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9.9: Aislamiento de factores de transcripción - Biología

9.9: Aislamiento de factores de transcripción - Biología


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Los factores de transcripción son extraordinariamente diversos y cualquier factor representa solo una pequeña fracción de las moléculas de proteína presentes en la célula. Esta página describe cómo se pueden aislar y purificar moléculas tan raras.

Ejemplo: aislar el laca Represor

Un E. coli celda contiene sólo 10-20 copias del laca represor. Esto representa una proporción de solo 1 molécula en 50.000 moléculas de proteína en la célula. Sin embargo, la especificidad del laca El represor de la secuencia de ADN del operador proporciona un mecanismo para extraerlo de la mezcla.

Cromatografía de afinidad

El siguiente procedimiento se lleva a cabo para un cromatógrafo de afinidad:

  • Aprenda la secuencia a la que se une el represor (por huella).
  • Sintetiza un segmento de ADN que contiene la secuencia.
  • Adjunte esta molécula artificial a perlas de un medio sólido inerte (la matriz).
  • Vierta un extracto de E. coli células sobre las perlas.
  • Solo moléculas específicas para la secuencia de ADN, en este caso, moléculas del laca represor - se unirá a las cuentas.
  • Después de que las moléculas de proteína irrelevantes hayan pasado a través de la columna, lave las perlas con un tampón que liberará el laca moléculas represoras para que puedan ser estudiadas.

AaORA, un factor de transcripción AP2 / ERF específico de tricomas de Artemisia annua, es un regulador positivo en la vía biosintética de la artemisinina y en la resistencia a enfermedades Botrytis cinerea

Artemisinina, un importante metabolito secundario de Artemisia annua, es actualmente el mejor agente terapéutico contra cepas de paludismo tanto resistentes a los medicamentos como cerebrales Plasmodium falciparum (Clima et al., 2006). También se ha demostrado que la artemisinina y sus derivados son eficaces en el tratamiento de varios cánceres y enfermedades virales (Efferth, 2007 Efferth et al., 2008). Sin embargo, el contenido de artemisinina de A. annua es tan bajo (0,01 a 0,8% de peso seco) que limita en gran medida la comercialización de artemisinina.

Recientemente, varios grupos han resuelto casi por completo la vía biosintética de la artemisinina (fig. 1). En las plantas, hay dos vías independientes que producen difosfato de isopentenilo (IPP). Una es la vía clásica del ácido mevalónico citosólico (MVA) regulada, en gran medida, por la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGR), la otra es la vía del metileritritol fosfato (MEP) regulada, en gran medida, por 1-desoxilulosa 5-fosfato sintasa (DXS) y 1-desoxilulosa 5-fosfato reductoisomerasa (DXR Weathers et al., 2011). Luego, IPP y dimetilalil difosfato (DMAPP) como sustratos se convierten en farnesil difosfato por la farnesil difosfato sintasa (FPS). El primer paso comprometido en la vía biosintética específica de artemisinina es la conversión de difosfato de farnesilo en amorfa-4,11-dieno por amorfa-4,11-dieno sintasa (ADS Bouwmeester et al., 1999 Mercke et al., 2000). En el siguiente paso, el amorfa-4,11-dieno se hidroxila para producir alcohol artemisínico, que es catalizado por una hidroxilasa dependiente del citocromo P450 (CYP71AV1) y NADPH: el citocromo P450 oxidorreductasa (CPR) como socio redox nativo (Ro et al., 2006 Teoh et al., 2006). Estas dos enzimas también pueden oxidar el alcohol artemisínico a aldehído artemisínico y luego a ácido artemisínico (Ro et al., 2006). Recientemente, se ha presentado evidencia experimental de que el ácido dihidroartemisínico es el precursor directo de la artemisinina (Brown y Sy, 2004). Esta ruta está respaldada por la clonación y caracterización de la reductasa 2 de doble enlace (DBR2 Zhang et al., 2008), y la clonación de la aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1), que cataliza la oxidación de aldehídos artemisínicos y dihidroartemisínicos (Teoh et al., 2009). Se sugiere que las conversiones de ácido dihidroartemisínico en artemisinina y ácido artemisínico en arteannuína B son reacciones independientes de la enzima (Brown & Sy, 2004, 2007).

La artemisinina, el ácido dihidroartemisínico y varios otros terpenoides se producen en los tricomas secretores glandulares (GST) presentes en las superficies aéreas de la planta (Olofsson et al., 2011). Las enzimas clave de la vía biosintética de la artemisinina son ADS, CYP71AV1 y DBR2, que se expresan específicamente solo en GST (Olofsson et al., 2012). Los tricomas se dividen en tricomas no glandulares en forma de T (TST) y GST. Los tricomas no glandulares tienen un papel más especializado en la defensa de las plantas y actúan como elementos disuasorios de la oviposición y alimentación de los insectos (Levin, 1973). Los GST tienen la capacidad de sintetizar, almacenar y, a veces, secretar grandes cantidades de metabolitos especializados que están relacionados con funciones demostradas o supuestas en la defensa de las plantas (Levin, 1973 Schilmiller et al., 2008 ).

Los factores de transcripción AP2 / ERF son una de las familias más importantes de factores de transcripción involucrados en la respuesta de las plantas al estrés biótico y abiótico, y en la regulación del metabolismo y los procesos de desarrollo en varias especies de plantas (Agarwal et al., 2006). La sobreexpresión del regulador transcripcional AP2 / ERF ORCA3 resultó en la expresión mejorada de varios genes biosintéticos de metabolitos y, en consecuencia, en una mayor acumulación de alcaloides indol terpenoides en Catharanthus roseus (Van der Fits y Memelink, 2000). Recientemente, la sobreexpresión de factores transcripcionales AP2 / ERF AaERF1 y AaERF2 Se ha demostrado que eleva los niveles de transcripción de ambos ANUNCIOS y CYP71AV1, lo que resulta en una mayor acumulación de artemisinina y ácido artemisínico en A. annua (Yu et al., 2012). Por lo tanto, los factores de transcripción AP2 / ERF en A. annua, que se expresan específicamente en tricomas, pueden desempeñar funciones importantes en la regulación de la vía biosintética de la artemisinina y en la defensa de las plantas.

En este artículo, se clonaron y analizaron seis factores de transcripción AP2 / ERF en A. annua. Después de una serie de filtraciones por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-Q-PCR), AaORA fue el único factor de transcripción AP2 / ERF que exhibió patrones de expresión similares a los de ANUNCIOS, CYP71AV1 y DBR2 en diferentes posiciones de las hojas y en diferentes tejidos en A. annua. AaORA se analizó en detalle, incluido el análisis del promotor y la localización subcelular. También realizamos Agrobacterium tumefaciens-transformación mediada para generar plantas transgénicas que expresen la AaORA promotor-β-glucuronidasa (GUS), AaORA-sobreexpresando y AaORA Vectores de interferencia de ARN (ARNi), y reportaron su caracterización fenotípica así como biológica y bioquímica con respecto a la biosíntesis de artemisinina y resistencia a enfermedades de Botrytis cinerea.


Introducción

Las proteínas básicas hélice-bucle-hélice (bHLH) son una gran familia de factores de transcripción que controlan los procesos metabólicos, fisiológicos y de desarrollo en todos los organismos eucariotas. Se consideró que tenían una función diferente según la distinción del dominio 1, 2 de bHLH. La proteína bHLH consta de aproximadamente 60 aminoácidos organizados en la región básica y la región 3 de HLH. La región HLH en el C-terminal está involucrada en la homo o heterodimerización con otra proteína, mientras que la región básica en el N-terminal para la unión al ADN. Según la capacidad de unión al ADN, las proteínas bHLH se dividen en dos grupos, "bHLH que se une al ADN" y "bHLH atípica" sin capacidad de unión al ADN 1, 4. Estudios recientes han demostrado que los factores de transcripción típicos de bHLH participan en varios procesos de crecimiento y desarrollo de las plantas, como la señalización luminosa 5, la señalización hormonal 6, la biosíntesis de antocianinas 7, 8, el desarrollo de frutos 9 y las respuestas al estrés 10. Por ejemplo, sobreexpresión de PIF5 induce la senescencia de las hojas y la degradación de la clorofila en cultivos oscuros Arabidopsis 11. los SlPIF1a se caracteriza por regular la biosíntesis de carotenoides durante la maduración del fruto por un mecanismo dependiente de la luz en tomate 12. A bHLH35 gen de Euphratica populosa podría regular la fotosíntesis en Arabidopsis 13. Además, se ha demostrado que los genes bHLH atípicos desempeñan un papel en la regulación de la señalización hormonal 14, 15, la señalización luminosa 16, el desarrollo vascular 17 y el tamaño de grano 18, como PRE1 y KIDARI / PRE6 19, 20 .

PRE1 y KIDARI pertenecen a la resistente al paclobutrazol (PRE) familia con 6 miembros en Arabidopsis. PRE1, uno de estos bHLH atípicos, se identifica inicialmente como un activador de las respuestas de giberelina [19]. Las investigaciones posteriores muestran que PRE1 media la señalización de brasinoesteroides, auxinas y luz 21,22,23. los PRE3 es un supresor dominante del mutante BR bri1-301 y participa en la regulación de la transducción de señales luminosas en Arabidopsis 24, 25. los PRE4 / BNQ3 también funcionan en señalización luminosa, y bnq3 El mutante tiene una flor de color verde pálido y un nivel reducido de clorofila 26. KIDARI / PRE6 es un represor de la señalización luminosa y afecta la fotomorfogénesis al regular negativamente la actividad del HFR1 20, 27. Sobreexpresión de ILI1 (MAYOR INCLINACIÓN DE LAMINA1), una homología de PRE1 en el arroz, aumento de la elongación celular a través de un mecanismo involucrado en la señalización de brasinoesteroides [21]. BU1 (BRASSINOSTEROID UPREGULATED1) participa en la señalización de brasinoesteroides y controla la flexión de la articulación de la lámina en el arroz 28. Sobreexpresión de PGL1 (REGULADOR POSITIVO LONGITUD DE GRANO 1) y PGL2 en lemma / pálea podría aumentar la longitud y el peso del grano en el arroz transgénico 18, 29. Hasta la fecha, solo Slstyle2.1, a PRE-como gen en tomate, fue identificado para controlar la longitud del estilo floral y contribuir a la evolución de la autopolinización en la variedad cultivada 30. A través de nuestro análisis de todo el genoma de PRE familia, hay cinco miembros en el tomate, incluidos SlSTYLE2.1. Sin embargo, aún se desconoce su función biológica en el crecimiento del tomate, lo que sin duda necesita más estudios.

Se considera que el tomate es uno de los mejores sistemas para estudiar la maduración de frutos carnosos. Aquí, un gen homólogo de PRE de Arabidopsis, que fue nombrado SlPRE2 a lo largo de PRE-como gen estilo2.1 30, fue clonado. En este estudio, la sobreexpresión de SlPRE2 se realizó para investigar el papel de SlPRE2 en el desarrollo del tomate. Los tomates transgénicos mostraron alteración de la morfología de la planta al afectar la señalización luminosa y la represión de la acumulación de pigmento en la fruta. Nuestros resultados indican que SlPRE2 afecta la morfogénesis de las plantas, la clorofila de la fruta y la acumulación de carotenoides probablemente al influir en la actividad de las proteínas bHLH implicadas en la señalización luminosa.


Abstracto

La regulación de la expresión génica por factores de transcripción toca muchos aspectos de la biología eucariota, y su control externo sistemático por moléculas orgánicas representa un desafío en química. Aquí presentamos el diseño de un compuesto no peptídico completamente orgánico que imita un factor de transcripción. El diseño aprovecha la afinidad específica de unión al ADN de una molécula de poliamida en horquilla y la capacidad del wrenchnolol para unirse a la subunidad Sur-2 del complejo mediador humano. El compuesto híbrido de estas dos moléculas activa la transcripción de un gen indicador in vitro de una manera dependiente del promotor a través de contactos simultáneos con ADN y Sur-2. Nuestros resultados indican que es posible generar un factor de transcripción a partir de componentes no peptídicos.

Facultad de Medicina de Baylor.

Instituto de Tecnología de California.

En los artículos con más de un autor, el asterisco indica el nombre del autor al que deben dirigirse las consultas sobre el artículo.


Un E. coli celda contiene sólo 10-20 copias del laca represor. Esto representa una proporción de solo 1 molécula en 50.000 moléculas de proteína en la célula.

Sin embargo, la especificidad del laca El represor de la secuencia de ADN del operador proporciona un mecanismo para extraerlo de la mezcla.

El procedimiento:

  • Aprenda la secuencia a la que se une el represor (por huella).
    Enlace a una discusión sobre huellas.
  • Sintetiza un segmento de ADN que contiene la secuencia.
  • Adjunte esta molécula artificial a perlas de un medio sólido inerte (la matriz).
  • Vierta un extracto de E. coli células sobre las perlas.
  • Sólo moléculas específicas para la secuencia de ADN y mdash en este caso, moléculas del laca repressor & mdash se unirá a las cuentas.
  • Después de que las moléculas de proteína irrelevantes hayan pasado a través de la columna,
  • lavar las perlas con un tampón que liberará el laca moléculas represoras para que puedan ser estudiadas.

Esta técnica se llama cromatografía de afinidad. Muchos factores de transcripción eucariotas también han sido aislados y estudiados por este método.


Materiales y métodos

Hibridación e inmunohistoquímica in situ

Se obtuvieron huevos de pollito fertilizados de Winter Egg Farm (Royston, Reino Unido) y se incubaron en una incubadora humidificada a 38 ° C. Los embriones se clasificaron según Hamburger y Hamilton (HH) (Hamburger y Hamilton, 1951). Los embriones se fijaron durante una hora a 4ºC en paraformaldehído al 4% en tampón fosfato (PB) 0,1 M, se crioprotegieron con sacarosa al 30% en PB y se crioseccionaron. La hibridación in situ de la sección congelada se realizó como se describe (Schaeren-Wiemers y Gerfin-Moser, 1993), utilizando sondas para polluelos Sox8, Sox9, Sox10(Cheng et al., 2000 Cheng et al., 2001), pollito Babosa (Nieto et al., 1994), BMP4, BMP7 (un regalo de T. Momose), Cad6B, RhoB (Liu y Jessell, 1998), Cad7 (un regalo de Y. Wakamatsu), Wnt1, Wnt3a (un regalo de N. Itasaki), FoxD3 y CiclinaD1clones de etiqueta de secuencia expresada en pollo (EST). La localización inmunohistoquímica de proteínas en secciones y explantes de placas neurales en geles de colágeno se realizó como se describe (Yamada et al., 1993 Briscoe et al., 2001). La inmunofluorescencia de montaje completo se llevó a cabo como se describe (Davis et al., 1991). Se utilizaron anticuerpos contra las siguientes proteínas: proteína verde fluorescente (GFP) (Molecular Probes), Sox9 (da Silva et al., 1996), Slug (Liu y Jessell, 1998), Laminin (Sigma), Pax2 (Covance), TuJ1 (Covance), HNK-1 (Becton Dickinson), Lbx1 (Müller et al., 2002) y pan-Nkx6 (un regalo de H. Edlund), Pax6, Pax7, MNR2 (Persson et al., 2002), Islet1 / 2 (Vallstedt et al., 2001), P0 (Bhattachyaryya et al., 1991) y BrdU (bromodesoxiuridina) (George-Weinstein et al., 1993). Las imágenes se recogieron en un microscopio confocal Zeiss LSM510 o Leica TCS SP2.

Pollito en electroporación ovo y etiquetado BrdU

Polluelo Sox9 ADNc (Kamachi et al., 1999), pollito Sox8 ADNc (Cheng et al., 2001), pollito Sox10 ADNc (Cheng et al., 2000) y Wnt3a (un regalo de N. Itasaki) se insertaron corriente arriba de un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y una secuencia de localización nuclear (nls) marcada con GFP en el vector de expresión pCAGGS (Niwa et al., 1991). Sox2 El ADNc se clonó en el vector de expresión pCS2 + (un regalo de E. Remboutsika). Los embriones de pollo se electroporaron con ADN a 2.5 μgμl –1, para las cotransfecciones, se utilizó pCAGGS-IRES-nls-GFP a 500 ng μl –1. Brevemente, se inyectó ADN plasmídico en el lumen de los tubos neurales de la etapa 10-11 de HH, se colocaron electrodos a cada lado del tubo neural y se llevó a cabo la electroporación utilizando un electroporador BTX que entrega cinco pulsos de 50 milisegundos de 30 V (Briscoe et al., 2001) . Se permitió que los embriones transfectados se desarrollaran hasta las etapas especificadas y luego se diseccionaron, fijaron y procesaron para inmunohistoquímica. La transfección de pCAGGS-IRES-nls-GFP solo no afecta la expresión de marcadores neurales o marcadores de cresta neural (datos no mostrados). Para el etiquetado de BrdU, se aplicaron 100 μl de 200 ngμl –1 BrdU (Roche Biochemicals) sobre los embriones transfectados in ovo 1 hora antes de la recolección.

Explantes de placa neural

Para el cultivo de explantes de tejido neural electroporado, los embriones de la etapa 10 de HH se electroporaron con pCAGGS-Sox9-IRES-nls-GFP o pCAGGS-IRES-nls-GFP como control y se incubaron in ovo durante 1-2 horas antes de aislar los explantes neurales ( Yamada y col., 1993 Briscoe y col., 2001). Se cultivaron explantes neurales en matriz de colágeno (Vitrogen) con medio F12 que contenía penicilina / estreptomicina y Mito + Serum Extender (Collaborative Biomedical Products) durante 48 horas antes de ensayar la expresión de GFP y HNK-1 (Liem et al., 1995). Para los trasplantes, se colocaron regiones electroporadas [i] (tubo neural intermedio) entre el tubo neural y el somita al nivel de la extremidad anterior de los embriones de pollo en estadio 12-14 HH. Los embriones trasplantados se incubaron durante 72 horas antes de procesarlos para inmunohistoquímica.


Introducción

La vía de señalización Notch se conserva ampliamente en el desarrollo animal y se utiliza en una enorme variedad de decisiones sobre el destino celular (para una revisión, véase Artavanis-Tsakonas et al., 1999). Solo en el desarrollo del sistema vascular de los vertebrados, la señalización de Notch desempeña un papel en la proliferación celular, la migración celular, la diferenciación del músculo liso y la diferenciación arteriovenosa (Iso et al., 2003). La señalización de Notch puede actuar en múltiples momentos dentro de un solo linaje celular para generar múltiples tipos de células. Por ejemplo, la señalización de Notch en Drosophiladiversifica las hijas de la célula precursora del órgano sensorial, luego actúa nuevamente en la siguiente división para diversificar cada par de nietas (Hartenstein y Posakony, 1990 Parks y Muskavitch, 1993). Las interacciones celulares mediadas por Notch se han documentado a lo largo del desarrollo embrionario y post-embrionario de C. elegans, con roles que incluyen el desarrollo del mesodermo, elecciones entre mitosis y meiosis, morfogénesis del intestino y desarrollo del útero y la vulva (Greenwald et al., 1983 Austin y Kimble, 1987 Priess et al., 1987 Lambie y Kimble, 1991 Hutter y Schnabel, 1994 Mango y col., 1994a Mello y col., 1994 Moskowitz y col., 1994 Hutter y Schnabel, 1995 Newman y col., 1995 Moskowitz y Rothman, 1996 Hermann y col., 2000). Interacciones mediadas por Notch en C. elegans utilice uno de los dos receptores relacionados con Notch, llamados GLP-1 / Notch y LIN-12 / Notch, y varios ligandos como APX-1 / Delta o LAG-2 / Delta. Los patrones de expresión de estos receptores y ligandos son notablemente complejos y dinámicos durante todo el desarrollo, y sugieren que la larga lista de interacciones mediadas por Notch caracterizadas sigue siendo incompleta.

A pesar de la importancia de la señalización de Notch, se sabe poco sobre cómo las interacciones individuales mediadas por Notch especifican distintos destinos celulares en diferentes momentos y lugares del desarrollo. Los receptores GLP-1 / Notch y LIN-12 / Notch parecen ser funcionalmente equivalentes, al igual que los ligandos expresados ​​por las diversas células de señalización (Fitzgerald et al., 1993 Fitzgerald y Greenwald, 1995 Gao y Kimble, 1995 Moskowitz y Rothman, 1996 Shelton y Bowerman, 1996). Además, todos los ejemplos conocidos de transducción de señales Notch en C. elegans parecen implicar un único efector transcripcional llamado LAG-1 / Suppressor of Hairless [Su (H)] (Christensen et al., 1996). Por lo tanto, la especificidad del destino celular debe lograrse mediante factores que actúan en combinación con la señalización de Notch.

Al menos cuatro interacciones distintas ocurren durante las primeras divisiones celulares del C. elegans embrión, proporcionando un sistema experimental relativamente simple para analizar una red de decisiones de destino celular mediadas por Notch (para una revisión, ver Schnabel y Priess, 1997). La célula anterior en el embrión en etapa de dos células se llama AB, y todos los descendientes tempranos de AB expresan los receptores GLP-1 / Notch o LIN-12 / Notch. Varios descendientes de AB entran en contacto con una de varias células que expresan ligandos que nacen en diferentes momentos y lugares durante las primeras divisiones, y cambian su destino en consecuencia. En estudios genéticos de decisiones de destino de células binarias mediadas por Notch, el destino de una célula a menudo se puede considerar como `` primario '' y el destino de una segunda célula como `` secundario '' La función de Notch es necesaria para el destino secundario, pero no primario (Artavanis-Tsakonas et al., 1999). En ausencia de todas las interacciones mediadas por Notch en C. elegans embriones, los descendientes de AB adoptan destinos ectodérmicos altamente modelados que, por lo tanto, se describirán aquí como destinos primarios.

La primera interacción Notch ocurre en la etapa de cuatro células cuando la hija posterior de AB, llamada ABp, contacta con una célula llamada P2que expresa un ligando de Notch (ver Fig. 1). La interacción entre P2 y ABp hace que los descendientes de ABp adopten nuevos destinos que describimos aquí como destinos secundarios. Las células con destinos secundarios siguen siendo precursores ectodérmicos, pero tienen un patrón de diferenciación distinto de las células con destinos primarios. La hija anterior de AB, llamada ABa, no contacta con P2 y así produce descendientes que inicialmente retienen su potencial para destinos primarios. Sin embargo, en la etapa de 12 células, dos de las nietas de ABa entran en contacto con una nueva célula que expresa ligando llamada MS. Esta segunda interacción de Notch induce a esas dos nietas de ABa a adoptar nuevos destinos terciarios y convertirse en precursores mesodérmicos. Durante las siguientes divisiones celulares, hay una tercera y cuarta interacciones de Notch que diversifican aún más el destino de algunos descendientes de ABp (ver más abajo y la leyenda de la Fig. 1). Coincidiendo con la especificación del destino celular mediada por Notch, un sistema de polaridad anteroposterior separado genera diferencias adicionales entre las células hermanas que nacen de divisiones celulares anteroposteriores. Por tanto, hay dos tipos de destinos primarios (1a y 1p) dependiendo de si una célula es hermana anterior (1a) o hermana posterior (1p Fig. 1B). De manera similar, hay dos tipos de destinos secundarios y dos destinos terciarios (Fig. 1B). Estas diferencias anteroposteriores parecen involucrar POP-1, un factor de transcripción que se localiza asimétricamente después de todas las divisiones anteroposteriores de los descendientes AB (Kaletta et al., 1997 Lin et al., 1998 Park y Priess, 2003).

Interacciones celulares que diversifican los descendientes de AB. (A) Embriones de cuatro y 12 células que muestran las células descritas en el texto. ABa, ABp y sus descendientes expresan cada uno de los nietos de GLP-1 / Notch (verde) ABp en la etapa de 12 células se describen en negrita. (B). Diagrama de linaje que muestra las primeras divisiones de ABa y ABp. Los destinos de las celdas se muestran en ausencia de señalización Notch (–Notch) y cuando se producen tanto la primera (cuatro celdas) como la segunda (12 celdas) interacciones Notch (+ Notch). Los destinos de los descendientes de ABp llamados ABpla y ABplp se modifican aún más por la tercera y cuarta interacciones de Notch, respectivamente (ver Tabla 1). La señalización de MS conduce a la expresión de PHA-4 por los descendientes de ABalp y ABara, y además reprime LAG-2 en los descendientes de ABara.

Interacciones celulares que diversifican los descendientes de AB. (A) Embriones de cuatro y 12 células que muestran las células descritas en el texto. ABa, ABp y sus descendientes expresan cada uno de los nietos de GLP-1 / Notch (verde) ABp en la etapa de 12 células se describen en negrita. (B). Diagrama de linaje que muestra las primeras divisiones de ABa y ABp. Los destinos de las celdas se muestran en ausencia de señalización Notch (–Notch) y cuando se producen tanto la primera (cuatro celdas) como la segunda (12 celdas) interacciones Notch (+ Notch). Los destinos de los descendientes de ABp llamados ABpla y ABplp se modifican aún más por la tercera y cuarta interacciones de Notch, respectivamente (ver Tabla 1). La señalización de MS conduce a la expresión de PHA-4 por los descendientes de ABalp y ABara, y además reprime LAG-2 en los descendientes de ABara.

Los precursores mesodérmicos que son inducidos por la segunda interacción Notch forman la mitad anterior de la faringe, una gran estructura muscular utilizada en la alimentación (Sulston et al., 1983). La mitad posterior de la faringe contiene muchos de los tipos de células mesodérmicas idénticas que se encuentran en la mitad anterior, pero se deriva de descendientes no AB a través de una vía independiente de Notch (Priess et al., 1987). La prevención de la segunda interacción Notch da como resultado embriones que carecen de la faringe anterior, pero que tienen una media faringe posterior producida por descendientes no AB (el fenotipo Aph falla en la faringe anterior). A través de exámenes genéticos para mutantes Aph, identificamos dos factores de transcripción de caja T funcionalmente redundantes llamados TBX-37 y TBX-38 que son esenciales para el desarrollo de la faringe anterior. Mostramos que la señalización de Notch ocurre en la etapa de 12 células en tbx-37 tbx-38 embriones mutantes, pero no da como resultado una especificación mesodérmica. Además, proporcionamos evidencia de que la función principal, si no la única, de la señalización de Notch en la etapa de cuatro células es reprimir la expresión de TBX-37, TBX-38 en descendientes de ABp. Por tanto, la primera interacción Notch restringe la expresión de las proteínas T-box que son esenciales para acoplar la segunda interacción Notch al desarrollo del mesodermo.


Metodología y lecturas de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

La identificación de blancos directos de genes receptores de hormonas nucleares proporciona pistas sobre su contribución tanto al desarrollo como a la progresión del cáncer. Hasta hace poco, la identificación de tales genes diana directos se ha basado en una combinación de análisis de expresión y búsquedas in silico de motivos de unión de consenso en promotores de genes. Los motivos de unión por consenso para factores de transcripción a menudo se definen utilizando estrategias de unión de ADN in vitro. Tales estrategias in vitro no tienen en cuenta los muchos factores que contribuyen significativamente a la selección de la diana mediante factores de transcripción en las células más allá del reconocimiento de estas secuencias cortas de ADN de consenso. Estos factores incluyen la metilación del ADN, la estructura de la cromatina, las modificaciones postraduccionales de los factores de transcripción y el reclutamiento cooperativo de complejos de factores de transcripción. La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) proporciona un medio para aislar complejos de factores de transcripción en el contexto de la cromatina endógena, lo que permite la identificación de objetivos directos de factores de transcripción. ChIP se puede combinar con PCR de sitio específico para sitios de unión candidatos o, alternativamente, con clonación, microarrays genómicos o, más recientemente, secuenciación directa de alto rendimiento para identificar nuevos objetivos genómicos. La aplicación de enfoques basados ​​en ChIP ha redefinido los motivos de unión por consenso para los factores de transcripción y ha proporcionado importantes conocimientos sobre la biología de los factores de transcripción.


Profesor adjunto

Enseñanza: & # 160
PHAR 820: Técnicas de laboratorio en las neurociencias - Otoño de 2019
Director del curso - Huangui Xiong, MD, PhD
Eudy: Introducción a la tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS) [1 hora de clase, 1 hora de laboratorio] & # 160

MGCB / GCBA 823: Fundamentos en genética - Primavera de 2019
Directora del curso - Karen Gould PhD
Eudy: Introducción a la secuenciación de próxima generación (NGS) [2 horas de clase]

NSC 922: Neurociencia molecular y celular
Director del curso - Huangui Xiong, MD, PhD
Eudy: Genética del neurodesarrollo [1 hora de clase]

Investigación: & # 160
Estrategias de secuenciación de ADN de próxima generación para la identificación de genes de enfermedades mendelianas raras y tecnologías genómicas funcionales en general. También colaboro en una serie de proyectos de investigación en la UNMC que involucran muchas áreas diferentes de interés biomédico, incluido el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la virología.

Instalación básica de genómica:& # 160La instalación UNMC Genomics Core es una instalación completamente equipada que sirve a la comunidad de investigación regional. Se procesa una amplia variedad de muestras de ARN / ADN en el núcleo para una serie de aplicaciones diferentes, incluida la secuenciación de ARN (tradicional y de una sola célula), exoma, resecuenciación genómica, metagenómica, metilación y secuenciación de ChIP. El núcleo opera los sistemas Illumina NovaSeq6000, NextSeq550 y MiSeq. (Illumina, San Diego, CA). Además de los sistemas NGS, el núcleo alberga un Nanostring EnCounter, ideal para experimentos rápidos de expresión génica dirigida para el perfil de vías y la validación de experimentos NGS. Los experimentos de RNAseq de célula única se realizan utilizando tecnología 10xGenomics. & # 160 & # 160

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  31. Weston MD, Eudy JD, Fujita S, Yao SF, Sumegi J, Kimberling WJ.  Genomic structure and identification of novel mutations in usherin, the gene responsible for usher syndrome type IIa. Revista estadounidense de genética humana. First two authors contributed equally to this manuscript. 66:1199-1210, 2000.
  32. Spiegelstein O, Eudy JD, and Finnell, RH.  Identification of two novel folate receptor genes in mouse and humans. Gene. First two authors contributed equally to this manuscript. 27258:117-25, 2000.
  33. Eudy JD, Spiegelstein O, Barber RC, Wlodarczyk BJ, Talbot J, Finnell, RH.  Identification and characterization of the human and mouse SLC19A3 gene: a novel member of the reduced folate family of micronutrient transporter genes. Molecular Genetics and Metabolism. First two authors contributed equally to this manuscript.㻇:581-590, 2000.
  34. Eudy JD, Sumegi J.  Cellular and molecular aspects of Usher Syndrome. Ciencias de la vida celular y molecular㺸:258-267, 1999.
  35. Eudy JD, Yao SF, Ma-Edmonds M, Talmadge C, Weston MD, Kimberling W, Sumegi J.  Isolation of a gene encoding a novel member of the orphan hormone receptor superfamily from the Usher Syndrome Type 2a locus on Chr 1q41.Genómica㺲:382-384, 1998.
  36. Eudy JD, Weston MD, Yao SF, Hoover DM, Ma-Edmonds M, Yan D, Cheng JJ, Beisel K, Ayuso C, Cremers C, Davenport S, Moller C, Talmadge C, Tamayo M, Swaroop A, Kimberling WJ, Sumegi J.  A novel gene encoding a protein with extracellular matrix motifs is mutated in Usher syndrome type 2a. Ciencias𧈘:1753-1757, 1998.


University of Nebraska Medical Center
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ACKNOWLEDGEMENTS

We wish to thank G. Nolan for providing the pBABE vector and Phoenix packaging cell line, and S. Renner for help with FACS. This work was supported by a grant from the Austrian Science Foundation (SFB‐5‐12) to R.d.M.

Figura 1. Strategy of the TF cloning system. cDNA from cytokine‐ stimulated EC was ligated into the Bst XI sites of the retroviral expression vector pBG4B, a derivative of pBABE, leading to expression of the inserts as fusion genes with the yeast gal4 DBD. Plasmid DNA from this library was transfected into Phoenix ecotropic packaging cells, and retrovirus applied to a murine NIH3T3 reporter cell line that carries a gal4‐dependent EGFP reporter gene. EGFP‐positive cells were isolated by FACS, expanded, and the cDNA inserts retrieved by RT–PCR.

Figura 1. Strategy of the TF cloning system. cDNA from cytokine‐ stimulated EC was ligated into the Bst XI sites of the retroviral expression vector pBG4B, a derivative of pBABE, leading to expression of the inserts as fusion genes with the yeast gal4 DBD. Plasmid DNA from this library was transfected into Phoenix ecotropic packaging cells, and retrovirus applied to a murine NIH3T3 reporter cell line that carries a gal4‐dependent EGFP reporter gene. EGFP‐positive cells were isolated by FACS, expanded, and the cDNA inserts retrieved by RT–PCR.

Figura 2. FACS analysis. The gal4–EGFP NIH3T3 reporter cell line was transduced with retrovirus containing either the positive control, the empty vector or the cDNA library, and 3 days later analyzed for EGFP expression. ( A ) Positive control (p65‐NF‐κB TAD fused to the gal4 DBD) ( B ) negative control, non‐transduced NIH3T3‐Gal4–EGFP cells ( C ) HUVEC cDNA library ( D ) empty vector. Gates were set as indicated (R1) to definitely exclude GFP‐negative cells. After transduction with the cDNA library (C), ∼1 in 10 000 cells (0.01%) scored positive, in the vector control (D) 0.0012%.

Figura 2. FACS analysis. The gal4–EGFP NIH3T3 reporter cell line was transduced with retrovirus containing either the positive control, the empty vector or the cDNA library, and 3 days later analyzed for EGFP expression. ( A ) Positive control (p65‐NF‐κB TAD fused to the gal4 DBD) ( B ) negative control, non‐transduced NIH3T3‐Gal4–EGFP cells ( C ) HUVEC cDNA library ( D ) empty vector. Gates were set as indicated (R1) to definitely exclude GFP‐negative cells. After transduction with the cDNA library (C), ∼1 in 10 000 cells (0.01%) scored positive, in the vector control (D) 0.0012%.

Figura 3. Domain structures of selected TFs. Black bars represent the region contained in the cDNA inserts that were isolated. For some of the TFs, several independent clones were identified.

Figura 3. Domain structures of selected TFs. Black bars represent the region contained in the cDNA inserts that were isolated. For some of the TFs, several independent clones were identified.

Figura 4. Luciferase assay. cDNA inserts from EGFP‐positive clones were recovered by RT–PCR, subcloned into the pBG4B vector and transiently transfected into NIH3T3 cells together with the gal4–Luc reporter as well as RSV‐βgal as internal control. Positive control, gal4–VP‐16 negative control, empty gal4 vector MT, metallothionein vWF, von Willebrand factor. Luciferase values were normalized for β‐galactosidase expression.

Figura 4. Luciferase assay. cDNA inserts from EGFP‐positive clones were recovered by RT–PCR, subcloned into the pBG4B vector and transiently transfected into NIH3T3 cells together with the gal4–Luc reporter as well as RSV‐βgal as internal control. Positive control, gal4–VP‐16 negative control, empty gal4 vector MT, metallothionein vWF, von Willebrand factor. Luciferase values were normalized for β‐galactosidase expression.

Genes identified in the TF screen: (A) cognate TFs, (B) potentially novel TFs and (C) false positives

Nombre Accession no. Observaciones
A
Notch‐1 (3×) AF308602 TF, vascular development
MAML‐1 AF221759 Co‐activator of NOTCH
HSF‐1 HUMHSF1 Heat shock TF
RelA NM_021975 NF‐κB p65 subunit, TF involved in inflammation and apoptosis
Fus HSFUSA RelA co‐activator
Sox‐7 (3×) BC004299 Sry related HMG‐box related TF, involved in wnt signaling
MondoA AF312918 bHLH TF, Max interacting
STAT‐6 (2×) XM_043112 TF, interferon signaling
STAT‐3 AF029311 TF, interferon signaling
Foxo1a NM_002015 TF, forkhead domain
B
Hypothetical Hs11_9491_22_27_7 Proline‐rich, forkhead domain
Hypothetical Hs19_11453_22_26_1 Proline‐rich, ankyrin repeat
Eric‐1 HSA243997 TACC (transforming acidic coiled‐coil) domain present in centrosomal proteins
E7/Hakai AF167441 Proline‐rich, C2H2 and C2HC4 zinc fingers
Junction Plakoglobin BC011865 Involvement in β‐catenin/wnt signaling
TFG (3×) NM_006070 TRK fused gene, transforming, glutamine‐rich
VE‐cadherin X79981 Acidic region, membrane associated
Atrophin XM_006637 Polyglutamine stretch
BCAR‐1 AJ242987 Proline‐rich, breast cancer anti‐estrogen resistence protein
Zyxin XM_056979 Contains LIM domain
Peflin AB026628 Penta‐EF‐hand Ca 2+ binding domains
Reticuloalbin BC010120 Penta‐EF‐hand Ca 2+ binding domains
HNRPF NM_004966 RNA binding protein RRM motif can also bind single‐strand DNA
C
von Willebrand factor XM_006947 Stop codon
Metallothionein‐1 XM_165657 Antisense
PAI‐1 AH002922 Antisense
RP11‐4H20 AL445543 Putative protein, out of frame
MORF NM_012330 Out of frame
NUMB NM_003744 Out of frame
MMP‐1 NM_002421 Antisense/stop codon
Empty or re‐arranged vector
Nombre Accession no. Observaciones
A
Notch‐1 (3×) AF308602 TF, vascular development
MAML‐1 AF221759 Co‐activator of NOTCH
HSF‐1 HUMHSF1 Heat shock TF
RelA NM_021975 NF‐κB p65 subunit, TF involved in inflammation and apoptosis
Fus HSFUSA RelA co‐activator
Sox‐7 (3×) BC004299 Sry related HMG‐box related TF, involved in wnt signaling
MondoA AF312918 bHLH TF, Max interacting
STAT‐6 (2×) XM_043112 TF, interferon signaling
STAT‐3 AF029311 TF, interferon signaling
Foxo1a NM_002015 TF, forkhead domain
B
Hypothetical Hs11_9491_22_27_7 Proline‐rich, forkhead domain
Hypothetical Hs19_11453_22_26_1 Proline‐rich, ankyrin repeat
Eric‐1 HSA243997 TACC (transforming acidic coiled‐coil) domain present in centrosomal proteins
E7/Hakai AF167441 Proline‐rich, C2H2 and C2HC4 zinc fingers
Junction Plakoglobin BC011865 Involvement in β‐catenin/wnt signaling
TFG (3×) NM_006070 TRK fused gene, transforming, glutamine‐rich
VE‐cadherin X79981 Acidic region, membrane associated
Atrophin XM_006637 Polyglutamine stretch
BCAR‐1 AJ242987 Proline‐rich, breast cancer anti‐estrogen resistence protein
Zyxin XM_056979 Contains LIM domain
Peflin AB026628 Penta‐EF‐hand Ca 2+ binding domains
Reticuloalbin BC010120 Penta‐EF‐hand Ca 2+ binding domains
HNRPF NM_004966 RNA binding protein RRM motif can also bind single‐strand DNA
C
von Willebrand factor XM_006947 Stop codon
Metallothionein‐1 XM_165657 Antisense
PAI‐1 AH002922 Antisense
RP11‐4H20 AL445543 Putative protein, out of frame
MORF NM_012330 Out of frame
NUMB NM_003744 Out of frame
MMP‐1 NM_002421 Antisense/stop codon
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Genes identified in the TF screen: (A) cognate TFs, (B) potentially novel TFs and (C) false positives

Nombre Accession no. Observaciones
A
Notch‐1 (3×) AF308602 TF, vascular development
MAML‐1 AF221759 Co‐activator of NOTCH
HSF‐1 HUMHSF1 Heat shock TF
RelA NM_021975 NF‐κB p65 subunit, TF involved in inflammation and apoptosis
Fus HSFUSA RelA co‐activator
Sox‐7 (3×) BC004299 Sry related HMG‐box related TF, involved in wnt signaling
MondoA AF312918 bHLH TF, Max interacting
STAT‐6 (2×) XM_043112 TF, interferon signaling
STAT‐3 AF029311 TF, interferon signaling
Foxo1a NM_002015 TF, forkhead domain
B
Hypothetical Hs11_9491_22_27_7 Proline‐rich, forkhead domain
Hypothetical Hs19_11453_22_26_1 Proline‐rich, ankyrin repeat
Eric‐1 HSA243997 TACC (transforming acidic coiled‐coil) domain present in centrosomal proteins
E7/Hakai AF167441 Proline‐rich, C2H2 and C2HC4 zinc fingers
Junction Plakoglobin BC011865 Involvement in β‐catenin/wnt signaling
TFG (3×) NM_006070 TRK fused gene, transforming, glutamine‐rich
VE‐cadherin X79981 Acidic region, membrane associated
Atrophin XM_006637 Polyglutamine stretch
BCAR‐1 AJ242987 Proline‐rich, breast cancer anti‐estrogen resistence protein
Zyxin XM_056979 Contains LIM domain
Peflin AB026628 Penta‐EF‐hand Ca 2+ binding domains
Reticuloalbin BC010120 Penta‐EF‐hand Ca 2+ binding domains
HNRPF NM_004966 RNA binding protein RRM motif can also bind single‐strand DNA
C
von Willebrand factor XM_006947 Stop codon
Metallothionein‐1 XM_165657 Antisense
PAI‐1 AH002922 Antisense
RP11‐4H20 AL445543 Putative protein, out of frame
MORF NM_012330 Out of frame
NUMB NM_003744 Out of frame
MMP‐1 NM_002421 Antisense/stop codon
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Nombre Accession no. Observaciones
A
Notch‐1 (3×) AF308602 TF, vascular development
MAML‐1 AF221759 Co‐activator of NOTCH
HSF‐1 HUMHSF1 Heat shock TF
RelA NM_021975 NF‐κB p65 subunit, TF involved in inflammation and apoptosis
Fus HSFUSA RelA co‐activator
Sox‐7 (3×) BC004299 Sry related HMG‐box related TF, involved in wnt signaling
MondoA AF312918 bHLH TF, Max interacting
STAT‐6 (2×) XM_043112 TF, interferon signaling
STAT‐3 AF029311 TF, interferon signaling
Foxo1a NM_002015 TF, forkhead domain
B
Hypothetical Hs11_9491_22_27_7 Proline‐rich, forkhead domain
Hypothetical Hs19_11453_22_26_1 Proline‐rich, ankyrin repeat
Eric‐1 HSA243997 TACC (transforming acidic coiled‐coil) domain present in centrosomal proteins
E7/Hakai AF167441 Proline‐rich, C2H2 and C2HC4 zinc fingers
Junction Plakoglobin BC011865 Involvement in β‐catenin/wnt signaling
TFG (3×) NM_006070 TRK fused gene, transforming, glutamine‐rich
VE‐cadherin X79981 Acidic region, membrane associated
Atrophin XM_006637 Polyglutamine stretch
BCAR‐1 AJ242987 Proline‐rich, breast cancer anti‐estrogen resistence protein
Zyxin XM_056979 Contains LIM domain
Peflin AB026628 Penta‐EF‐hand Ca 2+ binding domains
Reticuloalbin BC010120 Penta‐EF‐hand Ca 2+ binding domains
HNRPF NM_004966 RNA binding protein RRM motif can also bind single‐strand DNA
C
von Willebrand factor XM_006947 Stop codon
Metallothionein‐1 XM_165657 Antisense
PAI‐1 AH002922 Antisense
RP11‐4H20 AL445543 Putative protein, out of frame
MORF NM_012330 Out of frame
NUMB NM_003744 Out of frame
MMP‐1 NM_002421 Antisense/stop codon
Empty or re‐arranged vector

Breakdown of cell numbers

A
Total number of cells sorted 10 million
Number of cells scored positive in FACS 500
Number of clones analyzed 69
Known TFs 15
Potentially novel TFs 40
False positives 14
B
cDNA library 151
Empty vector 18
A
Total number of cells sorted 10 million
Number of cells scored positive in FACS 500
Number of clones analyzed 69
Known TFs 15
Potentially novel TFs 40
False positives 14
B
cDNA library 151
Empty vector 18

(A) The total number of cells in an experiment is given, the transduction efficiency is estimated between 20 and 50% depending on the experiment. False positives include inserts in antisense orientation, short (<5 amino acids) open reading frame, or empty vector (see Table 1 ). (B) In a separate experiment, the number of GFP‐positives obtained after transduction of 1.5 × 10 6 cells with the library and with the empty vector was determined.

Breakdown of cell numbers

A
Total number of cells sorted 10 million
Number of cells scored positive in FACS 500
Number of clones analyzed 69
Known TFs 15
Potentially novel TFs 40
False positives 14
B
cDNA library 151
Empty vector 18
A
Total number of cells sorted 10 million
Number of cells scored positive in FACS 500
Number of clones analyzed 69
Known TFs 15
Potentially novel TFs 40
False positives 14
B
cDNA library 151
Empty vector 18

(A) The total number of cells in an experiment is given, the transduction efficiency is estimated between 20 and 50% depending on the experiment. False positives include inserts in antisense orientation, short (<5 amino acids) open reading frame, or empty vector (see Table 1 ). (B) In a separate experiment, the number of GFP‐positives obtained after transduction of 1.5 × 10 6 cells with the library and with the empty vector was determined.


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