promotor CCSP) previno la metaplasia mucosa en un modelo de asma alérgica (Kuperman et al., 2005a). La unión de IL-13 conduce a la activación de las quinasas Jak asociadas con el dominio citoplásmico del receptor y la posterior fosforilación del transductor de señal y el activador de la transcripción 6 (STAT6). La activación de STAT6 es necesaria para la metaplasia mucosa inducida por IL-13 (Kuperman et al., 2002).

La serie de eventos que relacionan la activación de STAT6 con la metaplasia mucosa se comprenden solo en parte. STAT6 no parece regular directamente MUC5AC no se han determinado la transcripción (Young et al., 2007) y los objetivos directos críticos de STAT6. Una vía que depende de la activación de STAT6 involucra la proteína canal 1 de cloruro activado por calcio (CLCA1). CLCA1 es uno de los genes más altamente inducidos en las células epiteliales de las vías respiratorias de individuos con asma (Hoshino et al., 2002 Toda et al., 2002). A pesar de su nombre, CLCA1 no parece funcionar como un canal iónico, sino que sufre secreción y escisión extracelular. CLCA1 extracelular puede inducir MUC5AC expresión a través de la activación de la MAP quinasa MAPK13 (p38δ-MAPK Alevy et al., 2012), aunque aún no se han identificado el presunto receptor CLCA1 y las dianas MAPK13 relevantes. Una segunda vía involucra al inhibidor de proteasa Serpin3a, el ortólogo de ratón de SERPINB3 y SERPINB4 humanas. Estas serpinas son inducidas por IL-13 de una manera dependiente de STAT6 (Ray et al., 2005). Después de la provocación con alérgenos, Serpin3a - / - los ratones tenían menos metaplasia mucosa que los ratones de tipo salvaje (Sivaprasad et al., 2011), a pesar de una respuesta inflamatoria intacta. Estos resultados sugieren que las serpinas inhiben las proteasas que normalmente degradan una o más proteínas necesarias para la metaplasia mucosa, aunque todavía no se conocen las proteasas relevantes y sus sustratos proteicos. Otra vía inducida por IL-13 involucra la enzima 15-lipoxigenasa-1 (15-LO-1 Zhao et al., 2009). 15-LO-1 convierte el ácido araquidónico en ácido 15-hidroxieicosatetraenoico, que ha demostrado mejorar MUC5AC expresión en células epiteliales de las vías respiratorias humanas.

La metaplasia mucosa mediada por IL-13 y STAT6 depende de cambios en la actividad de una red de factores de transcripción. La activación de STAT6 mediada por IL-13 inducida por alérgenos conduce a un aumento de la expresión del factor similar a Ets que contiene el dominio en punta SAM (SPDEF Park et al., 2007 Chen et al., 2009). La inducción de SPDEF depende al menos en parte de FOXM1, un miembro de la familia de factores de transcripción Forkhead box (FOX) (Ren et al., 2013). El programa SPDEF también es importante para la metaplasia mucosa desencadenada por otros estímulos, incluidos los rinovirus (Korfhagen et al., 2012). Aunque SPDEF no parece regular directamente la transcripción del gen de la mucina, SPDEF inicia un programa de transcripción que es necesario y suficiente para inducir la metaplasia mucosa. Uno de los efectos de SPDEF es la inhibición de la expresión de otro gen de la familia FOX, FOXA2. En ratones, la deleción de Foxa2 en precursores de células mucosas es suficiente para inducir metaplasia mucosa, y la sobreexpresión de FOXA2 inhibe la metaplasia mucosa inducida por alérgenos (Zhen et al., 2007 G. Chen et al., 2010). La relación entre IL-13 y FOXA2 es compleja. IL-13 inhibe la expresión de FOXA2, que contribuye a la metaplasia mucosa. Sin embargo, la eliminación de Foxa2 en las células epiteliales de las vías respiratorias durante el desarrollo fetal dio como resultado la inflamación Th2 y la producción de IL-13 en las vías respiratorias (G. Chen et al., 2010). Los objetivos directos que son responsables de estos efectos de FOXA2 aún no se conocen.

La vía del EGFR induce la expresión del gen de la mucina y la metaplasia mucosa.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se une a múltiples ligandos que incluyen EGF, TGF-α, EGF de unión a heparina, anfirregulina, β-celulina y epirregulina. La unión del ligando activa el dominio quinasa EGFR, iniciando cascadas de señalización que son centrales para muchos procesos biológicos fundamentales, incluida la proliferación, diferenciación, supervivencia y migración celular. Los ligandos de EGFR inducen la expresión de MUC5AC en líneas celulares epiteliales de las vías respiratorias humanas y un inhibidor de la tirosina quinasa que inhibe la quinasa EGFR previene la metaplasia mucosa inducida por un ligando de EGFR o por la exposición a alérgenos (Takeyama et al., 1999). Estudios posteriores mostraron que los niveles de EGFR en el epitelio bronquial aumentan en el asma y se correlacionan con la gravedad de la enfermedad (Takeyama et al., 2001a), y que la señalización de EGFR epitelial contribuye a la metaplasia mucosa en un modelo de asma crónica (Le Cras et al., 2011).

Varios estímulos, incluidos productos bacterianos (Kohri et al., 2002 Lemjabbar y Basbaum, 2002 Koff et al., 2008), virus (Tyner et al., 2006 Zhu et al., 2009 Barbier et al., 2012), humo de cigarrillo ( Takeyama et al., 2001b Basbaum et al., 2002) y los productos de células inflamatorias (Burgel et al., 2001) pueden activar la vía EGFR en las células epiteliales de las vías respiratorias. Se ha demostrado que algunos estímulos inician la cascada de señalización de EGFR activando las isoformas de PKC PKC δ y PKC θ, lo que lleva al reclutamiento de las subunidades p47 phox y p67 phox de la NADPH oxidasa a la doble oxidasa-1 asociada a la membrana y la generación de especies reactivas de oxígeno. (ROS) en la superficie celular (Shao y Nadel, 2005). Las ROS, a su vez, activan la enzima convertidora de TGF-α latente, lo que resulta en la escisión de los pro-ligandos de EGFR de superficie (Shao et al., 2003). La unión del ligando EGFR conduce a la activación de la vía Ras-Raf-MEK1 / 2-ERK1 / 2 y MUC5AC inducción transcripcional, que depende del factor de transcripción Sp1 y los sitios de unión a Sp1 dentro del MUC5AC promotor (Takeyama et al., 2000 Perrais et al., 2002). Las vías de IL-13 y EGFR hacen contribuciones críticas pero distintas a la regulación génica en las células epiteliales de las vías respiratorias (Zhen et al., 2007). Ambas vías inhiben la expresión de FOXA2, lo que sugiere que este factor de transcripción puede representar una vía común final para la metaplasia mucosa inducida por IL-13 y EGFR.

La señalización de Notch regula la diferenciación de las células mucosas.

La señalización de la muesca también es importante para la metaplasia mucosa (Tsao et al., 2011). Notch es un receptor transmembrana que se une a ligandos de la superficie celular en las familias tipo Delta y Jagged. La unión del ligando activa la escisión proteolítica mediada por la γ-secretasa y libera el dominio intracelular de Notch, que ingresa al núcleo, se asocia con factores de transcripción e impulsa la expresión de genes Notch cadena abajo. La manipulación genética de la señalización de Notch en ratones tiene diferentes efectos según la etapa de desarrollo. En pulmones embrionarios explantados, la adición de ligando Notch o la expresión de una forma constitutivamente activa de Notch aumentó las células mucosas que contienen MUC5AC, mientras que un inhibidor de la γ-secretasa redujo las células mucosas (Guseh et al., 2009). La metaplasia mucosa inducida por Notch no requirió la activación de STAT6, lo que sugiere que las vías Notch y STAT6 pueden operar en paralelo. Por el contrario, en el pulmón de ratón posnatal, las alteraciones de la señalización de Notch indujeron la metaplasia mucosa (Tsao et al., 2011), un proceso que depende principalmente del ligando de Notch Jagged1 (Zhang et al., 2013). El objetivo de Notch Hes1 parece ser crítico para la inhibición de la metaplasia mucosa y MUC5AC transcripción, aunque la inactivación de Hes1 no fue suficiente para inducir la metaplasia mucosa (Ou-Yang et al., 2013). La observación de que un inhibidor de la γ-secretasa redujo la metaplasia mucosa inducida por IL-13 en células epiteliales de las vías respiratorias humanas cultivadas (Guseh et al., 2009) sugiere que se justifica prestar más atención al papel de la señalización de Notch epitelial en el asma.

La vía secretora en las células mucosas.

Los monómeros de mucina son proteínas grandes (alrededor de 5000 residuos de aminoácidos) que requieren un procesamiento extenso en el RE y el aparato de Golgi. Cada monómero de mucina contiene aproximadamente 200 residuos de cisteína que pueden participar potencialmente en enlaces disulfuro intra e intermoleculares. El RE de las células mucosas contiene moléculas especializadas que no se expresan ampliamente en otros tipos de células y son necesarias para el procesamiento eficaz de las mucinas. Uno de ellos es el homólogo del gradiente anterior 2 (AGR2), un miembro de la familia de la proteína disulfuro isomerasa. Un residuo de cisteína del sitio activo en AGR2 forma enlaces disulfuro mixtos con mucinas en el RE y los ratones deficientes en AGR2 tienen profundos defectos en la producción de mucina intestinal (Park et al., 2009). En un modelo de ratón de asma alérgica, los ratones deficientes en AGR2 habían reducido la producción de moco en comparación con los ratones de tipo salvaje desafiados con alérgenos (Schroeder et al., 2012). La reducción en la producción de moco se asoció con la activación de la respuesta de la proteína desplegada, una respuesta característica al estrés ER (Walter y Ron, 2011). Por lo tanto, AGR2 puede tener un papel directo en el plegamiento de la mucina u otra función necesaria para mantener la función normal del RE de las células mucosas. Otra molécula que se encuentra en el RE de células mucosas es la enzima 1β que requiere inositol (IRE1β), un sensor de estrés del RE transmembrana. IRE1β se encuentra en las células productoras de moco en el intestino y las vías respiratorias, pero no en otras células. IRE1β regula la transcripción de AGR2, y los ratones deficientes en IRE1β tenían una expresión de AGR2 reducida y una producción alterada de mucina en las vías respiratorias en un modelo de asma alérgica (Martino et al., 2013). Aparentemente, AGR2 e IRE1β han evolucionado para satisfacer las demandas inusuales planteadas por la necesidad de producir grandes cantidades de mucinas.

ORMDL3, un miembro de la familia Orm de proteínas ER transmembrana, también se ha implicado en el asma. Polimorfismos genéticos en loci cercanos a ORMDL3 se asociaron fuertemente con el asma en múltiples estudios de asociación de todo el genoma (Moffatt et al., 2007 Galanter et al., 2008). El desafío de alérgenos indujo la expresión de ORMDL3 en las células epiteliales de las vías respiratorias de una manera dependiente de STAT6, aunque ORMDL3 no parece ser un objetivo directo de STAT6 (Miller et al., 2012). Los estudios que involucran la sobreexpresión o la eliminación de ORDML3 en células HEK293 indican que ORMDL3 está involucrado en la regulación de las respuestas al estrés del ER y la señalización de calcio mediada por ER (Cantero-Recasens et al., 2010). Además, las proteínas Orm forman complejos con la serina palmitoil-CoA transferasa (SPT), la primera enzima que limita la velocidad en la producción de esfingolípidos y, por lo tanto, pueden ayudar a coordinar el metabolismo de los lípidos en la vía secretora (Breslow et al., 2010). Las reducciones genéticas y farmacológicas en la actividad de SPT indujeron hiperreactividad de las vías respiratorias en ausencia de inflamación o metaplasia mucosa (Worgall et al., 2013). Se necesitan más estudios para determinar si el papel de ORMDL3 en la modulación de la producción de esfingolípidos, el estrés del RE, la señalización del calcio u otras funciones del RE en las células epiteliales de las vías respiratorias u otras células es importante en el asma.

Las mucinas viajan desde el ER al Golgi y luego se empaquetan en grandes gránulos para su secreción. En el Golgi, las mucinas se encuentran ampliamente O-glicosilada y se somete a una multimerización adicional antes de ser liberada de la célula por exocitosis regulada. En las vías respiratorias de los ratones normales y en las vías respiratorias distales (más pequeñas) de los seres humanos, la secreción basal es responsable de la mayor parte de la liberación de mucina, y las células productoras de mucina retienen muy poca mucina para detectarla mediante tinciones histológicas. Sin embargo, las células mucosas que se encuentran en las vías respiratorias más grandes de los seres humanos y los ratones expuestos a alérgenos contienen acumulaciones fácilmente detectables de gránulos que contienen mucina que pueden ser liberados por diversos estímulos, incluido el P2Y2 ligandos del receptor ATP y UTP y proteasas que escinden los receptores activados por proteasas. Los ratones que carecen de la proteína de cebado exocítica Munc13-2 acumulan mucina en las células secretoras que normalmente tienen mucina intracelular mínima (células club) pero pueden secretar mucina en respuesta a la estimulación (Zhu et al., 2008). Por el contrario, los ratones expuestos a alérgenos que carecen del sensor de calcio de baja afinidad sinaptotagmina-2 tienen un defecto grave en la secreción de mucina de las vías respiratorias estimulada por agonistas agudos, pero han conservado la secreción basal y no acumulan mucinas en las células del club (Tuvim et al., 2009) . La secreción estimulada por agonistas también depende del canal de cloruro activado por calcio inducible por IL-13 TMEM16A, que aumenta en las células mucosas de individuos con asma (Huang et al., 2012). Debido a que el aumento de la producción de MUC5AC a través de la sobreexpresión transgénica no fue en sí mismo suficiente para causar obstrucción de las vías respiratorias (Ehre et al., 2012), parece probable que los defectos cualitativos en el procesamiento, secreción o hidratación de la mucina que afectan las propiedades fisicoquímicas del moco contribuyan a la obstrucción de las vías respiratorias. obstrucción en el asma. El transporte epitelial de agua e iones, incluidos H + y bicarbonato, es importante para mantener las propiedades normales del moco (E. Chen et al., 2010 Paisley et al., 2010 Garland et al., 2013). La secreción rápida de mucina almacenada, que no está completamente hidratada, puede resultar en la formación de moco gomoso concentrado que no puede ser eliminado normalmente por los cilios o tosiendo (Fahy y Dickey, 2010). Por lo tanto, la IL-13 (Danahay et al., 2002 Nakagami et al., 2008) y otros mediadores del asma que afectan el transporte de iones y agua de las células epiteliales de las vías respiratorias podrían contribuir a la obstrucción de las vías respiratorias al alterar las propiedades fisicoquímicas del moco.

Estructura y función de las células ciliadas en el asma

En comparación con la extensa literatura sobre el asma con respecto a las células mucosas, relativamente pocos informes se han centrado en las células ciliadas. Un estudio de tiras de células epiteliales obtenidas mediante cepillado endobronquial encontró una disminución de la frecuencia de los latidos ciliares y aumentos en los patrones anormales de latidos ciliares y defectos ultraestructurales de los cilios en individuos con asma en comparación con controles sanos (Thomas et al., 2010). Estas anomalías fueron más pronunciadas en el asma grave. Las anomalías ciliares se acompañaron de aumentos en el número de células muertas y evidencia de pérdida de la integridad estructural del epitelio, lo que sugiere que la disfunción ciliar puede ser una consecuencia de una lesión epitelial generalizada. En cualquier caso, estos resultados sugieren que la disfunción ciliar podría ser un contribuyente importante a la alteración del aclaramiento mucociliar en el asma.

Biología celular del músculo liso de las vías respiratorias en el asma

El estrechamiento excesivo de las vías respiratorias que puede provocar falta de aire grave, insuficiencia respiratoria y muerte por asma se debe en gran parte a la contracción de las bandas de músculo liso presentes en las paredes de las vías respiratorias conductoras de tamaño grande y mediano en el pulmón. En las grandes vías respiratorias centrales de los seres humanos, estas bandas de músculo están presentes en la porción posterior de las vías respiratorias y se unen a los anillos de cartílago de las vías respiratorias anteriores, pero en las vías respiratorias más periféricas, el músculo liso está presente circunferencialmente alrededor de las vías respiratorias. En ambos lugares, la contracción del músculo liso, que puede ser inducida fisiológicamente por la liberación de acetilcolina de los nervios parasimpáticos eferentes o por la liberación de histamina y cisteinil leucotrienos de los mastocitos y basófilos, causa el estrechamiento de las vías respiratorias, con el estrechamiento más extenso en las vías respiratorias de tamaño mediano. . En mamíferos sanos, incluidos los seres humanos, las respuestas fisiológicas a la liberación de acetilcolina de los nervios eferentes o la liberación de histamina y leucotrienos de los mastocitos y basófilos provocan sólo un estrechamiento leve y generalmente asintomático de las vías respiratorias. Los mamíferos normales también son generalmente resistentes al estrechamiento marcado de las vías respiratorias en respuesta a la administración farmacológica de altas concentraciones de estos agonistas contráctiles directamente en las vías respiratorias. Sin embargo, las personas con asma tienen un marcado aumento en la sensibilidad a todos estos agonistas que puede demostrarse fácilmente por aumentos dramáticos en la resistencia de las vías respiratorias y caídas asociadas en las tasas de flujo de aire espiratorio máximo durante las maniobras espiratorias forzadas (Boushey et al., 1980). Las comparaciones recientes entre las respuestas a los alérgenos inhalados en sujetos alérgicos asmáticos y otros sujetos con respuestas inmunitarias cutáneas igualmente graves a los alérgenos dejan en claro que todos los seres humanos alérgicos liberan cantidades muy similares de broncoconstrictores en las vías respiratorias (es decir, histamina y leucotrienos), pero solo los asmáticos desarrollan estrechamiento exagerado de las vías respiratorias en respuesta a estos mediadores (Becky Kelly et al., 2003).

Mecanismos que regulan la generación de fuerza por acoplamiento actina-miosina del músculo liso de las vías respiratorias

La generación de fuerza por el músculo liso de las vías respiratorias está mediada por interacciones entre actina y miosina que dependen de la fosforilación de la cadena ligera de miosina por la serina-treonina quinasa, cadena ligera de miosina quinasa (Fig. 3). Este proceso está regulado negativamente por la miosina fosfatasa. Los aumentos en la concentración de calcio intracelular en las células del músculo liso inducen la contracción por dos vías paralelas. Cuando se une al calcio, la serina-treonina quinasa calmodulina fosforila directamente y, por lo tanto, activa la miosina quinasa de cadena ligera. El aumento de calcio también aumenta la carga de GTP de la GTPasa, RhoA, que aumenta la actividad de sus quinasas efectoras descendentes, las proteínas quinasas 1 y 2 que contienen espirales en espiral asociadas a Rho (ROCK 1 y 2). Las ROCK fosforilan directamente la fosfatasa de cadena ligera de miosina, un efecto que inactiva la fosfatasa, lo que mejora aún más la fosforilación de miosina. RhoA también se puede activar independientemente de los aumentos en el calcio intracelular.

Existen múltiples vías ascendentes para aumentar el i [Ca] en el músculo liso de las vías respiratorias. La acetilcolina, liberada por los nervios eferentes parasimpáticos posganglionares que inervan el músculo, activa los receptores muscarínicos M2 acoplados a la proteína G, que están acoplados a Gαq. Gαq cargado con GTP activa su efector aguas abajo, PLCβ, que fosforila PIP2 para generar IP3. IP3, a su vez, se une a los receptores IP3 en el retículo sarcoplásmico para desencadenar la translocación del calcio al citosol. Otros agonistas contráctiles, como histamina, bradicinina y serotonina (5-HT, los agonistas y receptores específicos varían entre las especies de mamíferos) se unen a diferentes receptores acoplados a proteína G para desencadenar la misma vía. La contracción del músculo liso de las vías respiratorias inducida por agonistas generalmente se asocia con oscilaciones cíclicas en i [Ca], que se cree que son inducidas por cambios locales en el calcio citosólico que desencadenan la recaptación de calcio por el retículo sarcoplásmico, y la magnitud de la fuerza contráctil inducida está más estrechamente relacionada con la frecuencia de estas oscilaciones de calcio en lugar de su amplitud (Bergner y Sanderson, 2002).

Los aumentos en la concentración de calcio citosólico también pueden ser inducidos por un influjo de calcio desde el espacio extracelular, generalmente debido a la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje en la membrana plasmática. Estos canales pueden abrirse experimentalmente aumentando la concentración extracelular de iones de potasio, lo que también induce la contracción del músculo liso de las vías respiratorias. El aumento de las concentraciones de potasio extracelular también aumenta la liberación de acetilcolina de los nervios eferentes posganglionares, por lo que la interpretación adecuada de los efectos del KCl requiere la adición simultánea de un antagonista muscarínico como la atropina.

Regulación de la generación de fuerza del músculo liso de las vías respiratorias mediante complejos de adhesión que contienen integrinas

Para que la contracción de las células del músculo liso se traduzca en la fuerza necesaria para el estrechamiento de las vías respiratorias, la célula del músculo liso en contracción debe estar firmemente sujeta al ECM subyacente. El enlace con la ECM se logra mediante la organización de complejos de múltiples proteínas nucleados por integrinas. Los dominios citoplasmáticos cortos de las integrinas pueden organizar máquinas de múltiples proteínas sorprendentemente grandes que modulan múltiples vías de señalización y unen las integrinas (y por lo tanto sus ligandos ECM) al citoesqueleto de actina-miosina (Yamada y Geiger, 1997 Zaidel-Bar et al., 2007) . Muchos de los agonistas contráctiles que estimulan la fosforilación de miosina y la interacción actina-miosina mejoran simultáneamente la formación de complejos de señalización de integrina, inducen la polimerización de actina en los sitios de adhesión y fortalecen el acoplamiento entre el citoesqueleto de actina-miosina y la ECM (Mehta y Gunst, 1999 Tang et al., 1999, 2003 Gunst y Fredberg, 2003 Gunst et al., 2003 Opazo Saez et al., 2004). Estos eventos también parecen ser bastante importantes para la generación de la fuerza contráctil máxima porque las intervenciones que inhiben la formación o la actividad de los complejos de adhesión pueden inhibir la fuerza de la contracción sin afectar la fosforilación de la miosina (Mehta y Gunst, 1999 Tang et al., 2003 Opazo Saez et al. al., 2004).

Lecciones del comportamiento anormal del músculo liso de las vías respiratorias en modelos animales

Ratones que carecen de integrina α9β1 en el músculo liso de las vías respiratorias.

Aunque existen grandes diferencias entre la organización de las vías respiratorias en ratones y humanos, las anomalías in vivo en el estrechamiento de las vías respiratorias observadas en modelos de ratón proporcionan una idea de las vías que potencialmente contribuyen a la contracción anormal del músculo liso de las vías respiratorias en el asma. Para los propósitos de esta revisión, citaremos tres ejemplos ilustrativos. La integrina α9β1 se expresa en gran medida en el músculo liso de las vías respiratorias (Palmer et al., 1993). La desactivación condicional de la subunidad de la integrina α9 (que se encuentra únicamente en la integrina α9β1) da como resultado un aumento espontáneo de la capacidad de respuesta de las vías respiratorias in vivo (medida por los aumentos de la resistencia pulmonar en respuesta a la acetilcolina intravenosa) y un aumento de las respuestas contráctiles a los agonistas colinérgicos de ambos. vías respiratorias en cortes de pulmón y anillos traqueales estudiados en un baño de órganos (Chen et al., 2012). Curiosamente, aunque los anillos traqueales de estos ratones también tienen respuestas contráctiles aumentadas a otros agonistas del receptor acoplado a proteína G (p. Ej., Serotonina), tienen respuestas contráctiles normales a la despolarización con KCl. Estos hallazgos sugieren que la pérdida de α9β1 aumenta la capacidad de respuesta de las vías respiratorias en algún paso antes de la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico (Fig. 4 A). En este caso, el aumento de la capacidad de respuesta de las vías respiratorias parece deberse a la pérdida de la co-localización de la enzima que cataboliza las poliaminas espermidina / espermina N1-acetiltransferasa (SSAT), que se une directamente al dominio citoplásmico α9 (Chen et al., 2004), y la lípido quinasa, PIP5K1γ, que se une directamente a la talina, un socio de unión de la subunidad β1 de la integrina. La espermina y la espermidina son cofactores críticos para PIP5K1γ, por lo que su yuxtaposición con SSAT reduce eficazmente la actividad enzimática. PIP5K1γ convierte PI4P en PIP2 y es responsable de la mayor parte de la PIP2 producida en las células del músculo liso de las vías respiratorias (Chen et al., 1998). PIP2 es el sustrato para la generación de IP3 por PLCβ, por lo que cuando α9β1 está presente y ligado, los agonistas contráctiles que activan los receptores acoplados a Gαq inducen menos generación de IP3 (Chen et al., 2012) y, por lo tanto, menos liberación de Ca 2+ a través de los receptores IP3 en el retículo sarcoplásmico. La importancia de esta vía fue confirmada por las observaciones de que la frecuencia de las oscilaciones de Ca 2+ inducidas por agonistas colinérgicos se redujo en cortes de pulmón de ratones que carecen de α9β1, y que todas las anomalías en el músculo liso de estos animales podrían rescatarse mediante la adición de una forma de PIP2 permeable a las células (Chen et al., 2012).

Efectos de las citocinas de células T sobre la contractilidad del músculo liso de las vías respiratorias.

Varios estudios realizados durante los últimos 15 años han sugerido que las citocinas liberadas por las células T pueden contribuir a la hiperreactividad de las vías respiratorias en el asma alérgica (Locksley, 2010). La citocina Th2 IL-13 se ha estudiado más extensamente y puede inducir tanto metaplasia mucosa como hiperreactividad de las vías respiratorias cuando se administra directamente en las vías respiratorias de ratones (Grünig et al., 1998 Wills-Karp et al., 1998). In vitro, la incubación de anillos traqueales o cortes pulmonares aumenta el estrechamiento de las vías respiratorias en cortes pulmonares y aumenta la generación de fuerza por los anillos traqueales del ratón, al menos en parte al inducir un aumento dramático en la expresión de la pequeña GTPasa, RhoA (Chiba et al., 2009 ), que es un efector crítico de la contracción del músculo liso de las vías respiratorias (Fig. 4 B). La provocación crónica con alérgenos o la administración directa de IL-13 en las vías respiratorias de ratones también aumentó la expresión de RhoA, en asociación con la inducción de hiperreactividad de las vías respiratorias. Un estudio reciente sugirió que la IL-17 también puede aumentar la contractilidad del músculo liso de las vías respiratorias y el estrechamiento de las vías respiratorias mediante la inducción de RhoA en las células del músculo liso de las vías respiratorias (Kudo et al., 2012). En ese estudio, los ratones que carecen de la integrina αvβ8 específicamente en las células dendríticas presentadoras de antígenos fueron protegidos de la hiperreactividad de las vías respiratorias inducida por alérgenos. Estos ratones tenían el mismo grado de inflamación general de las vías respiratorias y metaplasia mucosa en respuesta al alérgeno que los ratones de control de tipo salvaje, pero tenían un defecto muy específico en la generación de células Th17 específicas de antígeno, una fuente importante de IL-17 en los pulmones ( Kudo et al., 2012). In vitro, se demostró que la IL-17 aumenta directamente la contractilidad de los anillos traqueales del ratón y aumenta los niveles de la proteína RhoA y su efector aguas abajo, ROCK2, y aumenta la fosforilación del objetivo directo de ROCK, la miosina fosfatasa. La fosforilación de la miosina fosfatasa inhibe su función, y también se demostró que la IL-17 aumenta en consecuencia la fosforilación de la cinasa de cadena ligera de miosina. Es importante destacar que todos estos efectos bioquímicos se indujeron de forma espectacular in vivo en el músculo liso de las vías respiratorias de los ratones de control en respuesta a la sensibilización al alérgeno y al desafío, pero todos se redujeron notablemente en los ratones que carecían de αvβ8 en las células dendríticas. Además, los anillos traqueales extraídos de estos ratones knockout después de la exposición al alérgeno habían disminuido la contractilidad in vitro en comparación con los anillos de los ratones de control expuestos al alérgeno, pero esta diferencia en la contractilidad se eliminó mediante la adición exógena de IL-17. Estos hallazgos sugieren fuertemente que tanto la IL-13 como la IL-17 pueden contribuir a la hiperreactividad de las vías respiratorias induciendo directamente la expresión de RhoA en el músculo liso de las vías respiratorias (Fig. 4 B). Se ha demostrado que el factor de necrosis tumoral α, también implicado en la patogénesis del asma, aumenta la contractilidad del músculo liso de las vías respiratorias mediante un mecanismo similar (Goto et al., 2009).

Contracción mejorada del músculo liso de las vías respiratorias mediada por citocinas en ratones deficientes en MFGE8.

El factor 8 de EGF del glóbulo de grasa de la leche (MFGE8) es una proteína secretada compuesta por dos repeticiones de EGF y dos dominios de discoidina. MFGE8 se describió originalmente para facilitar la captación de células apoptóticas por fagocitos (Hanayama et al., 2004). Los ratones que carecen de MFGE8 tienen una función y una morfología pulmonar basales normales, pero tienen una respuesta exagerada de las vías respiratorias después de la sensibilización y exposición a alérgenos (Kudo et al., 2013). Sin embargo, esta anomalía no pareció estar relacionada con ningún efecto sobre la recaptación de células apoptóticas. La inmunotinción demostró que la MFGE8 secretada se concentraba junto al músculo liso de las vías respiratorias. Los anillos traqueales extraídos de los ratones knockout para MFGE8 tenían respuestas contráctiles normales al inicio del estudio, pero tenían respuestas contráctiles notablemente mejoradas después de la incubación durante la noche con IL-13, y este aumento en la contractilidad podría rescatarse mediante la adición de MFGE8 recombinante al baño muscular. Es importante destacar que el rescate requirió la presencia de al menos uno de los dominios de discoidina y del motivo RGD de unión a integrina de la segunda repetición de EGF. En los anillos traqueales de ratón y el músculo liso de las vías respiratorias cultivado, la pérdida de MFGE8 mejoró en gran medida el aumento de la proteína RhoA inducido por IL-13. Estos hallazgos sugieren que la ligadura de una o más integrinas que se unen a RGD en el músculo liso de las vías respiratorias por MFGE8 extracelular normalmente sirve como freno en la inducción de RhoA mediada por citocinas y, por lo tanto, limita la hiperreactividad máxima de las vías respiratorias inducida por citocinas (figura 4 B). La o las integrinas específicas implicadas en esta respuesta, los mecanismos moleculares que unen la ligadura de la integrina con la inhibición de RhoA, y el papel y los socios de unión de los dominios de discoidina MFGE8 que se requieren para la inhibición de RhoA quedan por determinar.

Conclusiones

Se ha avanzado rápidamente en la identificación de las moléculas y las vías de las células epiteliales y del músculo liso que pueden producir muchas de las anomalías que se encuentran en las personas con asma. Debido a que estos descubrimientos se realizaron en diversos sistemas experimentales, todavía nos enfrentamos a grandes desafíos para comprender cómo estas moléculas y vías interactúan in vivo y para identificar las vías que son más relevantes en las personas con asma. El asma es una enfermedad heterogénea, y los avances recientes hacia la identificación de subtipos con distintos mecanismos fisiopatológicos prometen centrar la atención en ciertas vías en las células epiteliales y del músculo liso (Lötvall et al., 2011). Será especialmente importante comprender los mecanismos que subyacen al asma grave. Aproximadamente del 5 al 10% de las personas con asma tienen una enfermedad grave, con síntomas que persisten a pesar del tratamiento estándar con broncodilatadores y corticosteroides inhalados (Brightling et al., 2012). Estas personas tienen altas tasas de exacerbaciones del asma que conducen a la hospitalización y tienen un riesgo relativamente alto de sufrir ataques de asma mortales. La atención continua al estudio de la biología celular del asma será crucial para generar nuevas ideas para la prevención y el tratamiento del asma basados ​​en la normalización de la función del músculo liso y epitelial.


Resultados y discusión

Dado que nuestro conocimiento sobre la alergia al maní se ha limitado a las especies de cultivos y sus dos ancestros genómicos, y considerando los hallazgos de que las sustituciones de un solo aminoácido podrían tener un impacto sustancial en la alergenicidad [14, 31, 32], es pertinente explorar un solo aminoácido sustituciones en las especies silvestres de Arachis y evaluar su impacto sobre la alergenicidad. Para ello, secuenciamos los dos alérgenos inmunodominantes Ara h 2 y Ara h 6 de 24 especies que representan los principales linajes en Arachis y utilizó múltiples enfoques para caracterizar las alteraciones moleculares y determinar su impacto sobre la alergia. Han surgido tres resultados sorprendentes de este estudio. Uno, los dos alérgenos homólogos estudiados, Ara h 2 y Ara h 6, siguió caminos evolutivos muy contrastantes. Específicamente, Ara h 2 ha sufrido una mayor proporción de sustituciones de aminoácidos en comparación con Ara h 6 y ha acumulado, con mucho, un mayor número de pérdidas y ganancias de motivos que van de 1 a 24 aminoácidos (Fig. S1). Dos, y muy importante, estas alteraciones moleculares se concentraron principalmente en las regiones ricas en epítopos inmunodominantes, específicamente en los Epítopos 6 y 7 (Fig. 2, Fig. S1). Tres, los eventos mutacionales (sustituciones e inserciones / deleciones) particularmente en Ara h 2 parecen seguir las tendencias filogenéticas desde la base de la Arachis árbol a las ramas terminales.Estos hallazgos plantean preguntas sobre los factores subyacentes que afectaron de manera diferente Ara h 2 y Ara h 6 modos de evolución y si tales alteraciones moleculares están relacionadas con una posible acentuación de la alergenicidad. Para abordar esta curiosa situación biológica, compararemos los dos homólogos en varios niveles moleculares y discutiremos los hallazgos en un marco filogenético / evolutivo.

Los espacios y epítopos están etiquetados. Los números sobre las columnas indican posiciones de alineación.

Composición molecular comparativa en todo el género Arachis

Uno de los hallazgos destacados de este estudio es que Ara h 2 y Ara h 6 homólogos de wild Arachis las especies difieren sustancialmente en patrones mutacionales y longitud de ORF. Para arrojar luz sobre los factores subyacentes que podrían explicar estas diferencias y evaluar el impacto de este modo de evolución contrastante en estas proteínas, evaluamos las composiciones moleculares en dos niveles: niveles de nucleótidos y aminoácidos. Las composiciones de nucleótidos para todos los ORF de Ara h 2 y Ara h 6 los homólogos así como las frecuencias de nucleótidos por posición de codón se presentan en la Fig. 3. En general, los dos homólogos no difirieron significativamente en su composición de nucleótidos en todo el género ya que la prueba t rechazó la hipótesis nula. Esto subraya las limitaciones notables en su modo de sustituciones de nucleótidos para mantener composiciones similares.

Porcentajes promedio de relaciones de adenina (A), timina (T), guanina (G), citosina y GC. Se realizaron cálculos para secuencias de ADN generales y posiciones de codones individuales de Ara h 2 y Ara h 6 de la especie Arachis. Las notaciones 1, 2 y 3 denotan las posiciones del codón 1ª, 2ª y 3ª. Los datos se presentan como media ± DE. Se aplicó un ANOVA de dos vías con post-test de Sidak. Los dos homólogos no fueron estadísticamente diferentes en la composición de nucleótidos.

Se ha demostrado que un mayor contenido de GC se correlaciona positivamente con las tasas de sustituciones [62, 63]. Un estudio reciente centrado en A. duranensis estimó un contenido medio de GC del 31,8% para todo el genoma, lo que coincide con la mayoría de las leguminosas examinadas [9]. La proporción global de GC para ambos homólogos fue muy similar (Ara h 2 = 55.7± 0.8 Ara h 6 = 56,1 ± 0,5, (figura 3). El contenido medio de GC del 56% de Ara h 2 y Ara h 6, siendo sustancialmente superior (75%) a lo informado para el conjunto A. duranensis El genoma apunta a un paisaje genético adecuado para tasas aceleradas de mutaciones en ambos. Sin embargo, la frecuencia de sustituciones de aminoácidos se mantuvo más baja en Ara h 6. Una diferencia notable es que Ara h 2 exhibió proporciones de GC relativamente más altas en sus posiciones de codón 1ª y 2ª en contraste con Ara h 6 (Fig. 3). Esta diferencia puede explicar en parte las elevadas sustituciones de aminoácidos en Ara h 2 dado que las mutaciones en las posiciones de codón 1ª y 2ª se traducen en sustituciones no sinónimas del 96% y 100%, respectivamente, en comparación con el 31% de la 3ª posición [64].

Los dos homólogos, aunque son altamente alergénicos, muestran disparidad en su número y modos de sustituciones de aminoácidos (Fig. 4, Fig. S1). Identidades recíprocas de secuencias de aminoácidos para Ara h 2 a través de Arachis especies variaban entre 65,5% a 99,4% (media 89,4% ± 8,2) en comparación con 75,7% -99,3% para Ara h 6 (media 93,2% ± 5,3), lo que subraya la mayor frecuencia de sustituciones en el primero. En el caso de Ara h 2, la longitud del ORF varía de 156 a 181 aminoácidos (Tabla S1). La alineación de aminoácidos de Ara h 2 requirió la inserción de 17 espacios que van de 1 a 29 aminoácidos, lo que resultó en 203 posiciones de alineación (Fig. S1). Es importante destacar que las posiciones de aminoácidos 59-90 en el epítopo 5 y los epítopos inmunodominantes 6, 7 y el 7b recientemente reconocido muestran sustituciones de residuos y pérdidas / ganancias que pueden afectar potencialmente la alergenicidad (Fig. 2). Se identifican y etiquetan Trece espacios en el sector que incluye los epítopos 6, 7 y 7b A-L (Fig. 2). La mutación en la posición 64 presenta un marcador molecular para la ascendencia genómica del cultivo tetraploide, ya que es una glicina (G) en las tres accesiones de A. ipaensis y ácido glutámico (E) en todos A. hipogaea y A. duranensis accesiones (Fig 2).

Se aplicó un ANOVA de dos vías con post-test de Sidak. Todos los datos se presentan como media ± DE. * p & lt 0.05, ** p & lt 0.01, *** p & lt 0.001, **** p & lt0.0001.

los Ara h 6 En comparación, el ORF mostró un rango más estrecho de residuos de aminoácidos en todo el género, 145 a 147 (Tabla S1). Solo se requirieron dos espacios de secuencia para la alineación, correspondientes a una metionina en la posición 22 y una arginina en la posición 69 (Fig. S1). Curiosamente, este aparente codón de iniciación en marco en la posición 22 evolucionó en especies que emergieron después de la divergencia temprana A. triseminata, A. paraguariensis y A. macedoi. Este residuo de metionina no podría considerarse como un codón de iniciación alternativo, ya que se encuentra aguas abajo de la región del péptido señal. Las diferencias de aminoácidos restantes se debieron a reemplazos, lo que subraya los patrones contrastantes de evolución experimentados por Ara h 2 y Ara h 6 en todo el género. La pérdida / ganancia poco frecuente de residuos de aminoácidos en Ara h 6 a través del género Arachis comparado con Ara h 2 es intrigante y podría atribuirse a limitaciones estructurales / funcionales de esta proteína alergénica.

Evaluar la heterogeneidad potencial en la composición de aminoácidos en Arachis historia evolutiva del género debido a los eventos mutacionales notados, analizamos las composiciones de aminoácidos del Ara h 2 y Ara h 6 homólogos. Los dos eran comparables en composición de aminoácidos en todo el género, y eran bajos en triptófano (W) y altos en arginina (R) y glutamina (Q) (Fig. 4 y Tabla S2). Estos hallazgos están de acuerdo con estudios previos sobre maní [65]. Faltaba triptófano Ara h 2 de tres especies y el Ara h 6 de 14 especies (Tabla S2). Se observa que Ara h 2 acomodó una mayor variación en todo el género Arachis en glutamina (Q), prolina (P) y aspartato (D), mientras que Ara h 6 mostró una mayor variación en glutamato (E), histidina (H) y arginina (R) (Figura S2 y Tabla S2). A pesar de los patrones contrastantes de variabilidad, los dos homólogos son similares en composición en términos de los cinco grupos fisicoquímicos de aminoácidos y son ricos en aminoácidos hidrófobos y bajos en aminoácidos aromáticos (Fig. 5). Por lo tanto, los eventos mutacionales en los dos homólogos parecen estar limitados a mantener la composición de los grupos fisicoquímicos con el fin de conservar la integridad funcional y estructural de estas proteínas.

Las medias, las desviaciones estándar (indicadas como barras) y los valores p estadísticos para la significación de la diferencia se calcularon en Graphpad Prism. Se aplicó un ANOVA de dos vías con post-test de Sidak. Los dos homólogos no fueron estadísticamente diferentes en las composiciones de cadenas laterales.

La naturaleza hidrofóbica de la proteína es importante para la funcionalidad de los péptidos señal de estos alérgenos [30]. Ara h 2 y Ara h 6 se sintetizan en el citoplasma como proteínas precursoras con un péptido señal de aminoácido N-terminal adicional necesario para el transporte a las vacuolas [19, 30, 66]. Los péptidos señal (residuos de aminoácidos 1 a 7 [29] o residuos 1 a 21 [67] contienen espacios de 2 residuos en Ara h 2 y mostrar una serie de sustituciones en ambos Ara h 2 y Ara h 6 (Figura 6 y Figura S1). A pesar de estas mutaciones, la región permaneció muy restringida para mantener la propiedad fisicoquímica hidrófoba requerida para su función crucial (Fig. S1). En resumen, aunque las dos proteínas alergénicas han experimentado patrones contrastantes de sustituciones de aminoácidos y pérdidas / ganancias a lo largo de la historia evolutiva del género, mantuvieron una composición de aminoácidos y grupos fisicoquímicos comparables.

Se muestra una distribución por codón de mutaciones sinónimas (rojo), mutaciones no sinónimas (gris) e indeles (azul). Los epítopos de unión a IgE se destacan debajo de los residuos de aminoácidos. 5A. Homólogo de Ara h 2. 5B. Homólogo de Ara h 6.

Firmas de selección natural en Ara h 2 y Ara h 6

Los patrones mutacionales contrastantes observados en Ara h 2 y Ara h 6 (Figuras 4 y 6, Figura S1) plantean la pregunta de si estos modos evolutivos están impulsados ​​por la selección natural, la diversificación positiva o la purificación negativa. La evaluación de las firmas de la selección natural que operan en la codificación de regiones genómicas es un desafío importante. Murrell y col. (2015) [45] señaló que todavía no existe una forma indiscutible de responder a la pregunta de si un gen evolucionó bajo selección positiva. Los factores subyacentes que contribuyen a las dificultades para determinar la firma de selección positiva incluyen patrones intrínsecos de sustituciones de genes, suposiciones biológicas realizadas y modelos utilizados. Evaluar posibles firmas de selección natural que actúan sobre Ara h 2 y Ara h 6, dadas las diferencias prominentes en los patrones mutacionales, seleccionamos y contrastamos los resultados de tres métodos independientes (basados ​​en la distancia, BUSTED y FUBAR) que adoptan diferentes supuestos biológicos y usan métricas para la estimación de genes completos o específicos del sitio de las firmas de selección natural.

Uno de los métodos más sencillos es el de Nei y Gojobori (1986) [43] que se centra en la detección de la selección natural utilizando las tasas de sustituciones sinónimos frente a no sinónimos en genes codificadores de proteínas. Los algoritmos calculan la varianza y covarianza de mutaciones dS (sinónimas) y dN (no sinónimas) y las proporciones de diferencias sinónimas (pS) y no sinónimas (pN). Usando SNAP para estos cálculos, los promedios de todas las comparaciones por pares para el Ara h 2 El conjunto de datos mostró dS = 0.0142, dN = 0.0475, dS / dN = 0.3319 y pS / pN = 0.3379. En contraste, el Ara h 6 El conjunto de datos reveló dS = 0.0831, dN = 0.0247, dS / dN = 5.8627 y pS / pN = 5.5914. El 0.332 dS / dN para Ara h 2 implica que ha experimentado una selección positiva a lo largo de la historia evolutiva del género, mientras que los 5.863 dS / dN calculados para Ara h 6 indica selección purificadora. Un valor de dS / dN por debajo de 1 implica una selección positiva / diversificadora, mientras que por encima de 1 significa una selección de purificación (La salida SNAP se presenta como dS / dN no dN / dS). BUSTED, un método centrado en la selección positiva y en todo el gen, informó evidencia de una selección de diversificación episódica en todo el gen en Ara h 2 a través de las ramas de la filogenia (pag = 0,005 ≤ 0,05) pero no hay evidencia de selección diversificadora episódica en Ara h 6 (pag-valor = 0,151 ≥ 0,05). Por lo tanto, el hallazgo BUSTED está de acuerdo con el enfoque de Nei y Gojobori (1986), y ambos muestran que Ara h 2 está experimentando una selección positiva. Ara h 6, por otro lado, se mostró bajo selección purificadora utilizando el enfoque de Nei y Gojobori (1986) (pruebas BUSTED para selección positiva).

El método FUBAR basado en bayesiano específico del sitio detectado en Ara h 2 diversificando la selección y purificando la selección en 5 sitios cada uno con una probabilidad posterior de 0,9. Para Ara h 6, este método detectó la selección diversificada en 2 sitios pero la selección purificadora en 8 sitios (probabilidad posterior 0,9). Los sitios detectados se destacan en la tabla S3. FUBAR (Murrell et al. 2013) [46] tiene más poder para detectar selección positiva débil (a baja ω& gt1 valores). Al contrastar los métodos de todo el gen y los métodos específicos del sitio utilizados aquí, se cree que los métodos de todo el gen son más efectivos para detectar firmas de selección natural. Murrell y col. (2013) [46] señaló que cuando la selección positiva es indetectable en cualquier sitio de codón o rama de forma aislada, la combinación de pruebas de selección positiva en múltiples sitios y ramas puede hacer que su efecto acumulativo sea más evidente. Otros autores llegaron a inferencias similares [68, 69]. Este parece ser el caso en la detección de la selección positiva mediante los métodos genéticos utilizados en este estudio. En conclusión, los enfoques genéticos han demostrado que Ara h 2 está evolucionando bajo una selección positiva / diversificadora. Los enfoques de Nei y Gojobori (1986) [43] y FUBAR (pruebas BUSTED para selección positiva) demostraron que Ara h 6 está evolucionando bajo selección negativa / purificadora. FUBAR detectó sitios bajo selección positiva en ambos Ara h 2 y Ara h 6 pero más sitios bajo selección purificadora en Ara h 6 (2 frente a 8 sitios, respectivamente). Estos hallazgos plantean la curiosa pregunta de si la selección positiva en Ara h 2 jugó un papel en la aparición de motivos inmunodominantes, mientras que la selección purificadora en Ara h 6 mantuvo un estado que para un gen que ha emergido inicialmente con fuertes características alergénicas cuando Arachis divergió de su ascendencia común.

Evaluar las posibles consecuencias de la selección positiva detectada en Ara h 2, será necesario abordar dos conceptos. Uno se relaciona con la detección del aumento progresivo de la alergenicidad a lo largo de la historia evolutiva del género y el otro se refiere a sus posibles ventajas adaptativas para la alergenicidad. Comprensión de la relación entre la expansión progresiva de la región que abarca los epítopos inmunodominantes 6, 7 y 7b, incluidas las adiciones progresivas de motivos DPYSPS en Ara h 2 (Fig. 2) y la mejora de la alergenicidad es proporcionada por los experimentos de inmunotransferencia. Estos experimentos (detallados más adelante) revelaron un aumento progresivo de la alergenicidad de las especies basales. A. triseminata a la especie terminal en el árbol filogenético, A. hipogaea. Los cambios corresponden a expansiones de la región de motivos inmunodominantes (Fig. 2), lo que apunta a una posible asociación entre los dos fenómenos. El segundo punto que se debe abordar es la disponibilidad de evidencia de las ventajas adaptativas que la alergenicidad puede conferir a las semillas de maní. Estudios experimentales directos que abordan esta cuestión en las especies silvestres de Arachis no están disponibles en la literatura. Sin embargo, existen algunos trabajos que vinculan las proteínas alergénicas con la defensa contra insectos y patógenos. Ara h 2 es un inhibidor de la tripsina [7] y se ha demostrado que esta función controla los ataques de insectos, una característica que se está utilizando en programas de reproducción para la tolerancia de insectos durante el almacenamiento de semillas [70]. La familia de proteínas de la albúmina 2S, a la que Ara h 2 y Ara h 6 Pertenecen, se demostró que es eficaz para inhibir el crecimiento de hongos y bacterias en las semillas de rábano y otros cuatro miembros de la familia de la mostaza Brassicaceae [71]. De manera similar, se conocen las propiedades antifúngicas de una proteína homóloga a la albúmina 2S de las semillas de maracuyá [72]. Teniendo en cuenta estos hallazgos en los cacahuetes y otras plantas con flores, la presión de selección positiva / diversificadora que promueve el aumento de la alergenicidad puede ser ventajosa para aumentar las posibilidades de supervivencia de las semillas a través de la protección contra insectos y hongos. Los patrones de evolución molecular documentados en Ara h 2 y el correspondiente aumento progresivo de la alergenicidad resuelto en las inmunotransferencias fomenta los estudios directos sobre semillas de especies silvestres para evaluar las ventajas selectivas de la alergenicidad de las proteínas.

Evaluación filogenética y evolutiva de epítopos

El patrón de sustitución (mutaciones e indeles), en particular las sustituciones no sinónimas, podría tener implicaciones estructurales y funcionales duales en los genes que codifican proteínas. En los genes de alérgenos, las sustituciones no sinónimas en secciones ricas en epítopos o las duplicaciones de epítopos alergénicos pueden afectar sustancialmente la alergenicidad [14, 17, 30]. Se ha demostrado en los cacahuetes que una sustitución de un solo residuo expresa hasta un 99% de reducción de la alergenicidad al afectar la capacidad de unión de IgE [14, 31, 32]. Discutiremos dentro de una plataforma filogenética los eventos mutacionales en los epítopos alergénicos de los dos homólogos. Identificación del Ara h 2 y Ara h 6 Los epítopos de todo el género se basan en los epítopos reconocidos en el cultivo y sus supuestos ancestros por Staley et al. (1997) y Ratnaparkhe et al. (2014) [14, 29].

Los Ara h 2 homólogo

Se han reconocido diez epítopos en Ara h 2 [14]. Los epítopos 6 y 7 son exclusivos de este homólogo y contienen el motivo DPYSPS hexapéptido inmunodominante característico (figura 2 y figura S1) ubicado entre las hélices 2 y 3. Los otros ocho epítopos se dividen entre la región aguas arriba (epítopo 1-5) y aguas abajo regiones (epítopos 8-10). El epítopo 1 a 4 (HASARQQWEL, QWELQGDR, DRRCQSQLER, LRPCEQHLMQ, respectivamente) y los epítopos 8 a 10 (LQGRQQ, KRELRN, QRCDLDVE, respectivamente) se conservan de completa a muy alta Arachis (Figura S1). El epítopo 5 (KIQRDEDS), por el contrario, ha sufrido complejos eventos mutacionales. Aunque su motivo KIQR no ha cambiado en todo el género, el sector restante (DEDS) ha acomodado una serie de mutaciones e indeles a lo largo de la historia del género, apareciendo como DQD-Q y DED-S (los guiones denotan huecos) en el clado basal de A. macedoi, A. lutescens, y A. triseminata, mutando a DQS—, EED-Q, DEDSS en especies de linajes posteriores, y volviendo a la secuencia original de DED-S en el cultivo y sus especies relacionadas del linaje terminal (Fig. 1 y Fig. S1). Cabe señalar que las primeras divergencias A. triseminata con el DQS truncado, el motivo mostró el menor grado de alergenicidad en nuestro experimento de inmunotransferencia en comparación con el maní (Fig. 7, que se analiza a continuación). Estas mutaciones naturales tienen el potencial de proporcionar pautas valiosas para examinar el impacto de las mutaciones de pérdida / ganancia y residuos en la alergenicidad.


Información del autor

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Hugh H. Reid, Jamie Rossjohn.

Afiliaciones

Programa de Infección e Inmunidad y Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Instituto de Descubrimiento de Biomedicina, Universidad de Monash, Clayton, Victoria, Australia

Jan Petersen, Laura Ciacchi, Mai T. Tran, Khai Lee Loh, Nathan P. Croft, Anthony W. Purcell, Hugh H. Reid y Jamie Rossjohn

Centro de Excelencia del Consejo de Investigación Australiana en Imagen Molecular Avanzada, Universidad de Monash, Clayton, Victoria, Australia

Jan Petersen, Laura Ciacchi, Hugh H. Reid y Jamie Rossjohn

Departamento de Inmunohematología y Transfusión Sanguínea, Centro Médico de la Universidad de Leiden, Leiden, Países Bajos

Yvonne Kooy-Winkelaar y Frits Koning

El Instituto de Investigación Médica Walter y Eliza Hall, Parkville, Victoria, Australia

Melinda Y. Hardy y Jason A. Tye-Din

Departamento de Biología Médica, Universidad de Melbourne, Parkville, Victoria, Australia

Melinda Y. Hardy y Jason A. Tye-Din

Departamento de Microbiología e Inmunología, Instituto Peter Doherty para Infecciones e Inmunidad, Universidad de Melbourne, Melbourne, Victoria, Australia

Zhenjun Chen y James McCluskey

ImmusanT, Cambridge, MA, EE. UU.

Departamento de Gastroenterología, The Royal Melbourne Hospital, Parkville, Victoria, Australia

Instituto de Infección e Inmunidad, Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Cardiff, Reino Unido

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Contribuciones

J.P., H.H.R., L.C., M.T.T., K.-L.L., Y.K.-W., N.P.C. y M.Y.H. contribuido a la generación y análisis de datos. Z.C. y J.M. proporcionó reactivos clave. R.P.A., A.W.P., J.A.T-D. y F.K. contribuido al análisis de datos y la redacción de manuscritos. H.H.R. y J.R. son coautores senior y correspondientes y, con J.P., concibieron el estudio, analizaron los datos y coescribieron el manuscrito.

Autores correspondientes


Abstracto

Las bacterias utilizan mensajeros químicos difusibles, denominados feromonas, para coordinar la expresión génica y el comportamiento entre las células de una comunidad mediante un proceso conocido como detección de quórum. Feromonas de muchas bacterias grampositivas, como Bacilo y Estreptococo, son pequeños péptidos lineales secretados por las células y posteriormente detectados por receptores sensoriales como los que pertenecen a la gran familia de proteínas RRNPP. Estas proteínas son receptores de feromonas citoplásmicas que comparten un dominio de unión a feromonas estructuralmente similar que funciona alostéricamente para regular la actividad del receptor. Las estructuras cristalinas de rayos X de miembros prototípicos de RRNPP han proporcionado información a nivel atómico sobre su mecanismo y regulación por feromonas. Esta revisión proporciona una descripción general de la señalización del prototipo RRNPP describe la estructura-función de esta familia de proteínas, que se disemina ampliamente entre las bacterias grampositivas y sugiere enfoques para atacar los sistemas RRNPP con el fin de manipular comportamientos bacterianos beneficiosos y dañinos.


Para los sistemas inmunitarios de plantas y animales, las similitudes van más allá de la detección

Superposición de los dominios HeLo de MLKL vegetal (amarillo), humano (azul) y ratón (rosa). Crédito: Takaki Maekawa

Aunque profundamente diferentes en términos de fisiología, hábitat y necesidades nutricionales, las plantas y los animales se enfrentan a un problema existencial compartido: cómo mantenerse a salvo frente a la exposición constante a microorganismos dañinos. La creciente evidencia sugiere que las plantas y los animales han desarrollado independientemente receptores similares que detectan las moléculas de patógenos y ponen en movimiento las respuestas inmunes innatas apropiadas.

Ahora, en un estudio publicado en la revista Anfitrión celular y microbio, el autor principal Takaki Maekawa junto con los coautores Lisa K. Mahdi, Menghang Huang, Xiaoxiao Zhang y sus colegas han descubierto que las plantas han desarrollado una familia de proteínas que tienen un parecido sorprendente con las proteínas llamadas proteínas de linaje mixto de tipo dominio quinasa (MLKL) ), que desencadenan la muerte celular en vertebrados como parte de la respuesta inmunitaria. Al descubrir y caracterizar una nueva familia importante de proteínas inmunes a las plantas, el estudio de los autores, que involucró la colaboración con otros investigadores de MPIPZ, Paul Schulze-Lefert, Jane Parker y Jijie Chai, proporciona nuevos conocimientos interesantes sobre cómo las plantas se protegen de los invasores microbianos.

La muerte celular regulada a menudo acompaña a la inmunidad contra la infección en plantas, animales y hongos. Una teoría generalizada sugiere que las respuestas de muerte celular altamente localizadas sirven para limitar estrictamente la propagación de la infección. Aunque partiendo de orígenes independientes, esta respuesta compartida parece involucrar también una maquinaria muy similar: muchas proteínas involucradas en la muerte celular en diferentes reinos de la vida contienen el llamado dominio HeLo, una estructura de haz compuesta por cuatro hélices, que causa resistencia y resistencia celular. muerte alterando la integridad de las membranas celulares o formando canales iónicos.

Basándose en las similitudes entre los sistemas inmunitarios de animales y plantas y en el papel clave que desempeñan los dominios HeLo en la muerte celular, Maekawa planteó la hipótesis de que las plantas también podrían contener otras proteínas con dominios HeLo. Haciendo uso del análisis bioinformático y estructural, él y su equipo descubrieron una nueva familia de proteínas que contienen el dominio HeLo que se comparten ampliamente entre diferentes especies de plantas, lo que indica que son importantes para la fisiología de las plantas.

Maekawa denominó MLKL a las proteínas vegetales y, para estudios posteriores, se centró en los MLKL expresados ​​en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Él y su equipo aislaron proteínas MLKL de A. thaliana y determinaron que las MLKL vegetales poseen la misma arquitectura proteica general que sus homólogos vertebrados y también se ensamblan en estructuras tetrámeras, probablemente autoinhibidas, cuando no están activas. Es importante destacar que las MLKL de plantas también desempeñan un papel en la inmunidad, ya que las plantas en las que los genes que codifican estas proteínas estaban mutados y, por lo tanto, no funcionales eran susceptibles a la infección por patógenos.

Una investigación adicional reveló similitudes adicionales con las MLKL de vertebrados: las MLKL de plantas también se transportan a las membranas celulares como parte de su función, y la activación de estas proteínas conduce a la muerte celular. Maekawa ahora tiene como objetivo descubrir los detalles moleculares que subyacen a la función de las MLKL de las plantas en la inmunidad: "Será emocionante descubrir exactamente cómo se activan las MLKL tras la infección por patógenos y cómo esta activación se traduce en una protección eficaz de las plantas".


Familias de proteínas de alérgenos alimentarios y sus características estructurales y aplicación en el diagnóstico resuelto por componentes: nuevos datos del proyecto EuroPrevall

Se han identificado y caracterizado un gran número de alérgenos alimentarios capaces de inducir síntomas alérgicos en personas predispuestas, incluidas reacciones graves, incluso potencialmente mortales. Sin embargo, las proteínas capaces de provocar tales reacciones mediadas por IgE se pueden asignar a un número limitado de familias de proteínas. El conocimiento detallado sobre las características de los alérgenos alimentarios, sus estructuras 3D, actividad biológica y estabilidad, ayudará a mejorar el diagnóstico de alergia alimentaria, evitará dietas de exclusión innecesarias y evaluará el riesgo de alergias de reacción cruzada a otras fuentes alimentarias. Esta revisión está dedicada a resumir el conocimiento actual sobre las familias de proteínas de alérgenos alimentarios más importantes y a presentar datos de la biblioteca de alérgenos EuroPrevall, una colección de prueba de concepto de alérgenos alimentarios altamente purificados, caracterizados y autenticados de fuentes de alimentos animales y vegetales para facilitar mejor diagnóstico de alergias alimentarias.

Fuentes relevantes de alérgenos alimentarios

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MÉTODOS

Animales

Ratones hembra BALB / c, de 8 a 12 semanas (norte= 12 por grupo), se adquirieron de Charles River Laboratories (Saint-Constant, Quebec, Canadá) y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos controladas por el medio ambiente durante 1 semana antes del estudio y durante todos los experimentos. Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por la Junta de Ética en Investigación Animal de la Universidad McMaster.

Sensibilización y exposición a alérgenos

Los ratones fueron sensibilizados y expuestos a OVA, HDM o una combinación de los dos alérgenos (HDM y OVA) de acuerdo con los protocolos de exposición crónica a alérgenos establecidos (Fig.1) (Inman et al., 1999 Leigh et al., 2002 Leigh et al. , 2004c Leigh et al., 2004a Leigh et al., 2004b Southam et al., 2007).

Exposición a OVA

Todos los ratones que recibieron OVA se sensibilizaron a OVA mediante una inyección intraperitoneal (IP) el día 1 seguida de una inyección IP y una instalación intranasal (IN) el día 11. Las inyecciones IP de OVA implicaron la precipitación de sulfato de aluminio y potasio al 10% con OVA al 0,05%, ajustando el pH a 6.5, luego centrifugando y resuspendiendo el sedimento en solución salina, seguido de una inyección IP de 200 μl. A esto le siguieron cinco períodos de exposición IN OVA, cada 2 semanas de diferencia. Durante cada período de 2 días, se administró OVA en días consecutivos a una concentración de 100 μg / 25 μl. Los ratones que recibieron OVA también recibieron una exposición simulada al alérgeno HDM (en forma de IN SAL), de acuerdo con el protocolo de exposición HDM (Fig. 1).

Exposición HDM

Extracto de HDM de Dermatophagoides pteronyssinus (Greer Laboratories, Lenoir, NC) se resuspendió con solución salina tamponada con fosfato estéril para alcanzar una concentración de 15 μg / 25 μl, que posteriormente se dividió en alícuotas y se congeló a -20 ° C. La HDM se descongeló a 4ºC durante la noche para administrarla al día siguiente. Todos los ratones que recibieron HDM se expusieron inicialmente al alérgeno a través de una instalación IN diaria de 25 μl (15 μg / 25 μl), durante dos períodos de 5 días cada uno (días 29-33 y 36-40). Esto fue seguido por un período de exposición a HDM de 8 semanas, durante el cual los ratones fueron expuestos a IN HDM tres veces por semana, en días alternos de la semana (lunes, miércoles y viernes), comenzando el día 43. Los ratones que recibieron HDM también recibieron una exposición simulada al alérgeno OVA (en forma de IN SAL), de acuerdo con el protocolo de exposición a OVA (Fig. 1).

Exposición a HDM-OVA (combinación)

Utilizando los mismos métodos de administración utilizados para los alérgenos individuales solos, todos los ratones que recibieron la combinación de HDM y OVA se sensibilizaron primero a OVA y, después de un período de descanso de 16 días (días 12 a 28), se expusieron a HDM durante 5 días. por semana durante un período de 2 semanas. En un estudio piloto realizado antes del estudio actual (datos no mostrados), intentamos sensibilizar a los ratones a ambos alérgenos simultáneamente. Sin embargo, esto resultó en mala salud y muerte. Por lo tanto, el período de descanso de 16 días entre la sensibilización a cada alérgeno fue necesario para garantizar que los ratones permanecieran sanos durante la fase de sensibilización. Después de la sensibilización, los ratones se expusieron tanto a OVA como a HDM, combinando ambos protocolos de exposición a alérgenos (Fig. 1).

Exposición simulada (ratones de control con solución salina)

Los ratones de control se sensibilizaron y expusieron a SAL (25 µl IN) siguiendo los mismos protocolos de alérgenos crónicos ilustrados en la Fig. 1 y usando los mismos métodos de administración.

Medidas de resultado

Las mediciones de los resultados se realizaron en dos momentos: 24 horas después de la exposición final al alérgeno, para investigar la asociación entre la inflamación de las vías respiratorias y la AHR, y a las 4 semanas después de la exposición final al alérgeno, para investigar la asociación entre la remodelación de las vías respiratorias y la AHR en un momento en que La inflamación de las vías respiratorias había remitido por completo (Fig. 1). Las medidas de resultado se evaluaron en ocho grupos de ratones, que consistían en cuatro grupos diferentes de ratones en cada uno de los dos puntos de tiempo. El grupo 1 fue ratones de control expuestos a SAL, el grupo 2 fue ratones expuestos a OVA, el grupo 3 fue ratones expuestos a HDM y el grupo 4 fue ratones expuestos a la combinación de alérgenos (HDM y OVA) (norte= 12 ratones por grupo). La medida de resultado primaria en ambos puntos de tiempo fue una evaluación in vivo de la capacidad de respuesta de las vías respiratorias (RRS a MCh). Las mediciones de resultados adicionales en ambos puntos de tiempo incluyeron recuentos de células totales y diferenciales (eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y macrófagos) en el líquido BAL y morfometría de las vías respiratorias utilizando un sistema de análisis de imágenes basado en computadora (Northern Eclipse, Versión 7.0 Empix Imaging Inc., Mississauga , Ontario, Canadá) para cuantificar el número de mastocitos en un área determinada de tejido pulmonar. Otras mediciones de resultados realizadas a las 4 semanas después de la exposición final al alérgeno incluyeron la recuperación de esplenocitos para la TH2 citocinas IL-4, para confirmar la sensibilización al alérgeno, y morfometría de las vías respiratorias utilizando Northern Eclipse para cuantificar los cambios estructurales sostenidos en las vías respiratorias.

Capacidad de respuesta de las vías respiratorias

La respuesta de las vías respiratorias se evaluó midiendo la RRS respuesta a dosis crecientes de MCh intravenosa utilizando el ventilador flexible para animales pequeños (SCIREQ, Montreal, Canadá), como se describió anteriormente (Hirota et al., 2006).

Recuerdo de esplenocitos

La recuperación de esplenocitos se realizó como se describió anteriormente (Johnson et al., 2004). Brevemente, se recogieron los bazos y se aislaron los esplenocitos y se diluyeron a una concentración de 8 x 10 6 células / ml en RPMI completo. Los esplenocitos se cultivaron en RPMI completo solo, o en RPMI completo suplementado con OVA (40 μg / ml) o HDM (40 μg / ml) en una placa de 96 pocillos de fondo plano (Becton Dickinson) por cuadruplicado. Después de 5 días de cultivo, se recolectaron los sobrenadantes y se agruparon por cuadruplicados y se congelaron a -80 ° C hasta que las mediciones de citocinas estuvieron listas para realizarse.

Análisis de citocinas

Los niveles de IL-4 en el sobrenadante del cultivo de esplenocitos se midieron usando un kit ELISA para IL-4 (Quantikine R & ampD Systems, Minneapolis, MN).

Recolección y análisis de fluidos BAL

El líquido BAL se recogió como se describió anteriormente (Inman et al., 1999 Leigh et al., 2002 Leigh et al., 2004c Leigh et al., 2004a Leigh et al., 2004b Southam et al., 2007). Se realizaron recuentos celulares diferenciales en 400 células. Las células se clasificaron, según criterios morfológicos, en eosinófilos, neutrófilos y linfocitos.

Histología y morfometría pulmonar

La histología y morfometría pulmonar se realizaron como se describió anteriormente (Ellis et al., 2003 Inman et al., 1999 Leigh et al., 2002 Leigh et al., 2004c Leigh et al., 2004a Leigh et al., 2004b Southam et al. , 2007). Brevemente, se cortaron secciones de pulmón de 3 μm de grosor y se tiñeron con: PSRed para cuantificar la presencia de colágeno subepitelial, PAS para demostrar la presencia de células caliciformes y azul de toluidina para demostrar la presencia de mastocitos. Se prepararon secciones adicionales para inmunotinción usando un anticuerpo monoclonal contra α-SMA (Clon 1A4, DAKO, Dinamarca) para cuantificar la cantidad de proteínas contráctiles de la actina del músculo liso α en las vías respiratorias. La cuantificación morfométrica de las secciones pulmonares teñidas se realizó utilizando un sistema de análisis de imágenes digitales personalizado (Northern Eclipse). La cuantificación de los mastocitos, que no se ha descrito anteriormente, se realizó mediante la recogida de una imagen de toda la sección de tejido teñido con un objetivo de 1x para calcular el área de tejido pulmonar. Un individuo cegado a los códigos del estudio contó todos los mastocitos con un objetivo de 40 × y el resultado se expresó como MC / mm 2.

Análisis estadístico

Los valores se expresan como media ± s.e.m. Estudiantes t-se utilizaron pruebas para comparar los niveles de IL-4, reactividad de las vías respiratorias (la pendiente de la RRS-Curva dosis-respuesta de MC), Max RRS, recuentos de células totales y diferenciales e índices de remodelación de las vías respiratorias entre ratones de control con solución salina y ratones que recibieron alérgenos. Las comparaciones entre los grupos de ratones que recibieron alérgenos individuales y el grupo de ratones que recibieron la combinación de alérgenos se realizaron utilizando ANOVA (Statistica versión 10.0). Las pruebas de comparación múltiple post-hoc se realizaron utilizando la prueba de Duncan. Todas las comparaciones fueron de dos colas y PAG los valores inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.


Ver el vídeo: Sensores Fotónicos para la Detección de Alérgenos y Patógenos (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Ede

    Lo siento, pero creo que estás cometiendo un error. Vamos a discutir.

  2. Shaktijind

    te felicito me sera util tu pensamiento

  3. Liko

    puede aquí la falta?

  4. Sherard

    ¿Puedes decirme dónde comprar un nuevo iPhone? Simplemente no puedo encontrarlo en Moscú ...



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