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¿Cuál es el origen de los plásmidos?

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Según tengo entendido, los plásmidos, como las mitocondrias, tienen su propio material genético y son capaces de autorreplicarse.

Según Wikipedia: Los plásmidos se consideran replicones, unidades de ADN capaces de replicarse de forma autónoma dentro de un huésped adecuado. Sin embargo, al igual que los virus, no se clasifican como vida. Los plásmidos se transmiten de una bacteria a otra a través de la conjugación. A diferencia de los virus, los plásmidos son ADN "desnudo". Sin embargo, algunas clases de plásmidos codifican el pilus "sexual" conjugativo necesario para su propia transferencia.

Tengo entendido que una bacteria obtiene sus plásmidos no debido a la replicación de su cromosoma circular, ni porque ese cromosoma tiene genes para codificar el plásmido (no sé realmente si eso es posible), sino debido a la auto- replicación de sus propios plásmidos.

Entonces, mi pregunta es ¿cómo llegó el primer plásmido a las primeras bacterias, si no están en sus cromosomas? ¿Era un virus otra célula procariota que tenía ADN circular y fue fagocitada por esa bacteria?


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¿Bioblastos? Plasmagenes? En las décadas de 1940 y 1950, los científicos estaban trabajando para comprender los factores genéticos citoplasmáticos que podían transferirse entre células. En ese momento, se pensaba que estos agentes extranucleares de la herencia eran todo, desde parásitos hasta simbiontes y genes, y las etiquetas que se les aplicaban eran vagas o contradictorias, debido en parte al hecho de que se sabía muy poco sobre el papel que jugaban estos factores. dentro de un organismo.

Entonces, ¿cómo obtuvieron los plásmidos su nombre?

En 1952, Joshua Lederberg se propuso aclarar la clasificación de estos factores de herencia citoplasmática. Propuso el término "plásmido", derivado de un híbrido de "citoplasma" e "id" (en latín, "eso"), como "un término genérico para cualquier determinante hereditario extracromsomal". Su propuesta, sin embargo, fue básicamente ignorada. Un término separado, "episoma", definido como "un elemento genético no esencial que podría existir de forma autónoma o integrado en el cromosoma" fue propuesto unos años más tarde por Élie Jacob y François Wollman y se convirtió en el nombre ampliamente adoptado para estos elementos. En ese momento, el uso de episoma parecía apropiado, especialmente desde que se observó que la fertilidad o factor F descubierto por Ester Lederberg en 1952 se integraba en la E. coli cromosoma en algunos casos. Esta terminología se mantuvo hasta la década de 1960, cuando los científicos comenzaron a estudiar otras partículas extracromosómicas, particularmente la resistencia o factores R. Al igual que los factores F, los factores R podrían transferirse entre bacterias a través del contacto de célula a célula; sin embargo, los científicos señalaron que, a diferencia de los factores F, la evidencia no respaldaba la idea de que los factores R pudieran integrarse en el cromosoma. Por lo tanto, el término "episoma" finalmente se eliminó y hemos estado usando "plásmido" desde entonces.


Contenido

En la segunda mitad del siglo XIX, el trabajo pionero de Gregor Mendel sobre la herencia de rasgos en plantas de guisantes sugirió que "factores" específicos (hoy establecidos como genes) son responsables de la transferencia de rasgos de organismos entre generaciones. [4] Aunque inicialmente se asumió que las proteínas servían como material hereditario, Avery, MacLeod y McCarty establecieron un siglo después el ADN, que había sido descubierto por Friedrich Miescher, como portador de información genética. [5] Estos hallazgos allanaron el camino para la investigación que descubrió la naturaleza química del ADN y las reglas para codificar la información genética, y finalmente llevaron a la propuesta de la estructura de doble hélice del ADN por Watson y Crick. [6] Este modelo tridimensional de ADN iluminó los posibles mecanismos mediante los cuales la información genética podría copiarse de manera semiconservadora antes de la división celular, una hipótesis que más tarde fue apoyada experimentalmente por Meselson y Stahl utilizando la incorporación de isótopos para distinguir entre los padres y los recién sintetizados. ADN. [7] [8] El posterior aislamiento de las ADN polimerasas, las enzimas que catalizan la síntesis de nuevas cadenas de ADN, por parte de Kornberg y sus colegas, fue pionero en la identificación de muchos componentes diferentes de la maquinaria biológica de replicación del ADN, primero en el organismo modelo bacteriano. E. coli, pero más tarde también en formas de vida eucariotas. [2] [9]

Un prerrequisito clave para la replicación del ADN es que debe ocurrir con una fidelidad y eficiencia extremadamente altas exactamente una vez por ciclo celular para prevenir la acumulación de alteraciones genéticas con consecuencias potencialmente perjudiciales para la supervivencia celular y la viabilidad del organismo. [10] Los eventos de replicación del ADN incompletos, erróneos o inoportunos pueden dar lugar a mutaciones, poliploidía o aneuploidía cromosómica y variaciones en el número de copias de genes, cada una de las cuales a su vez puede provocar enfermedades, incluido el cáncer. [11] [12] Para asegurar la duplicación completa y precisa de todo el genoma y el flujo correcto de información genética a las células de la progenie, todos los eventos de replicación del ADN no solo están estrictamente regulados con señales del ciclo celular, sino que también están coordinados con otros eventos celulares como transcripción y reparación del ADN. [2] [13] [14] [15] Además, las secuencias de origen comúnmente tienen un alto contenido de AT en todos los reinos, ya que las repeticiones de adenina y timina son más fáciles de separar porque sus interacciones de apilamiento de bases no son tan fuertes como las de guanina y citosina. [dieciséis]

La replicación del ADN se divide en diferentes etapas. Durante la iniciación, los mecanismos de replicación, denominados replisomas, se ensamblan en el ADN de forma bidireccional. Estos loci de ensamblaje constituyen los sitios de inicio de la replicación del ADN o los orígenes de la replicación. En la fase de elongación, los replisomas viajan en direcciones opuestas con las horquillas de replicación, desenrollando la hélice de ADN y sintetizando hebras de ADN hijas complementarias utilizando ambas hebras parentales como plantillas. Una vez que se completa la replicación, los eventos de terminación específicos conducen al desensamblaje de los replisomas. Siempre que se duplique todo el genoma antes de la división celular, se podría suponer que la ubicación de los sitios de inicio de la replicación no importa todavía, se ha demostrado que muchos organismos usan regiones genómicas preferidas como orígenes. [17] [18] La necesidad de regular la ubicación del origen probablemente surge de la necesidad de coordinar la replicación del ADN con otros procesos que actúan sobre la plantilla de cromatina compartida para evitar roturas de la cadena de ADN y daños en el ADN. [2] [12] [15] [19] [20] [21] [22] [23]

Hace más de cinco décadas, Jacob, Brenner y Cuzin propusieron la hipótesis del replicón para explicar la regulación de la síntesis de ADN cromosómico en E. coli. [24] El modelo postula que un difusible, trans-factor de acción, un llamado iniciador, interactúa con un cis-Elemento de ADN que actúa, el replicador, para promover el inicio de la replicación en un origen cercano. Una vez unidos a los replicadores, los iniciadores (a menudo con la ayuda de proteínas co-cargadoras) depositan helicasas replicativas en el ADN, que posteriormente impulsan el reclutamiento de componentes replisomas adicionales y el ensamblaje de toda la maquinaria de replicación. De este modo, el replicador especifica la ubicación de los eventos de iniciación de la replicación, y la región cromosómica que se replica a partir de un solo origen o evento de iniciación se define como el replicón. [2]

Una característica fundamental de la hipótesis del replicón es que se basa en la regulación positiva para controlar el inicio de la replicación del ADN, lo que puede explicar muchas observaciones experimentales en sistemas bacterianos y fagos. [24] Por ejemplo, explica el fracaso de los ADN extracromosómicos sin origen para replicarse cuando se introducen en las células huésped. Además, racionaliza las incompatibilidades de plásmidos en E. coli, donde ciertos plásmidos desestabilizan la herencia de los demás debido a la competencia por la misma maquinaria de iniciación molecular. [25] Por el contrario, un modelo de regulación negativa (análogo al modelo de operador de replicón para la transcripción) no explica los hallazgos anteriores. [24] No obstante, la investigación posterior a la propuesta del modelo de replicón de Jacob, Brenner y Cuzin ha descubierto muchas capas adicionales de control de replicación en bacterias y eucariotas que comprenden elementos reguladores tanto positivos como negativos, destacando tanto la complejidad como la importancia de restringir la replicación del ADN. temporal y espacialmente. [2] [26] [27] [28]

El concepto de replicador como entidad genética ha demostrado ser muy útil en la búsqueda de identificar secuencias de ADN replicador y proteínas iniciadoras en procariotas y, en cierta medida, también en eucariotas, aunque la organización y complejidad de los replicadores difieren considerablemente entre los dominios de la vida. [29] [30] Si bien los genomas bacterianos generalmente contienen un solo replicador que se especifica mediante elementos de secuencia de ADN de consenso y que controla la replicación de todo el cromosoma, la mayoría de los replicadores eucariotas, con la excepción de la levadura en ciernes, no están definidos a nivel de ADN. en su lugar, parece que se especifican combinatoriamente mediante señales de cromatina y estructurales del ADN local. [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] Los cromosomas eucariotas también son mucho más grandes que sus homólogos bacterianos, lo que aumenta la necesidad de iniciar la síntesis de ADN en muchos orígenes simultáneamente para garantizar la replicación oportuna de todo el genoma. Además, se cargan muchas más helicasas replicativas de las que se activan para iniciar la replicación en un ciclo celular dado. La definición de replicadores basada en el contexto y la selección de orígenes sugiere un modelo de replicón relajado en sistemas eucariotas que permite flexibilidad en el programa de replicación del ADN. [29] Aunque los replicadores y los orígenes se pueden espaciar físicamente en los cromosomas, a menudo se co-localizan o se encuentran muy cerca para simplificar, por lo tanto, nos referiremos a ambos elementos como "orígenes" a lo largo de esta revisión. En conjunto, el descubrimiento y aislamiento de secuencias de origen en varios organismos representa un hito significativo hacia la obtención de una comprensión mecanicista de la iniciación de la replicación. Además, estos logros tuvieron profundas implicaciones biotecnológicas para el desarrollo de vectores lanzadera que pueden propagarse en células bacterianas, de levadura y de mamíferos. [2] [41] [42] [43]

La mayoría de los cromosomas bacterianos son circulares y contienen un solo origen de replicación cromosómica (oriC). Bacteriano oriC regiones son sorprendentemente diversas en tamaño (que van desde 250 pb a 2 kpb), secuencia y organización [45] [46] sin embargo, su capacidad para impulsar el inicio de la replicación depende típicamente de la lectura específica de la secuencia de los elementos de ADN de consenso por parte del iniciador bacteriano, una proteína llamada DnaA. [47] [48] [49] [50] Los orígenes de las bacterias son continuos o bipartitos y contienen tres elementos funcionales que controlan la actividad del origen: repeticiones de ADN conservadas que son reconocidas específicamente por DnaA (llamadas cajas de DnaA), un Elemento de desenrollamiento de ADN (DUE) y sitios de unión para proteínas que ayudan a regular el inicio de la replicación. [17] [51] [52] Las interacciones de DnaA tanto con las regiones de la caja de DnaA de cadena doble (ds) como con el ADN de cadena sencilla (ss) en el DUE son importantes para la activación del origen y están mediadas por diferentes dominios en el proteína iniciadora: un elemento de unión al ADN Helix-turn-helix (HTH) y una ATPasa asociada con varias actividades celulares (AAA +) de dominio, respectivamente. [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] Si bien la secuencia, el número y la disposición de las cajas de DnaA asociadas al origen varían en todo el reino bacteriano, su ubicación y espaciamiento específicos en un determinado las especies son críticas para oriC función y para la formación de complejos de iniciación productiva. [2] [45] [46] [60] [61] [62] [63] [64]

Entre las bacterias, E. coli es un sistema modelo particularmente poderoso para estudiar la organización, el reconocimiento y el mecanismo de activación de los orígenes de la replicación. E. coli oriC comprende un aproximadamente

Región de 260 pb que contiene cuatro tipos de elementos de unión del iniciador que difieren en sus afinidades por DnaA y sus dependencias en el cofactor ATP. Las cajas de DnaA R1, R2 y R4 constituyen sitios de alta afinidad que están unidos por el dominio HTH de DnaA independientemente del estado de unión a nucleótidos del iniciador. [47] [65] [66] [67] [68] [69] Por el contrario, los sitios I, τ y C, que están intercalados entre los sitios R, son cajas de DnaA de baja afinidad y se asocian preferentemente con DnaA unido a ATP, aunque ADP-DnaA puede sustituir al ATP-DnaA en determinadas condiciones. [70] [71] [72] [63] La unión de los dominios HTH a los elementos de reconocimiento de DnaA de alta y baja afinidad promueve la oligomerización de orden superior dependiente de ATP de los módulos AAA + de DnaA en un filamento derecho que envuelve el ADN dúplex alrededor de su superficie exterior, generando así una torsión superhelical que facilita la fusión del DUE rico en AT adyacente. [53] [73] [74] [75] La separación de la hebra de ADN también se ve favorecida por las interacciones directas del dominio AAA + ATPasa de DnaA con repeticiones de tripletes, las denominadas tríos de DnaA, en la región DUE proximal. [76] El acoplamiento de los segmentos de trinucleótidos monocatenarios por el filamento iniciador estira el ADN y estabiliza la burbuja de iniciación al evitar el recocido. [57] El elemento de origen DnaA-trio se conserva en muchas especies bacterianas, lo que indica que es un elemento clave para la función de origen. [76] Después de la fusión, el DUE proporciona un sitio de entrada para el E. coli helicasa replicativa DnaB, que se deposita en cada una de las cadenas individuales de ADN por su proteína cargadora DnaC. [2]

Aunque las diferentes actividades de unión al ADN del DnaA se han estudiado extensamente bioquímicamente y se han apo, se han determinado estructuras enlazadas con ADNss o ADNds, [56] [57] [58] [74] la arquitectura exacta del ADNA de orden superiororiC El montaje de iniciación sigue sin estar claro. Se han propuesto dos modelos para explicar la organización de elementos de origen esenciales y mediada por DnaA. oriC derritiendo. El modelo de dos estados asume un filamento de DnaA continuo que cambia de un modo de unión de dsDNA (el complejo organizador) a un modo de unión de ssDNA en el DUE (el complejo de fusión). [74] [77] Por el contrario, en el modelo de bucle invertido, el ADN está muy doblado en oriC y se pliega sobre el filamento iniciador de modo que los protómeros de DnaA se acoplan simultáneamente a regiones de ADN de hebra doble y simple. [78] Aclarar cómo exactamente oriC El ADN está organizado por DnaA sigue siendo, por tanto, una tarea importante para estudios futuros. Los conocimientos sobre la arquitectura del complejo de iniciación ayudarán a explicar no solo cómo se funde el ADN de origen, sino también cómo se carga direccionalmente una helicasa replicativa en cada una de las hebras de ADN individuales expuestas en el DUE desenrollado, y cómo estos eventos son ayudados por las interacciones de la helicasa con las proteínas iniciadoras y cargadoras específicas. [2]

Los orígenes de la replicación de las arqueas comparten algunas, pero no todas, las características organizativas de las bacterias. oriC. A diferencia de las bacterias, las arqueas a menudo inician la replicación a partir de múltiples orígenes por cromosoma (se han informado de uno a cuatro) [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [46] los orígenes también llevan regiones de secuencia especializadas que controlan la función del origen. [87] [88] [89] Estos elementos incluyen tanto cajas de reconocimiento de origen de secuencias de ADN específicas (ORB o miniORB) como un DUE rico en AT que está flanqueado por una o varias regiones ORB. [85] [90] Los elementos ORB muestran un grado considerable de diversidad en términos de su número, disposición y secuencia, tanto entre diferentes especies de arqueas como entre diferentes orígenes dentro de una sola especie. [80] [85] [91] El iniciador, Orc1 / Cdc6, introduce un grado adicional de complejidad en las arqueas, que se une a las regiones ORB. Los genomas de Archaeal típicamente codifican múltiples parálogos de Orc1 / Cdc6 que varían sustancialmente en sus afinidades por distintos elementos ORB y que contribuyen de manera diferente a las actividades de origen. [85] [92] [93] [94] En Sulfolobus solfataricus, por ejemplo, se han cartografiado tres orígenes cromosómicos (oriC1, oriC2 y oriC3), y los estudios bioquímicos han revelado patrones de unión complejos de iniciadores en estos sitios. [85] [86] [95] [96] El iniciador afín de oriC1 es Orc1-1, que se asocia con varios ORB en este origen. [85] [93] OriC2 y oriC3 están unidos por Orc1-1 y Orc1-3. [85] [93] [96] Por el contrario, un tercer parálogo, Orc1-2, imprime huellas en los tres orígenes, pero se ha postulado que regula negativamente el inicio de la replicación. [85] [96] Además, se ha demostrado que la proteína WhiP, un iniciador no relacionado con Orc1 / Cdc6, se une a todos los orígenes e impulsa la actividad del origen de oriC3 en los Sulfolobus islandicus. [93] [95] Debido a que los orígenes de las arqueas a menudo contienen varios elementos ORB adyacentes, múltiples parálogos Orc1 / Cdc6 pueden reclutarse simultáneamente en un origen y oligomerizar en algunos casos [94] [97] sin embargo, en contraste con el DnaA bacteriano, la formación de un El ensamblaje del iniciador de orden superior no parece ser un requisito previo general para la función de origen en el dominio de las arqueas. [2]

Los estudios estructurales han proporcionado información sobre cómo el arqueal Orc1 / Cdc6 reconoce los elementos ORB y remodela el ADN de origen. [97] [98] Los parálogos Orc1 / Cdc6 son proteínas de dos dominios y están compuestos por un módulo AAA + ATPasa fusionado a un pliegue de hélice alada C-terminal. [99] [100] [101] Las estructuras complejadas con ADN de Orc1 / Cdc6 revelaron que los ORB están unidos por un monómero Orc1 / Cdc6 a pesar de la presencia de secuencias repetidas invertidas dentro de los elementos ORB. [97] [98] Tanto la ATPasa como las regiones de hélice alada interactúan con el dúplex de ADN pero contactan asimétricamente la secuencia de repetición del ORB palindrómico, lo que orienta a Orc1 / Cdc6 en una dirección específica en la repetición. [97] [98] Curiosamente, los elementos ORB o miniORB flanqueantes DUE a menudo tienen polaridades opuestas, [80] [85] [94] [102] [103] que predice que los subdominios de la tapa AAA + y los dominios de hélice alada de Orc1 / Cdc6 se colocan a ambos lados del DUE de manera que se enfrenten entre sí. [97] [98] Dado que ambas regiones de Orc1 / Cdc6 se asocian con una helicasa replicativa de mantenimiento de minicromosomas (MCM), [104] [105] esta disposición específica de elementos ORB y Orc1 / Cdc6 es probablemente importante para cargar dos complejos MCM simétricamente en el DUE. [85] Sorprendentemente, mientras que la secuencia de ADN de ORB determina la direccionalidad de la unión de Orc1 / Cdc6, el iniciador hace relativamente pocos contactos específicos de secuencia con el ADN. [97] [98] Sin embargo, Orc1 / Cdc6 se enrolla y dobla severamente el ADN, lo que sugiere que se basa en una mezcla de secuencia de ADN y características estructurales de ADN dependientes del contexto para reconocer los orígenes. [97] [98] [106] En particular, el emparejamiento de bases se mantiene en el dúplex de ADN distorsionado tras la unión de Orc1 / Cdc6 en las estructuras cristalinas, [97] [98] mientras que los estudios bioquímicos han arrojado hallazgos contradictorios sobre si los iniciadores de arqueas pueden derretirse ADN de manera similar al ADN bacteriano. [93] [94] [107] Aunque el parentesco evolutivo de los iniciadores de arqueas y eucariotas y las helicasas replicativas indica que es probable que la MCM de arqueas se cargue en el ADN dúplex (ver la siguiente sección), el orden temporal de origen de fusión y la carga de helicasa, así como Por lo tanto, el mecanismo de fusión del ADN de origen en los sistemas de arqueas aún no se ha establecido claramente. Del mismo modo, en estudios futuros se debe abordar exactamente cómo se carga exactamente la helicasa MCM en el ADN. [2]

La organización, especificación y activación del origen en eucariotas son más complejas que en los dominios bacterianos o arqueales y se desvían significativamente del paradigma establecido para el inicio de la replicación procariota. Los grandes tamaños del genoma de las células eucariotas, que van desde 12 Mbp en S. cerevisiae a 3 Gbp en humanos, requiere que la replicación del ADN comience en varios cientos (en levaduras en ciernes) a decenas de miles (en humanos) para completar la replicación del ADN de todos los cromosomas durante cada ciclo celular. [27] [36] Con excepción de S. cerevisiae y relacionado Saccharomycotina especies, los orígenes eucariotas no contienen elementos de secuencia de ADN de consenso, pero su ubicación está influenciada por señales contextuales como la topología del ADN local, las características estructurales del ADN y el entorno de la cromatina. [110] [35] [37] No obstante, la función de origen eucariota todavía depende de un complejo proteico iniciador conservado para cargar helicasas replicativas en el ADN durante las fases tardías M y G1 del ciclo celular, un paso conocido como licencia de origen. [111] A diferencia de sus contrapartes bacterianas, las helicasas replicativas en eucariotas se cargan en el ADN dúplex de origen en una forma inactiva, doble hexamérica y solo un subconjunto de ellas (10-20% en células de mamíferos) se activa durante cualquier fase S determinada. , eventos que se conocen como activación de origen. [112] [113] [114] Por lo tanto, la ubicación de los orígenes eucariotas activos se determina en al menos dos niveles diferentes, la concesión de licencias de origen para marcar todos los orígenes potenciales y la activación de origen para seleccionar un subconjunto que permita el ensamblaje de la maquinaria de replicación y el inicio de Síntesis de ADN. Los orígenes con licencia adicional sirven como respaldo y se activan solo al ralentizar o estancar las horquillas de replicación cercanas, lo que garantiza que la replicación del ADN se pueda completar cuando las células se encuentren con estrés de replicación. [115] [116] Juntos, el exceso de orígenes autorizados y el estricto control del ciclo celular de la concesión de licencias de origen y el despido incorporan dos estrategias importantes para prevenir la replicación insuficiente y excesiva y para mantener la integridad de los genomas eucariotas. [2]

Los primeros estudios en S. cerevisiae indicó que los orígenes de replicación en eucariotas podrían reconocerse de una manera específica de secuencia de ADN de manera análoga a los de procariotas. En la levadura en gemación, la búsqueda de replicadores genéticos conduce a la identificación de secuencias de replicación autónoma (ARS) que apoyan el inicio eficiente de la replicación del ADN del ADN extracromosómico. [117] [118] [119] Estas regiones ARS tienen aproximadamente 100-200 pb de largo y exhiben una organización multipartita, que contiene elementos A, B1, B2 y, a veces, B3 que juntos son esenciales para la función de origen. [120] [121] El elemento A abarca la secuencia consenso ARS (ACS) de 11 pb conservada, [122] [123] que, junto con el elemento B1, constituye el sitio de unión principal para el complejo de reconocimiento de origen heterohexámero (ORC) , el iniciador de la replicación eucariota. [124] [125] [126] [127] Dentro de ORC, cinco subunidades se basan en AAA + ATPasa conservada y pliegues de hélice alada y se ensamblan conjuntamente en un anillo pentamérico que rodea el ADN. [127] [128] [129] En el ORC de levadura en gemación, los elementos de unión al ADN en los dominios de la ATPasa y la hélice alada, así como las regiones del parche básico adyacente en algunas de las subunidades del ORC, se colocan en el poro central del anillo ORC de manera que ayuden al reconocimiento específico de la secuencia de ADN del ACS de una manera dependiente de ATP. [127] [130] Por el contrario, las funciones de los elementos B2 y B3 son menos claras. La región B2 es similar a la ACS en secuencia y se ha sugerido que funciona como un segundo sitio de unión a ORC bajo ciertas condiciones, o como un sitio de unión para el núcleo de helicasa replicativo. [131] [132] [133] [134] [135] A la inversa, el elemento B3 recluta el factor de transcripción Abf1, aunque B3 no se encuentra en todos los orígenes de levadura en gemación y la unión de Abf1 no parece ser estrictamente esencial para la función de origen. [2] [120] [136] [137]

Reconocimiento de origen en eucariotas distintos de S. cerevisiae o sus parientes cercanos no se ajustan a la lectura específica de secuencia de elementos de ADN de origen conservados. Las búsquedas para aislar secuencias replicadoras cromosómicas específicas de manera más general en especies eucariotas, ya sea genéticamente o mediante el mapeo de todo el genoma de la unión del iniciador o los sitios de inicio de la replicación, no han logrado identificar secuencias de consenso claras en los orígenes. [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144] [145] [146] [147] [148] [149] Por lo tanto, las interacciones ADN-iniciador específicas de secuencia en la levadura en gemación significan una un modo especializado para el reconocimiento del origen en este sistema en lugar de un modo arquetípico para la especificación del origen en todo el dominio eucariota. No obstante, la replicación del ADN se inicia en sitios discretos que no están distribuidos aleatoriamente entre los genomas eucariotas, argumentando que los medios alternativos determinan la ubicación cromosómica de los orígenes en estos sistemas. Estos mecanismos implican una interacción compleja entre la accesibilidad del ADN, el sesgo de la secuencia de nucleótidos (tanto la riqueza de AT como las islas CpG se han relacionado con los orígenes), el posicionamiento de los nucleosomas, las características epigenéticas, la topología del ADN y ciertas características estructurales del ADN (por ejemplo, motivos G4), así como como proteínas reguladoras e interferencia transcripcional. [17] [18] [34] [35] [37] [150] [151] [143] [152] Es importante señalar que las propiedades de origen varían no solo entre los diferentes orígenes de un organismo y entre las especies, sino que algunas también pueden cambiar durante desarrollo y diferenciación celular. El locus del corion en Drosophila Las células del folículo constituyen un ejemplo bien establecido para el control espacial y del desarrollo de los eventos de iniciación. Esta región experimenta una amplificación genética dependiente de la replicación del ADN en una etapa definida durante la ovogénesis y se basa en la activación oportuna y específica de los orígenes del corion, que a su vez está regulada por elementos cis específicos del origen y varios factores proteicos, incluido el complejo Myb, E2F1 y E2F2. [153] [154] [155] [156] [157] Esta especificación combinatoria y regulación multifactorial de los orígenes de los metazoos ha complicado la identificación de características unificadoras que determinan la ubicación de los sitios de inicio de replicación en eucariotas de manera más general. [2]

Para facilitar el inicio de la replicación y el reconocimiento del origen, los ensamblajes de ORC de varias especies han desarrollado dominios auxiliares especializados que se cree que ayudan a que el iniciador se dirija a los orígenes cromosómicos o cromosomas en general. Por ejemplo, la subunidad Orc4 en S. pombe ORC contiene varios AT-hooks que se unen preferentemente a ADN rico en AT, [158] mientras que en metazoan ORC se cree que el dominio de tipo TFIIB de Orc6 realiza una función similar. [159] Las proteínas Metazoan Orc1 también albergan un dominio de homología bromo-adyacente (BAH) que interactúa con los nucleosomas H4K20me2. [109] Particularmente en células de mamíferos, se ha informado que la metilación de H4K20 es necesaria para un inicio de replicación eficiente, y el dominio Orc1-BAH facilita la asociación de ORC con cromosomas y replicación dependiente del origen del virus de Epstein-Barr. [160] [161] [162] [163] [164] Por lo tanto, es intrigante especular que ambas observaciones están vinculadas mecánicamente al menos en un subconjunto de metazoos, pero esta posibilidad debe explorarse más en estudios futuros. Además del reconocimiento de ciertas características epigenéticas o de ADN, ORC también se asocia directa o indirectamente con varias proteínas asociadas que podrían ayudar al reclutamiento del iniciador, incluidas LRWD1, PHIP (o DCAF14), HMGA1a, entre otras. [33] [165] [166] [167] [168] [169] [170] [171] Curiosamente, Drosophila ORC, al igual que su contraparte de levadura en ciernes, dobla el ADN y se ha informado que el superenrollamiento negativo mejora la unión al ADN de este complejo, lo que sugiere que la forma y maleabilidad del ADN podrían influir en la ubicación de los sitios de unión de ORC en los genomas de metazoos. [31] [127] [172] [173] [174] Una comprensión molecular de cómo las regiones de unión al ADN de ORC podrían respaldar la lectura de las propiedades estructurales del dúplex de ADN en metazoos en lugar de secuencias de ADN específicas como en S. cerevisiae espera información estructural de alta resolución de conjuntos iniciadores de metazoos unidos al ADN. Del mismo modo, si los diferentes factores epigenéticos contribuyen al reclutamiento del iniciador en los sistemas de metazoos, y cómo, está mal definido y es una cuestión importante que debe abordarse con más detalle. [2]

Una vez reclutados en los orígenes, ORC y sus cofactores Cdc6 y Cdt1 impulsan la deposición del complejo de mantenimiento de minicromosomas 2-7 (Mcm2-7) en el ADN. [111] [175] Al igual que el núcleo de helicasa replicativa de arqueas, Mcm2-7 se carga como un doble hexámero de cabeza a cabeza en el ADN para autorizar los orígenes. [112] [113] [114] En la fase S, la quinasa dependiente de Dbf4 (DDK) y la quinasa dependiente de ciclina (CDK) fosforilan varias subunidades de Mcm2-7 y factores de iniciación adicionales para promover el reclutamiento de los coactivadores de helicasa Cdc45 y GINS, fusión de ADN y, en última instancia, ensamblaje de replisoma bidireccional en un subconjunto de los orígenes autorizados. [28] [176] Tanto en la levadura como en los metazoos, los orígenes están libres o sin nucleosomas, una propiedad que es crucial para la carga de Mcm2-7, lo que indica que el estado de la cromatina en los orígenes regula no solo el reclutamiento del iniciador sino también la carga de helicasa. [144] [177] [178] [179] [180] [181] Un entorno de cromatina permisivo es aún más importante para la activación del origen y se ha implicado en la regulación tanto de la eficiencia del origen como del tiempo de activación del origen. Los orígenes eucromáticos contienen típicamente marcas de cromatina activas, se replican temprano y son más eficientes que los orígenes heterocromáticos de replicación tardía, que a la inversa se caracterizan por marcas represivas. [27] [179] [182] No es sorprendente que se haya encontrado que varios remodeladores de cromatina y enzimas modificadoras de cromatina se asocian con los orígenes y ciertos factores de iniciación, [183] ​​[184] pero cómo sus actividades impactan en los diferentes eventos de iniciación de la replicación sigue siendo en gran parte oscuro . Sorprendentemente, los "elementos de control de la replicación temprana" (ECRE) que actúan en cis también se han identificado recientemente para ayudar a regular el tiempo de replicación e influir en la arquitectura del genoma 3D en células de mamíferos. [185] Comprender los mecanismos moleculares y bioquímicos que orquestan esta compleja interacción entre la organización del genoma en 3D, la estructura de la cromatina local y de orden superior y la iniciación de la replicación es un tema interesante para futuros estudios. [2]

¿Por qué los orígenes de la replicación de los metazoos han divergido del paradigma de reconocimiento específico de la secuencia de ADN que determina los sitios de inicio de la replicación en procariotas y levaduras en gemación? Las observaciones de que los orígenes de los metazoos a menudo co-localizan con regiones promotoras en Drosophila y células de mamíferos y que los conflictos de replicación-transcripción debidos a colisiones de las maquinarias moleculares subyacentes pueden provocar daños en el ADN sugieren que la coordinación adecuada de la transcripción y la replicación es importante para mantener la estabilidad del genoma. [139] [141] [143] [146] [186] [20] [187] [188] Los hallazgos recientes también apuntan a un papel más directo de la transcripción en influir en la ubicación de los orígenes, ya sea inhibiendo la carga de Mcm2-7 o reposicionando el Mcm2-7 cargado en los cromosomas. [189] [152] La unión del iniciador independiente de la secuencia (pero no necesariamente al azar) al ADN permite además flexibilidad para especificar los sitios de carga de helicasa y, junto con la interferencia transcripcional y la variabilidad en las eficiencias de activación de los orígenes autorizados, probablemente determina la ubicación del origen y contribuye a la co-regulación de la replicación del ADN y los programas de transcripción durante el desarrollo y las transiciones del destino celular. Modelado computacional de eventos de iniciación en S. pombe, así como la identificación de orígenes específicos de tipo celular y regulados por el desarrollo en metazoos, están de acuerdo con esta noción. [140] [148] [190] [191] [192] [193] [194] [152] Sin embargo, también existe un gran grado de flexibilidad en la elección del origen entre las diferentes celdas de una misma población, [143] [149] [191] albeit the molecular mechanisms that lead to the heterogeneity in origin usage remain ill-defined. Mapping origins in single cells in metazoan systems and correlating these initiation events with single-cell gene expression and chromatin status will be important to elucidate whether origin choice is purely stochastic or controlled in a defined manner. [2]


What is Plasmid?

a Plásmido is an extrachromosomal DNA molecule within a cell that is physically separated from chromosomal DNA and can replicate independently. They are most commonly found as small circular, double-stranded DNA molecules in bacteria however, plasmids are sometimes present in archaea and eukaryotic organisms. In nature, plasmids often carry genes that benefit the survival of the organism and confer selective advantages such as antibiotic resistance. While chromosomes are large and contain all the essential genetic information for living under normal conditions, plasmids are usually very small and contain only additional genes that may be useful in certain situations or conditions. Artificial plasmids are widely used as vectors in molecular cloning, serving to drive the replication of recombinant DNA sequences within host organisms. In the laboratory, plasmids may be introduced into a cell via transformation.

Scientists have taken advantage of plasmids to use them as tools to clone, transfer, and manipulate genes. Plasmids that are used experimentally for these purposes are called vectors. Researchers can insert DNA fragments or genes into a plasmid vector, creating a so-called recombinant plasmid. This plasmid can be introduced into a bacterium by way of the process called transformation. Then, because bacteria divide rapidly, they can be used as factories to copy DNA fragments in large quantities.

Plasmid Structure

  • They are extrachromosomal and not essential. They are useful but not necessarily present in every organism of the species
  • Plasmids are not a part of the genome and the same plasmid can exist in different species and gets transferred from one another
  • Plasmids have their own origin of replication (ORI) and they replicate along with the cell so that each daughter cell possesses a copy of the plasmid also
  • Apart from the origin of replication, often it contains genes for antibiotic resistance, for the production of toxins, and other useful genes, that may be required for the survival of cells

The word Plasmid was first coined by Joshua Lederberg in 1952. The term was first described in a research paper he published describing the experiments carried out by himself and his student Norton Zinder. The experiment was conducted on salmonella bacteria and its virus P22.


7.4A: Introduction to Plasmids

  • Contributed by Boundless
  • General Microbiology at Boundless

The term plasmid was first introduced by the American molecular biologist Joshua Lederberg in 1952. A plasmid is a DNA molecule that is separate from, and can replicate independently of the chromosomal DNA. They are double-stranded and, in many cases, circular. Plasmids usually occur naturally in bacteria, but are sometimes found in archaea, and even in eukaryotic organisms (e.g., the 2-micrometre ring in Saccharomyces cerevisiae). Plasmid sizes vary from 1 to over 1,000 kbp. The number of identical plasmids in a single cell can range anywhere from one to thousands under some circumstances. Plasmids can be considered part of the mobilome because they are often associated with conjugation, a mechanism of horizontal gene transfer.

Figura: Step by step of cloning a gene using a plasmid: This image shows a line drawing that compares the activity of non-integrating plasmids, on the top, with episomes, on the bottom, during cell division. The upper half of the image shows a bacterium with its chromosomal DNA and plasmids dividing into two identical bacteria, each with their chromosomal DNA and plasmids. The lower half of the image shows a bacterium with its chromosomal DNA, but with an episome. Next to this bacterium, we see the same bacterium, but after the episome has integrated into the chromosomal DNA and has become a part of it. This second bacterium now divides into two bacteria identical to it, each with an episome integrated into it.

Plasmids are considered replicons. They can be found in all three major domains: Archaea, Bacteria, and Eukarya. Similar to viruses, plasmids are not considered by some to be a form of life. Unlike viruses, they are naked DNA and do not encode genes necessary to encase the genetic material for transfer to a new host, though some classes of plasmids encode the sex pilus necessary for their own transfer. Plasmid host-to-host transfer requires direct mechanical transfer by conjugation, or changes in incipient host gene expression allowing the intentional uptake of the genetic element by transformation. Microbial transformation with plasmid DNA is neither parasitic nor symbiotic in nature, because each implies the presence of an independent species living in a commensal or detrimental state with the host organism. Rather, plasmids provide a mechanism for horizontal gene transfer within a population of microbes and typically provide a selective advantage under a given environmental state. Plasmids may carry genes that provide resistance to naturally occurring antibiotics in a competitive environmental niche, or the proteins produced may act as toxins under similar circumstances. Plasmids can also provide bacteria with the ability to fix elemental nitrogen or to degrade recalcitrant organic compounds that provide an advantage when nutrients are scarce.


Diversity, biology and evolution of IncQ-family plasmids

Plasmids of IncQ-family are distinguished by having a unique strand-displacement mechanism of replication that is capable of functioning in a wide variety of bacterial hosts. In addition, these plasmids are highly mobilizable and therefore very promiscuous. Common features of the replicons have been used to identify IncQ-family plasmids in DNA sequence databases and in this way several unstudied plasmids have been compared to more well-studied IncQ plasmids. We propose that IncQ plasmids can be divided into four subgroups based on a number of mutually supportive criteria. The most important of these are the amino acid sequences of their three essential replication proteins and the observation that the replicon of each subgroup has become fused to four different lineages of mobilization genes. This review of IncQ-family plasmid diversity has highlighted several events in the evolution of these plasmids and raised several questions for further research.


Plasmids

Electron micrograph of an E. coli cell ruptured to release its DNA. The tangle is a portion of a single DNA molecule containing over 4.6 million base pairs encoding approximately 4,300 genes. The small circlets are plasmids. (Courtesy of Huntington Potter and David Dressler, Harvard Medical School.)

Plasmids are molecules of DNA that are found in bacteria separate from the bacterial chromosome.

  • are small (a few thousand base pairs)
  • usually carry only one or a few genes
  • are circular
  • tener un solo origin of replication

Plasmids are replicated by the same machinery that replicates the bacterial chromosome. Some plasmids are copied at about the same rate as the chromosome, so a single cell is apt to have only a single copy of the plasmid. Other plasmids are copied at a high rate and a single cell may have 50 or more of them.

Genes on plasmids with high numbers of copies are usually expressed at high levels. In nature, these genes often encode proteins (e.g., enzymes) that protect the bacterium from one or more antibióticos.

Plasmids enter the bacterial cell with relative ease. This occurs in nature and may account for the rapid spread of antibiotic resistance in hospitals and elsewhere. Plasmids can be deliberately introduced into bacteria in the laboratory transforming the cell with the incoming genes.


Virulence Plasmids

Compared to other harmless bacteria, bacteria that tend to be pathogenic in nature carry genes for virulence factors that allow them to invade and infect their respective hosts.

For some of these bacteria, the virulence factors are the result of the organisms' own genetic material. However, for others, this is as a result of genetic elements from extra-chromosomal DNA. Although there are other sources of such elements, e.g. transposons, plasmids are some of the most common mobile genetic elements.

With regards to pathogenicity, virulence plasmids play an important role given that they can help bacteria effectively adapt to their respective environments. This is because the virulence plasmid can enable the organism to express an array of virulence-associated functions thus providing the organism with more advantageous characteristics to thrive in their environment.

Like other types of plasmids, virulence plasmids can also be transmitted from one bacterium to another. Apart from the virulence gene, plasmids have also been shown to carry other important elements that enhance transmission and maintenance.

For this reason, they are larger in size but low in numbers. This ensures that they do not cause additional burden to the organism during cell division.

Typically, cell division and cell maintenance require the use of energy. By having low numbers of virulence plasmids, the cells are spared significant metabolic burden that would be required for maintenance and genome duplication of numerous plasmids.

Some of the other types of plasmids include:

  • Recombinant plasmids - Plasmids that have been altered in the laboratory and introduced into the bacteria for the purposes of studies
  • Crptic plasmids - No known functions
  • Metabolic plasmids - Enhance metabolism of the host
  • Conjugative plasmids - Promote self-transfer
  • Suicide plasmids - Fail to replicate when transferred from one cell to another

Eva Top

My research is currently focused on the evolution and ecology of plasmids that transfer to and replicate in a broad range of bacteria. Plasmids are mobile genetic elements found in most bacteria. Because they readily transfer between different types of bacteria under natural conditions, they play an important role in rapid bacterial adaptation to changing environments. A good example is the current epidemic of multiple antibiotic resistance in human pathogens, which is largely due to the spread of multi-drug resistance plasmids. Although plasmid-mediated gene transfer is now recognized as a key mechanism in the alarming rise of antibiotic resistance, little is known about their host range, their ability to invade bacterial populations in the absence of selection, and their genetic diversity. We are addressing these questions using various Proteobacteria and plasmids as model systems.

Publicaciones Seleccionadas

Selection of publications in peer-reviewed journals (from over 100 total)

  • Loftie-Eaton, W., K. Bashford, H. Quinn, K. Dong, J. Millstein, S. Hunter, M. Thomason, H. Merrikh, H., J.M. Ponciano, and E.M. Top. 2017. Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids. Nature Ecol. Evol. 1: 1354&ndash1363.
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  • Thomas, C.M., N. R. Thomson, A. M. Cerdeño-Tárraga, C. J. Brown, E.M. Top, and L. S. Frost. 2017. Annotation of Plasmid Genes. Plasmid 91:61-67.
  • Ridenhour, B., G. Metzger, M. France, K. Gliniewicz, J. Millstein, L. Forney, E.M. Top. 2017.Persistence of antibiotic resistance plasmids in bacterial biofilms. Evol. Apl. 10:640-647.
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  • Loftie-Eaton, W. H. Yano, S. Burleigh, R.S. Simmons, J.M. Hughes, L.M. Rogers, S.S. Hunter, M.L. Settles, L.J. Forney, J.M. Ponciano, and E.M. Top. 2016. Evolutionary paths that expand plasmid host-range: implications for spread of antibiotic resistance. Mol. Biol. Evol. 33: 885&ndash897.
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  • Hunter, S., H. Yano, W. Loftie-Eaton, J. Hughes, L. De Gelder, P. Stragier, P. De Vos, M. Settles, and E. M. Top. 2014. Draft genome sequence of Pseudomonas moraviensis R28. Genome Announcement 2: e00035-14. (PMCID: PMC3931354).
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Research Projects

Dr. Top's lab is a member of Biology, Institute for Bioinformatics and Evolutionary Studies (IBEST) and the Bioinformatics & Computational Biology (BCB) Graduate Programs.


Types of vectors:

1) Plasmids- extrachromosomal, double-stranded DNA molecules, circular, self-replicating. Contain origin of replication, allowing for replication-independent and found in prokaryotes.

Classification if plasmids

a) Fertility plasmid- fertility plasmid is also known as F plasmid, contains a transferred gene that allows genes to be transferred from one cell to another through conjugation.

P.ej. F plasmid of Escherichia coli

b) Col plasmid- col plasmid contains genes that make bacteriocins (also known as aa colicins), which are protein that kills other bacteria and thus defends the host bacterim.

P.ej. ColE1 of Escherichia coli

c) Resistance plasmid – resistance plasmid or R plasmid contains genes that help the bacteria cell defend against the environment, factors such as poisons or antibiotics.

P.ej. RP4 in Pseudomonas

d) Degradative plasmid- degradative plasmid helps the host bacterium to digest compounds that are commonly found in nature, such as camphor, xylene, toluene. These plasmids contain the gene for special enzymes that break down specifics compound.

P.ej. Tol of Pseudomonas putida

e) Virulence plasmids- when a virulence plasmid is inside the bacterium, it turns that plasmid into pathogen which is an agent of antigens.

P.ej. Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens

2) Bacteriophage lambda- phage lambda is a bacteriophage or phage i.e. bacterial virus that uses E. coli as a host cell. Its structure is as a typical phage- head, tail, fibers. Lamda viral genome contains 485kb linear DNA with 12base ssDNA. Sticky end at both ends and ends is complementary in sequence and can hybridize to each other.

P.ej. phage lambda, M13phage

3) Cosmid- the Cosmid vectors are the combination of plasmid vector and the cos site which allows the target DNA to be inserted into the lambda head.

4) Artificial chromosomes- artificial chromosomes are DNA molecules or fragments assembled in vitro from define constituents, which guarantee stable maintenance of large DNA fragments with the properties of natural chromosomes. Useful for genome sequencing programs, functional characteristics of entire genome regions, and for transduction of large DNA segment into human and non-human mammalian cells.

Types of artificial chromosomes:

a) Bacterial artificial chromosome (BAC)
b) Yeast artificial chromosome(YAC)


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