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¿PTM de proteínas a través de espectrometría de masas?

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Entiendo que la especificación de masas se usa ampliamente para estudiar PTM como la glicosilación de proteínas, pero ¿cómo puede la especificación de masas determinar la estructura de PTM correcta de, por ejemplo, la glicosilación si dos estructuras de glucanos tienen la misma masa pero una disposición diferente (es decir, isobárica)? Además, ¿cómo puede la especificación de masas determinar la diferencia entre los isómeros estructurales?


No soy un experto en MassSpec, pero esto es lo que entiendo de mis conceptos básicos de espectroscopia:

En MS en tándem (MS-MS), el analito ionizado generalmente sufre o se hace sufrir fragmentación (ruptura en iones más pequeños). La fragmentación le permite estudiar detalles más finos. También es esencial para la secuenciación de péptidos de novo. Diferentes técnicas de fragmentación, como la disociación inducida por colisión (CID) o la fotofragmentación, producen diferentes tipos de iones secundarios.

Puede comprender intuitivamente que la fragmentación de isómeros estructurales producirá diferentes tipos de iones secundarios (utilizando la misma técnica de fragmentación). La elección de la técnica de fragmentación depende de la naturaleza molecular del analito. En el artículo que mencioné anteriormente, utilizan fotofragmentación inducida por láser para disociar iones de glicano.

Incluso las moléculas pequeñas, que habían sido clásicamente estudiadas por MassSpec, sufren isomerización después de la ionización para estabilizar el ion. También pueden ocurrir reacciones como la inversa de Diels-Adler. El patrón de reacciones diferiría entre isómeros estructurales. Para conocer los conceptos básicos, puede consultar un libro sobre técnicas espectroscópicas de Silverstein


Análisis completo del succiniloma de lisina y las co-modificaciones de proteínas en el desarrollo de semillas de arroz

La succinilación de lisina se ha reconocido como una modificación postraduccional (PTM) en los últimos años. Es plausible que la succinilación pueda tener un impacto funcional más vasto que la acetilación debido a cambios estructurales más voluminosos y diferencias de carga más significativas en el residuo de lisina modificado. Sin embargo, actualmente, la cantidad e identidad de las proteínas succiniladas y sus funciones correspondientes en las plantas de cereales siguen siendo en gran parte desconocidas. En este estudio, estimamos que la ocupación de succinilación nativa en lisina fue de entre 2% y 10% en el desarrollo de semillas de arroz. Se han identificado ochocientos cincuenta y cuatro sitios de succinilación de lisina en 347 proteínas mediante una investigación exhaustiva en el desarrollo de semillas de arroz. Se revelaron seis motivos como arreglos de secuencia de aminoácidos preferidos para los sitios de succinilación, y se identificó una preferencia de motivo notable en proteínas asociadas con diferentes procesos biológicos, funciones moleculares, rutas y dominios. Sorprendentemente, se detectó una fuerte succinilación en las principales proteínas de almacenamiento de semillas, junto con enzimas críticas involucradas en el metabolismo central del carbono y las vías biosintéticas del almidón para el desarrollo de la semilla de arroz. Mientras tanto, nuestros resultados mostraron que el patrón de modificación de in vitro Las proteínas succiniladas no enzimáticamente eran diferentes de las de las proteínas aisladas de células en transferencias Western, lo que sugiere que la succinilación no se genera mediante una reacción no enzimática en las células, al menos no completamente. Usando los datos de acilación obtenidos del mismo tejido de arroz, mapeamos muchos sitios que albergan succinilación, acetilación, malonilación, crotonilación y 2-hidroxisobutirilación de lisina en proteínas de semillas de arroz. Se demostró que un número sorprendente de proteínas con múltiples modificaciones están involucradas en eventos metabólicos críticos. Dado que estos restos de modificación son productos intermedios de múltiples rutas metabólicas celulares, estos residuos de lisina dirigidos pueden mediar la diafonía entre diferentes rutas metabólicas a través de modificaciones por diferentes restos. Nuestro estudio exhibe una plataforma para la investigación extensa de redes moleculares que administran el desarrollo y metabolismo de semillas de cereales a través de PTM.

Palabras clave: acetilación lisina succinilación espectrometría de masas biología vegetal modificaciones postraduccionales modificación de proteínas almacenamiento de semillas de arroz nutriente succiniloma.


6.3. CONSIDERACIONES DE BÚSQUEDA EN BASE DE DATOS

La identificación de péptidos a partir de una proteína o una base de datos genómica traducida se basa en la probabilidad. Esto se hace comparando el espectro MS / MS observado con los espectros teóricos para los péptidos proteolíticos predichos (ver Figura 6.1) de todas las proteínas en la base de datos. Si se consideran más de unas pocas modificaciones a la vez, el tiempo de búsqueda aumenta exponencialmente y la puntuación de probabilidad disminuye si se utilizan más modificaciones para lograr un & # x0201cmatch. & # X0201d

FIGURA 6.1

Esquema del espectro de EM de una proteína digerida con tríptico.

Otro factor crítico para la búsqueda en bases de datos es que la modificación debe ser específica solo para ciertos aminoácidos. Modificaciones no específicas, por ejemplo, modificaciones que pueden reaccionar con alguna aminoácido, no se puede buscar con algunos motores de búsqueda de bases de datos comunes, como Mascot & # x02122 (3).


Las aplicaciones de la espectrometría de masas del departamento incluyen:

Proteómica neurológica: evaluación de poblaciones de proteínas y PTM en el cerebro

Uno de los objetivos de la proteómica es ir más allá del análisis reductor de las isoformas de proteínas que actúan individualmente para examinar cómo cambia la composición de las poblaciones de proteínas en respuesta a estímulos naturales y factores estresantes, estados de enfermedad y terapias con medicamentos. Por lo tanto, el objetivo es realizar una medición global (global) de las cantidades relativas de los cientos de proteínas diferentes que interactúan para generar resultados biológicos, yendo más allá de las actividades de especies individuales de neurotransmisores y receptores.

Las sinapsis del cerebro y el sistema nervioso central (SNC), uniones dinámicas donde las neuronas intercambian señales químicas que son la base molecular de fenómenos como el aprendizaje y la memoria, son el tema de análisis proteómico cuantitativo y cualitativo (PTM) realizado por investigadores del departamento y sus colaboradores neurocientíficos. Por ejemplo:

Seguimiento de cambios coordinados en el proteoma sináptico durante la estimulación del SNC

Se usó MS combinada con marcaje isotópico de péptidos para analizar variaciones en la abundancia relativa de casi 900 proteínas en densidades postsinápticas (PSD) de ratón en distintos intervalos de tiempo en respuesta a una amplia estimulación de fármacos del SNC. La densidad es una estructura rica en proteínas en el extremo receptor (terminal dendrita) de las comunicaciones químicas interneuronales a través de la hendidura sináptica. Los PSD contienen concentraciones de receptores que se unen a neurotransmisores, así como numerosas proteínas reguladoras y de señalización sinápticas asociadas, ensambladas por una variedad de proteínas de andamio.

Al analizar los cambios en las cantidades relativas de las proteínas postsinápticas, el estudio encontró evidencia de la activación co-regulada de ciertos grupos. Por lo tanto, pudieron identificar complejos funcionales centrales en los que las proteínas mostraban una actividad coordinada incluso cuando no se sabía que interactuaran físicamente.

Cuantificación de la fosforilación sináptica y la expresión de proteínas por región cerebral

Se aplicó la cuantificación global de MS y el marcaje isotópico para examinar las diferencias en la expresión de proteínas y la fosforilación en densidades postsinápticas por región cerebral. El análisis de más de 2,100 proteínas y 1,500 sitios de fosforilación en un modelo de ratón sugirió roles para proteínas previamente no anotadas cuya mayor expresión se agrupaba con complejos funcionales conocidos.

Este estudio también reveló relativamente más sitios de fosforilación en NMDA que los receptores AMPA, que están involucrados en la plasticidad sináptica: cambios en la eficacia de las transmisiones sinápticas que subyacen al aprendizaje, la memoria y otros fenómenos neurológicos. De hecho, el estudio encontró niveles promedio más altos de enzimas asociadas con la fosforilación reversible (quinasas, fosfatasas) en el hipocampo, una región asociada con la formación de la memoria y la orientación espacial que se encuentra entre las primeras en sufrir daños en la enfermedad de Alzheimer.

Gráfico de la abundancia relativa de una proteína específica, chapsyn-110 (una quinasa asociada a la membrana) en densidades postsinápticas por región cerebral, que muestra su mayor prevalencia en la corteza, el cerebro medio, el cerebelo y el hipocampo. (Los péptidos individuales están representados por puntos, los promedios de proteínas por barras horizontales). Esta investigación se publicó originalmente en Molecular & amp Cellular Proteomics. Trinidad, et al., Análisis cuantitativo de fosforilación sináptica y expresión de proteínas. Expresión molecular y proteica. 2008 Vol 7: 684-696

El gráfico muestra una mayor expresión relativa de enzimas asociadas con la fosforilación reversible en el hipocampo. Esta investigación se publicó originalmente en Molecular & amp Cellular Proteomics. Trinidad et al., Análisis cuantitativo de fosforilación sináptica y expresión de proteínas. Expresión molecular y proteica. 2008 Vol 7: 684-696

Primer mapeo a gran escala de modificaciones desafiantes de carbohidratos en el proteoma sináptico

Los científicos del departamento aplicaron la cromatografía líquida y la disociación por transferencia de electrones MS para realizar el primer estudio a gran escala que caracteriza los sitios específicos y las estructuras modificadoras de más de 2500 glicopéptidos únicos unidos a N y O de 453 proteínas en sinaptosomas de ratón: sacos de membrana unidos a vesículas de terminales de axones neuronales.

La glicosilación extracelular es un conjunto complejo común de PTM estructuralmente relacionados en el que uno o más carbohidratos (glicanos) se unen a una membrana o proteína secretada. La designación N- u O- se refiere al nitrógeno u oxígeno en las cadenas laterales de aminoácidos (residuos) donde está unido el glicano. Estos PTM ayudan y estabilizan el plegamiento de proteínas, entre otras funciones.

Dichos análisis son un desafío porque los enlaces glicosídicos se rompen más fácilmente en los procesos disociativos inducidos por colisión que los enlaces peptídicos de otros PTM covalentes. Además, existe un software limitado para automatizar la identificación de espectros de modificación de glucanos.

Los investigadores aquí utilizaron dos formas de cromatografía de afinidad (lectina, TiO2) para clasificar y enriquecer la concentración de glicopéptidos para su identificación. Luego, habiendo identificado previamente miles de proteínas sinaptosómicas, se enfocaron en proteínas transmembrana / secretadas anotadas y utilizaron el prospector de proteínas del recurso para buscar esas proteínas, lo que permitió modificaciones con valores de masa específicos correspondientes a componentes de glicanos potenciales. Así identificaron las modificaciones de carbohidratos más comunes y compararon sus masas con las estructuras de azúcar (oligosacáridos).

Dichos análisis de EM también identificaron el número de glucanos únicos para cada sitio de glucosilación ligado a N, incluido un sitio único con 19 modificaciones de glucanos.

Pioneros en la identificación de sitios y roles de una PTM de azúcar común e importante: O-GlcNAcilación

La O-GlcNAcilación es una modificación postraduccional común, vital y reversible que ocurre en todos los animales y plantas (metazoos), tanto en el núcleo celular como en el citosol. Implica la modificación de residuos de serina y treonina de proteínas nucleares y citosólicas con una única N-acetilglucosamina unida a oxígeno (GlcNAc). Está implicado en la modulación de:

  • regulación genética (incluso a través de la modificación de factores de transcripción)
  • respuestas al estrés celular y los niveles de nutrientes, incluidos los efectos de estos últimos en los relojes circadianos celulares
  • el objetivo de proteínas para su destrucción por el proteasoma
  • Vías de señalización intracelular reguladas por fosforilación (la PTM más estudiada y comúnmente un interruptor de encendido y apagado de proteínas): a través de la intercomunicación en residuos co-modificados o la competencia por sitios de modificación.
  • enfermedades como la diabetes y el Alzheimer (las enzimas que agregan / eliminan O-GlcNAc se expresan en gran medida en el cerebro)

Si bien este PTM se descubrió hace tres décadas, la determinación detallada de sus funciones biológicas se había visto limitada por la dificultad de identificar con precisión qué residuos de serina o treonina en una proteína se modificaron. El uso de la disociación inducida por colisión para fragmentar proteínas en péptidos para el análisis típicamente rompió los enlaces glucosídicos azúcar-oxígeno más débiles antes de la estructura del péptido de la proteína modificada, perdiendo así los datos del sitio de modificación.

En un momento en que se conocían menos de 80 residuos exactos de O-GlcNAcilación en todas las proteínas, principalmente a través de disección química (degradación de Edman), los científicos aquí fueron pioneros en una nueva metodología, combinando cromatografía de afinidad de lectina (aglutina de germen de trigo) con disociación por transferencia de electrones (ETD). ) MS en tándem. Esto se aplicó a los proteomas de células cerebrales de ratón, donde se habían observado altas tasas de O-GlcNAcilación. Específicamente, los investigadores analizaron las densidades postsinápticas, es decir, estructuras ricas en proteínas en el extremo receptor (terminal dendrita) de las comunicaciones químicas interneuronales a través de la hendidura sináptica.

Al aplicar inicialmente el nuevo método, los investigadores del departamento determinaron 58 sitios de modificación de un solo experimento, incluidos 28 en Fagot, una proteína en la zona activa sináptica, que coincidía con el número de sitios de fosforilación conocidos en ese momento en esa proteína y sugirieron que la O-GlcNAcilación podría desempeñar un papel equivalente en la regulación de su función. De hecho, el estudio también encontró más evidencia de que la modificación del azúcar podría interactuar (diafonía) con la fosforilación en la sinapsis, ya que varios sitios modificados con O-GlcNAc en Bassoon se informaron previamente como modificados con fosfato.

Modificaciones postraduccionales en la proteína sináptica Fagot, que se compone de 3940 aminoácidos desde su extremo N a C terminal. Las posiciones de las modificaciones de 28 O-GlcNAC (arriba) se indican en relación con los sitios de fosforilación (abajo). Los sitios O-GlcNAc también informados como sitios de fosforilación se indican en rojo. De Proceedings of the National Academy of Sciences, Identificación de sitios de O-GlcNAcilación de proteínas usando espectrometría de masas de disociación de transferencia de electrones en péptidos nativos, Chalkley et al., Vol 106 no. 22 de 2009, 8894–8899

Caracterización global combinada de dos modificaciones importantes

El potencial de efectos moduladores, regulación recíproca y otra interacción (diafonía) entre O-GlcNAcilación y fosforilación es sugerida por factores que incluyen:

  • Ambos modifican reversiblemente las cadenas laterales de los residuos de serina y treonina.
  • Ambos son comunes (la mayoría de las proteínas celulares pueden estar fosforiladas, mientras que ahora se conocen miles de sitios de O-GlcNAcilación)
  • La modulación in vitro de los niveles globales de fosforilación cambia los niveles de O-GlcNAcilación de muchas proteínas y viceversa.

Para examinar la interacción de estos dos PTM comunes, los investigadores desarrollaron un enfoque que permite la detección combinada y las determinaciones del sitio de O-GlcNAcylatoin y fosforilación, en la misma muestra biológica. Esto aplica cromatografía de afinidad (una interacción débil entre O-GlcNAc y lectina o aglutinina germinal, así como entre fosfatos y dióxido de titanio) para el enriquecimiento de O-GlcNAc y péptidos modificados con fosfato con captura / transferencia de electrones MS de disociación. Ejemplos de esta caracterización dual de PTM incluyen:

Identificación global, ubicación de O-GlcNAcilación y fosforilación en las mismas muestras de proteoma de sinapsis

Los científicos del departamento y sus colaboradores aplicaron este enfoque para detectar tanto modificaciones como sus ubicaciones en proteínas en las mismas muestras biológicas de sinaptosomas de ratón: sacos de vesículas unidas a la membrana del lado de liberación (terminales axónicos) de las comunicaciones químicas interneuronales a través de la hendidura sináptica.

El estudio identificó más de 6000 proteínas con una o ambas modificaciones y arrojó estimaciones de que el 19% y el 63% de las proteínas del sinaptosoma estaban O-GlcNAciladas o fosforiladas, respectivamente. También encontró que las proteínas ampliamente modificadas por O-GlcNAc casi siempre estaban fosforiladas en un grado similar o mayor, lo que indica que la O-GlcNAc-transferasa (OGT, que cataliza la PTM), se dirige a ciertas proteínas fosforiladas. Además, las quinasas (que fosforilan proteínas) fueron la clase de proteínas más modificadas por O-GlcNAc, lo que sugiere una forma de diafonía en la que la O-GlcNAcilación regula la actividad de las enzimas.

Interacción de O-GlcNAcylatoin y fosforilación en la regulación del reloj circadiano

El recurso proporcionó un análisis de MS de la interacción entre estas modificaciones en la regulación de los relojes circadianos celulares de 24 horas, que coordinan los procesos biológicos en los organismos, desde las bacterias hasta los humanos. Los ritmos de los relojes pueden verse afectados tanto por los niveles de nutrientes como por la luz.

Estudios anteriores habían encontrado que la O-GlcNAcilación de factores de transcripción y proteínas relacionados con el ciclo circadiano funciona como un sensor de nutrientes y afecta los relojes (alterando la duración del período en ratones y moscas de la fruta). El análisis de MS de proteínas de cerebros e hígados de ratón realizado por científicos del departamento mostró que la OGT, la enzima que cataliza la O-GlcNAcilación, está fosforilada y, por lo tanto, aumentada por una quinasa (glucógeno sintasa quinasa 3β), pero también puede modificarse O-GlcNAc en los mismos lugares, como que las dos enzimas compiten y "afinan" los efectos de la otra.

A] Espectro de EM / EM de una región doblemente modificada con O-GlcNAc de la proteína cerebral PER2, que regula la velocidad del reloj circadiano, o el momento del inicio del sueño. B] MS / MS identificaron sitios de modificación de O-GlcNAc de un dominio de unión de quinasa (CK1) (aminoácidos 557 a 771). Las serinas identificadas (números 662, 668 y 671) también son sitios de fosforilación de CK1 que sugieren modificaciones competitivas. De Metabolismo celular Sensor de glucosa O-GlcNAcilación coordina con fosforilación para regular el reloj circadiano, Kaasik et. al, febrero de 2013, págs. 291-302.

El mismo estudio utilizó análisis de EM en tándem para encontrar que la O-GlcNAcilación y la fosforilación también son modificaciones competitivas de una región específica de una proteína cerebral (PER2) crítica para regular la "velocidad" del reloj: una mutación que reduce la fosforilación de la región conduce a un síndrome de inicio del sueño temprano en la noche.

Descifrando la epigenética: detección y caracterización de modificaciones de histonas y proteínas de cromatina (ADN)

Hay aproximadamente 20.000 genes que codifican proteínas en cada célula de nuestro cuerpo. Sin embargo, la expresión génica difiere no solo por el tipo de célula y la etapa de desarrollo, sino también durante la respuesta saludable a los estímulos y el estrés y a través de la disfunción y la enfermedad, convirtiendo la composición genética (genotipo) en rasgos observables (fenotipo).

Una forma en que la expresión génica se modifica regularmente es mediante la unión de grupos químicos y carbohidratos al complejo combinado de ADN y sus proteínas asociadas (cromatina) en el núcleo celular, lo que lleva a una remodelación física que altera la accesibilidad de los genes.

Determinar cómo y dónde ocurren tales modificaciones es un ejemplo de epigenética: el estudio de tales cambios no relacionados con la secuencia en la expresión génica que pueden ser heredados por generaciones posteriores. Se realiza un subconjunto clave de modificaciones epigenéticas en las histonas: varias isoformas de proteínas que empaquetan y estabilizan el ADN en forma de carrete (una unidad básica repetitiva llamada nucleosoma es un segmento de ADN enrollado alrededor de ocho núcleos de histonas). Tras la modificación de las histonas por múltiples grupos químicos (p. Ej., Acetilo, metilo, ubiquitina, fosfato), generalmente en sus terminales N no estructurados (denominados "colas"), remodelan parte de la cromatina, regulando las afinidades de unión de las proteínas transcripcionales y, en última instancia, alteración de la expresión génica.

Espectro MS / MS de un péptido de histona (H4) (GKGGKGLGKGGAKR) de maíz (también conocido como maíz) que muestra sus modificaciones postraduccionales por grupos acetil (ac) (acetilación). M / Z indica relaciones de masa a carga.

Los científicos del departamento y sus colaboradores han sido pioneros en la aplicación de la espectrometría de masas a las modificaciones de histonas, así como a los cambios epigenéticos como la metilación del ADN. Dicha investigación podría ayudar a descifrar los códigos hipotéticos de histonas y epigenéticos, que proponen que las combinaciones complejas de múltiples modificaciones y sus interacciones (diafonía) están correlacionadas con cambios en la expresión génica en las respuestas moduladas a estímulos endógenos y ambientales y, cuando se interrumpen, con disfuncionales. expresión en la enfermedad.

Las modificaciones de histonas representan un modelo desafiante para la aplicación de la espectrometría de masas al análisis de proteínas intactas, dada su compleja variedad de modificaciones. Se ha descubierto que más de 60 residuos de las histonas de los cuatro nucleosomas centrales están sujetos a una o más modificaciones. Las técnicas de disociación de captura / transferencia de electrones de arriba hacia abajo permiten el análisis de péptidos más grandes, pero las modificaciones en diferentes sitios y en diferentes cantidades (por ejemplo, trimetilación) deben detectarse con precisión a pesar de variar en frecuencia y abundancia en órdenes de magnitud.

Ejemplos de investigación del departamento y aplicaciones de metodologías de EM en modificaciones epigenéticas incluyen:

Cuantificación de los efectos de la exposición al arsénico cancerígeno sobre las modificaciones de las histonas

Aquí, los científicos aplicaron análisis cuantitativo de EM de modificaciones de histonas comparativas a un modelo de cultivo celular para el desarrollo de cáncer de vejiga debido a la exposición al arsénico. Si bien se sabe que la exposición al arsénico, especialmente a través de aguas subterráneas contaminadas, está asociada con varios tipos de cánceres en humanos, los mecanismos subyacentes han sido esquivos. Trabajando con colaboradores, los científicos analizaron aquí las modificaciones de las histonas en las células del uroepitelio humano (que recubren el tracto urinario) expuestas a dosis de arsénico a lo largo del tiempo. El estudio detectó una reducción en los niveles de acetilación en las isoformas de histonas H3 y H4 en residuos de lisina específicos. Al observar los hallazgos relacionados de la acetilación de histonas alteradas por arsénico y la transformación maligna, los autores del estudio sugirieron que tales alteraciones epigenéticas podrían silenciar genes clave que controlan el crecimiento, lo que lleva al desarrollo de tumores.

Evaluación de la desmetilación reguladora de genes de sitios clave de nucleosomas

Usando cromatografía líquida-MS en tándem para monitorear la eliminación de grupos metilo (desmetilación) de un sustrato de histona a lo largo del tiempo, los investigadores pudieron desarrollar un método ampliamente aplicable para evaluar la desmetilación de sitios específicos de nucleosomas. Al reconstituir el proceso in vitro, el estudio analizó específicamente las velocidades de reacción (cinética) de un dominio catalítico de histona desmetilasa JMJD2A que, entre sus diversos sustratos de histonas, elimina un tercer grupo metilo del noveno residuo de lisina de una histona H3 trimetilada (H3 K9). Esta modificación reprime la transcripción alterando la estructura de la cromatina para inactivar genes. Si bien se ha observado trimetilación de ese sitio de histonas en genes silenciados en el cáncer, la sobreexpresión de la familia de enzimas JMJD2 también está implicada en la enfermedad, lo que indica la importancia de una regulación precisa de la desmetilación.


Análisis espectrométrico de masas de las modificaciones postraduccionales más frecuentes

Fosforilación

La fosforilación está muy extendida y, a menudo, se estudia la modificación de proteínas. Los residuos de serina, treonina y tirosina se modifican covalentemente mediante la adición enzimática de un grupo fosfato. La fosforilación es un proceso reversible, generalmente utilizado para encender y apagar varios procesos biológicos. La presencia del grupo hidrófilo cargado cambia la estructura de las proteínas, regulando múltiples procesos bioquímicos, por ejemplo, el ciclo celular, el metabolismo y la regulación de los receptores [41, 42].

La fosforilación de un sitio determinado ocurre típicamente solo en una (pequeña) fracción de moléculas. El análisis de fosforilación, por lo tanto, requiere tanto la asignación de estructura (identificación del sitio de fosforilación) como la determinación de la proporción de análogos fosforilados y no fosforilados. Las fosfoproteínas constituyen solo una pequeña fracción del proteoma, por lo que las estrategias de enriquecimiento son esenciales para un análisis exitoso. Se han desarrollado varios métodos para este propósito, como la cromatografía de inmunoafinidad, la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) y la cromatografía de afinidad de óxido metálico (MOAC) como el dióxido de titanio (TiO2) y dióxido de circonio (ZrO2) cromatografía [43, 44, 45, 46]. IMAC y MOAC se basan en la afinidad de los grupos fosfato por iones de metales de transición y óxidos de metales. Sin embargo, estos materiales también muestran afinidad por los grupos carboxilo, lo que resulta en el aislamiento de residuos ácidos como glutamato y péptidos que contienen aspartato junto con los fosforilados [47, 48]. Se han desarrollado numerosas estrategias para superar estos problemas de especificidad. La esterificación de los grupos carboxilo antes del enriquecimiento reduce la retención de péptidos ácidos. Los ácidos orgánicos que tienen mayor afinidad por la fase estacionaria que los grupos carboxilo pero menor que los grupos fosfato se emplean como excluyentes no fosfopéptidos. Los fosfopéptidos también pueden eluirse específicamente del material IMAC mediante eliminación beta, que elimina el enlace entre el péptido y el grupo fosfato [48]. Aunque se ha demostrado que el MOAC es más resistente a los compuestos que interfieren (por ejemplo, sales, detergentes) y más selectivo que el IMAC en muchos casos, los residuos fosforilados múltiples pueden unirse con alta afinidad al óxido metálico, lo que los hace drásticamente difíciles de eluir. IMAC, por lo tanto, proporciona una cobertura mejorada de péptidos multifosforilados y también es capaz de enriquecer fosfoproteínas de longitud completa sin ninguna digestión proteolítica previa [48,49,50]. La cromatografía de inmunoafinidad se emplea principalmente en el enriquecimiento de proteínas fosforiladas en el residuo de tirosina [51]. Teniendo en cuenta que los datos obtenidos con diferentes métodos de enriquecimiento solo se superponen parcialmente (alrededor del 30%), se recomienda la combinación de múltiples métodos para mejorar la cobertura de fosfoproteomas [52]. Las muestras enriquecidas se pueden fraccionar posteriormente antes del análisis de MS mediante múltiples métodos, como la cromatografía de interacción hidrófila (HILIC), RP-HPLC y SCX [53,54,55].

Hay dos cuestiones importantes que hacen que la caracterización de péptidos fosforilados mediante EM no sea trivial. En primer lugar, la sensibilidad de un fosfopéptido es significativamente menor que la de su análogo no fosforilado [56]. En segundo lugar, los fosfopéptidos se fragmentan típicamente en la CID al perder ácido fosfórico y, por lo tanto, la identificación del sitio de fosforilación puede verse comprometida [43]. El uso de ECD, ETD y / o técnicas especiales de MS / MS (como MS 3) puede aliviar este problema y permitir tanto el análisis de secuencia como la localización del sitio de fosforilación [57]. El análisis de fosfopéptidos también se puede realizar usando derivatización. Los residuos de fosfoserina y fosfotreonina se transforman selectivamente en un análogo de lisina y la posterior escisión proteolítica (usando, por ejemplo, tripsina o Lys-C) da como resultado péptidos novedosos [58]. La identificación de estos péptidos mediante MS / MS y su comparación con la MS / MS del análogo no derivatizado puede utilizarse para identificar el sitio de fosforilación [46, 58].

Acetilación

En los últimos años, el estudio de la acetilación de proteínas se ha convertido en un tema importante en el análisis de PTM. Las proteínas pueden acetilarse en el extremo N y en el grupo ε-amino de los residuos de lisina, teniendo este último la mayor relevancia biológica. La acetilación se ha caracterizado más ampliamente por la regulación de histonas, concluyendo que desempeña un papel importante en los procesos del ciclo celular, como la expresión génica y la reparación del ADN [59, 60].

Dado que la acetilación suele producirse con una estequiometría muy baja, el enriquecimiento de las proteínas y péptidos modificados es de importancia crítica. Los anticuerpos específicos de acetilsina son muy valiosos para este propósito y se utilizan como paso de purificación inicial de muestras muy complejas [61,62,63]. Sin embargo, el método funciona correctamente solo para péptidos, ya que la accesibilidad de los residuos de aminoácidos acetilados es limitada en el caso de proteínas intactas. Además, no hay ningún anticuerpo disponible para el enriquecimiento de la acetilación N-terminal [64]. Se puede acceder a varios métodos para el fraccionamiento previo de histonas, incluida la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), SDS-PAGE y CE [65,66,67]. La acetilación aumenta el carácter hidrófobo de las proteínas y elimina la carga positiva del grupo amino N-terminal. Los residuos acetilados, por lo tanto, pueden separarse de sus contrapartes no acetiladas basándose en la hidrofobicidad (RP-HPLC), interacciones electrostáticas (SCX) o ambas (cromatografía líquida de interacción hidrófila de ion híbrido, ZIC-HILIC) [64, 68]. HILIC también tiene el valor añadido de poder separar las histonas metiladas y acetiladas, lo que reduce significativamente la complejidad de la muestra [69]. Otra posibilidad para reducir la complejidad de la muestra es la derivatización con anhídrido propiónico, que convierte los residuos de lisina y el grupo amino N-terminal en propionilamidas, lo que proporciona un desplazamiento de masa de +56 Da y protección frente a la digestión enzimática [37, 70].

La acetilación de lisina se considera un PTM estable bajo análisis de espectrometría de masas, es decir, el grupo funcional se retiene en la proteína utilizando CID de alta energía [23]. La acetilación se puede identificar mediante un desplazamiento de masa de 42,01 Da, en contraste con la variante no modificada. Aunque otra modificación llamada lisina trimetilada tiene un peso muy similar (42,04 Da) a la acetilación de lisina, los espectrómetros de masas de alta resolución son capaces de diferenciar tales modificaciones [71]. Dado que la acetilación neutraliza la carga positiva del residuo de lisina y bloquea la escisión tríptica, la ausencia de esta escisión característica puede ser otro signo de acetilación [72].

Glucosilación O / N

Aproximadamente, más de la mitad de las proteínas humanas tienen cadenas laterales de glucanos simples o complejas, que influyen en el plegamiento y la estabilidad de las proteínas [73, 74]. Hay dos tipos principales de cadenas laterales de glicanos: (1) glicanos unidos a O unidos al grupo hidroxi de serina, treonina, tirosina, mientras que, (2) glicanos unidos a N están unidos al nitrógeno de las cadenas laterales de asparagina. A diferencia de la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas, los procesos de glicosilación no están dirigidos por molde, lo que proporciona una gran heterogeneidad para los glicoconjugados. En consecuencia, una glicoproteína es una mezcla de isoformas de proteínas (glicoformas), en lugar de ser una entidad química exacta y bien definida [75].

La caracterización completa de glicoproteínas y glicopéptidos requiere múltiples métodos analíticos. En un enfoque, las cadenas laterales de glicanos se liberan de la proteína mediante la aplicación de una enzima (p. Ej., Péptido norte-glicosidasa F, PNGasa F) o por eliminación reductora. El primero se puede utilizar en el caso de N-glicanos, y el segundo para O-glicanos [76,77,78,79]. Cuando se liberan los azúcares, normalmente se separan de la mezcla de proteínas y se derivatizan. Reemplazar todos los hidrógenos reactivos con grupos metilo (permetilación) es el método más extendido para este propósito, que permite la determinación estructural detallada de glucanos complejos (por ejemplo, sitios de ramificación, enlaces interglucosídicos, isómeros configuracionales) [82]. A medida que el procedimiento estabiliza los residuos de ácido siálico, los derivados permetilados muestran una ionización más eficaz y propiedades de fragmentación más predecibles en comparación con sus homólogos nativos [80,81,82,83,84]. Los glicanos permetilados se analizan con mayor frecuencia mediante MALDI-MS. El marcado con ácido antranílico (ácido 2-aminobenzoico, 2-AA) de los carbohidratos reductores se lleva a cabo en condiciones suaves, por lo que se puede evitar una desialilación indeseable [85]. 2-AA tag improves both chromatographic and mass spectrometric (in negative ion mode) detectabilities of glycans by acting as a chromophore, fluorophore and adding a negative charge to all the molecules. It also provides more informative fragments facilitating sequential analysis of saccharides [81, 85,86,87,88]. The derivatives can be subsequently separated by a number of methods, such as HILIC and CE prior to mass spectrometric analysis. CE is capable of separating positional isomers as well as differently linked glycans with high resolution and short analysis time, while HILIC tends to yield better retention time repeatability [89, 90]. It is also demonstrated that the techniques show notable complementarity in the glycoform profiling of therapeutic proteins [91].

An alternative to release glycan analysis is digestion of the protein (mixture) with proteolytic enzymes (e.g. trypsin). This yields a mixture of peptides and glycopeptides, and can be analyzed by CID- or ECD-based tandem mass spectrometry. Enzymatic digestion is often followed by enrichment techniques prior to the MS analysis. Glycopeptides may be enriched by boronate affinity chromatography, lectin affinity chromatography, HILIC, and electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography (ERLIC) [75, 92,93,94,95,96]. Boronate affinity chromatography is able to capture glycan moieties through formation of borate diesters with vicinal diols of the sugar residues. This ensures selective enrichment of glycopeptides, even in complex mixtures. In contrast to boronate affinity chromatography, lectin affinity chromatography allows the enrichment of unique glycoproteins/peptides having specific glycan structure, which may be exceptionally useful in the exploration of disease-related, abnormal glycosylation pattern [97]. As glycosylation increases hydrophilicity of proteins and peptides, glycopeptides can be easily separated from non-glycosylated ones by HILIC. ERLIC, in which positively charged functional groups are attached to the stationary phase, can be considered as a combination of hydrophilic interaction and ion-exchange chromatography. Sialylated moieties with negative charge are, therefore, highly retained, while positively charged peptides are easily eluted [98]. It is also reported that certain gradient HILIC methods can be converted into isocratic separations by ERLIC [99].

There are various mass spectrometric approaches for glycopeptide analysis, identifying the glycan structure, the glycosylation site and also the abundance ratio of various glycoforms. CID fragmentation often cleaves off the sugar residue, while ECD and ETD can yield information on the peptide sequence [75]. Ion mobility–mass spectrometry (IM-MS) is also a promising analytical tool in this field with the added value of being able to separate analytes based on their size. This technique has been successfully applied for the separation and characterization of isobaric polysaccharides and glycopeptides [100, 101].

Amidation

Approximately, half of the endocrine and neural peptides bear C-terminal amidation [102]. The presence of such modification is indispensable for signal transduction and receptor recognition [102, 103]. Furthermore, derivatization of amidated peptides with glycosylphosphatidylinositol is responsible for anchoring peptides and proteins to the cell membrane [104].

As in most cases in the field of PTMs, proteins that are presumably amidated at the C terminus can be separated or enriched by specifically engineered approaches based on the affinity of such proteins. For a long time, only radioimmunoassay (RIA) and immunoprecipitation (IP) have been applied for identification of amidated proteins [105, 106]. Separation of amidated peptides from their precursors can be carried out with RP-HPLC [105]. Weak cation-exchange chromatography (WCX) has been reported to be able to separate the α-amidated heavy chain of immunoglobulin G1 from other isoforms [107].

Amidation of a carboxyl group manifests in a 1 Da mass shift, which is very difficult to identify. The situation can be further complicated when the C-terminal amino acid is glutamine or asparagine, which cannot be distinguished from the amidated form of glutamate or aspartate, except when an auxiliary chemical or enzymatic procedure is performed. An approach has been developed for detecting C-terminal amidation by a combination of chemical derivatization and MALDI-TOF/TOF MS [86]. First step is the derivatization of the free carboxyl group at the C terminal, resulting in a methylamide structure [108, 109]. This results in a 13 Da mass increment observable in the spectrum, enabling the distinction between the amidated and the unmodified peptides. This method was shown to be able to distinguish isobaric residues at the C terminal, such as Gln-OH and Glu-NH2 or Asn-OH and Asp-NH2, suggesting a wider application to investigate modified and unmodified C terminals of proteins [104].

Hydroxylation

Although hydroxylation can take place on several amino acids including lysine, histidine, asparagine, aspartate, and aromatic residues, the most commonly hydroxylated amino acid is proline, which makes up almost one-third of collagen protein [110,111,112]. Hydroxylation generally takes place at the γ-C atom, yielding 4-hydroxyproline (4-Hyp), which has the ability to stabilize the secondary structure of the protein by the powerful electronegative effect of the hydroxy group [112]. Hyp is also associated with the decreased availability of oxygen in the cellular environment, as the alpha subunits of hypoxia-induced factor (HIF) contain hydroxylated proline residues [113].

Mass spectrometric investigation of collagenous proteins is intricate due to the large number of proline residues and the high abundance of hydroxylation. These structural features result in a vast number of isobaric but differently modified peptides in a typical proteomic workflow, which usually co-elute during chromatographic separation and provide chimeric spectra troublesome to elucidate. Moreover, the nominal mass of Hyp is 113 Da, which is the same as leucine and isoleucine. To overcome such difficulties, a mass spectrometer with high mass accuracy and abundant product ions from the tandem MS experiment are required [114, 115]. Unfortunately, MS norte sequence analysis is ruined by the abnormal fragmentation of Pro- and Hyp-rich proteins and peptides. These residues promote characteristic and dominant cleavages instead of those nonselective ones, which may provide sequence information. This phenomenon is the so-called “proline-effect”, by which the identification of collagens and other proline-rich proteins are greatly hampered [114, 116, 117]. An approach has been suggested that is based on the application of five different proteolytic enzymes to increase sequence coverage of collagenous proteins. Thereafter, the analytes were separated by nano-LC and introduced into a linear ion trap–orbitrap instrument. Differently modified peptides with the same sequence were eluted and ionized together producing chimeric mass spectra. As ETD-induced fragmentation did not yield sufficient amount of data, additional dissociation techniques (CID and HCD) were also applied. In general, multistage activation made the identification of PTM-carrying residues possible, however, in some cases, the exact localization of the modification has remained unknown [114].

Table 2 summarizes the separation/enrichment techniques, fragmentation methods, and commonly used derivatization methods of modified peptides and proteins.


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A High Resolution Mass Spectrometry Study Reveals the Potential of Disulfide Formation in Human Mitochondrial Voltage-Dependent Anion Selective Channel Isoforms (hVDACs)

The voltage-dependent anion-selective channels (VDACs), which are also known as eukaryotic porins, are pore-forming proteins, which allow for the passage of ions and small molecules across the outer mitochondrial membrane (OMM). They are involved in complex interactions that regulate organelle and cellular metabolism. We have recently reported the post-translational modifications (PTMs) of the three VDAC isoforms purified from rat liver mitochondria (rVDACs), showing, for the first time, the over-oxidation of the cysteine residues as an exclusive feature of VDACs. Noteworthy, this peculiar PTM is not detectable in other integral membrane mitochondrial proteins, as defined by their elution at low salt concentration by a hydroxyapatite column. In this study, the association of tryptic and chymotryptic proteolysis with UHPLC/High Resolution nESI-MS/MS, allowed for us to extend the investigation to the human VDACs. The over-oxidation of the cysteine residues, essentially irreversible in cell conditions, was as also certained in VDAC isoforms from human cells. In human VDAC2 and 3 isoforms the permanently reduced state of a cluster of close cysteines indicates the possibility that disulfide bridges are formed in the proteins. Importantly, the detailed oxidative PTMs that are found in human VDACs confirm and sustain our previous findings in rat tissues, claiming for a predictable characterization that has to be conveyed in the functional role of VDAC proteins within the cell. Data are available via ProteomeXchange with identifier PXD017482.

Palabras clave: Cysteine over-oxidation Orbitrap Fusion Tribrid hydroxyapatite mitochondria mitochondrial intermembrane space outer mitochondrial membrane post-translational modification.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Cifras

Sequence coverage map of hVDAC1…

Sequence coverage map of hVDAC1 obtained by tryptic and chymotryptic digestion. The gray…

MS/MS spectrum of the doubly…

MS/MS spectrum of the doubly charged molecular ion at m/z 1083.9756 (calculated 1083.9754)…

MS/MS spectrum of the triply…

MS/MS spectrum of the triply charged molecular ion at m/z 812.0634 (calculated 812.0635)…

Sequence coverage map of hVDAC2…

Sequence coverage map of hVDAC2 obtained by tryptic and chymotryptic digestion. Gray solid…

Sequence coverage map of hVDAC3…

Sequence coverage map of hVDAC3 obtained by tryptic and chymotryptic digestion. The gray…

Scheme of the cysteine localization…

Scheme of the cysteine localization in the aligned sequences of human VDAC isoforms.…


The basics of mass spectrometry

Since their inception in 1912, mass spectrometers have undergone continuous development, and these sophisticated bioanalytical instruments have now reached unrivalled detection limits, speed and diversity in applications. They detect the presence and abundance of peptides (or other biomolecules such as metabolites, lipids and proteins) using fundamental properties of molecules, such as mass, and net charge. When peptides obtain a net charge (usually through gain of protons), they are referred to as peptide ions.

All mass spectrometers have three fundamental components: an ion source, mass analyser and detector (Figure 1A). As mass spectrometers can only analyse gaseous ions, methods such as electrospray ionization (ESI) are needed to convert peptides from the liquid phase to gaseous ions. The liquid containing the peptides is pumped through a micrometre-sized orifice held at a high voltage (2–4 kV). Upon reaching this emitter, the steady stream of liquid disintegrates into extremely small, highly charged and rapidly evaporating charged droplets, leaving peptide ions in the gas phase. Even 20 years after John Fenn received the Nobel Prize for this discovery, the exact mechanisms are not completely understood. We know that the abundance of gaseous peptide ions is proportional to their original concentration, making it beneficial to use the lowest flow rates possible, thereby maximizing sensitivity. It is common in proteomics to separate peptide mixtures using high-performance liquid chromatography (HPLC) systems with flow rates of only a few hundred nanolitres per minute rather than millilitres in conventional HPLC.

Overview of sample preparation and instrumentation used in MS-based proteomics. (A) Proteins are digested into peptides using sequence-specific proteases. Optionally, post-translational modification (PTM)-containing peptides can be enriched using beads with specific surface chemistry or coupled antibodies. High-performance liquid chromatography (HPLC) separates peptides based on hydrophobicity, and they are subsequently analysed by a TOF mass spectrometer. (B) Alternatively, peptides can be analysed by an Orbitrap mass spectrometer, which is a mainstream instrument in proteomics.

The principal role of a mass analyser is to separate ions by their mass-to-charge ratios (m/z). Fundamentally, all ions are separated by modulating their trajectories in electrical fields. Mass analysers differ in the principle they use for separating ions, and this defines their preferred application areas. Quadrupoles, usually combined with time-of-flight (TOF) or Orbitrap analysers, are the most common in proteomics. Quadrupole mass analysers separate ions using an oscillating electrical field between four cylindrical rods in a parallel arrangement, where each pair of rods produces a radio frequency electrical field with a phase offset. The resulting electrical fields define a pseudo-potential surface that is configured to allow the transmission of all ions, or to selectively transmit ions of a specific m/z window.

TOF mass analysers separate ions based on the differences in velocities after acceleration to about 20 kV and subsequent different arrival times at the detector. A TOF can measure mass differences of one part per million (ppm) by detecting time differences of sub-microseconds. In contrast, the Orbitrap mass analyser distinguishes ions based on their oscillation frequencies. Ions are tangentially injected and then trapped in the Orbitrap, and they move along the length axis of a central metal spindle (Figure 1B). Although an Orbitrap is only a few centimetres long, the ions can rapidly travel up to several kilometres, enabling very high resolution (typically tens of thousands) and low ppm mass accuracy.

In proteomics, the quadrupole element is normally followed by a ‘collision cell’, which is a quadrupole where the ions can be fragmented. Either intact peptide ions or fragment ions enter the final stage that also contains the detector – the resulting spectra are called MS 1 or precursor ion spectra in the former case and MS 2 or product or MS/MS spectra in the latter. TOF instruments have microchannel plate (MCP) detectors, where each individual ion ejects electrons from a surface that are then amplified. Individual ions can be readily measured with MCPs, but this exquisite sensitivity comes with the caveat that the detector can easily saturate in case of high signals. In Orbitrap analysers, the ‘image current’ induced by the rapidly oscillating ions is measured, and it represents a quantitative readout of the strength of the individual ion packages. The current is recorded in the time domain and is converted into the frequency domain using Fourier transformation. Advances in signal processing algorithms have repeatedly doubled the achievable resolution with a given transient time of the signal, but these are still orders of magnitude slower than those of TOF analysers (tens to hundreds of milliseconds vs typically 100 microseconds for a single TOF pulse).

How do the MS instruments sequence or identify peptides? Precursor ions with a specific m/z are first isolated by the quadrupole and fragmented through collision with inert gases such as N2, He or Ar. This causes them to break apart at the lowest energy bonds – typically, some of the amide bonds (peptide bonds) connecting the amino acid residues – and leaves MS/MS spectra with incomplete ladders of peaks differing by amino acid masses. This information is incredibly specific and is used for identification of the peptide sequence. A sequence of just a few amino acids and the flanking masses – a peptide sequence tag – is sufficient for identifying a peptide from the entirety of human proteome. More usually, database identification involves generating all possible fragmentation spectra and then statistically scoring them against the experimental spectra.

The chromatographic retention time is an important level of information when matching a dataset against a previous measurement and is key to ‘targeted proteomics’ technologies. Furthermore, ion mobility analysis, an additional dimension of separation of peptide ions, has recently become mainstream. Ions are either filtered based on their cross-section (FAIMS, field asymmetric ion mobility spectrometry) or actually separated during their analysis (T-Wave or TIMS, trapped ion mobility spectrometry). TIMS is the basis of the parallel accumulation–serial fragmentation (PASEF) technology, which multiplies sequencing speed 10-fold while improving sensitivity.


Abstracto

Protozoan parasitic infections are health, social and economic issues impacting both humans and animals, with significant morbidity and mortality worldwide. Protozoan parasites have complicated life cycles with both intracellular and extracellular forms. As a consequence, protozoan adapt to changing environments in part through a dynamic enzyme-catalyzed process leading to reversible posttranslational modifications (PTMs). The characterization by proteomics approaches reveals the critical role of the PTMs of the proteins involved in host-pathogen interaction. The complexity of PTMs characterization is increased by the high diversity, stoichiometry, dynamic and also co-existence of several PTMs in the same moieties which crosstalk between them. Here, we review how to understand the complexity and the essential role of PTMs crosstalk in order to provide a new hallmark for vaccines developments, immunotherapies and personalized medicine. In addition, the importance of these motifs in the biology and biological cycle of kinetoplastid parasites is highlighted with key examples showing the potential to act as targets against protozoan diseases.


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