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¿Qué mecanismo evita que Colchicum Autumnale se vea afectado por la colchicina?

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La colchicina es una sustancia química que generalmente se usa para causar poliploidía mutante al inhibir la segregación cromosómica.
Se sintetiza en el Colchicum Autumnale.
Pero, ¿qué mecanismo evita que la colchicina afecte a C. Autumnale?


¿Qué mecanismo evita que Colchicum Autumnale se vea afectado por la colchicina? - Biología

La sobredosis de colchicina es poco común pero potencialmente mortal. Es un fármaco seguro cuando se usa de acuerdo con las pautas terapéuticas establecidas, pero causa efectos sistémicos graves si se ingiere en dosis que exceden las recomendaciones. Por lo tanto, la sobredosis debe reconocerse temprano y tratarse adecuadamente para optimizar el resultado. Se informa un caso fatal de sobredosis de colchicina causada por una automedicación inapropiada y, según el conocimiento de los autores, no ha habido ningún informe de sobredosis accidental fatal en el Reino Unido. Se discuten la farmacología de la colchicina, las características clínicas asociadas con la sobredosis y las opciones de tratamiento.


Resultados

La colchicina inhibe la inflamación a través de factores inducidos en plasma.

Para modelar la acción antiinflamatoria de la colchicina en ratones, primero determinamos una dosis que es bioequivalente a las dosis clínicas humanas mediante escalado alométrico y medición de la diarrea, la toxicidad limitante de la dosis en humanos 7 (Datos extendidos Fig. 1). La dosis utilizada en todo momento para modelar como segura fue de 0,4 mg kg –1 por vía intraperitoneal (i.p.). Experimentos posteriores demostraron que era eficaz en modelos de inflamación. El modelado de una dosis tóxica se realizó a 2,4 mg kg –1 i.p., que está cerca de la dosis letal media 16.

Para medir la cinética de la acción antiinflamatoria, se administró colchicina a los ratones y luego se los desafió 1 a 12 h más tarde por vía i.p. inyección de zymosan, un glucano de la pared celular de levadura proinflamatoria, para desencadenar la peritonitis. La infiltración de neutrófilos se puntuó 3 h después del desafío (Fig. 1a). El pretratamiento con colchicina 6 h antes de la exposición redujo la infiltración peritoneal de neutrófilos Ly-6G + aproximadamente cuatro veces, mientras que el pretratamiento de 1 y 12 h no tuvo efecto (Fig. 1a). Debido a que la colchicina se elimina rápidamente del plasma 14, los neutrófilos circulantes estarían más expuestos al fármaco en el grupo de pretratamiento de 1 h. El efecto antiinflamatorio retardado que observamos en ratones, que es consistente con la cinética de reducción del dolor de la gota en humanos 17, sugiere que la colchicina podría actuar indirectamente sobre las células mieloides a través de cambios en la química sanguínea.

a, Cinética de los efectos antiinflamatorios in vivo de la colchicina (colc.). A X hX = 1, 6 o 12) después del tratamiento con colchicina, los ratones fueron desafiados con i.p. zymosan. Tres horas más tarde, se detectaron neutrófilos Ly-6G + infiltrados en el peritoneo mediante análisis FACS. Sólo el pretratamiento de 6 h con colchicina disminuyó la infiltración de neutrófilos. Cada punto representa un ratón, siete ratones por condición. Bmi, La colchicina inhibió indirectamente la activación de neutrófilos. B, Ensayos de activación de neutrófilos ex vivo que comparan los efectos de la propia colchicina, o del plasma de ratones tratados con colchicina, sobre marcadores de inflamación en neutrófilos primarios de tipo salvaje después de la exposición a PMA. Los tratamientos directos con colchicina se realizaron con plasma vehículo, por lo que las concentraciones plasmáticas fueron las mismas en todos los ensayos. Se recogió plasma de colchicina (plasma de ratones tratados con colchicina) en los momentos indicados después del tratamiento in vivo. C, Adhesión de neutrófilos a tubos de plástico. los y El eje indica las células que permanecen en suspensión. FC, doblar el cambio. Al menos tres muestras por condición en tres repeticiones biológicas. Veh. plasma, plasma de ratones tratados con vehículo. D, Generación de ROS detectada con el colorante sensible a ROS, dihidrorrodamina 123, y medida mediante análisis FACS. gMFI: intensidad de fluorescencia media geométrica. Al menos tres muestras por condición en tres repeticiones biológicas. mi, Expresión del gen Pro-IL-1β mediante inmunotransferencia. La propia colchicina carecía de actividad en todos los ensayos, mientras que el plasma recogido 6 h después del tratamiento con colchicina tenía una fuerte actividad antiinflamatoria en todos los ensayos. F, Análisis de biomarcadores in vivo. JNK activada por colchicina de forma selectiva en el hígado. Las cantidades de JNK fosforilada y total en nueve tejidos diferentes de cuatro ratones se midieron mediante inmunotransferencia. Los datos se representan como media ± desviación estándar. De dos caras t-se utilizaron pruebas para el análisis estadístico. gramoI, Colchicina despolimeriza selectivamente microtúbulos en hepatocitos. gramo, Microtúbulos en hepatocitos (identificados por HNF4 +), células de Kupffer (identificadas por F4 / 80 +) y otros tipos de células (HNF4 -, F4 / 80 - y DAPI +). Las imágenes muestran secciones congeladas de hígados fijadas 6 h después del tratamiento con vehículo o colchicina, teñidas y obtenidas mediante microscopía confocal. Las áreas encuadradas se amplían y se muestran a la derecha. Barras de escala, 10 μm. h, Microtúbulos en leucocitos circulantes. Barra de escala, 5 μm. I, Medida de la intensidad de los microtúbulos. Se cuantificaron aproximadamente 700 hepatocitos, 200 células de Kupffer y otras 150 células hepáticas de cuatro hígados después del tratamiento con vehículo o colchicina. AU, unidades arbitrarias.

Para investigar si la colchicina actúa directa o indirectamente sobre los neutrófilos, desarrollamos ensayos de activación ex vivo (Fig. 1b). Los neutrófilos primarios de la médula ósea de ratones no tratados de tipo salvaje se preincubaron con plasma de ratones tratados con vehículo o con colchicina, con o sin colchicina añadida ex vivo. Luego desafiamos a los neutrófilos con el desencadenante proinflamatorio estándar, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), que activa múltiples vías de señalización inflamatoria. La activación de neutrófilos se ensayó de tres formas: adhesión celular, generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y expresión de la citoquina proinflamatoria pro-IL-1β. La colchicina mezclada con plasma de control de ratones tratados con vehículo tuvo poco efecto (Fig. 1c-e), y no mostró una acción directa de la colchicina en estos ensayos. El plasma recolectado 6 h después de la dosificación de colchicina, pero no 1 o 18 h, redujo enérgicamente los tres marcadores de activación (fig. 1c-e). Estos datos apoyan la acción indirecta de la colchicina a través de sustancias desconocidas en el plasma. Es poco probable que estas sustancias sean metabolitos de la colchicina, ya que se excreta en su mayoría sin metabolizar 14. El principal metabolito conocido, 3-desmetilcolchicina, no bloqueó la expresión de pro-IL-1β en nuestro ensayo ex vivo (Fig. 1a complementaria). Los factores antiinflamatorios inducidos por colchicina en el plasma eran lábiles al calor y tenían un peso molecular & gt3 kDa (Fig. Complementaria 1b, c), lo que sugiere que eran proteínas.

La colchicina se dirige selectivamente a los hepatocitos

A continuación, implementamos una estrategia de biomarcadores para identificar tejidos en los que la colchicina tiene una acción directa, utilizando la activación de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) como un indicador del estrés celular inducido por la despolimerización de microtúbulos [18]. Entre nueve tejidos de ratones tratados, solo el hígado mostró un aumento en la proporción de fosforilada (pJNK) a JNK total 6 h después de una dosis segura y eficaz (Fig. 1f y Fig. 2 complementaria). Luego probamos si los microtúbulos están despolimerizados en el hígado, usando inmunofluorescencia. El hígado contiene múltiples tipos de células. La inmunofluorescencia de tubulina reveló que los hepatocitos (identificados por HNF4 + núcleos 19) exhibían despolimerización de tubulina (Fig. 1g, i y datos extendidos de la Fig. 2). Los microtúbulos en las células de Kupffer F4 / 80 + y otras células del hígado permanecieron intactos. Además, obtuvimos imágenes de microtúbulos en leucocitos circulantes de ratones tratados con colchicina y no encontramos despolimerización a la dosis segura (Fig. 1h, iy Datos extendidos Fig. 3). Las medidas cuantitativas de intensidad confirmaron la despolimerización selectiva en los hepatocitos (Fig. 1i). A una dosis tóxica, la colchicina perdió esta selectividad de tipo celular y provocó la despolimerización de los microtúbulos en todos los tipos de células hepáticas y células sanguíneas circulantes (Datos extendidos, Figuras 3 y 4). Estos datos muestran que la colchicina, a una dosis segura y eficaz, actúa de forma selectiva en los hepatocitos y respaldan la premisa de que la colchicina no se dirige directamente a las células mieloides in vivo. Los hepatocitos expresan transportadores de fármacos que concentran fármacos y xenobióticos 20 y se sabe que la colchicina se concentra en el hígado 14, por lo que el direccionamiento selectivo probablemente surge de la distribución selectiva de fármacos.

Los datos farmacocinéticos apoyan la acción selectiva del hígado

Para probar si la focalización de hepatocitos o células mieloides es más probable en humanos, realizamos un modelo de farmacocinética-farmacodinámica (PK-PD) utilizando concentraciones de colchicina plasmática medidas en humanos como entrada 12. Después de la dosificación terapéutica, la colchicina plasmática alcanza un máximo de 16 nM o menos y se elimina rápidamente de la circulación. Debido a que al menos el 2% de la tubulina total debe unirse a la colchicina para desestabilizar los microtúbulos 21, establecemos el umbral para la acción del fármaco en este nivel de ocupación del sitio. Un modelo PK-PD de dos compartimentos sugirió que la fracción de tubulina unida a colchicina en las células mieloides circulantes está por debajo de este umbral (Datos extendidos, Fig. 5), de acuerdo con la falta de efecto sobre los microtúbulos de leucocitos en ratones (Fig. 1h). Estos datos argumentan en contra del direccionamiento directo de las células mieloides in vivo en el régimen terapéutico. La mayoría de las pruebas de acción de la colchicina en células mieloides cultivadas han utilizado concentraciones de 1 a 10 µM o más, que modelan el régimen tóxico 11,22.

La colchicina activa Nrf2 en los hepatocitos

La acción selectiva del hígado fue sorprendente, ya que la colchicina no suele ser tóxica en el hígado, incluso cuando se toma a diario durante años en la FMF 7,23. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los hepatocitos se defienden activamente contra los efectos del desmontaje de microtúbulos por la colchicina. Nrf2, codificado por el gen 2 tipo 2 derivado del eritroide del factor nuclear (NFE2L2), es un factor de transcripción maestro que protege al hígado de los xenobióticos mediante la inducción de proteínas citoprotectoras [24]. Nrf2 está regulado negativamente por el adaptador de ligasa E3 Keap1. La activación de la autofagia selectiva dependiente de SQSTM1 / p62 conduce a la degradación de Keap1 y, por tanto, a la activación de Nrf2 (refs. 25, 26, 27). El tratamiento de tres y seis horas con colchicina disminuyó Keap1 y aumentó los niveles de Nrf2 en hígados de ratón (Fig. 2a). Observamos la fosforilación concomitante de SQSTM1 / p62 en Ser349 (Fig.2a), que mejora la afinidad de unión de SQSTM1 / p62 a Keap1 (ref.27), activación de LC3 (medida por conversión de LC3-I a LC3-II (ref. 28) Fig. 2b), aumento de la interacción de SQSTM1 / p62 con Keap1 en el análisis de co-inmunoprecipitación (Fig. 2c) y aumento de SQSTM1 / p62 puncta por inmunofluorescencia (Fig. 2d). Estos datos sugieren que la colchicina activa la autofagia selectiva dependiente de SQSTM1 / p62 en los hepatocitos, lo que conduce a la degradación de Keap1 y la activación de Nrf2.

a, La colchicina (colc.) Activó la vía Nrf2-Keap1 en el hígado. El análisis de inmunotransferencia se realizó con los anticuerpos indicados para identificar proteínas en esta vía. Los hígados tratados con colchicina se recogieron en los tiempos indicados. La colchicina desencadenó la degradación de Keap1, la estabilización de Nrf2 y la fosforilación del receptor selectivo de autofagia SQSTM1 / p62. B, LC3 activada con colchicina medida por conversión de la isoforma LC3-I citosólica en la isoforma LC3-II lapidada unida a la membrana. C, La colchicina promovió la interacción física entre SQSTM1 / p62 y Keap1 medida por análisis de co-inmunoprecipitación. D, Se detectaron puncta SQSTM1 / p62 en el hígado de ratones con vehículo (veh.) O tratamiento con colchicina mediante análisis de inmunofluorescencia. Se midió el número de puntos SQSTM1 / p62 por núcleo. Los datos se representan como media ± desviación estándar. De dos caras t-Se utilizaron pruebas para el análisis estadístico de tres réplicas biológicas. Barra de escala, 10 μm.

Para probar si la activación de Nrf2 protege a los hepatocitos contra la colchicina, tratamos el tipo salvaje y Nrf2 nocaut de la línea germinalNrf2 - / -) ratones con nuestra dosis segura. Observamos lesión de hepatocitos usando ensayos estándar de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) en suero en Nrf2 - / - ratones, pero sin daño hepático en ratones de tipo salvaje (Fig. 3). Por tanto, la colchicina en dosis seguras tiene el potencial de daño hepático, pero los hepatocitos normales están protegidos de las consecuencias del desensamblaje de microtúbulos mediante la activación de Nrf2.

Nrf2 previno la toxicidad hepática inducida por colchicina (colc.). De tipo salvaje y Nrf2 - / - los ratones se trataron con vehículo o con una dosis segura de colchicina como se indica. Los niveles séricos de AST (izquierda) y ALT (derecha) se midieron como biomarcadores clínicos estándar para inferir la muerte de las células de los hepatocitos. Cada punto representa un ratón. Se utilizaron cinco y siete ratones para el tratamiento con vehículo y colchicina, respectivamente. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. De dos caras t-se utilizaron pruebas para el análisis estadístico.

GDF15 es una hepatoquina antiinflamatoria inducida por colchicina

Para identificar las proteínas secretadas por el hígado en respuesta a la colchicina, consultamos una base de datos toxicogenómica de rata 29, buscando ARN mensajeros cuya cinética de inducción y desintegración coincidiera con la de los factores antiinflamatorios inducidos por la colchicina que encontramos en la sangre (Fig. 1). GDF15, un miembro de TGF-β divergente también conocido como MIC-1 o NAG-1, cumplió con estos criterios (Fig. 4a y Datos extendidos Fig. 6a, b). GDF15 regula la alimentación y la homeostasis energética al unirse al receptor restringido del tronco encefálico, GFRAL 30. Se ha relacionado con la biología de la inflamación y la salud del hígado, pero los mecanismos subyacentes no están claros 31,32,33,34. El GDF15 plasmático es un biomarcador de diversas enfermedades que incluyen la caquexia por cáncer, los trastornos mitocondriales y las enfermedades cardiovasculares, así como el envejecimiento normal y el embarazo 35,36,37,38,39. La colchicina aumenta el GDF15 plasmático en humanos 40.

a, Perfil de expresión génica de hígados de rata comparando el vehículo con el tratamiento con colchicina (colc.) Durante 3 h (X eje) y 6 h (y eje). Cada punto representa un gen. Los puntos rojos y grises indican genes que codifican proteínas secretadas y no secretadas respectivamente, y GDF15 está resaltado en azul. Los datos provienen de la base de datos toxicogenómica de Open TG-GATE. Todos los puntos de datos se derivaron de triplicados biológicos. B, Inducción de GDF15 en hígados de ratón detectada por inmunotransferencia. Los hígados se recolectaron en los tiempos indicados. C, Plasma GDF15 medido mediante análisis ELISA. Los puntos rojos muestran la cinética de inducción en ratones tratados con 0,4 mg kg –1 de colchicina. Los puntos azules muestran la respuesta a la dosis después de 6 h de tratamiento. Se utilizaron cinco y tres ratones para la cinética de inducción y la respuesta a la dosis, respectivamente. D,mi, GDF15 inducido por colchicina fue secretado principalmente por hepatocitos. DEl análisis de inmunotransferencia reveló que la inducción de GDF15 en hígados se bloqueó mediante el tratamiento de ARNip específico de hepatocitos (GalNAc-ARNip) contra GDF15. Luc, luciferasa. mi, El análisis ELISA mostró que la eliminación específica de hepatocitos de GDF15 redujo el GDF15 inducido por colchicina en plasma. El resto de GDF15 plasmático inducido por colchicina probablemente se derivó del hígado debido a una caída incompleta. Se utilizaron al menos cuatro ratones por condición. F, Nrf2 era necesario para la expresión de GDF15 inducida por colchicina en los hepatocitos del hígado. gramo,h, Peritonitis in vivo inducida por vía i.p. desafío con zymosan y ensayado por reclutamiento de neutrófilos (gramo) y niveles plasmáticos de IL-1β (h). Tanto Nrf2 como GDF15 fueron necesarios para la actividad antiinflamatoria in vivo de la colchicina usando knockouts de la línea germinal, knockdowns de ARNip específicos de hepatocitos y un anticuerpo neutralizador de GDF15 (anti-GDF15). Cada punto representa un ratón, al menos seis ratones por condición y tres réplicas biológicas. Los datos se representan como media ± desviación estándar. De dos caras t-se utilizaron pruebas para el análisis estadístico. Veh., Vehículo.

La presencia de la proteína GDF15 en el hígado y el plasma fue fuertemente inducida por la colchicina de una manera dependiente del tiempo y de la dosis, en ambos sexos (Fig. 4b, cy Datos extendidos Fig. 6c, d). Su patrón de inducción temporal (Fig. 4b) coincidió con el de la fosforilación de JNK en el hígado y la cinética antiinflamatoria de la colchicina medida in vivo y ex vivo (Fig. 1). Para probar el papel de los hepatocitos en la secreción de GDF15 después de la dosificación de colchicina, desarrollamos un reactivo de eliminación específico de hepatocitos, triantenario norte-acetilgalactosamina (GalNAc), que conjugó pequeños ARN de interferencia dirigidos a GDF15 (GalNAc-siGDF15). La GalNAc triantenaria confiere una captación de ARNip específica de hepatocitos [41]. El tratamiento con GalNAc-siGDF15 atenuó notablemente la inducción de GDF15 por la colchicina tanto en el hígado (Fig. 4d) como en el plasma (Fig. 4e), lo que indica que los hepatocitos son la fuente de la mayor parte de GDF15 inducida por colchicina. Para modelar la ruta de dosificación clínica, tratamos ratones con colchicina por sonda oral. Se indujo GDF15 en el hígado y el plasma, pero no en el intestino o el colon (Fig. 3 complementaria).

Para probar si la vía Nrf2-Keap1 está involucrada en la inducción de GDF15, usamos la eliminación de la línea germinal Nrf2 (Nrf2 - / -) o eliminación específica de hepatocitos (GalNAc-siNrf2). Ambos redujeron significativamente la expresión de GDF15 inducido por colchicina en hígado y plasma (Fig. 4f y Datos extendidos Fig. 7a, b). Además, sobreexpresamos Nrf2 en células HEK 293T que contienen un promotor GDF15 corriente arriba de luciferasa. El gen de la luciferasa fue inducido por Nrf2 (Datos extendidos, Fig. 7c). CHOP, un regulador clave de la respuesta celular integrada al estrés (ISR), está involucrado en la expresión de GDF15 inducida por metformina 42. Sin embargo, CHOP no fue inducido por colchicina en el hígado, y el patrón de expresión de los reguladores de ISR no coincidió con el de GDF15 inducido por colchicina (Datos extendidos, Fig. 7d, e). Por tanto, la colchicina provoca un aumento de los niveles de GDF15 en plasma mediante la activación de Nrf2 en los hepatocitos.

A continuación, probamos el papel de GDF15 y su regulador Nrf2, en la acción antiinflamatoria de la colchicina. Desarrollamos ensayos de peritonitis para medir el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a i.p. desafío con zymosan para modelar infección, o cristales de urato monosódico (MSU) para modelar gota. En ratones de tipo salvaje, con o sin tratamiento de ARNip de control (GalNAc-siLuc), la colchicina redujo la infiltración de neutrófilos en un 80 y un 70% en los modelos zymosan y MSU, respectivamente (Fig. 4g y Fig. 7f de datos extendidos). Esta actividad antiinflamatoria se perdió completamente cuando GDF15 o Nrf2 se ablacionaron en el ratón completo usando knockouts de la línea germinal, o específicamente en hepatocitos usando ARNip dirigidos a hepatocitos (Fig. 4g y Datos extendidos Fig. 7f). También medimos la IL-1β circulante siguiendo i.p. desafío zymosan. La colchicina redujo la IL-1β circulante como se esperaba (Fig. 4h). La inhibición sistémica de GDF15 en ratones mediante el uso de un anticuerpo neutralizante de GDF15 bloqueó esta actividad antiinflamatoria de la colchicina (Fig. 4h).Concluimos que la colchicina inhibe la inflamación indirectamente mediante la activación de Nrf2 en los hepatocitos, desencadenando la secreción de factores antiinflamatorios que incluyen GDF15.

Se requiere GDF15 para efectos antiinflamatorios en las células mieloides

Para probar si las acciones antiinflamatorias del plasma post-colchicina sobre las células mieloides dependen de GDF15, volvimos a nuestros ensayos de activación ex vivo y probamos tanto neutrófilos como macrófagos (Fig. 5 y Figs. 8 y 9 de datos extendidos). Cuatro grupos de ratones (tipo salvaje, Gdf15 - / - y de tipo salvaje pretratados con GalNAc-siLuc o GalNAc-siGDF15) se dosificaron con vehículo o colchicina, y el plasma se recogió 6 h más tarde. Los neutrófilos de ratones de tipo salvaje no tratados se pretrataron con estas muestras de plasma y luego se desafiaron con PMA. Plasma de ratones de tipo salvaje o GalNAc-siLuc tratados con colchicina, pero no Gdf15 Los ratones - / - o GalNAc-siGDF15, inhibieron fuertemente la activación de la adhesión (Fig. 5b) y la inducción de pro-IL-1β (Fig. 5d y Datos extendidos Fig. 8a). Para la validación independiente de la dependencia de GDF15, probamos el efecto mediante tres anticuerpos neutralizantes diferentes. Todos estos bloquearon enérgicamente los efectos antiinflamatorios ex vivo del plasma poscolchicina (Fig. 5c, e y Datos extendidos Fig. 8b).

a, Ensayos de activación de células mieloides ex vivo. Los neutrófilos de ratones no tratados o BMDM inmortalizados se incubaron en plasma recolectado de ratones (tipo salvaje, Gdf15 - / - o derribos de ARNip específicos de hepatocitos) después del tratamiento con vehículo (veh.) O colchicina (colc.), Luego desafiado con PMA (neutrófilos) o Pam3CSK4 (BMDM). Anticuerpo TPI-1 anti-GDF15, neutralizador de GDF15, un inhibidor de SHP-1. B, La adhesión de neutrófilos a los cubreobjetos estimulada por PMA fue inhibida por el plasma de ratones de tipo salvaje tratados con colchicina, pero no por Gdf15 - / -. El co-tratamiento con TPI-1 bloqueó la actividad anti-adhesiva del plasma post-colchicina. CLa inhibición de GDF15 usando un anticuerpo neutralizante de GDF15 bloqueó la actividad antiinflamatoria del plasma poscolchicina. Veh. plasma, plasma de ratones tratados con vehículo colc. plasma, plasma de ratones tratados con colchicina. De dos caras t-se utilizaron pruebas para el análisis estadístico. D, La inducción de pro-IL-1β fue bloqueada por plasma post-colchicina de ratones de tipo salvaje, pero no de Gdf15 - / - ratones. mi, El tratamiento conjunto con un anticuerpo neutralizante de GDF15 bloqueó la actividad plasmática. Fh, SHP-1 fue activado por GDF15 inducido por colchicina. La fosforilación de SHP-1 en Y564 marca la forma activa de SHP-1, mientras que la fosforilación en S591 marca la forma inactiva. I, TPI-1 rescató la inducción de pro-IL-1β, que fue bloqueada por plasma post-colchicina. El plasma poscolchicina aumentó la forma activa (F) y disminuyó la forma inactiva (gramo) de SHP-1. hLa actividad antiinflamatoria del plasma poscolchicina fue bloqueada por inhibición de GDF15. j, La inhibición de SHP-1 por TPI-1 bloqueó el efecto antiinflamatorio in vivo de la colchicina en el ensayo de peritonitis con zimosan. Cada punto representa un ratón. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. k, Modelo de acción antiinflamatoria indirecta de la colchicina. La colchicina activa la señalización de Nrf2-Keap1 en los hepatocitos, lo que los protege del daño y la inducción de una nueva hepatocina antiinflamatoria, GDF15, en el plasma. El GDF15 inducido por colchicina actúa luego sobre las células mieloides circulantes apoyando el estado activo de SHP-1.

A continuación, probamos macrófagos inmortalizados derivados de la médula ósea de ratón (BMDM). Cuando se activan por el ligando Pam3CSK4 de TLR2 / TLR1 seguido por la toxina microbiana nigericina, las BMDM inmortalizadas expresaron pro-IL-1β y secretaron IL-1β madura. El plasma poscolchicina redujo tanto la expresión como la secreción de una manera dependiente de GDF15 (Datos extendidos, Fig. 9). En conjunto, nuestros datos muestran que el polipéptido GDF15 es necesario para la acción antiinflamatoria del plasma poscolchicina en las células mieloides, de acuerdo con nuestros datos in vivo.

La fosfatasa SHP-1 media los efectos antiinflamatorios sobre las células mieloides

La activación de las células mieloides se controla mediante la activación e inhibición de receptores de superficie cuyas señales están integradas por la proteína tirosina fosfatasa SHP-1 (PTPN6) 43,44. El estado de actividad de SHP-1 puede ensayarse convenientemente midiendo los sitios de fosforilación activadores (pY564) e inhibidores (pS591) 45. Cuando los neutrófilos se trataron con PMA en el plasma de control, los niveles de pY564-SHP-1 disminuyeron y los niveles de pS591-SHP-1 aumentaron, mostrando la inactivación de SHP-1 como se esperaba. Cuando se incubaron neutrófilos en plasma post-colchicina que contenía GDF15, la PMA ya no provocó la inactivación de SHP-1 (Fig. 5f, g). La neutralización de GDF15 por tres clones diferentes de anticuerpos anti-GDF15 bloqueó fuertemente la capacidad del plasma post-colchicina para mantener el estado activo de SHP-1 después de la exposición a PMA ex vivo (Fig. 5h y Datos extendidos Fig. 8c). Además, el plasma de ratones GalNAc-siGDF15 carecía de esta actividad (Datos extendidos, Fig. 8d). Por tanto, la capacidad del plasma poscolchicina para regular positivamente la SHP-1 depende de GDF15.

Para probar si SHP-1 está involucrado causalmente en los efectos inhibidores mieloides de la colchicina, usamos el inhibidor de SHP-1 TPI-1 (ref. 46). El tratamiento con TPI-1 contrarrestó la capacidad del plasma poscolchicina para prevenir la adhesión de neutrófilos inducida por PMA (figura 5b) y la inducción de pro-IL-1β (figura 5i). Además, TPI-1 bloqueó el efecto antiinflamatorio de la colchicina in vivo en el modelo de peritonitis inducida por zimosán (Fig. 5j). Estos datos sugieren que SHP-1 transduce la actividad antiinflamatoria dependiente de GDF15 de la colchicina.


Síndrome pospericardiotomía

El síndrome pospericardiotomía (SPP), que ocurre en el 10 & # x0201345% de los pacientes después de una cirugía cardíaca, es una complicación común, que se desarrolla en días o meses después de la lesión pericárdica que a menudo puede conducir a una discapacidad (Tabla 2) 22 & # x0201325.

Tabla 2

Autor, añoPMIDDiseño del estudioMuestraSeguimiento (meses)Edad media (años)Masculino (%)Intervención (dosis, intervalo)Variable de resultado primariaMedida de resultadoVariable de resultado secundariaMedida de resultado
Finkelstein Y et al., 200212574898Diseño prospectivo, aleatorizado, doble ciego163163.573Colchicina (1,5 mg / día) o placebo durante 1 mesPrevención del SPP en pacientes después de una cirugía cardíaca(pag& # x0003c0.135)N / AN / A
Imazio M et al., 201020805112Ensayo COPPS (ensayo multicéntrico, doble ciego, aleatorizado)3601265.766Colchicina (1,0 mg dos veces al día durante el primer día seguido de una dosis de mantenimiento de 0,5 mg dos veces al día durante 1 mes en pacientes & # x0226570 kg, y dosis reducidas a la mitad para pacientes & # x0003c70 kg o intolerantes a la dosis más alta)Incidencia de SPP a los 12 mesespag= 0,002 número necesario a tratar = 8)Tasa combinada de hospitalización relacionada con la enfermedad, taponamiento cardíaco, pericarditis constrictiva y recaídaspag=0.024
Imazio M et al., 201323816016COPPS-2 (ensayo aleatorio multicéntrico, doble ciego, controlado con placebo)3601N / AN / AColchicina (0,5 mg dos veces al día durante 1 mes en pacientes que pesan & # x0226570 kg y 0,5 mg una vez para pacientes que pesan & # x0003c70 kg o que no toleran la dosis más alta)Incidencia de SPP, derrames posoperatorios y POAF a los 3 meses de la cirugíaN / AIncidencia de taponamiento cardíaco o necesidad de pericardiocentesis o toracocentesis, recurrencia del SPP, ingresos relacionados con la enfermedad, accidente cerebrovascular y mortalidad generalN / A

El uso de colchicina en PPS no está bien estudiado. En un pequeño ensayo aleatorizado en 2002, la colchicina no demostró ser clínicamente efectiva para prevenir el SPP (26). Sin embargo, en 2010, el ensayo COPPS informó que la colchicina redujo significativamente la incidencia de PPS en comparación con el placebo en el intervalo de 12 meses & # x02019. Estos resultados iniciales fueron alentadores y fueron un gran avance, ya que ningún fármaco había demostrado ser lo suficientemente eficaz y seguro para prevenir el SPP (27). Tampoco se conocía un método óptimo de prevención del SPP. Una combinación metanalítica mostró que la colchicina se asoció con una disminución del riesgo de SPP (OR 0,38; 0,22 a 0,65); sin embargo, la evidencia clínica para la prevención primaria del SPP se limitó a unos pocos estudios de calidad variable, lo que dio lugar a sesgos individuales entre los diferentes estudios. . Sin embargo, los datos disponibles en ese momento sugirieron un perfil beneficioso para la colchicina (28). Los estudios de seguimiento no confirmaron los resultados del ensayo COPPS, lo que sugiere que el uso de colchicina como profilaxis primaria en el SPP es indeterminado, por lo tanto, la colchicina no debe recomendarse de forma rutinaria hasta que los ensayos controlados, aleatorizados y grandes confirmen la eficacia de la colchicina (16, 29). ). Sin embargo, recientemente se han publicado muchos estudios que favorecen el uso de colchicina en el SPP, siendo el más influyente un estudio de metanálisis que mostró una menor incidencia de SPP con una reducción del riesgo relativo del 56,6% en el grupo de colchicina en comparación con el grupo de terapia convencional. La reducción en la incidencia de pericarditis sola fue aún más sorprendente en este estudio con una tasa de reducción del riesgo relativo del 57,4% (30).

Por lo tanto, el curso futuro del tratamiento y el manejo dependerá en gran medida de los resultados del ensayo COPPS-2 (COlchicina para la prevención del síndrome pospericardiotomía y fibrilación auricular posoperatoria), que será el primer ensayo clínico grande aleatorizado controlado con placebo en evaluar el perfil de eficacia y seguridad de la colchicina para la prevención de diversas complicaciones postoperatorias y en el período perioperatorio. Este ensayo evaluará el posible beneficio del uso temprano de colchicina, comenzando antes de la cirugía cardíaca, lo que potencialmente proporcionará evidencia más sólida para respaldar el uso de colchicina preoperatoria sin una dosis de carga para prevenir varias complicaciones posoperatorias (31). Dados estos resultados preliminares positivos, el uso terapéutico futuro de colchicina parece prometedor y merece ser estudiado más a fondo.


Resultados

La incisión plantar induce hipersensibilidad mecánica

Se indujo POP agudo mediante una incisión en la superficie plantar de la pata trasera del ratón. La frecuencia de respuesta de retirada de la pata trasera ipsilateral a la estimulación mecánica por un filamento de von Frey de 0.04 & # x02009g aumentó significativamente uno y tres días después de la incisión plantar (F3,24& # x02009 = & # x0200916.21, PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001), mientras que no hubo cambios en el de la pata trasera contralateral. La hipersensibilidad mecánica fue más severa en un día y duró tres días, antes de regresar a la línea de base siete días después de la cirugía (Figura 1 (a)). La inmunorreactividad de Iba1 (un marcador para macrófagos) y las células Gr1 + (un marcador de neutrófilos) se observaron raramente en la pata trasera contralateral pero aumentaron notablemente alrededor de la incisión en la pata trasera ipsilateral después de la cirugía. La inmunofluorescencia de Iba1 alrededor de la incisión aumentó significativamente (F2,12& # x02009 = & # x0200912.24, PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.01), y se incrementó gradualmente y permaneció aumentado incluso siete días después de la cirugía. El número de células Gr1 + alrededor del sitio de la incisión también aumentó significativamente (F2,12& # x02009 = & # x0200912.55, PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.01), pero alcanzó su punto máximo un día después de la cirugía y luego disminuyó (Figura 1 (b) a (d)).

Hipersensibilidad mecánica e infiltración de macrófagos y neutrófilos alrededor del sitio de la incisión en un modelo de ratón de dolor posoperatorio. La cirugía de incisión plantar se realizó en la pata trasera derecha del ratón. (a) Para evaluar las sensibilidades mecánicas en las patas traseras contralaterales e ipsilaterales, se midió la frecuencia de las respuestas de retirada de la pata a la estimulación del filamento de von Frey antes de la cirugía (pre) así como uno, tres y siete días después de la cirugía. Los datos se expresan como medias del porcentaje & # x02009 & # x000b1 & # x02009S.E.M. norte& # x02009 = & # x020095. **PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.01, ***PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.001, en comparación con pre. (b) Fotografías representativas para la tinción por inmunofluorescencia de Iba1 (verde) y Gr1 (rojo) en las patas traseras contralaterales (un día) e ipsilaterales uno, tres y siete días después de la cirugía. Barra de escala & # x02009 = & # x02009100 & # x02009 & # x000b5m. Las líneas punteadas blancas marcan el exterior de la epidermis. Las líneas de puntos blancos separan la dermis de la epidermis y la fascia. Los gráficos muestran la intensidad de fluorescencia de Iba1 (c) y el número de células Gr1 + (d) en las patas traseras contralaterales e ipsilaterales, norte& # x02009 = & # x020093. Los datos se expresan como medias & # x02009 & # x000b1 & # x02009S.E.M. ****PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001, *PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05.

La colchicina atenúa la hipersensibilidad mecánica inducida por la incisión plantar y la infiltración de neutrófilos

Para examinar el efecto de la colchicina sobre la infiltración de células inflamatorias alrededor del sitio de la incisión y el POP agudo, se administró por vía intraperitoneal una vez al día comenzando dos días antes de la cirugía. El número de células Gr1 + alrededor del sitio de la incisión disminuyó significativamente con el tratamiento con colchicina (F2,56& # x02009 = & # x0200921.15, PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001). Se observaron disminuciones significativas uno y tres días después de la cirugía. Además, la inmunorreactividad de Iba1 alrededor del sitio de la incisión también se atenuó significativamente en el grupo tratado con colchicina (F2,54& # x02009 = & # x020097.718, PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.01), con una diferencia significativa observada tres días después de la cirugía (Figura 2 (a) a (c)). El tratamiento con colchicina también atenuó significativamente la hipersensibilidad mecánica inducida por la incisión plantar (F2,87& # x02009 = & # x020091.888, PAG& # x02009 = & # x020090.1575). Se observó una diferencia significativa el día 1 y la hipersensibilidad mecánica tendió a atenuarse tres días después de la cirugía (Figura 2 (d)).

Efectos del tratamiento con colchicina sobre la infiltración de macrófagos y neutrófilos y la hipersensibilidad mecánica en un modelo de ratón de dolor posoperatorio. Se inyectó por vía intraperitoneal colchicina (0,75 & # x02009 mg / kg) o solución salina una vez al día comenzando dos días antes de la cirugía de incisión plantar. (a) Fotografías representativas de tinción de inmunofluorescencia para Iba1 (verde) y Gr1 (rojo) en las patas traseras contralateral e ipsilateral uno y tres días después de la cirugía. Barra de escala & # x02009 = & # x02009100 & # x02009 & # x000b5m. La línea discontinua blanca marca el exterior de la epidermis. Las líneas de puntos blancos separan la dermis de la epidermis y la capa más profunda. Los gráficos muestran la intensidad de fluorescencia de Iba1 (b) y el número de células Gr1 + (c) en los grupos tratados con vehículo y colchicina, norte& # x02009 = & # x020096 & # x0201316. Los datos se expresan como medias & # x02009 & # x000b1 & # x02009S.E.M. ***PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.001. (d) Para evaluar las sensibilidades mecánicas en las patas traseras ipsilaterales del vehículo- (norte& # x02009 = & # x0200914) o grupos tratados con colchicina (norte& # x02009 = & # x0200913), la frecuencia de las respuestas de retirada de la pata a la estimulación del filamento de von Frey se midió antes de la cirugía (pre) y uno y tres días después de la cirugía. Los datos se expresan como medias del porcentaje & # x02009 & # x000b1 & # x02009S.E.M. *PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05, ***PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.001, comparado con pre en cada grupo. ## PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.01. n.s .: no significativo.

Efectos de la colchicina sobre las respuestas inflamatorias inducidas por la incisión plantar y el fenotipo de los macrófagos

A continuación, investigamos los efectos del tratamiento con colchicina sobre las respuestas inflamatorias inducidas por la incisión plantar. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real reveló que el nivel de expresión de ARNm de la citocina proinflamatoria interleucina-1 & # x003b2 (IL1 & # x003b2) en la pata trasera ipsilateral se incrementó notablemente un día después de la cirugía, aunque la expresión en la pata trasera contralateral no fue mayor detectado. El tratamiento con colchicina inhibió significativamente la regulación positiva del ARNm de IL1 & # x003b2 (Figura 3 (a)). La quimiocina C-C motivo quimiocina 2 (CCL2) es producida principalmente por neutrófilos y macrófagos y participa en la migración de macrófagos a través del receptor de quimiocina C-C tipo 2 (CCR2). 27 En el grupo tratado con solución salina, los niveles de expresión de ARNm de CCL2 (Figura 3 (b)) y CCR2 (Figura 3 (c)) en la pata trasera ipsilateral se regularon significativamente al alza, en comparación con los de la pata trasera contralateral, mientras que no se observó regulación positiva en el grupo tratado con colchicina. El tratamiento con colchicina tendió a suprimir la regulación positiva de los niveles de ARNm de CCL2 y CCR2, aunque los efectos inhibidores no fueron significativos (CCL2, F1,22& # x02009 = & # x020091.176, PAG& # x02009 = & # x020090.2898 CCR2, F1,22& # x02009 = & # x020090.8611, PAG& # x02009 = & # x020090.3635).

Efectos de la colchicina sobre las respuestas inflamatorias y el fenotipo de los macrófagos alrededor del sitio de la incisión. Se inyectó por vía intraperitoneal colchicina (0,75 & # x02009 mg / kg) o solución salina una vez al día comenzando dos días antes de la cirugía de incisión plantar. Se recogieron muestras de patas traseras contralaterales e ipsilaterales derivadas de ratones en grupos tratados con solución salina o colchicina un día después de la cirugía. Los niveles de expresión de ARNm de IL1 & # x003b2 (a norte& # x02009 = & # x0200913), CCL2 (b norte& # x02009 = & # x020096 & # x020137), CCR2 (c norte& # x02009 = & # x020096 & # x020137), CD86 (d norte& # x02009 = & # x020097 & # x020138) y Arg1 (e norte& # x02009 = & # x020098) se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Cada nivel de expresión se normalizó al del ARNr 18S y se presentó en relación con cada grupo contralateral. El nivel de expresión de ARNm de IL1 & # x003b2 se presentó en relación con el grupo ipsilateral tratado con solución salina, porque la expresión de ARNm de IL1 & # x003b2 era indetectable en la pata trasera contralateral. Los datos se expresan como medias & # x02009 & # x000b1 & # x02009S.E.M. *PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05, **PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.01, en comparación con la pata trasera contralateral # PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05 ## PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.01. n.d .: no detectado.

La polarización de los macrófagos puede verse afectada por la infiltración temprana y la apoptosis de los neutrófilos. 25 Para determinar si el tratamiento con colchicina afecta el fenotipo de macrófagos infiltrantes en este modelo de ratón de POP, investigamos los niveles de expresión de ARNm de CD86 (un marcador para macrófagos proinflamatorios M1) y arginasa 1 (Arg1 un marcador para macrófagos antiinflamatorios M2) uno día después de la cirugía. La expresión de ARNm de CD86 en la pata trasera ipsilateral se incrementó significativamente en el grupo tratado con solución salina. El tratamiento con colchicina inhibió significativamente la regulación positiva del ARNm de CD86 (F1,26& # x02009 = & # x020097.767, PAG& # x02009 = & # x020090.0098 Figura 3 (d)). De manera similar, la expresión de ARNm de Arg1 en la pata trasera ipsilateral se incrementó significativamente en el grupo tratado con solución salina, mientras que no se observó una regulación ascendente significativa en el grupo tratado con colchicina. El tratamiento con colchicina tendió a suprimir la regulación positiva, aunque el efecto no fue significativo (F1,28& # x02009 = & # x020090.7424, PAG& # x02009 = & # x020090.3962 Figura 3 (e)).

El agotamiento de los macrófagos por los liposomas de clodronato tiene poco efecto sobre la hipersensibilidad mecánica inducida por la incisión plantar

Agotamos los macrófagos circulantes mediante la administración intravenosa de liposomas de clodronato 1 & # x02009h antes de la cirugía. La administración intravenosa de clodronato encapsulado en liposomas da como resultado el agotamiento selectivo y temporal de macrófagos y monocitos circulantes por fagocitosis del sistema de fagocitos mononucleares. 28 Encontramos que el tratamiento con liposomas de clodronato inhibió significativamente el aumento de la inmunofluorescencia de Iba1 alrededor del sitio de la incisión (F2,36& # x02009 = & # x0200919.62, PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001). Se observaron diferencias significativas uno y tres días después de la cirugía en comparación con el grupo tratado con vehículo. Por el contrario, el número de células Gr1 + alrededor del sitio de la incisión no se vio afectado por el tratamiento con liposomas de clodronato (F2,24& # x02009 = & # x020090.1894, PAG& # x02009 = & # x020090.8287 Figura 4 (a) a (c)). El tratamiento con liposoma con clodronato también tuvo poco efecto sobre la hipersensibilidad mecánica inducida por incisión plantar; no hubo diferencias significativas entre los grupos tratados con liposoma con vehículo y con clodronato (F2,36& # x02009 = & # x020090.142, PAG& # x02009 = & # x020090.8681 Figura 4 (d)).

Efectos de los liposomas de clodronato sobre la infiltración de macrófagos y neutrófilos y la hipersensibilidad mecánica en un modelo de ratón de dolor posoperatorio. Se administraron por vía intravenosa clodronato (100 & # x02009 & # x000b5L / ratón) o liposomas de control a ratones 1 & # x02009 h antes de la cirugía de incisión plantar. (a) Fotografías representativas para la tinción por inmunofluorescencia de Iba1 (verde) y Gr1 (rojo) en las patas traseras contralateral e ipsilateral uno y tres días después de la cirugía. Barra de escala & # x02009 = & # x02009100 & # x02009 & # x000b5m. La línea discontinua blanca marca el exterior de la epidermis. Las líneas de puntos blancos separan la dermis de la epidermis y la capa más profunda. Los gráficos muestran la intensidad de fluorescencia de Iba1 (b, norte& # x02009 = & # x020094 & # x0201311) y el número de celdas Gr1 + (c, norte& # x02009 = & # x020093 & # x020138) en grupos tratados con vehículo y clodronato. Los datos se expresan como medias & # x02009 & # x000b1 & # x02009S.E.M. *PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05, ***PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.001. (d) Para evaluar las sensibilidades mecánicas en las patas traseras ipsolaterales del vehículo- (norte& # x02009 = & # x020099) o grupo tratado con clodronato (norte& # x02009 = & # x0200911), se midió la frecuencia de las respuestas de retirada de la pata a la estimulación del filamento de von Frey antes de la cirugía (pre) y uno y tres días después de la cirugía. Los datos se expresan como medias del porcentaje & # x02009 & # x000b1 & # x02009S.E.M. *PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05, **PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.01, *** PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.001, comparado con pre en cada grupo. n.s .: no significativo.

Efecto de los liposomas de colchicina y clodronato sobre el cierre de heridas

Finalmente, examinamos los efectos de los liposomas de colchicina o clodronato sobre el cierre de heridas en este modelo de ratón de POP. El sitio de la incisión se cerró gradualmente en ambos grupos tratados con vehículo. El tratamiento con colchicina retrasó significativamente el cierre de la herida después de la cirugía (F2,28& # x02009 = & # x020091.709, PAG& # x02009 = & # x020090.1995) se observó una diferencia significativa entre los grupos tratados con vehículo y con colchicina tres días después de la cirugía (Figura 5 (a) y (b)). Por el contrario, no hubo diferencias significativas en el cierre de la herida entre los grupos tratados con vehículo y liposomas con clodronato (F2,16& # x02009 = & # x020090.8921, PAG& # x02009 = & # x020090.4292 Figura 5 (c) y (d)).

Efectos del tratamiento con colchicina o clodronato sobre el cierre de heridas después de la cirugía. (ayb) Se inyectó por vía intraperitoneal colchicina (0,75 & # x02009 mg / kg) o solución salina una vez al día, comenzando dos días antes de la cirugía de incisión plantar, norte& # x02009 = & # x020098. (cyd) Se administraron por vía intravenosa clodronato (100 & # x02009 & # x000b5L / ratón) o liposomas de control a ratones 1 & # x02009 h antes de la cirugía de incisión plantar, norte& # x02009 = & # x020093 & # x020135. (ayc) Fotografías representativas del sitio de la incisión en la pata trasera ipsilateral uno, dos y tres días después de la cirugía de incisión plantar. (byd) Los gráficos muestran el ancho (mm) de la incisión en (b) grupos tratados con colchicina o (d) clodronato. Los datos se expresan como medias & # x02009 & # x000b1 & # x02009S.E.M. *PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05.

También examinamos el efecto del tratamiento con colchicina en los niveles de expresión de ARNm de factores promotores de la fibrogénesis, factor de crecimiento transformante - & # x003b2 (TGF & # x003b2) y factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF2), un día después de la cirugía. En el grupo tratado con solución salina, los niveles de expresión de ARNm de TGF & # x003b2 y FGF2 en la pata trasera ipsilateral se regularon significativamente al alza, en comparación con los de la pata trasera contralateral. La regulación al alza de TGF & # x003b2 (F1,12& # x02009 = & # x020096.434, PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05) y FGF2 (F1,12& # x02009 = & # x020096.517, PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05) los niveles de ARNm se atenuaron significativamente en el grupo tratado con colchicina (Figura 6).

Efectos del tratamiento con colchicina sobre la expresión de factores promotores de la fibrogénesis. Se inyectó por vía intraperitoneal colchicina (0,75 & # x02009 mg / kg) o solución salina una vez al día comenzando dos días antes de la cirugía de incisión plantar. Se recogieron muestras de patas traseras contralaterales e ipsilaterales de grupos tratados con solución salina o colchicina un día después de la cirugía. Los niveles de expresión de ARNm de (a) TGF & # x003b2 y (b) FGF2 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Cada nivel de expresión se normalizó al del ARNr 18S y se presentó en relación con cada grupo contralateral. Los datos se expresan como medias & # x02009 & # x000b1 & # x02009S.E.M, norte& # x02009 = & # x020094. *PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05, **PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.01, comparado con el grupo contralateral, # PAG& # x02009 & # x0003c & # x020090.05.

FGF2: factor de crecimiento de fibroblastos 2 TGF & # x003b2: factor de crecimiento transformante - & # x003b2.


Colchicina y sus diversos aspectos fisicoquímicos y biológicos.

Natural (-) - (aS, 7S) -colchicina, un alcaloide y producto natural tóxico es un metabolito vegetal secundario, obtenido de Colchicum autumnale también conocido como "azafrán de pradera". La colchicina, entre las plantas medicinales indias, está contenida en los bulbos de Colchicum luteum y las semillas de Ifigenia, en la medida de aproximadamente 0,25 y 0,9%, respectivamente. Estas plantas no están disponibles en cantidades suficientes para justificar su uso comercial. (-) - La colchicina natural tiene un solo centro estereogénico: el carbono-7. La biosíntesis de colchicina implica precursores de aminoácidos, fenilalanina y tirosina. Se utiliza para tratar las dolencias reumáticas, especialmente la gota, también se prescribe por sus efectos catárticos y antieméticos y también en el tratamiento inicial de la pericarditis. También se está investigando su uso como fármaco contra el cáncer. La colchicina en sí es demasiado tóxica para el uso humano como fármaco antitumoral y, por tanto, se han utilizado sus derivados. Se ha informado de intoxicación por colchicina en pacientes con insuficiencia renal o hepática. En las neuronas, la colchicina interrumpe el transporte axoplásmico. Los naturópatas lo utilizan ampliamente para varios tratamientos, incluido el tratamiento del dolor de espalda, y también como agente antiinflamatorio para el tratamiento a largo plazo de la enfermedad de Behcet.

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Seguridad y tolerancia a largo plazo

Si bien una sobredosis deliberada de colchicina puede ser fatal en hasta el 10% de los casos, el uso juicioso de colchicina en dosis de 0.5 a 1.0 mg al día ha demostrado ser seguro, como lo demuestra una década de observaciones en una amplia gama de pacientes con FMF. gota, pericarditis y, más recientemente, enfermedad coronaria. 17-21 En una revisión sistemática reciente centrada en los eventos adversos en pacientes tratados con colchicina en ensayos para indicaciones CV, se informó la aparición de cualquier evento adverso en el 15,3% de los pacientes tratados con colchicina frente al 13,9% de los pacientes tratados con placebo [relativo riesgo (RR) 1,26, intervalo de confianza (IC) del 95% 0,96-1,64, PAG = 0.09]. 16

No obstante, los efectos secundarios gastrointestinales inferiores son comunes y dan lugar a la interrupción temprana del tratamiento, lo que limita el uso de colchicina en aproximadamente el 10% de los pacientes. Estos efectos están relacionados con la dosis, por lo general ocurren a los pocos días de comenzar la terapia, pueden resolverse espontáneamente durante el tratamiento en curso, pero invariablemente desaparecen una vez que se suspende la colchicina.

En contraste con la intolerancia temprana, durante un seguimiento prolongado en el ensayo LoDoCo2, la intolerancia tardía a la colchicina fue poco común (3,4%) e igual al placebo. 21 La incidencia de mialgia autoinformada fue mayor en los pacientes tratados con colchicina (21% frente al 18,5% RR 1,16; IC del 95%: 1,02-1,32, PAG = 0.03), pero esta no fue una causa común de interrupción del tratamiento. Como se indicó anteriormente, la incidencia de miotoxicidad asociada con creatinina quinasa elevada fue rara (& lt1%) y no difirió entre los asignados a colchicina o placebo. Otros efectos adversos del uso de colchicina, que incluyen hepatotoxicidad, neutropenia o agranulocitosis, erupciones cutáneas, infección o muerte, no han aparecido en los ensayos CV de colchicina; sin embargo, todos los ensayos hasta la fecha no tenían el poder estadístico suficiente para detectar diferencias en la incidencia de estos eventos raros. dieciséis

En una revisión reciente de la agranulocitosis inducida por fármacos, 22 de más de 120 fármacos, incluida la colchicina, se enumeraron como potencialmente causales. Sin embargo, en la literatura actual solo se describe un caso clínico en un paciente que toma terapia de dosis baja sin antecedentes de enfermedad renal o hepática. 16w

El uso prolongado de colchicina se ha asociado con un aumento transitorio de las enzimas hepáticas en aproximadamente el 2% de los pacientes, pero al igual que con el tratamiento con estatinas, esto no provocó la interrupción del tratamiento ni una disfunción hepática grave. Otros posibles efectos secundarios notificados, como alopecia y neuropatía, rara vez se han informado (& lt1% de los usuarios) y parecen resolverse rápidamente después de la abstinencia de colchicina. 14, 16 Aunque la colchicina atraviesa la placenta, el uso continuo en dosis de 0.5 a 1.0 mg al día durante el embarazo no aumenta el riesgo de malformaciones congénitas o pérdida del embarazo en la FMF. A pesar de entrar en la leche materna, la colchicina se considera segura durante la lactancia. 17, 18

Por lo tanto, cuando se usa en dosis de hasta 1.0 mg al día en pacientes sin enfermedad renal o hepática avanzada, la colchicina es segura. En el 90% de los pacientes que no desarrollan intolerancia temprana al tratamiento, el uso prolongado de esta dosis demostró ser seguro y bien tolerado.


¿Qué mecanismo evita que Colchicum Autumnale se vea afectado por la colchicina? - Biología

La colchicina tiene la aprobación de la FDA para la profilaxis de la gota y el tratamiento de los brotes de gota agudos. También tiene aprobación para el tratamiento de la fiebre mediterránea familiar. La colchicina se ha utilizado fuera de la etiqueta para tratar varias otras afecciones, incluida la cirrosis hepática, la cirrosis biliar primaria y la pseudogota. La colchicina tiene principalmente propiedades antiinflamatorias. Esta actividad revisa el mecanismo de acción, el perfil de eventos adversos, la toxicidad, la dosificación, la farmacodinamia y el control de la colchicina para la gota y otras indicaciones para los miembros del equipo interprofesional.

  • Identificar los diversos mecanismos de acción hipotéticos de la colchicina.
  • Resuma las indicaciones primarias y secundarias de la colchicina.
  • Revise el perfil de eventos adversos potenciales de la colchicina.
  • Resumir la importancia de la comunicación interprofesional mejorando la coordinación asistencial entre el equipo interprofesional al iniciar la terapia antibiótica con colchicina.

Indicaciones

La colchicina tiene la aprobación de la FDA para la profilaxis de la gota y el tratamiento de los brotes de gota agudos. También tiene aprobación para el tratamiento de la fiebre mediterránea familiar. [1] [2]

Si bien no está aprobada para las siguientes afecciones, la colchicina se ha utilizado fuera de la etiqueta para tratar las siguientes:

  • Pericarditis aguda y recurrente
  • Prevención del síndrome pospericárdico
  • Cirrosis biliar primaria
  • Cirrosis hepática
  • Dermatitis herpetiforme
  • Enfermedad ósea de Paget
  • Trombocitopenia inmunitaria crónica y púrpura trombocitopénica idiopática
  • Pseudogota
  • Fibrosis pulmonar idiopática

Las recomendaciones de colchicina no incluyen la profilaxis ni el tratamiento de los brotes de gota en la población pediátrica. Se puede usar para tratar la fiebre mediterránea familiar en niños de cuatro años o más.

Mecanismo de acción

La colchicina tiene principalmente propiedades antiinflamatorias. Interrumpe las funciones citoesqueléticas al inhibir la polimerización de beta-tubulina en microtúbulos, previniendo la activación, desgranulación y migración de neutrófilos asociados con la mediación de algunos síntomas de la gota. La colchicina no inhibe la fagocitosis de los cristales de ácido úrico, pero parece prevenir la liberación. de una glicoproteína inflamatoria de los fagocitos. La colchicina bloquea la metafase debido a dos efectos antimitóticos separados: la interrupción de la formación del huso mitótico y la interrupción de la formación de sol-gel. Los efectos tóxicos de la colchicina están relacionados con esta actividad antimitótica dentro del tejido en proliferación, como la piel, el cabello y la médula ósea. [3] [4]

El mecanismo de acción de la colchicina en el tratamiento de la fiebre mediterránea familiar es menos conocido, ya que puede interferir con el ensamblaje intracelular del complejo inflamasoma presente en los neutrófilos y monocitos que median la activación de la interleucina-1-beta.

Administración

La colchicina está disponible en forma de tableta, cápsula y gel. & # 160 En forma de tableta, está disponible en una tableta de 0,6 mg. Está disponible en cápsulas de 0,6 mg. Hay una forma de gel tópico de Colchicum autumnale.

La administración de colchicina suele ser por vía oral y el uso del gel tópico es poco frecuente. Debido a la toxicidad, la forma inyectable ya no está disponible en los Estados Unidos.

Profilaxis de la gota: La dosis de colchicina es de 0,6 mg una o dos veces al día en adultos y adolescentes mayores de 16 años, la dosis máxima es de 1,2 mg por día.

Tratamiento del brote de gota agudo: 1,2 mg al primer signo de un brote de gota seguido de 0,6 mg una hora después.

Fiebre mediterránea familiar: 1,2 mg a 2,4 mg para adultos y niños mayores de 12 años, la dosis diaria se administra en una o dos tomas.

Efectos adversos

Las reacciones adversas más frecuentes están relacionadas con el tracto gastrointestinal. La diarrea es el síntoma más común (23%), seguido de vómitos (17%) y náuseas (4% a 17%). Hay informes de síntomas del sistema nervioso central como fatiga y dolor de cabeza. Se han informado afecciones endocrinas y metabólicas como la gota cuando se usa colchicina, al igual que el dolor faringolaríngeo. [5] [6]

Aunque es menos común, se han informado las siguientes reacciones adversas con la colchicina y se cree que son reversibles al suspender el medicamento o reducir la dosis:

  • Neurológico - neuropatía sensitivomotora
  • Dermatológico: alopecia, erupción maculopapular, púrpura, erupción
  • Gastrointestinal: calambres abdominales, dolor abdominal, intolerancia a la lactosa
  • Hematológico: leucopenia, granulocitopenia, trombocitopenia, pancitopenia, anemia aplásica
  • Hepatobiliar: AST elevado, ALT elevado
  • Musculoesquelético: miopatía, CPK elevado, miotonía, debilidad muscular, dolor muscular, rabdomiólisis.
  • Reproductivo: azoospermia, oligospermia

Interacciones con la drogas

La colchicina es un sustrato para el transportador de salida de la glucoproteína P. De las enzimas del citocromo P450 analizadas, CYP3A4 es la principal enzima involucrada en el metabolismo de la colchicina. Si se administra colchicina con medicamentos que inhiben la glicoproteína P-160, la mayoría de los cuales también inhiben CYP3A4, es probable que aumenten las concentraciones de colchicina, y hay informes de interacciones medicamentosas fatales.

Cuando se coadministra con medicamentos que se sabe que inhiben el CYP3A4 y / o la glicoproteína & # 160P, se debe ajustar la dosis de colchicina.

Los siguientes medicamentos deben usarse con precaución cuando se coadministran con colchicina:

Potentes inhibidores de CYP3A4 & # 160 & ndash atazanavir, claritromicina, indinavir, itraconazol, ketoconazol, nefazodona, nelfinavir, ritonavir, saquinavir y telitromicina

Inhibidores moderados de CYP3A4 & # 160 - amprenavir, aprepitant, diltiazem, eritromicina, fluconazol, fosamprenavir, jugo de toronja y verapamilo

P-glicoproteína & # 160 inhibidores & # 160 & ndash ciclosporina, ranolazina

Interacciones de alimentos

El jugo de toronja puede aumentar la concentración sérica de colchicina. Por lo tanto, la dosis de colchicina puede requerir un ajuste cuando se toma jugo de toronja. Los pacientes deben evitar el jugo de toronja si tienen insuficiencia hepática o renal y están tomando colchicina.

Contraindicaciones

Contraindicaciones

El metabolismo de la colchicina se produce a través del hígado y otros tejidos y depende del transporte de la glucoproteína P y de las isoenzimas CYP 384. Se elimina inalterado por la orina y por metabolismo. Los inhibidores de la glicoproteína P y CYP3A4 pueden disminuir el metabolismo de la colchicina y, por lo tanto, dar como resultado un aumento de los niveles plasmáticos de colchicina. El deterioro de la función renal y hepática puede disminuir el metabolismo y el aclaramiento de la colchicina y dar lugar a concentraciones elevadas. Estos niveles elevados pueden causar reacciones adversas, incluida la muerte. [7] [8] [9]

Está contraindicado el uso concomitante de un inhibidor de la glucoproteína P o CYP3A4 y colchicina en presencia de insuficiencia renal o hepática. Los ajustes de dosis o las terapias alternativas son consideraciones para los pacientes con insuficiencia renal o hepática que no están tomando una glicoproteína P o un inhibidor de CYP3A4.

Precauciones

Obstrucción biliar, insuficiencia renal, enfermedad hepática y enfermedad renal

Los ajustes de dosis son necesarios para pacientes con función renal y hepática normal, que toman medicamentos que interactúan y pacientes con insuficiencia renal o hepática. & # 160 Los pacientes con insuficiencia renal o concentraciones plasmáticas elevadas de colchicina debido a enfermedad renal pueden desarrollar mieloneuropatía caracterizada por debilidad proximal. , creatinina sérica elevada y posiblemente rabdomiólisis. & # 160 La colchicina se elimina a través de las vías biliares. Por lo tanto, los pacientes con enfermedad hepática u obstrucción biliar hepática deben considerar terapias alternativas.

Alcoholismo, enfermedad gastrointestinal

El riesgo de daño tisular gastrointestinal inducido por la colchicina puede ser mayor en pacientes con alcoholismo preexistente o enfermedad gastrointestinal. Por lo tanto, el médico debe considerar ajustes en la dosificación.

Supresión de la médula ósea

La colchicina tomada durante un período prolongado tiene correlaciones con la supresión de la médula ósea. Por lo tanto, la colchicina debe usarse con precaución en pacientes con supresión de la médula ósea preexistente. Se ha informado que las dosis terapéuticas de colchicina se han correlacionado con mielosupresión, leucopenia, granulocitopenia, trombocitopenia, pancitopenia y anemia aplásica. Además, la colchicina puede empeorar este tipo de discrasias sanguíneas.

La diálisis no elimina la colchicina Los pacientes que recibieron diálisis requirieron una reducción de la dosis secundaria a su función renal deteriorada.

Enfermedad dental

La colchicina puede causar mielosupresión y, por lo tanto, su uso requiere precaución en pacientes con enfermedades dentales. La recomendación es que el trabajo dental se realice antes de iniciar la terapia con colchicina o se retrase hasta que el recuento sanguíneo vuelva a la normalidad.

Toxicidad neuromuscular

Existen informes de toxicidad neuromuscular inducida por colchicina y rabdomiólisis con tratamiento crónico en dosis terapéuticas de colchicina. Los pacientes con insuficiencia renal y los pacientes de edad avanzada, incluso aquellos con función renal y hepática normal, tienen un mayor riesgo. El uso concomitante de colchicina y atorvastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina, gemfibrozil y ácido fenofíbrico o ciclosporina puede potenciar el desarrollo de miopatía.

Con o sin insuficiencia renal o hepática preexistente, los pacientes geriátricos tienen un mayor riesgo de toxicidad neuromuscular y rabdomiólisis cuando toman colchicina. Es necesario tener precaución y puede ser apropiado un ajuste de la dosis cuando se administre colchicina a pacientes geriátricos.

La colchicina se clasifica en la categoría C del embarazo. El uso de colchicina durante el embarazo solo debe ser si el beneficio potencial para la madre justifica el posible riesgo para el feto.

Lactancia materna

La colchicina se excreta en la leche materna humana. La colchicina puede alterar la renovación y la permeabilidad de las células gastrointestinales; sin embargo, no se han informado efectos adversos en bebés humanos amamantados. La Academia Estadounidense de Pediatría considera que la colchicina suele ser compatible con la lactancia.

Vigilancia

No se dispone de un análisis de sangre para determinar la concentración sérica de colchicina. En pacientes con insuficiencia o enfermedad hepática o renal, o en pacientes que toman una glucoproteína P o un inhibidor de CYP3A4, los parámetros que requieren monitorización incluyen un hemograma completo y pruebas de función renal y hepática.

Toxicidad

Se desconoce la dosis precisa de colchicina que produce una toxicidad significativa. Se ha producido toxicidad después de la ingestión de una dosis tan baja como 7 mg durante cuatro días, mientras que otros pacientes sobrevivieron después de tomar más de 60 mg. En una revisión de 150 pacientes con una sobredosis de colchicina, hubo un 100% de mortalidad en aquellos que ingirieron más de 0,8 mg / kg.

La toxicidad aguda por colchicina por lo general comienza dentro de las 24 horas posteriores a la ingestión e incluye síntomas gastrointestinales, lo que eventualmente conduce a una pérdida significativa de líquidos y depleción de volumen. En esta fase inicial, también puede haber leucocitosis periférica. Las complicaciones potencialmente mortales a menudo ocurren de 24 a 72 horas después de la administración del fármaco y generalmente se atribuyen a insuficiencia multiorgánica. La muerte suele ser el resultado de una depresión respiratoria y un colapso cardiovascular.

El tratamiento de la intoxicación por colchicina debe comenzar con un lavado gástrico y medidas para prevenir el shock. & # 160 De lo contrario, el tratamiento es sintomático y de apoyo. No existe un antídoto específico conocido y la colchicina no se elimina eficazmente mediante diálisis.

Mejora de los resultados del equipo de atención médica

Si bien el uso de colchicina ha disminuido en las últimas dos décadas, los médicos, enfermeras y farmacéuticos aún deben conocer los requisitos y restricciones de dosificación. Antes de administrar colchicina a cualquier paciente, se deben conocer las recomendaciones de dosificación actuales y la edad, función renal y hepática del paciente. Al menos el 30% de todos los errores de medicación relacionados con la colchicina están relacionados con regímenes de dosificación incorrectos. Además, es importante saber qué más está tomando el paciente para prevenir interacciones farmacológicas letales. También se debe asegurar que el paciente sepa cómo tomar colchicina y que no sea un agente analgésico. Se han producido muchos errores con la colchicina simplemente porque los pacientes no sabían que los efectos del fármaco podrían tardar de 24 a 36 horas en desarrollarse, y el paciente debe evitar tomar dosis repetidas dentro de este período. Además, los pacientes deben entender que deben suspender la colchicina si desarrollan efectos secundarios gastrointestinales o parestesias. Finalmente, todos los pacientes requieren educación sobre cómo almacenar colchicina de manera segura en el hogar, lejos del alcance de los niños. La colchicina tiene una tasa de mortalidad muy alta en poco tiempo cuando se ingiere una dosis alta. [10] [1]

Dado lo anterior, los prescriptores deben trabajar en estrecha colaboración con el farmacéutico y el personal de enfermería al iniciar la terapia con colchicina. Las tres disciplinas deben brindar asesoramiento al paciente para que los puntos cruciales reciban énfasis. El prescriptor y el farmacéutico deben revisar todos los parámetros del paciente y asegurarse de que no sean necesarios ajustes de dosis. Las enfermeras deben estar familiarizadas con los signos de toxicidad o eventos adversos para monitorear al paciente e informar al prescriptor en caso de que surja algún problema. Con un enfoque de equipo interprofesional, la colchicina aún puede ser un agente eficaz en casos específicos. [Nivel 5]


El efecto de la colchicina sobre la pérdida de hueso alveolar en la periodontitis inducida por ligadura.

La periodontitis es una enfermedad inflamatoria crónica causada por una microbiota patógena en la biopelícula subgingival. El desafío bacteriano induce una reacción inflamatoria con un aumento de citocinas, prostaglandinas y especies reactivas de oxígeno. (1, 2) La inflamación sostenida en el tejido progresa hacia los tejidos profundos y causa la pérdida del tejido conectivo de soporte y del hueso alveolar. La inflamación continua también causa la formación de una bolsa periodontal, lo que finalmente conduce a la pérdida de dientes. (3) Sin embargo, ahora se sabe que el daño tisular subyacente observado en esta enfermedad es el resultado de una respuesta inmune excesiva a los patógenos subgingivales. (4) Por lo tanto, se deduce que la inhibición farmacológica de las vías de respuesta del huésped puede ser una estrategia complementaria o alternativa para el tratamiento de la enfermedad periodontal. (5)

La colchicina, originalmente extraída de Colchicum autumnale, es un fármaco antiinflamatorio que se ha utilizado de forma continua durante más de 3.000 años. (6) La colchicina actúa uniéndose a la tubulina de una manera poco reversible, formando un complejo colchicina-tubulina. En dosis más bajas, este complejo interfiere con la formación y elongación de los microtúbulos, y en concentraciones más altas promueve la despolimerización de los microtúbulos. (7) Clásicamente, se pensaba que la rotura de los microtúbulos causada por la colchicina producía efectos antiinflamatorios al inhibir la quimiotaxis de los neutrófilos, disminuir la liberación de enzimas lisosomales durante la fagocitosis, inhibir la expresión de moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales y leucocitos y también inhibiendo la activación del inflamasoma dentro de los macrófagos. (8,9,10,11) Además, la colchicina deprime la desgranulación de los neutrófilos, que está estrechamente relacionada con la respuesta secretora y el brote oxidativo (12,13), y se ha demostrado que la colchicina atenúa la peroxidación lipídica y estabiliza las membranas. (14) La colchicina también ha sido prescrita para ataques agudos de gota y profilaxis, enfermedad de Behcet (15), fiebre mediterránea familiar (FMF), pseudo-gota y trastornos dermatológicos, debido a sus efectos antes mencionados. (dieciséis)

Si bien la actividad antiinflamatoria de la colchicina es bien conocida, su efecto sobre el metabolismo óseo no está claro. Estudios anteriores sugirieron que la colchicina disminuyó el número de osteoclastos y bloqueó la reabsorción en los huesos tratados previamente con hormona paratiroidea. (17) Por el contrario, un estudio reciente informó que el tratamiento prolongado con colchicina (1 mg / kg / día durante 6 semanas) tuvo una influencia negativa significativa en la curación de la fractura en la tibia de rata, al inhibir la consolidación de la fractura y reducir la resistencia ósea. (18) Además, en un estudio clínico reciente que investigó la asociación entre la FMF y la osteoporosis en pacientes adultos, encontraron que el tratamiento regular con colchicina, que podría haber suprimido el estado inflamatorio de la FMF, puede no prevenir el desarrollo de la osteoporosis. (19) Sin embargo, hasta donde sabemos, no existen datos sobre los efectos de la colchicina sobre la pérdida de hueso alveolar en la periodontitis. Además, se desconoce si la colchicina puede mejorar o reducir la progresión de la periodontitis. En consecuencia, el objetivo de este estudio fue investigar el efecto de la colchicina, que tiene efectos antiinflamatorios y antioxidantes, sobre el periodonto sano y la resorción ósea alveolar en un modelo de rata de periodontitis experimental, tanto histopatológica como histomorfométricamente.

Animales y modelo experimental

Este estudio fue aprobado por el Comité Ético de Estudios con Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad Cumhuriyet. En total, se utilizaron 42 ratas Wistar macho (que pesaban 230-250 g) en el experimento. Las ratas se alojaron en jaulas individuales en una habitación con ciclos de luz-oscuridad de 12 h, con agua y comida disponibles ad libitum.

Este estudio utilizó un diseño de boca dividida para estudiar grupos ligados con o sin administración sistémica de colchicina, con las condiciones experimentales de un lado y el control del otro. En cada rata, se colocó una ligadura alrededor de su primer molar derecho, mientras que el primer molar izquierdo contralateral no tenía una ligadura como control de colchicina. Los animales se dividieron en grupos de la siguiente manera:

una. Controles no ligados (control) (6 ratas)

B. Grupo de ligadura solamente (LO) (12 ratas)

C. Colchicina 0.4 mg / kg / día - grupo no ligado (0.4 mgC) (lado izquierdo) y grupo ligado (0.4 mgC-L) (lado derecho) (12 ratas)

D. Grupo de colchicina 1 mg / kg / día no ligado (1 mgC) (lado izquierdo) y grupo ligado (1 mgC-L) (lado derecho) (12 ratas).

Inducción de periodontitis experimental

El procedimiento se llevó a cabo bajo anestesia general utilizando 40 mg / kg de hidrocloruro de ketamina. Se colocó submarginalmente una sutura de seda 4-0 alrededor de los primeros molares de los cuadrantes mandibulares derechos. Todas las ligaduras se colocaron subgingivalmente y se reemplazaron las suturas perdidas o sueltas. Todas las colocaciones de ligaduras fueron realizadas por el mismo operador (A.Y.).

La colchicina se preparó en dosis de 0,4 mg / kg y 1 mg / kg en 0,5 ml de agua destilada y se administró sistémicamente mediante alimentación gástrica a una velocidad de 0,5 ml al día hasta el sacrificio. Las dosis de colchicina utilizadas en los estudios oscilaron entre 0,1 mg / kg y 1 mg / kg. Y las dosis de colchicina se seleccionaron en base a los estudios de dosis en estudios previos que demostraron ser efectivos. (20, 21, 22, 23) En los grupos de colchicina, la mitad de los animales de cada grupo se sacrificaron a los 11 días y el resto a los 30 días. Se considera que ambas duraciones son un período de tiempo adecuado para observar el curso de la enfermedad periodontal en ratas. (24,25,26,27)

Medidas del hueso alveolar

Después del sacrificio, se recolectaron las mandíbulas y se extirparon los tejidos blandos alrededor de las mandíbulas. Las mandíbulas se tiñeron con azul de metileno acuoso al 1% para identificar la unión cemento-esmalte (CEJ). La distancia entre el CEJ y la cresta alveolar se midió con un aumento de 16 (x) utilizando un software de imágenes digitales (Zeiss, Stemi 2000, Oberkochen, Alemania) integrado con un estereomicroscopio y un sistema de cámara. Todas las mediciones se realizaron en seis puntos, tres superficies bucales y tres linguales, y se calculó un valor medio para cada diente. La medición morfométrica de la pérdida de hueso alveolar fue realizada por un solo examinador (M.B.T.) que desconocía la identidad de las muestras.

Después del análisis estereomicroscópico, las mandíbulas derecha e izquierda se sumergieron en formalina tamponada neutra al 10% durante 48 h. La descalcificación de las mandíbulas se realizó con solución de EDTA (10%, durante 10 semanas). Después de la descalcificación, todas las muestras se deshidrataron mediante una serie de etanol y se incluyeron en parafina, luego se prepararon secciones seriadas de 5 µm y se utilizaron para tinción histoquímica de hematoxilina y eosina (H & ampE) y fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP). Las secciones teñidas se evaluaron mediante microscopía óptica (Eclipse E 600 Nikon, Tokio, Japón).

Las células de osteoblastos cuboides bordeadas con osteoide y ligamento periodontal vecino y visibles en las superficies de formación de hueso activas se consideraron células de osteoblastos activas y se contaron. También se evaluó la infiltración de células inflamatorias (ICI) del tejido periodontal en todas las secciones. Se contaron las células inflamatorias totales en un área de 10.000 [micro] [m2] (neutrófilos, linfocitos, eosinófilos y células de macrófagos) con un aumento de 1000x. Un solo examinador (F.G.) que tampoco conocía la identidad de las muestras, realizó todas las evaluaciones histológicas.

Las células de osteoclastos se identificaron mediante tinción con TRAP en secciones descalcificadas. El procedimiento de histoquímica TRAP se realizó de acuerdo con el protocolo de Leong. (28) Las muestras se rehidrataron y trataron con una mezcla de acetato de sodio (0,2 M) y tartrato de sodio dibásico deshidratado. Las secciones se incubaron en esta solución durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, se añadieron la sal TR roja rápida y el fosfato de naftol AS-MX y se realizó una segunda incubación durante 1 ha 37 ° C. Durante la segunda incubación, después de los primeros 30 minutos, las secciones se controlaron de cerca con un microscopio óptico. Una vez que las células de los osteoclastos TRAP + se tiñeron de rojo brillante, se detuvo el procedimiento y las secciones se lavaron y tiñeron con hematoxilina de Gill.

Se realizó inmunohistoquímica con MMP-1 para evaluar la degradación del colágeno. Después de la desparafinización y deshidratación de las secciones, la recuperación de antígeno se realizó utilizando tampón de citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) durante 2 ha 70 ° C. Luego, las secciones se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% para apagar la actividad de peroxidasa endógena. Después de la incubación con suero de conejo normal durante 30 min, las muestras se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche. Luego, las secciones se lavaron cinco veces con solución salina tamponada con fosfato, luego se incubaron con inmunoglobulina G biotinilada durante 30 min, se lavaron varias veces con solución salina tamponada con fosfato y se hicieron reaccionar con un reactivo conjugado con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante 30 min. Después de tres lavados de 5 minutos con solución salina tamponada con fosfato, las muestras se incubaron con cromógeno AEC para visualizar la inmunorreactividad, luego se contratiñeron con hematoxilina y se analizaron usando microscopía óptica.

Análisis de puntuación H inmunohistoquímica

Se seleccionaron cinco áreas al azar de las secciones de cada animal a examinar, bajo un microscopio óptico con un aumento de 1000x. Se realizó una enumeración categórica de las células dentro de estas áreas de acuerdo con su intensidad de tinción inmunológica. Se contaron todas las células en un área de 10.000 [micro] [m2] considerando las intensidades de tinción. Durante estos recuentos, se consideraron tanto el número de células que mostraban inmunorreactividad positiva como el grado de intensidad inmunorreactiva de estas células, así como el número total de células que se tiñeron y no se tiñeron. Ninguna tinción se consideró como puntuación "0", la intensidad de tinción leve fue "1", la intensidad de tinción leve fue "2" y la intensidad de tinción fuerte fue "3". Se tomó el promedio de los resultados de un estudio ciego. Para estimar los resultados de los conteos, se utilizó la fórmula H Score [[SIGMA] Pi (i + l)]. En esta fórmula, I representa la puntuación de intensidad de tinción y Pi representa el porcentaje de células teñidas.

Los datos se presentan como media [+ o -] DE o porcentaje, según corresponda. Los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS [R] (frente a 23,00). El número de osteoclastos, la pérdida de hueso alveolar, el número de osteoblastos y la puntuación H de MMP-1 se evaluaron mediante las pruebas de Kruskal-Wallis y Man-Whitney-U para realizar comparaciones por pares. Los valores de p & lt 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

La periodontitis experimental se logró con éxito y la ligadura causó destrucción periodontal y pérdida de hueso alveolar alrededor de los primeros molares mandibulares. Los animales no mostraron ningún signo obvio de enfermedad sistémica durante el período de estudio y no se perdieron ni excluyeron ratas del estudio.

El nivel más alto de pérdida de hueso alveolar se midió en el grupo LO a los 11 días (p & lt 0,05) (Figura 1 y 2). No hubo diferencias significativas en la pérdida de hueso alveolar entre todos los grupos de control. Además, la pérdida de hueso alveolar fue similar en ambos grupos de colchicina con una ligadura (p & gt 0,05), y sólo la administración sistémica de 0,4 mg de colchicina disminuyó la pérdida de hueso alveolar (p & lt 0,05).

Según los análisis a los 30 días, no hubo diferencias significativas entre todos los grupos de control (p & gt 0,05). Aunque la pérdida de hueso alveolar en ambos grupos de colchicina fue menor que en el grupo L, las diferencias no fueron significativas (p & gt 0,05). Sin embargo, a los 30 días, la pérdida de hueso alveolar aumentó en el grupo de 0,4 mgC-L en comparación con los 11 días (p & lt 0,05).

La figura 3 muestra una vista histológica representativa de los grupos. El número de osteoclastos positivos para TRAP en el grupo L fue mayor que en cualquiera de los grupos de colchicina con una ligadura, pero la diferencia no fue significativa a los 11 días (p & gt 0,05) (Figura 4). Además, el número de osteoclastos en el grupo L fue mayor que en todos los grupos de control. Las otras comparaciones no mostraron diferencias significativas con respecto al número de osteoclastos a los 11 días.

A los 30 días, el número de osteoclastos en los grupos L y 1 mg-L fue mayor que en cualquiera de los controles (Figura 3 II-B). Además, se encontró que el grupo de 1 mg-L contenía números de osteoclastos significativamente más altos que el grupo de 0,4 mg-L, pero las diferencias no fueron significativas. Entre los grupos de control, no hubo diferencias significativas en el número de osteoclastos a los 30 días, ni hubo diferencias significativas entre los 11 y 30 días. Por el contrario, en el grupo L, hubo diferencias significativas entre 11 y 30 días en términos del número de osteoclastos (p & lt 0,05).

La ICI fue mayor en todos los grupos ligados que en los controles no ligados a los 11 o 30 días (p & lt 0,05). No hubo diferencias significativas entre todos los controles en términos de ICI en ninguno de los puntos temporales (p & gt 0,05). Además, hubo diferencias significativas en la ICI entre el grupo de 0,4 mgC-L y el grupo L a los 11 días. Sin embargo, a los 30 días, no hubo diferencias estadísticamente significativas en ICI entre los grupos ligados.

Según los análisis histológicos, los números de osteoblastos fueron similares entre todos los grupos de control y no se observaron diferencias significativas (Figura 5). Asimismo, no hubo diferencias significativas en el número de osteoblastos entre los grupos L y 0,4 mg-L (p & gt 0,05) (Figura 3 III-B). Sin embargo, los números de osteoblastos en el grupo de 1 mg-L fueron más altos que en el grupo L a los 11 días (p & lt 0,05).

A los 30 días, se observaron los números de osteoblastos más bajos en el grupo L (p & lt 0,05). Aunque el número de osteoblastos fue mayor en el grupo de 1 mgC-L que en el grupo L, no hubo diferencias significativas en el número de osteoblastos entre el grupo L y el grupo de 0,4 mgC-L a los 30 días. Además, el número de osteoblastos aumentó en el grupo de 1 mgC-L a los 30 días en comparación con los 11 días (p & lt 0,05). Por el contrario, el número de osteoblastos disminuyó en el grupo L a los 30 días (p & lt 0,05).

La expresión de MMP-1 fue significativamente mayor en el grupo L que en los grupos de 1 mgC, 0,4 mgC-L o 1 mgC-L a los 11 días (p & lt 0,05). Sin embargo, no hubo diferencias significativas en la expresión de MMP-1 entre los grupos de 0,4 mgC-L y 1 mgC-L a los 11 días (p & gt 0,05). Además, todos los grupos expresaron niveles similares de MMP-1 a los 30 días sin diferencias significativas entre ellos (p & gt 0,05) (Figura 3 I-IV C).

Este estudio es el primero en evaluar el efecto de la colchicina sobre la periodontitis experimental y el tejido óseo alveolar.Hemos demostrado que la colchicina administrada sistémicamente no aumenta la pérdida de hueso alveolar en ninguna de las dosis y después de cualquier término en periodonto sano. Además, encontramos que la colchicina tiende a disminuir la pérdida de hueso alveolar aumentando la actividad osteoblástica y disminuyendo la actividad osteoclástica en la periodontitis inducida por ligaduras.

El método de la ligadura se ha utilizado ampliamente para la inducción de periodontitis experimental. (29,) (30) En este método, la ligadura desencadena una reacción inflamatoria causada por una acumulación de placa bacteriana alrededor del primer molar. (26) En el presente estudio, la colocación de la ligadura en el primer molar provocó una pérdida significativa de hueso en los días 11 y 30. Los períodos de 11 y 30 días se consideran períodos adecuados para observar el progreso temprano y tardío de la enfermedad y el tratamiento, relativamente. (24,25,26,27) Sin embargo, para cada modelo animal de una enfermedad humana, existen limitaciones inherentes. Los molares en ratas son similares en configuración anatómica y estructura a los molares humanos, pero el modelo experimental utilizado es que la periodontitis inducida sigue un curso agudo, durante el cual el trauma tisular y la acumulación microbiana adyacente aceleran el proceso destructivo. Es probable que estas vías de inflamación aguda difieran de las implicadas en la periodontitis crónica.

Actualmente, la colchicina se utiliza con confianza en varias enfermedades debido a su efecto antiinflamatorio. (31-32) En un estudio experimental reciente que investigó los efectos de la colchicina, un agente disruptor de los microtúbulos, sobre la lesión isquémica del músculo esquelético en ratas, los autores sugirieron que 1 mg / kg de colchicina disminuyó significativamente los niveles de malondialdehído, TNF-? e IL-1 beta y aumento de superóxido dismutasa en tejidos isquémicos. (33) Además, en dosis más altas, la colchicina ejerce varios otros efectos inflamatorios, incluida la supresión de la activación de la fosfolipasa A2, la liberación de enzimas lisosomales y la fagocitosis. (34-35) Sin embargo, en nuestro estudio, el estado inflamatorio se evaluó histológicamente y la expresión de MMP-1 La infiltración de células inflamatorias se incrementó en todos los grupos ligados debido a la presencia de ligaduras. Sin embargo, la administración de colchicina, especialmente a una dosis de 0,4 mg / kg, disminuyó la actividad de la ICI a los 11 días, pero este efecto no se observó a los 30 días.

MMP-1 y -8 pertenecen al grupo colagenasa de la familia MMP, y se ha informado que tanto MMP-1 como -8, las principales colagenasas intersticiales, degradan la matriz extracelular en la enfermedad periodontal y son secretadas principalmente por neutrófilos. (36) Además, MMP-1 puede afectar preferentemente el inicio de la destrucción del colágeno en comparación con MMP-8. Además, varios informes han demostrado que los niveles de MMP son más altos en la periodontitis, en comparación con la gingivitis y las personas sanas. (37-38) En nuestro estudio, la expresión más alta de MMP-1 se observó en el grupo de solo ligadura y la expresión disminuyó en los grupos con colchicina administrada sistémicamente. Además, no hubo un efecto significativo sobre el periodonto sano a las dosis evaluadas. Sin embargo, Nahm et al. encontraron efectos contradictorios, informando que los fibroblastos del ligamento periodontal tratados con colchicina aumentaron significativamente la expresión de MMP-1 de manera dependiente del tiempo en comparación con los controles y también mostraron un aumento dependiente del tiempo en la expresión de TIMP-1 y TGF-beta1. (39)

Se han realizado varios estudios clínicos para investigar la asociación entre el metabolismo óseo y la colchicina, pero se han encontrado resultados contradictorios. Suyani y col. investigó la asociación entre la FMF y la osteoporosis en pacientes adultos que tomaban colchicina de forma regular. (19) Descubrieron que las puntuaciones T totales del fémur eran significativamente más bajas en los pacientes con FMF en comparación con los controles sanos. También sugirieron que la inflamación subclínica puede estar asociada con una disminución del contenido mineral óseo en estos pacientes. Por el contrario, Siverekli et al. (40) sugirieron que no se encontraron diferencias significativas entre la FMF y los controles sanos con respecto a la densidad ósea. En nuestro estudio, el número de osteoclastos fue mayor en el grupo de ligadura solamente que en cualquier otro durante el período de estudio. El tratamiento con colchicina redujo el número de osteoclastos para controlar los niveles en 11 días y no causó ninguna pérdida de hueso alveolar en el periodonto. De manera similar, los resultados de nuestro estudio clínico anterior sugirieron que los pacientes con FMF, que usaban regularmente colchicina, no manifestaron una mayor pérdida de apego en comparación con los controles sistémicamente sanos de la misma edad y sexo. (41)

En un estudio anterior realizado por Arai et al, informaron que el tratamiento con colchicina a una dosis de 1 mg / kg por vía intravenosa reveló altos niveles de expresión de ARNm de colágeno tipo I en osteoblastos de la superficie ectópica mineralizada durante el período óseo y formaron ectópicos calcificados similares a huesos trabeculares. tejido. (42) Además, en ese estudio, la osteocalcina no mostró señales específicas a lo largo de los experimentos, pero el ARNm de osteopontina se expresó especialmente en la fase inicial de la resorción ósea ectópica. Sin embargo, Salai et al. informó que la colchicina es un inhibidor in vitro de la proliferación de osteoblastos, lo que provoca una marcada disminución de la mineralización tisular. (43) Además, sugirieron que la colchicina en concentraciones bajas, de hasta 3 ng / ml, tiene la capacidad de inhibir selectivamente la mineralización por cultivo de células similares a huesos, sin afectar la proliferación de células osteoblásticas. Por el contrario, encontramos que la actividad osteoblástica se observó con menos frecuencia en el grupo de ligadura solamente y mostró mayor actividad y números en los grupos de colchicina, especialmente a una dosis de 1 mg.

Existen ciertas limitaciones para el presente estudio. Como el mecanismo exacto que subyace al efecto antiinflamatorio de la colchicina en la periodontitis no está claro, evaluamos parámetros limitados en el presente estudio, solo evaluando los niveles de MMP-1 y los recuentos de células inflamatorias en secciones histológicas como marcadores de inflamación. Deben investigarse los cambios en la expresión de marcadores óseos específicos como RANKL y osteoprotegerina.

En conclusión, dentro de las limitaciones inherentes de este estudio en animales, encontramos que la colchicina ejercía un efecto antiinflamatorio sobre la progresión de la periodontitis en la periodontitis inducida por ligaduras sin afectar el periodonto sano. Sin embargo, se necesitan más estudios para investigar la eficacia a largo plazo y el modo de acción de la colchicina sobre la pérdida de hueso alveolar y la inflamación en la periodontitis debido a su amplio uso en varias enfermedades inflamatorias.

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Hulya TOKER (a) Hatice BALCI YUCE (b) Ali YILDIRIM (a) Mehmet Bugrul TEKIN (a) Fikret GEVREK (c)

(a) Universidad Cumhuriyet, Facultad de Odontología, Departamento de Periodoncia, Sivas, Turquía.

(b) Universidad de Gaziosmanpasa, Facultad de Odontología, Departamento de Periodoncia, Tokat, Turquía

(c) Universidad de Gaziosmanpasa, Facultad de Medicina, Departamento de Histología y Embriología, Tokat, Turquía

Declaración de intereses: Los autores certifican que no tienen ningún interés comercial o asociativo que represente un conflicto de intereses en relación con el manuscrito.


Financiamiento y divulgaciones

Con el apoyo del Consejo Nacional de Investigación Médica de la Salud de Australia, una subvención del Comité Asesor de Investigación Sir Charles Gairdner, la Fundación Withering de los Países Bajos, la Fundación del Corazón de los Países Bajos, la Organización de los Países Bajos para la Investigación y el Desarrollo de la Salud y un consorcio de Teva, Disphar, y Tiofarma en Holanda.

Los formularios de divulgación proporcionados por los autores están disponibles con el texto completo de este artículo en NEJM.org.

El Dr. Mosterd informa haber recibido subvenciones de Novartis, honorarios por conferencias de Amarin, honorarios de la junta asesora de Amgen y Boehringer Ingelheim, y honorarios por servir como investigador principal nacional de BMS, MSD y Pfizer. institución y honorarios de AstraZeneca, Bayer, Boehringer Ingelheim, Bristol-Myers Squibb / Pfizer, Daiichi Sankyo, Eli Lilly, GlaxoSmithKline, Janssen y Sanofi Aventis Dr. Alings, recibiendo honorarios de consultoría de Bayer, Bristol-Myers Squibb, Boehringer Ingelheim, Daiichi Sankyo, Pfizer, Portola y Sanofi y el Dr. Cornel, recibiendo honorarios del consejo asesor de AstraZeneca, honorarios del consejo asesor y honorarios por servir como investigador principal nacional de Amgen, y honorarios por servir como presidente de un comité de adjudicación de punto final de IQVIA . No se informó de ningún otro conflicto de intereses potencial relevante para este artículo.

Drs. Nidorf y Fiolet y los Dres. Mosterd, Cornel y Thompson contribuyeron igualmente a este artículo.

Este artículo fue publicado el 31 de agosto de 2020 en NEJM.org.

Una declaración de intercambio de datos proporcionada por los autores está disponible con el texto completo de este artículo en NEJM.org.

Agradecemos a todos los pacientes por su participación en el ensayo, a los investigadores y coordinadores del ensayo en todos los centros y a los monitores del ensayo y al personal de GenesisCare, incluidos Penny Buczec, Denny Craig, Karen Doherty, Louise Ferguson, Louise Nidorf y Karen Youl, de el Instituto de Investigación Cardiovascular y Vascular del Hospital Sir Charles Gairdner, que incluye a Louise Ferguson, y de la Red Holandesa de Investigación Cardiovascular, que incluye a Marjelle van Leeuwen (directora de proyectos), Ingrid Groenenberg y Glentino Rodríguez para la gestión de datos, Erik Stroes, Max Silvis y Tim de Vries para revisión médica y Petra Bunschoten y Wendy Tousain para monitoreo del sitio.


Ver el vídeo: Colchicina en primer episodio de pericarditis aguda idiopática. Antonia Sambola (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Os

    Me alegro de que tu blog está en constante evolución. Tales publicaciones solo agregan popularidad.

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    idea muy divertida

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    Uuurraaaa, finalmente, zaber

  5. Gagor

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