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3.3: Ejemplo de mutaciones humanas - Biología

3.3: Ejemplo de mutaciones humanas - Biología


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Fibrosis quística (FQ): autosmica recesiva

Fibrosis quística (FQ) es una de las muchas enfermedades que los genetistas han demostrado que es causada por la mutación de un solo gen bien caracterizado. La enfermedad se debe a una mutación en el CFTR (Regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística), que fue identificado por Lap-chee TsuiDel grupo de la Universidad de Toronto.

Los tejidos epiteliales de algunos órganos dependen de la proteína CFTR para transportar iones (especialmente Cl-) a través de sus membranas celulares. El paso de iones a través de un canal de seis lados está controlado por otra parte de la proteína CFTR, que se une al ATP. Si la actividad de CFTR es insuficiente, se produce un desequilibrio en la concentración de iones, lo que altera las propiedades de la capa líquida que normalmente se forma en la superficie epitelial. En los pulmones, esto hace que la mucosidad se acumule y puede provocar una infección. Los defectos en el CFTR también afectan al páncreas, el hígado, los intestinos y las glándulas sudoríparas, todos los cuales necesitan este transporte de iones. El CFTR también se expresa en niveles elevados en la glándula salival y la vejiga, pero los defectos en la función del CFTR no causan problemas en estos órganos, probablemente porque otros transportadores de iones son capaces de compensar.

Se han descrito más de mil alelos mutantes diferentes de CFTR. Cualquier mutación que evite que CFTR transporte iones suficientemente puede conducir a fibrosis quística (FQ). En todo el mundo, el alelo CFTR más común entre los pacientes con FQ se llama ΔF508 (delta-F508; o PHE508DEL), que es una deleción de tres nucleótidos que elimina una fenilalanina de la posición 508 de la proteína de tipo salvaje de 1480 aa. La mutación ΔF508 hace que el CFTR se pliegue incorrectamente en el retículo endoplásmico (RE), lo que evita que el CFTR alcance la membrana celular. ΔF508 representa aproximadamente el 70% de los casos de FQ en América del Norte, con ~ 1/25 personas de ascendencia europea que son portadoras. La alta frecuencia del alelo ΔF508 ha llevado a la especulación de que puede conferir alguna ventaja selectiva a los heterocigotos, quizás al reducir la deshidratación durante las epidemias de cólera o al reducir la susceptibilidad a ciertos patógenos que se unen a las membranas epiteliales.

El CFTR también es notable porque es una de las enfermedades genéticas bien caracterizadas para las que se ha desarrollado un fármaco que compensa los efectos de una mutación específica. La droga, Kalydeco, fue aprobado por la FDA y Health Canada en 2012, décadas después de que el gen CFTR fuera mapeado por primera vez en marcadores de ADN (en 1985) y clonado (en 1989). Kalydeco es eficaz solo en algunas mutaciones de CFTR, más notablemente G551D (es decir, donde la glicina se sustituye por ácido aspártico en la posición 551 de la proteína; GLY551ASP). Esta mutación se encuentra en menos del 5% de los pacientes con FQ. La mutación G551D afecta la capacidad del ATP para unirse a CFTR y abrir el canal para su transporte. Kalydeco compensa la mutación uniéndose a CFTR y manteniéndolo en una conformación abierta. Se espera que Kalydeco cueste aproximadamente $ 250,000 por paciente por año.


Los humanos todavía están evolucionando: 3 ejemplos de adaptaciones recientes

La evolución es un proceso continuo, aunque muchos no se dan cuenta de que la gente todavía está evolucionando. Eso es verdad Homo sapiens se ve muy diferente a Australopithecus afarensis, un homínido primitivo que vivió hace unos 2,9 millones de años. Pero también es cierto que somos muy diferentes en comparación con los miembros de nuestra misma especie, Homo sapiens, que vivió hace 10.000 años, y es muy probable que seamos diferentes de los humanos del futuro.

Lo que comemos, cómo usamos nuestro cuerpo y con quién elegimos tener hijos son solo algunos de los muchos factores que pueden hacer que el cuerpo humano cambie. Las mutaciones genéticas conducen a nuevos rasgos, y con la población mundial ahora por encima de los 7 mil millones y en aumento, las posibilidades de mutaciones genéticas sobre las que la selección natural puede actuar potencialmente están aumentando.

¿No nos crees? Inverso presenta tres ejemplos de cambios recientes en el cuerpo humano.

Reciente, es decir, en evolutivo condiciones. Después de todo, Homo sapiens sólo han existido durante unos 200.000 años, y la Tierra tiene casi 4.500 millones de años.

3. Nos estamos enfriando

En 1868, un médico alemán publicó un manual médico que establecía 98,6 grados Fahrenheit como la temperatura humana "normal". Desde entonces, se ha aceptado generalmente a 98,6 grados como la temperatura media. Por encima de eso, tienes fiebre. Debajo de eso, tienes hipotermia.

Pero esta temperatura de Ricitos de Oro se está volviendo obsoleta rápidamente. En enero, los científicos descubrieron que en realidad somos mucho más geniales de lo que pensamos.

Según su estudio, publicado este enero en la revista eLife, es mucho más probable que la temperatura media sea 97,9 grados.

El equipo analizó los registros médicos de los últimos 200 años, que incluían mediciones de temperatura. Descubrieron que, promediados en conjunto, los registros indican que ha habido una disminución gradual de la temperatura corporal de 0,05 grados Fahrenheit cada década.

Julie Parsonnet, autora principal del estudio y profesora de medicina en la Universidad de Stanford, dice Inverso que esta tendencia de enfriamiento probablemente esté relacionada con una disminución de la inflamación en toda la población y mejores niveles de vida.

Muchas de las enfermedades infecciosas que eran comunes en el siglo XIX habrían causado inflamación crónica, que a su vez quema calorías y aumenta la tasa metabólica de una persona, aumentando su temperatura interna, dice ella. Debido a que las personas ya no luchan contra estas enfermedades al mismo ritmo, ese cambio se reflejaría en la temperatura corporal, teoriza.

Vivir cómodamente en interiores también puede haber afectado profundamente a los seres humanos. A diferencia de nuestros antepasados, "no tenemos que trabajar demasiado para estar a temperaturas fisiológicamente neutrales que no graven nuestro metabolismo", dice Parsonnet.

Si bien una vida más saludable probablemente impulsó esta tendencia de enfriamiento, no está claro si tener una temperatura más baja necesariamente también mejora nuestra salud. El cambio parece significar que necesitamos unas 150 calorías menos por día para mantener nuestras necesidades metabólicas básicas que en el pasado, dice. Pero aún hay que resolver cualquier otra consecuencia, y aunque es posible que necesitemos menos calorías, no parece que comamos menos.

“Somos mucho más saludables que los humanos del siglo XIX”, dice Parsonnet. Y todavía. "Nos hemos vuelto más gordos, más altos y nos hemos vuelto más frescos. ¿Podemos enfriarnos aún más? Eso espero, pero no estoy seguro de cuánto ".

2. Nuestros genes cambian constantemente

Los humanos no son inmunes a los efectos de la selección natural, dice Joshua Akey, profesor de la Universidad de Princeton. Inverso. Muchas de las mismas presiones que hemos enfrentado a lo largo de la historia de la raza humana, como los patógenos, todavía existen y amenazan nuestra salud hoy. Pero nuestro entorno ha cambiado drásticamente, y eso tiene que tener un impacto, dice.

“Nuestro entorno es ciertamente diferente de lo que era hace un siglo, y no es difícil imaginar que cosas como la evolución de la cultura genética jueguen un papel aún más prominente en el futuro de la evolución humana”, dice Akey..

Su ejemplo favorito de reciente positivo La selección es FADS2, que se cree que es un gen dietético importante. Las diferentes versiones de este gen son adaptables en diferentes poblaciones, dependiendo de si tienen o no más dietas a base de carne o vegetales, dice Akey. Por ejemplo: en 2016, los científicos descubrieron que, a lo largo de generaciones, consumir dietas vegetarianas provocaba que una población de Pune, India, mostrara una frecuencia más alta de una mutación específica en el gen FADS2. La mutación les permitió procesar de manera eficiente los ácidos grasos omega-3 y omega-6 de fuentes no cárnicas y convertirlos en compuestos esenciales para la salud del cerebro, algo para lo que las personas que siguen dietas omnívoras no están necesariamente adaptadas.

Al mismo tiempo, también están aumentando los genes que controlan la tolerancia a la lactosa. Hace varios miles de años, la enzima que ayuda a las personas a beber leche sin enfermarse se apagaba cuando las personas alcanzaban la edad adulta. Pero las mutaciones genéticas posteriores que surgieron en todo el mundo durante un período de tiempo de entre 2.000 y 20.000 años han ayudado a las personas a tolerar los productos lácteos hasta bien entrada la edad. Los investigadores estiman que, en África Oriental, ese cambio genético ocurrió hace tan solo 3.000 años, cuando la cría de ganado se convirtió en una parte más importante de la vida humana.

Las transiciones en la forma en que vivimos nuestras vidas, como pasar de pastor nómada a granjero, luego de granjero a trabajador industrial, a menudo impulsan estas adaptaciones genéticas. Otro ejemplo de esto es un vínculo aparente entre la vida urbana y estar mejor adaptado para combatir la tuberculosis. En 2010, los científicos encontraron una asociación estadísticamente significativa entre las poblaciones que tienen una historia profunda de urbanización y un gen que está asociado con la resistencia a la tuberculosis. Esa innovación evolutiva probablemente ocurrió en los últimos 8.000 años.

Mark Thomas, profesor del University College de Londres, es uno de los investigadores que descubrió ese vínculo. Él dice Inverso que, antes de convertirse en agricultores asentados, las poblaciones humanas estuvieron expuestas a un conjunto diferente de enfermedades infecciosas en comparación con las que nos preocupan hoy. Estas enfermedades eran más "oportunistas y crónicas", como los gusanos, dice. Cuando la sociedad humana se trasladó a grandes asentamientos urbanos, las enfermedades también cambiaron.

“Durante los últimos 10.000 años hemos evolucionado en respuesta a los tipos de enfermedades a las que estamos expuestos”, dice Thomas. “La resistencia a los patógenos es en gran parte genética, por lo que eso significa que ocurre la selección natural. Es uno de los principales tipos de selección natural en curso en todos los espacios ".

1. Nuestros huesos se vuelven más livianos

En comparación con otros homínidos, los huesos humanos son más débiles y menos densos. En un estudio de 2015, los científicos plantearon la hipótesis de que Homo sapiens Los huesos empezaron a debilitarse hace unos 12.000 años, cuando la gente empezó a cultivar más. Con la agricultura establecida, nuestras dietas cambiaron, la actividad física cambió y, a su vez, nuestros esqueletos se volvieron más livianos y más frágiles.

El estudio encontró que el tejido óseo trabecular, el tejido poroso y esponjoso que se encuentra al final de los huesos largos como el fémur, disminuyó en grosor y volumen. La menor caza nómada y la cría de ganado más asentada significaron que disminuyó la necesidad de huesos más pesados ​​y duraderos. Este cambio en la densidad ósea persiste hoy en los seres humanos modernos.

"Nuestro estudio muestra que los humanos modernos tienen menos densidad ósea que la observada en especies relacionadas, y no importa si miramos los huesos de personas que vivían en una sociedad industrial o poblaciones agrícolas que tenían una vida más activa", explicó el autor principal. Habiba Chirchir, antropóloga biológica.

En un artículo de 2014, los científicos también determinaron que nuestros esqueletos se han vuelto mucho más livianos desde el auge de la agricultura. Argumentan que la reducción de la actividad física, más que un cambio de dieta, es la causa principal de la degradación de la fuerza ósea humana. Es probable que la tendencia continúe: la gente se mueve menos ahora que nunca, dijeron los investigadores.

"Solo en los últimos 50 a 100 años hemos sido tan sedentarios, peligrosamente", explicó el coautor Colin Shaw, investigador de la Universidad de Cambridge. "Sentarnos en un automóvil o frente a un escritorio no es para lo que hemos evolucionado".

Los humanos tienen la capacidad de ser tan fuertes como un orangután, dicen Shaw y su equipo. Pero no lo somos porque no desafiamos nuestros huesos. Solo el tiempo dirá si nuestros huesos cambiarán una vez más para permitirnos desafiarlos con fuerza en el futuro.

También veremos si ocurren más cambios en el cuerpo, y si podemos ayudarnos o no con las nuevas tecnologías, como la edición de genes. Algunos científicos plantean la hipótesis de que los humanos superarán el ritmo de la evolución con nuestros propios inventos. Independientemente de si eso sucede o no, una cosa es cierta: nuestra biología nunca se detendrá.


Métodos

Base de datos del genoma

La base de datos de agregación del genoma (gnomAD versión 2.1.1) ha reunido datos de la secuencia del exoma de 125 748 individuos no relacionados con una edad media de 55 años pero que abarcan el espectro de la edad adulta. 21 El gnomAD excluye a las personas con enfermedades graves de inicio pediátrico, incluidos los síndromes de IBMF y las neoplasias malignas. Las características demográficas del conjunto de datos de gnomAD y las cohortes de las que se deriva se resumen en las Tablas complementarias 1 y 2. Para la validación, utilizamos 2 conjuntos de datos de genomas independientes de 71 702 genomas secuenciados incluidos en gnomAD versión 3.0 y 15708 genomas incluidos en gnomAD versión 2.1.1 (tablas complementarias 3 y 4).

Selección de genes IBMF

Se interrogaron cien genes con variantes conocidas asociadas con la predisposición IBMF / MDS para las variantes de pLoF. Este panel de genes contiene genes incluidos en el panel de secuenciación IBMF de próxima generación aprobado por las Enmiendas de mejora de laboratorio clínico en el Hospital Infantil de Filadelfia (CHOP), complementado con genes asociados con IBMF / MDS informados después de la creación del panel CHOP IBMF. 22 Genes que median la enfermedad a través de la ganancia de función o mecanismos dominantes-negativos similares (p. Ej., ELANE) fueron excluidos.

Variantes de LoF

Usamos el Estimador de efecto de transcripción de pérdida de función (LOFTEE), un proceso de filtrado estricto, para identificar variantes de pLoF de alta confianza en IBMF y genes asociados al síndrome de predisposición. 21 Como se describió anteriormente, el predictor de efecto variante identifica variantes de pLoF de alta confianza que causan parada prematura, desplazamiento de marco o alteración de 2 nucleótidos esenciales del sitio de empalme. Las variantes putativas se filtraron a través de LOFTEE y se eliminaron las variantes que se preveía que escaparían a la descomposición mediada por tonterías. Como control de calidad, las variantes de un subgrupo de genes se curaron manualmente, lo que demuestra que los algoritmos de filtrado computacional seleccionaron estrictamente las verdaderas variantes de LoF. Las variantes de pLoF únicas observadas que surgen de variantes de un solo nucleótido (SNV) se informaron para cada gen y se compararon con el número esperado de variantes de pLoF mediante el uso de algoritmos descritos anteriormente que incorporaron variables como el tamaño del gen, la mutabilidad y el estado de metilación. La frecuencia agregada de todas las variantes de pLoF en cada gen se determinó como una suma de los SNV y las inserciones / deleciones que se predice que causan LoF. Estimamos la carga mutacional para cada gen y, en conjunto, para cada subgrupo de enfermedad (p. Ej., Trastornos de la biología de los telómeros, trastornos hereditarios de los glóbulos rojos). Se calculó la frecuencia de haploinsuficiencia de los genes con un fenotipo clínico informado tanto en estados de inactivación haploinsuficiente como bialélica. En la Figura 1 se muestra un diagrama del flujo de trabajo analítico.

Canalización de análisis de variantes de IBMF. El diagrama de flujo del flujo de trabajo analítico para el análisis de variantes de pLoF en 100 genes vinculados a IBMF y predisposición a malignidad hematológica. RPS17 se encuentra en una duplicación segmentaria y, por lo tanto, no es susceptible de análisis basado en secuencias en el conjunto de datos de gnomAD. indels, inserciones / deleciones WES, secuenciación del exoma completo.

Canalización de análisis de variantes de IBMF. El diagrama de flujo del flujo de trabajo analítico para el análisis de variantes de pLoF en 100 genes vinculados a IBMF y predisposición a malignidad hematológica. RPS17 se encuentra en una duplicación segmentaria y, por lo tanto, no es susceptible de análisis basado en secuencias en el conjunto de datos de gnomAD. indels, inserciones / deleciones WES, secuenciación del exoma completo.

Cálculos de tolerancia / intolerancia genética (restricción evolutiva)

La proporción de haplotipos con variantes de pLoF se calculó como se describió anteriormente para determinar la frecuencia de pLoF agregada para cada gen. 21 Estos datos se analizaron utilizando 2 métricas de restricción mutacional que detectan el agotamiento de la variación en la evolución humana reciente. El primero, "la fracción de límite superior esperada / observada con pérdida de función" (LOEUF), representa una estimación conservadora de la relación entre las variantes de pLoF observadas y esperadas. La LOEUF para los genes IBMF se calculó como se describió anteriormente, determinando la proporción observada / esperada de mutaciones en cada gen y calculando el intervalo de confianza alrededor de esa proporción. El límite superior del intervalo de confianza se utilizó como una estimación conservadora de la razón observada / esperada. Para facilitar la interpretación, las estimaciones del límite superior observado / esperado para cada gen en el genoma humano se agruparon en deciles de 1920 genes cada uno. Los deciles de la LOEUF van de 0 (más empobrecido / con limitaciones evolutivas) a 9 (no reducido / limitado). También se analizó cada gen mediante el uso de la puntuación de "probabilidad de intolerancia a la pérdida de función" (pLI). pLI se ha establecido previamente para estimar la probabilidad de que LoF en un alelo genético provoque un fenotipo haploinsuficiente y estima la probabilidad de que un gen pertenezca a la clase de genes haploinsuficientes de LoF. Se demostró previamente que pLI separa los genes de longitud adecuada en aquellos intolerantes (pLI ≥ 0,9) o tolerantes (pLI ≤ 0,1) a LoF. 23

Análisis estadístico

El estudiante t La prueba se utilizó para comparar el agotamiento / restricción de pLoF en genes asociados con IBMF frente a los genes restantes en el genoma. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para el análisis de distribución por sexo. Las puntuaciones de LOEUF fueron previamente validadas estadísticamente. 21 El conjunto de datos de gnomAD de 125 748 exomas proporcionó la potencia suficiente para permitir el cálculo de la puntuación de LOEUF para todos los genes en los que la frecuencia de variante de pLoF esperada era variantes de & gt9.2 en toda la cohorte del exoma. Para los genes que habían esperado pLoF & lt9.2, incluimos el pLoF observado y esperado y las frecuencias variantes, pero no el decil de LOEUF o pLI.


Métodos

Recopilación de datos

Recopilamos la versión reciente de todos los datos de SNP humanos de NCBI dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) (Versión: Build 150. Última descarga: enero de 2018). Los SNP comunes y todos están etiquetados de forma distinta en el sitio web. La lista de 719 genes humanos relacionados con el cáncer (Archivo adicional 1: Tabla S1) se descargó de la última versión del sitio web del censo de genes del cáncer (CGC, https://cancer.sanger.ac.uk/census/). Las secuencias del genoma de referencia de humanos (H. sapiens, versión hg19) y mouse (M. musculus, versión mm10) se descargaron de UCSC Genome Browser (genome.ucsc.edu), y el genoma de referencia del macaco rhesus (M. mulatta, Ensembl versión v89) se descargó de Ensembl Genome Browser (www.ensembl.org).

Anotación de SNP humanos

Anotamos los sitios SNP utilizando el genoma humano hg19 descargado de UCSC Genome Browser (genome.ucsc.edu). Si un SNP golpea múltiples isoformas del mismo gen, se retuvo la transcripción con el CDS (transcripción canónica) más larga. La transcripción canónica de cada gen fue definida por el software SnpEff (versión 4.2) [33]. Si un SNP no afecta a ningún gen, se anota como intergénico. Los genes con al menos un SNP común en CDS se dan en Archivo adicional 2: Tabla S2. Toda la información de un SNP dado en CDS, incluida la posición en CDS, el aminoácido antes y después de la mutación, se infirió del archivo de salida de SnpEff.

Análisis de conservación

El nivel de conservación de las posiciones genómicas se mide mediante la puntuación phyloP (archivo hg19.100way.phyloP100way.bw, descargado de UCSC Genome Browser, genome.ucsc.edu). En resumen, los sitios con un nivel de conservación más alto tienen puntuaciones phyloP más altas. Los sitios ortólogos (coordenadas genómicas) entre humanos y ratones o entre humanos y macacos rhesus se transfirieron con liftOver [34] basándose en las alineaciones genómicas por parejas. Los archivos de la cadena liftOver se descargaron del sitio web UCSC Genome Browser (http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/liftOver/). Se utilizó Bedtools (versión 2.25) [35] para extraer secuencias de una región determinada de acuerdo con el genoma de referencia.

Sesgo de uso de codones

El protocolo de cálculo del sesgo de uso de codones se llevó a cabo en un estudio anterior [21]. El sesgo de codones de un gen se calcula mediante la desviación (chi-cuadrado) del contenido A / T de codones sinónimos del de las regiones intrónicas. Una desviación más alta indica un sesgo de codón más fuerte para un gen. El sesgo del codón de un codón particular es el coeficiente de correlación entre la frecuencia del codón dentro de una familia de codones sinónimos y la desviación (valor de chi-cuadrado) de cada gen [21]. Un coeficiente de correlación más alto sugiere un sesgo más fuerte (preferido) para un codón.

Resumimos la tubería de la siguiente manera:

Los 59 codones de sentido (sin ATG, TGG y tres codones de terminación) se clasifican en 21 familias de codones sinónimos. Leu (L), Arg (R) y Ser (S) tienen seis codones, por lo que una sola mutación a veces no puede cambiar un codón a otro (por ejemplo, AGT y TCT codifican Ser pero una sola mutación no puede cambiar uno a otro ). Por lo tanto, cada uno de estos aminoácidos debe dividirse en dos familias de codones sinónimos [21].

Para cada uno de la familia de codones sinónimos dentro de cada gen, calculamos la desviación (chi cuadrado) del contenido de A / T en la posición del codón 3 del contenido intrónico de A / T (59% en humanos). Tomemos el codón AAG de Lys (K), por ejemplo, la familia "K" tiene dos codones AAG y AAA. En el gen X, supongamos:

OAAA = número observado de codones AAA.

OAAG = número observado de codones AAG.

miAAA = (OAAA + OAAG) × 0,59, el número esperado de codones AAA (dentro de la familia "K").

miAAG = (OAAA + OAAG) x (1–0,59), el número esperado de codones AAG (dentro de la familia "K").

Chi cuadrado (X 2 ) [familia K, gen X] = chisq.test (matriz (c (OAAA, OAAG, EAAA, EAAG), ncol = 2)) $ estadísticas. “Chisq.test” es una función en lenguaje R (http://www.R-project.org/) para realizar pruebas de chi cuadrado.

Para cada gen, el nivel de gen CUB es el "chi cuadrado escalado", que es la suma de los valores de chi cuadrado de las familias de codones dentro de este gen normalizados por la longitud del péptido. Un valor de "chi cuadrado escalado" más alto indica CUB más fuerte para un gen.

Para cada uno de los 59 codones de sentido, el nivel de codón CUB (preferencia de codón) se mide mediante el método de Spearman. Rho. De nuevo, tome el codón AAG de Lys, por ejemplo (la bibliografía original también tomó este codón como ejemplo, consulte la Fig. 1 de Akashi 1995), la familia "K" tiene dos codones AAG y AAA. El eje Y es la frecuencia de AAG entre "AAG + AAA" en cada gen (cada punto representa un gen). El eje X es el correspondiente valor de chi cuadrado escalado de cada gen (Akashi 1995 Fig. 1). El nivel de codón CUB (preferencia de codón) es el de Spearman Rho entre el eje X y el eje Y. Rho & gt 0 indica un codón preferido y Rho & lt 0 indica un codón no preferido [21]. En humanos, el Rho el valor para el codón AAG es 0,74.

Este algoritmo se implementó en todos los genes humanos y los 59 codones de sentido. Existe una tendencia a que se prefieran los codones de terminación G / C y no se prefieren los codones de terminación A / T.

El panorama de los SNP humanos. a Un diagrama esquemático que muestra el filtrado de SNP según los sitios ortólogos en los genomas de mono rhesus y ratón. El árbol filogenético no tiene escala. B Un diagrama esquemático que muestra la definición de SNP de uni-mutación. árbitro., referencia. Mut., mutación. C las fracciones de diferentes tipos de mutaciones. D Las anotaciones y proporciones de SNP genómicos (izquierda) y SNP exónicos (derecha) después de los pasos de filtrado anteriores. Las imágenes prediseñadas de humano / mono / ratón fueron dibujadas por nosotros mismos.

Para un codón dado, el sesgo del codón delta (o de manera similar, la frecuencia del codón delta) es la diferencia entre los valores de sesgo del codón de las versiones "post-mutación" y "pre-mutación". El sesgo del codón delta (o de manera similar, la frecuencia del codón delta) de un gen se define como el valor delta medio de todos los SNP en la región codificante de este gen.

Cálculo del nivel de expresión génica en células HeLa humanas

Buscamos en la base de datos pública y elegimos un conjunto de datos NGS realizado en células HeLa humanas (GES63591) [36]. Se usó la biblioteca de ARNm-Seq (control si) para definir el nivel de expresión génica. Hemos alineado las lecturas de mRNA-Seq NGS con el genoma de referencia de hg19 utilizando STAR (versión 2.7) [37]. Las lecturas mapeadas de forma única se conservaron para el análisis posterior. Los recuentos de lectura de cada gen se calcularon mediante htseq-count (versión 0.5.4) [38]. En este cálculo de expresión génica, se eligió la transcripción canónica de cada gen y se contaron todas las lecturas superpuestas con las regiones del exón. Los genes altamente expresados ​​(9903 genes en total) se definen como genes con recuento de lecturas & gt 100. Además, según los SNP que recuperamos, hay 17,940 genes que tienen SNP en sus CDS. 649 de los 719 genes relacionados con el cáncer (como se mencionó anteriormente) pertenecen a estos 17,940 genes. Cuando solo consideramos los 9903 genes altamente expresados ​​en las células HeLa, 8857 se superpusieron con los 17,940 genes con SNP, y 439 de ellos pertenecen a genes relacionados con el cáncer y 8418 son otros genes. Los análisis que tienen en cuenta el nivel de expresión génica se llevan a cabo utilizando estos 439 genes relacionados con el cáncer frente a otros 8418 genes.

Análisis estadístico y disponibilidad de código

Todos los análisis estadísticos (pruebas de correlación, pruebas exactas de Fisher, pruebas de suma de rangos de Wilcoxon) y el trabajo gráfico se realizaron en el entorno R (http://www.R-project.org/) (versión 3.3.3). Todos los códigos utilizados en los análisis están disponibles bajo pedido.


Métodos

Base de datos del genoma

La base de datos de agregación del genoma (gnomAD versión 2.1.1) ha reunido datos de la secuencia del exoma de 125 748 individuos no relacionados con una edad media de 55 años pero que abarcan el espectro de la edad adulta. 21 El gnomAD excluye a las personas con enfermedades graves de inicio pediátrico, incluidos los síndromes de IBMF y las neoplasias malignas. Las características demográficas del conjunto de datos de gnomAD y las cohortes de las que se deriva se resumen en las Tablas complementarias 1 y 2. Para la validación, utilizamos 2 conjuntos de datos de genomas independientes de 71 702 genomas secuenciados incluidos en gnomAD versión 3.0 y 15708 genomas incluidos en gnomAD versión 2.1.1 (tablas complementarias 3 y 4).

Selección de genes IBMF

Se interrogaron cien genes con variantes conocidas asociadas con la predisposición IBMF / MDS para las variantes de pLoF. Este panel de genes contiene genes incluidos en el panel de secuenciación IBMF de próxima generación aprobado por las Enmiendas de mejora de laboratorio clínico en el Hospital Infantil de Filadelfia (CHOP), complementado con genes asociados con IBMF / MDS informados después de la creación del panel CHOP IBMF. 22 Genes que median la enfermedad a través de la ganancia de función o mecanismos dominantes-negativos similares (p. Ej., ELANE) fueron excluidos.

Variantes de LoF

Utilizamos el Estimador de efecto de transcripción de pérdida de función (LOFTEE), un proceso de filtrado estricto, para identificar variantes de pLoF de alta confianza en IBMF y genes asociados al síndrome de predisposición. 21 Como se describió anteriormente, el predictor de efecto variante identifica variantes de pLoF de alta confianza que causan parada prematura, desplazamiento de marco o alteración de 2 nucleótidos esenciales del sitio de empalme. Las variantes putativas se filtraron a través de LOFTEE y se eliminaron las variantes que se predijo que escaparían a la descomposición mediada por tonterías. Como control de calidad, las variantes de un subgrupo de genes se curaron manualmente, lo que demuestra que los algoritmos de filtrado computacional seleccionaron estrictamente las verdaderas variantes de LoF. Las variantes de pLoF únicas observadas que surgen de variantes de un solo nucleótido (SNV) se informaron para cada gen y se compararon con el número esperado de variantes de pLoF mediante el uso de algoritmos descritos anteriormente que incorporaron variables como el tamaño del gen, la mutabilidad y el estado de metilación. La frecuencia agregada de todas las variantes de pLoF en cada gen se determinó como una suma de los SNV y las inserciones / deleciones que se predice que causan LoF. Estimamos la carga mutacional para cada gen y, en conjunto, para cada subgrupo de enfermedad (p. Ej., Trastornos de la biología de los telómeros, trastornos hereditarios de los glóbulos rojos). Se calculó la frecuencia de haploinsuficiencia de los genes con un fenotipo clínico informado tanto en estados de inactivación haploinsuficiente como bialélica. En la Figura 1 se muestra un diagrama del flujo de trabajo analítico.

Canalización de análisis de variantes de IBMF. El diagrama de flujo del flujo de trabajo analítico para el análisis de variantes de pLoF en 100 genes vinculados a IBMF y predisposición a malignidad hematológica. RPS17 se encuentra en una duplicación segmentaria y, por lo tanto, no es susceptible de análisis basado en secuencias en el conjunto de datos de gnomAD. indels, inserciones / deleciones WES, secuenciación del exoma completo.

Canalización de análisis de variantes de IBMF. El diagrama de flujo del flujo de trabajo analítico para el análisis de variantes de pLoF en 100 genes vinculados a IBMF y predisposición a malignidad hematológica. RPS17 se encuentra en una duplicación segmentaria y, por lo tanto, no es susceptible de análisis basado en secuencias en el conjunto de datos de gnomAD. indels, inserciones / deleciones WES, secuenciación del exoma completo.

Cálculos de tolerancia / intolerancia genética (restricción evolutiva)

La proporción de haplotipos con variantes de pLoF se calculó como se describió anteriormente para determinar la frecuencia de pLoF agregada para cada gen. 21 Estos datos se analizaron utilizando 2 métricas de restricción mutacional que detectan el agotamiento de la variación en la evolución humana reciente. El primero, "la fracción de límite superior esperada / observada con pérdida de función" (LOEUF), representa una estimación conservadora de la relación entre las variantes de pLoF observadas y esperadas. La LOEUF para los genes IBMF se calculó como se describió anteriormente, determinando la proporción observada / esperada de mutaciones en cada gen y calculando el intervalo de confianza alrededor de esa proporción. El límite superior del intervalo de confianza se utilizó como una estimación conservadora de la razón observada / esperada. Para facilitar la interpretación, las estimaciones del límite superior observado / esperado para cada gen en el genoma humano se agruparon en deciles de 1920 genes cada uno. Los deciles de la LOEUF van de 0 (más empobrecido / con limitaciones evolutivas) a 9 (no reducido / limitado). Cada gen también se analizó mediante el uso de la puntuación de "probabilidad de intolerancia a la pérdida de función" (pLI). pLI se ha establecido previamente para estimar la probabilidad de que LoF en un alelo genético provoque un fenotipo haploinsuficiente y estima la probabilidad de que un gen pertenezca a la clase de genes haploinsuficientes de LoF. Se demostró previamente que pLI separa los genes de longitud adecuada en aquellos intolerantes (pLI ≥ 0,9) o tolerantes (pLI ≤ 0,1) a LoF. 23

Análisis estadístico

El estudiante t La prueba se utilizó para comparar el agotamiento / restricción de pLoF en genes asociados con IBMF frente a los genes restantes en el genoma. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para el análisis de distribución por sexo. Las puntuaciones de LOEUF fueron previamente validadas estadísticamente. 21 El conjunto de datos de gnomAD de 125 748 exomas proporcionó la potencia suficiente para permitir el cálculo de la puntuación de LOEUF para todos los genes en los que la frecuencia de variante de pLoF esperada era variantes de & gt9.2 en toda la cohorte del exoma. Para los genes que habían esperado pLoF & lt9.2, incluimos el pLoF observado y esperado y las frecuencias variantes, pero no el decil LOEUF o pLI.


La mayoría de las mutaciones provienen de papá: nuevos conocimientos sobre la edad, la altura y el sexo remodelan la visión de la evolución humana

Los seres humanos heredan más de tres veces más mutaciones de sus padres que de sus madres, y las tasas de mutación aumentan con la edad del padre, pero no con la de la madre, hallaron los investigadores en el estudio más grande de mutaciones genéticas humanas hasta la fecha.

The study, based on the DNA of around 85,000 Icelanders, also calculates the rate of human mutation at high resolution, providing estimates of when human ancestors diverged from nonhuman primates. It is one of two papers published this week by the journal Genética de la naturaleza as well as one published at Naturaleza that shed dramatic new light on human evolution.

"Most mutations come from dad," said David Reich, professor of genetics at Harvard Medical School and a co-leader of the study. In addition to finding 3.3 paternal germline mutations for each maternal mutation, the study also found that the mutation rate in fathers doubles from age 20 to 58 but that there is no association with age in mothers -- a finding that may shed light on conditions, such as autism, that correlate with the father's age.

The study's first author is James Sun, a graduate student in Reich's lab who worked with researchers from deCODE Genetics, a biopharma company based in Reykjavik, Iceland, to analyze about 2,500 short sequences of DNA taken from 85,289 Icelanders in 24,832 father-mother-child trios. The sequences, called microsatellites, vary in the number of times that they repeat, and are known to mutate at a higher rate than average places in the genome.

Reich's team identified 2,058 mutational changes, yielding a rate of mutation that suggests human and chimpanzee ancestral populations diverged between 3.7 million and 6.6 million years ago.

A second team, also based at deCODE Genetics (but not involving HMS researchers), published a paper this week in Nature on a large-scale direct estimate of the rate of single nucleotide substitutions in human genomes (a different type of mutation process), and came to largely consistent findings.

The finding complicates theories drawn from the fossil evidence. The upper bound, 6.6 million years, is less than the published date of Sahelanthropus tchadensis, a fossil that has been interpreted to be a human ancestor since the separation of chimpanzees, but is dated to around 7 million years old. The new study suggests that this fossil may be incorrectly interpreted.

Great Heights

A second study led by HMS researchers, also published in Genética de la naturaleza this week, adds to the picture of human evolution, describing a newly observable form of recent genetic adaptation.

The team led by Joel Hirschhorn, Concordia Professor of Pediatrics and professor of genetics at Boston Children's Hospital and HMS, first asked why closely-related populations can have noticeably different average heights. David Reich also contributed to this study.

They examined genome-wide association data and found that average differences in height across Europe are partly due to genetic factors. They then showed that these genetic differences are the result of an evolutionary process that acts on variation in many genes at once. This type of evolution had been proposed to exist but had not previously been detected in humans.

Although recent human evolution is difficult to observe directly, some of its impact can be inferred by studying the human genome. In recent years, genetic studies have uncovered many examples where recent evolution has left a distinctive signature on the human genome. The clearest "footprints" of evolution have been seen in regions of DNA surrounding mutations that occurred fairly recently (typically in the last several thousand years) and confer an advantageous trait, such as resistance to malaria. Hirschhorn's team observed, for the first time in humans, a different signature of recent evolution: widespread small but consistent changes at many different places in the genome, all affecting the same trait, adult height.

"This paper offers the first proof and clear example of a new kind of human evolution for a specific trait," said Hirschhorn, who is also a senior associate member of the Broad Institute. "We provide a demonstration of how humans have been able to adapt rapidly without needing to wait for new mutations to happen, by drawing instead on the existing genetic diversity within the human population."

Average heights can differ between populations, even populations that are genetically very similar, which suggests that human height might have been evolving differently across these populations. Hirschhorn's team studied variants in the genome that are known to have small but consistent effects on height: people inheriting the "tall" version of these variants are known to be slightly taller on average than people inheriting the "short" versions of the same variants.

The researchers discovered that, in northern Europe, the "tall" versions of these variants are consistently a little more common than they are in southern Europe. The combined effects of the "tall" versions being more common can partly explain why northern Europeans are on average taller than southern Europeans. The researchers then showed that these slight differences have arisen as a result of evolution acting at many variants, and acting differently in northern than in southern Europe.

"This paper explains -- at least in part -- why some European populations, such as people from Sweden, are taller on average than others, such as people from Italy," Hirschhorn said.

The researchers were only able to detect this signature of evolution by using the results of recent genome-wide association studies by the GIANT consortium, which identified hundreds of different genetic variants that influence height.


Discusión

We demonstrate here that several alternative three-amino-acid mutations (V186G/K-K193T-G228S or V186N-N224K-G228S) can switch the receptor specificity of the H7N9 HA from avian- to human-type, a property required for transmission in humans and ferrets [38, 39]. Of these mutations, only isolated examples of 186G and 193N have to date been reported in H7 avian isolates. The mutants show profound loss of binding to avian-type (α2–3 linked) receptors, and increased binding to human-type (α2–6 linked) receptors in both glycan microarrays and glycan ELISA-type avidity assays. The mutants exhibit preferential binding to a subset of human-type receptors with extended branched N-linked glycans that terminate with NeuAcα2-6Gal reported to be present in N-linked glycans in human and ferret airway tissues [23, 40, 41]. Notably, this specificity for a restricted subset of human-type receptors is shared with recent H3N2 viruses, and the 2009 H1N1 pandemic virus. We have also recently observed that different sets of mutations switch the H6N1 and H10N8 HAs to human-type receptor specificity and, in each case, confer specificity for a similar subset of human-type receptors [37] (de Vries, Tzarum, Wilson & Paulson manuscript in revision). Thus, recognition of human-type receptors with extended glycan chains appears to be a common characteristic of human influenza virus HAs, and avian virus HA mutants that bind to human-type receptors.

Ideally, it would be important to assess the impact of the switch in receptor specificity in the ferret model that displays human-type receptors in the airway epithelium and is used to assess the propensity for air droplet transmission of human viruses. However, the introduction of the mutations that switch receptor specificity into an actual H7N9 virus background would represent gain-of-function (GoF) experiments that are currently prohibited [42]. During the course of this study, no viruses were created, and no experiments assessing the potential for air droplet transmission were performed. We suggest that understanding mutations that can confer human-type receptor binding will benefit risk assessment in worldwide surveillance of H7N9 in poultry and humans.


The Ames Test

los Ames test, developed by Bruce Ames (1928–) in the 1970s, is a method that uses bacteria for rapid, inexpensive screening of the carcinogenic potential of new chemical compounds. The test measures the mutation rate associated with exposure to the compound, which, if elevated, may indicate that exposure to this compound is associated with greater cancer risk. The Ames test uses as the test organism a strain of Salmonella typhimurium that is a histidine auxotroph, unable to synthesize its own histidine because of a mutation in an essential gene required for its synthesis. After exposure to a potential mutagen, these bacteria are plated onto a medium lacking histidine, and the number of mutants regaining the ability to synthesize histidine is recorded and compared with the number of such mutants that arise in the absence of the potential mutagen (Figure 8). Chemicals that are more mutagenic will bring about more mutants with restored histidine synthesis in the Ames test. Because many chemicals are not directly mutagenic but are metabolized to mutagenic forms by liver enzymes, rat liver extract is commonly included at the start of this experiment to mimic liver metabolism. After the Ames test is conducted, compounds identified as mutagenic are further tested for their potential carcinogenic properties by using other models, including animal models like mice and rats.

Figure 8. The Ames test is used to identify mutagenic, potentially carcinogenic chemicals. A Salmonella histidine auxotroph is used as the test strain, exposed to a potential mutagen/carcinogen. The number of reversion mutants capable of growing in the absence of supplied histidine is counted and compared with the number of natural reversion mutants that arise in the absence of the potential mutagen.

Piénsalo

  • What mutation is used as an indicator of mutation rate in the Ames test?
  • Why can the Ames test work as a test for carcinogenicity?

Conceptos clave y resumen

  • A mutation is a heritable change in DNA. A mutation may lead to a change in the amino-acid sequence of a protein, possibly affecting its function.
  • A mutación puntual affects a single base pair. A point mutation may cause a silent mutation if the mRNA codon codes for the same amino acid, a missense mutation if the mRNA codon codes for a different amino acid, or a nonsense mutation if the mRNA codon becomes a stop codon.
  • Missense mutations may retain function, depending on the chemistry of the new amino acid and its location in the protein. Nonsense mutations produce truncated and frequently nonfunctional proteins.
  • A mutación con desplazamiento de la pauta de lectura results from an insertion or deletion of a number of nucleotides that is not a multiple of three. The change in reading frame alters every amino acid after the point of the mutation and results in a nonfunctional protein.
  • Spontaneous mutations occur through DNA replication errors, whereas induced mutations occur through exposure to a mutagen.
  • Mutagenic agents are frequently carcinogenic but not always. However, nearly all carcinogens are mutagenic.
  • Chemical mutagens include base analogs and chemicals that modify existing bases. In both cases, mutations are introduced after several rounds of DNA replication.
  • Ionizing radiation, such as X-rays and γ-rays, leads to breakage of the phosphodiester backbone of DNA and can also chemically modify bases to alter their base-pairing rules.
  • Nonionizing radiation like ultraviolet light may introduce pyrimidine (thymine) dimers, which, during DNA replication and transcription, may introduce frameshift or point mutations.
  • Cells have mechanisms to repair naturally occurring mutations. DNA polymerase has proofreading activity. Mismatch repair is a process to repair incorrectly incorporated bases after DNA replication has been completed.
  • Pyrimidine dimers can also be repaired. En nucleotide excision repair (dark repair), enzymes recognize the distortion introduced by the pyrimidine dimer and replace the damaged strand with the correct bases, using the undamaged DNA strand as a template. Bacteria and other organisms may also use direct repair, in which the photolyase enzyme, in the presence of visible light, breaks apart the pyrimidines.
  • Through comparison of growth on the complete plate and lack of growth on media lacking specific nutrients, specific loss-of-function mutants called auxótrofos can be identified.
  • los Ames test is an inexpensive method that uses auxotrophic bacteria to measure mutagenicity of a chemical compound. Mutagenicity is an indicator of carcinogenic potential.

Opción multiple

Which of the following is a change in the sequence that leads to formation of a stop codon?

  1. missense mutation
  2. nonsense mutation
  3. silent mutation
  4. mutación por deleción

The formation of pyrimidine dimers results from which of the following?

  1. spontaneous errors by DNA polymerase
  2. exposure to gamma radiation
  3. exposure to ultraviolet radiation
  4. exposure to intercalating agents

Which of the following is an example of a frameshift mutation?

  1. a deletion of a codon
  2. missense mutation
  3. silent mutation
  4. deletion of one nucleotide

Which of the following is the type of DNA repair in which thymine dimers are directly broken down by the enzyme photolyase?

  1. direct repair
  2. reparación por escisión de nucleótidos
  3. reparación de desajustes
  4. corrección de pruebas

Which of the following regarding the Ames test is true?

  1. It is used to identify newly formed auxotrophic mutants.
  2. It is used to identify mutants with restored biosynthetic activity.
  3. It is used to identify spontaneous mutants.
  4. It is used to identify mutants lacking photoreactivation activity.

Complete el espacio en blanco

A chemical mutagen that is structurally similar to a nucleotide but has different base-pairing rules is called a ________.

The enzyme used in light repair to split thymine dimers is called ________.

The phenotype of an organism that is most commonly observed in nature is called the ________.

Verdadero Falso

Carcinogens are typically mutagenic.

Piénsalo

Why is it more likely that insertions or deletions will be more detrimental to a cell than point mutations?

Why do you think the Ames test is preferable to the use of animal models to screen chemical compounds for mutagenicity?

Pensamiento crítico

Below are several DNA sequences that are mutated compared with the wild-type sequence: 3′-T A C T G A C T G A C G A T C-5′. Envision that each is a section of a DNA molecule that has separated in preparation for transcription, so you are only seeing the template strand. Construct the complementary DNA sequences (indicating 5′ and 3′ ends) for each mutated DNA sequence, then transcribe (indicating 5′ and 3′ ends) the template strands, and translate the mRNA molecules using the genetic code, recording the resulting amino acid sequence (indicating the N and C termini). What type of mutation is each?


Autosomal Dominant IRF8 Deficiency

In parallel with our analysis for Subject 1 with recessive disease, we sequenced IRF8 in 454 persons with MSMD in whom known MSMD-associated mutations had already been excluded (for details, see the Supplementary Appendix). Two unrelated persons from Brazil (Subject 2) and Chile (Subject 3) who had recurrent episodes of disseminated BCG disease were each found to carry the same de novo heterozygous mutation that was predicted to cause a threonine-to-alanine substitution at position 80 (T80A) of IRF8 ( Figure 2A and 2D ). We genetically confirmed the reported biologic paternity of these two subjects. The finding that each mutation was de novo suggests that the same T80A allele arose independently on two occasions. We did not detect the T80A variant in 1064 healthy control subjects of diverse relevant ancestry (for details, see the Supplementary Appendix). Amino acid position 80 of IRF8 is within the DNA-binding domain ( Figure 2A ). The threonine residue is strictly conserved across IRF8 orthologues ( Figure 2B ) and human paralogous genes (data not shown).

The T80A mutation had no effect on the level or stability of IRF8 in immortalized B-cell lines derived from the subjects ( Figure 3E ) or after expression in transfected macrophages (data not shown). When the T80A mutant was tested for its ability to transactivate the promoters of IL12B ( Figure 3A ) and NOS2 ( Figure 3B ) in mouse macrophages, it showed relatively low activity, similar to that of the hypomorphic R294C Irf8 variant found in Irf8-deficient BXH2 mutant mice. The T80A mutant showed weak recruitment to the IL12B promoter (20% of the amount of the nonmutant IRF8 protein), suggesting that the mutation interferes with DNA binding ( Figure 3D ).

Homology modeling shows that T80 maps to the DNA-binding α helix of IRF8 that fits into the major groove, with its side chain directed toward the DNA bases ( Figure 2E, subpanel c ). Molecular-dynamics simulations indicate that T80A alters the hydrophobic interface between the protein and DNA and possibly modulates the DNA-binding specificity of IRF8 ( Figure 2E, subpanel d ). Alanine has a smaller side chain than does threonine, which may allow the entry of a water molecule at the DNA–IRF8 interface. Although functional data suggest that T80A is severely hypomorphic, we investigated whether the T80A variant is negatively dominant (i.e., whether it interferes with the function of the nonmutant IRF8 protein). We coexpressed the mutant and nonmutant alleles in macrophages ( Figure 3C ) and observed decreasing activation of the IL12B promoter (not shown) and the NOS2 promoter with increasing levels of mutant T80A IRF8 added to fixed levels of nonvariant IRF8. The effect was T80A-specific we did not observe it to be associated with K108E (data not shown) or R294C mutant proteins. We conclude that the T80A mutation has a dual effect on IRF8 function and causes autosomal dominant MSMD.

Figura 4. Figure 4. Selective Depletion of Dendritic Cells in Autosomal Dominant IRF8 Deficiency.

In Panel A, blood CD1c+ myeloid dendritic cells (MDCs) are gated on HLA-DR+ lineage (Lin)-negative cells (CD14−CD16−CD19−), and the expression of CD11c+ and CD1c+ is shown. The percentage of DR+CD11c+ lineage-negative cells that are positive for CD1c+ is shown for Subjects 2 and 3 (who carry the T80A allele), their relatives, and control subjects. Horizontal lines indicate mean values, and the numbers on contour plots represent the mean of two independent samples. In Panel B, blood CD141+ MDCs are gated on HLA-DR+ lineage-negative cells (CD14−CD16−CD19−), and the expression of CD11c and CD141 is shown. The percentage of DR+CD11c+ lineage-negative cells with a high level of CD141 expression on the cell surface is shown. In Panel C, plasmacytoid dendritic cells (PDCs) are gated on HLA-DR+ lineage-negative cells (CD14−CD16−), and the expression of CD123 and BDCA2 is shown. The percentage of DR+ cells that are positive for CD123 and BDCA2 is shown. In Panel D, monocytes are gated on HLA-DR+ lineage-negative cells (CD2−CD15−CD19−Nkp46−), and the expression of CD14 and CD16 is shown. The numbers on the contour plots represent the percentage of each subgroup (low and high expression of CD14 and CD14+CD16+) among total monocytes. In Panel D, the percentage of peripheral-blood mononuclear cells (PBMCs) that are positive for CD14 or CD16 is shown for Subject 2, his relatives, and a control subject. In Panel E, the mean (±SD) production of IL-12p70 protein in response to R848 is shown in four samples of blood CD1c+ MDCs, in three samples of PBMCs depleted in CD1c+ MDCs (PBMCs CD1c+ depleted), and in three samples of PBMCs not depleted (PBMCs), obtained by fluorescence-activated cell sorting from healthy control subjects (white bars) and in PBMCs from Subject 2, his parents, and a control subject collected at the same time (gray bars).

We observed subtle deficits in the PBMCs of Subjects 2 and 3. There were no deficiencies of circulating lymphocytes and granulocytes (data not shown), monocyte subgroups, or BDCA2+CD123+ plasmacytoid dendritic cells ( Figure 4C and 4D ). However, within CD11c+ myeloid dendritic cells, which are normally divided into minor CD141+ and major CD1c+ subgroups, there was marked loss of CD1c+ dendritic cells ( Figure 4A ), whereas the CD141+ subgroup and the total number of CD11c+ dendritic cells remained intact ( Figure 4B ). CD1c+ dendritic cells from unaffected persons can produce large amounts of interleukin-12 when stimulated with the toll-like receptor 7/8 ligand R848, as compared with PBMCs, whereas their depletion from PMBCs was associated with relatively low levels of interleukin-12 production by the remaining PBMCs (P<0.02 for all comparisons) ( Figure 4E ). PBMCs with the IRF8 T80A allele produced one third the amount of interleukin-12 produced by control cells in response to R848 stimulation (P<0.004 for all comparisons) ( Figure 4E ).

We suggest that depletion of interleukin-12–producing CD1c+ dendritic cells contributes to the susceptibility to mycobacterial disease in these subjects. In vitro assays of whole blood from the affected subjects showed no detectable effect on the production of interferon-γ (Figure S6 in the Supplementary Appendix) or in the subjects' PBMCs in response to stimulation by purified protein derivative (PPD), BCG, or PHA (Figure S7 in the Supplementary Appendix) or by PHA-driven T-cell blasts stimulated with interleukin-12 (data not shown). The presence of T80A does not seem to cause a generalized defect in interleukin-12 production, as shown by normal levels of the cytokine in a whole-blood assay in response to BCG, in monocyte-derived dendritic cells stimulated with CD40L, and by Epstein–Barr virus–transformed B cells stimulated with phorbol dibutyrate (Figure S6, S8A, and S8B in the Supplementary Appendix). Because the two healthy heterozygous parents of the infant with autosomal recessive IRF8 deficiency had normal levels of functional dendritic cells, the marked deficit of CD1c+CD11c+ dendritic cells was probably caused by the dominant-negative effect of the T80A mutant protein.


Conclusion

We have characterized, for the first time, the shape of the time-dependent rate curve of human mtDNA mutation rate estimates for both the hypervariable and coding regions. We have shown that multiple hits can effectively account for the difference between pedigree-based and human versus chimpanzee phylogeny-based mutation rate estimates. However, the multiple hits model is unlikely to explain the time-dependent decay for the genealogy-based estimates, where rate estimates associated with more recent events are high and then decay over 50,000 years going back in time.

Purifying selection and population bottlenecks may explain the time dependency of within-species mutation rate estimates. Specifically, the genetic diversity estimators π y ρ are proportional to effective population size ( Forster et al. 1996). Thus, our human diversity estimates are lower if a population history was characterized by serial bottlenecks as compared with a history of constant population size ( Nei et al. 1975). Because phylogeny-based mutation rates are calibrated with “arrival time” archaeological information that is blind to later population size fluctuations, the mutation rate estimates based on π y ρ are also lower than expected. Using simulation, Zhivotovsky et al. (2006) showed that microsatellite mutation rates estimated from small populations (haplogroups) undergoing serial bottlenecks are indeed reduced compared with pedigree-based rates. Alternatively, purifying selection acts to eliminate newly arising deleterious alleles and linked diversity throughout both the coding and HVRs ( Kivisild et al. 2006). This also decreases genetic diversity estimates ( Charlesworth et al. 1995) and thus the mutation rate estimates.

Our mutation rate estimates from all but the most recent samples are lower than the pedigree-based rate estimate, which is not affected by the above processes of bottlenecks and selection (except for purifying selection on lethal alleles). Purifying selection and population size changes are not mutually exclusive. Both processes could underlie the exponentially decaying mutation rate curves ( figs. 2 and 3). However, reduction in population size is expected to reduce the efficacy of natural selection relative to genetic drift.


Ver el vídeo: Mutaciones génicas clasificación y caracteristicas (Febrero 2023).