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Etiquetado T7 en biología sintética

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¿Qué es una etiqueta T7 y puede usarse para purificar proteínas sintetizadas? ¿Se basa en el cargo como una etiqueta His?


La etiqueta T7 son los primeros 11 aminoácidos de la proteína 10 del gen T7. Básicamente, si diseña una proteína con la etiqueta T7, ha creado un pequeño epítopo conocido para la proteína de interés que puede detectarse inmunológicamente. El pequeño tamaño del epítopo reduce la posibilidad de que interrumpa la función normal de la proteína (a la que está etiquetada). Si miramos el kit de purificación por afinidad en la siguiente página del producto, podemos ver que se pueden usar vectores específicos para expresar proteínas marcadas con T7, y se puede usar una columna de inmunoafinidad para purificar la proteína de interés. La estructura química de la etiqueta T7 se indica aquí.


Archivos del blog

Aquí está Craig Venter anunciando la autorreplicación exitosa de una célula con un genoma completamente sintético:

Esta es una de las noticias más importantes del año y el tiempo dirá cuáles son sus implicaciones. Se ha cubierto ampliamente en los medios de comunicación y seguramente será parte de las discusiones sobre ética escolar en los próximos años. El artículo completo de Science está en línea aquí.

Busque historias y recursos de noticias que lo ayuden a responder estas preguntas:

1. ¿De qué manera es este el primer organismo sintético?

2. ¿Cuáles fueron los criterios de éxito para este organismo?

3. ¿Qué mecanismos de seguridad se implementaron en caso de que la bacteria se generalizara?

4. ¿Cuáles son algunas de las posibles aplicaciones de esta nueva tecnología?

5. ¿Cuáles son algunas de las implicaciones éticas de la biología sintética? Identificar a las partes interesadas en el debate y esbozar su punto de vista.

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Como esto:


PSF-CMV-PURO-COOH-FXA-T7 - C-TERMINAL T7 TAG PLÁSMIDO DE MAMÍFEROS

Este plásmido está diseñado para expresar proteínas marcadas en células de mamíferos mediante transfección transitoria o creando líneas celulares estables. Contiene un casete de expresión de resistencia a puromicina que utiliza el promotor de ubiquitina humano para impulsar la expresión y permitir la selección de células que contienen el plásmido.

Acerca de la etiqueta peptídica:Este plásmido contiene una etiqueta de epítopo de T7 c-terminal que puede fusionarse con un gen de interés para permitir la detección y / o purificación de proteínas. La secuencia de la etiqueta es: MASMTGGQQMG.

Acerca de la etiqueta de escote:Este plásmido también codifica un sitio de escisión de proteasa que está diseñado para colocarse entre su gen de interés y la etiqueta para permitir la eliminación de la etiqueta después de la purificación o el aislamiento de proteínas. Este plásmido contiene una etiqueta de escisión de FXa. La secuencia de proteínas de la etiqueta de escisión es: IEGR. Se escinde después del residuo de Arg, pero también se puede escindir con menos frecuencia en sitios básicos secundarios. Su sitio de escisión secundaria más común se encuentra entre los residuos Gly y Arg, aunque la frecuencia de estos eventos es específica de la proteína.

Nivel de expresión del promotor: Este plásmido contiene el promotor CMV de mamífero para impulsar la expresión génica. Hemos probado todos nuestros promotores de mamíferos en una variedad de tipos de células y el CMV es constantemente el más fuerte de los que hemos estudiado. Sin embargo, hay muchos informes del promotor de CMV que demuestran el silenciamiento por metilación en cultivos a largo plazo. Por esta razón, disponemos de una gama de otros promotores que son compatibles con este plásmido y están disponibles bajo pedido.

Secuencia

Seleccione el tipo de archivo que necesita. Como referencia, la mayoría de los programas de clonación importarán un archivo .gb (Genbank) y mostrarán todas las características de los plásmidos automáticamente cuando se descarguen e importen.


La nueva colección de animales de la biología sintética

Las nuevas tecnologías podrían algún día rediseñar potencialmente las especies en la naturaleza.

En el verano de 2009, un equipo de estudiantes de la Universidad de Cambridge construyó siete cepas de la bacteria. Escherichia coli, uno en cada color del arco iris. Los pigmentos carotenoides rojos y anaranjados se produjeron mediante la inserción de genes de patógenos vegetales. Pantoea ananatis un grupo de genes de Chromobacterium violaceum también se modificaron para producir verde y morado. Las creaciones en tecnicolor de los estudiantes, denominadas "E. chromi ”en referencia al nombre científico de los organismos, ganó el gran premio del equipo de Cambridge en el concurso internacional de máquinas de ingeniería genética (iGEM) de ese año, en el que estudiantes de secundaria y universitarios diseñan biología.

Los objetivos de los estudiantes no eran meramente cromáticos. En cambio, estaban construyendo piezas para máquinas biológicas. Diseñaron los genes en formas estandarizadas llamadas BioBricks: fragmentos de ADN que, como los Legos genéticos, están diseñados para mezclarse y combinarse a voluntad. Varios miles de estos BioBricks, que cumplen diversas funciones, ya se encuentran en el Registro de Partes Biológicas Estándar del MIT. Algunos BioBricks detectan sustancias químicas como el arsénico, otras actúan como "sintonizadores" que determinan el nivel de umbral de entrada de sustancias químicas necesario para activar un determinado gen. Se pensaba que, al combinar los nuevos genes productores de color con las partes existentes, se podrían construir fácilmente biosensores que, en presencia de toxinas ambientales, produzcan resultados visibles a simple vista.

"MI. chromi ”tocó la fibra sensible de los diseñadores Alexandra Daisy Ginsberg, G ’06, y James King, quienes comenzaron una colaboración con el equipo de iGEM. En un video corto que fue nombrado mejor documental en el festival de cine de biología sintética Bio: Fiction en 2011, Ginsberg y King imaginaron futuros posibles para el color vivo. Pronto, sugirieron, los científicos podrían buscar en el mundo natural nuevos pigmentos biológicos y los genes responsables, revolucionando la producción de tintes. "MI. chromi ”en el yogur probiótico podría monitorear la enfermedad humana mientras viajan a través del intestino, los microbios en la atmósfera pueden cambiar de color para indicar la calidad del aire.

"Creo que es un término nuevo para la mayoría del público, Biología sintética", Reflexionó el presentador de National Public Radio Viernes de ciencia en el otoño de 2009 cuando entrevistó al equipo de Cambridge. "Pero supongo que vamos a escuchar mucho más de eso".

Cómo construir una máquina biológica

Armados con nuevas y poderosas herramientas genéticas y una inclinación por los retoques, los biólogos sintéticos han construido una nueva colección de animales. Fotográfico “E. coliroid ”se oscurecen en respuesta a la luz. Las bacterias sensoras registran la presencia de una sustancia química en el intestino de un ratón activando ciertos genes. Hay cepas de E. coli que cuentan las señales de entrada y otras que realizan operaciones lógicas: pasos hacia las computadoras biológicas. Otras cepas huelen a gaulteria y plátanos en lugar de a intestino humano. En 2005, investigadores festivos "escribieron" el primer verso del poema navideño de Viktor Rydberg "Tomten" en el genoma de otro E. coli La cepa, utilizando tripletes de nucleótidos de ADN para representar cada letra, la bacteria resultante, escribieron, fue "el primer ejemplo de un organismo que 'recita' poesía".

En la medida en que un tema común une a estas diversas creaciones, es la transformación de la biología en una disciplina de ingeniería. La ingeniería genética tradicional equivalía más o menos a cortar y pegar biológicamente: los científicos podían, por ejemplo, transferir un gen de tolerancia al frío de un pez del Ártico a un tomate. La biología sintética apunta a una reorganización más radical. Sus organismos están construidos para ser máquinas biológicas, con ADN y proteínas en sustitución de componentes de circuitos o líneas de código informático. En combinación, las partes biológicas realizan funciones desconocidas para la naturaleza: procesar señales, producir nuevas sustancias químicas, almacenar información.

"Me gusta decir que el carbono biológico es el silicio de este siglo", dice Pamela A. Silver, profesora Adams de bioquímica y biología de sistemas en la Facultad de Medicina de Harvard (HMS, consulte "Biología en este siglo", septiembre-octubre de 2011, página 72 ). Así como las computadoras revolucionaron los últimos cien años, dice, la biología está preparada para transformar el próximo. "La construcción de máquinas biológicas y computadoras biológicas, todo eso pronto debería convertirse en una realidad".

Para cierta mente, una célula ya se parece a una máquina diminuta y compleja. Toma sustancias químicas del medio ambiente y realiza reacciones para construir nuevas partes biológicas, monitorea las señales y enciende y apaga los genes en respuesta. Las células se han comparado con computadoras, con fábricas, con autómatas. Para un biólogo sintético con sistemas tan complejos ya a la mano, la tarea es identificar y manipular las partes apropiadas. "Muchos de los componentes biomoleculares no los estamos construyendo desde cero", dice James J. Collins, profesor distinguido Warren en la Universidad de Boston y miembro fundamental del cuerpo docente fundador del Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de Harvard. "Tomamos sistemas nativos y luego los modificamos".

Comprender y manipular esta compleja maquinaria es un trabajo duro. “Pienso en ello como si una inteligencia extraterrestre nos hubiera arrojado toda su propiedad intelectual sin documentación”, dice George Church, profesor de genética en Winthrop en HMS (consulte “El ADN como datos”, enero-febrero de 2004, página 44). No existe un equivalente biológico directo de un capacitor o el comando de eliminación, y los biólogos sintéticos deben recombinar de manera creativa las partes biológicas existentes para construir nuevas funciones.

Tomemos, por ejemplo, el interruptor de palanca, uno de los componentes de circuito más simples. Un ejemplo no biológico sería un interruptor de luz: se puede cambiar entre dos estados discretos, encendido o apagado, sin nada intermedio. En un sentido abstracto, el interruptor de palanca equivale a una especie de memoria, con sus dos estados equivalentes a 0 y 1. Tal biestabilidad tiene algunos análogos en la naturaleza. Las trampas para moscas de Venus, por ejemplo, tienen estructuras que alternan entre abiertas y cerradas (ver “Hojas que almuerzan”, mayo-junio de 2005, página 14). Las señales específicas indican a las células si deben permanecer inactivas o dividirse. Algunos virus también alternan entre dos estados distintos de inactividad o infección activa.

Cuando el laboratorio de Collins construyó un bacteriano interruptor de palanca, una de las primeras piezas del circuito biológico, lo hicieron a partir de dos genes. Cada uno codificaba una proteína represora para el gen opuesto, una vez que se activaba un gen, se desactivaba el otro. El interruptor podría activarse dándole a la célula una señal química específica, deshabilitando la proteína represora activa y permitiendo que la otra se apodere. Con el segundo gen ahora encendido, apagando el primero, el interruptor permanecería encendido mucho después de que la señal hubiera desaparecido. "Como una unidad de memoria celular", escribió Collins cuando su equipo publicó su diseño en 2000, "la palanca constituye la base de los 'applets genéticos': circuitos genéticos sintéticos, programables y autónomos para el control de la función celular".

Los applets genéticos (quizás más acertadamente, las aplicaciones actuales) son uno de los objetivos definitorios de la biología sintética. Unos 40 años después de que los científicos comenzaran a aprender a reorganizar el ADN, la ingeniería genética sigue siendo una industria artesanal. En una artesanía casi artesanal que consume mucho tiempo, los investigadores modifican organismos ad hoc para adaptarse a sus necesidades particulares. La biología sintética nació del deseo de un control mayor y más versátil, dice Silver, quien participó en las primeras reuniones del Grupo de Trabajo de Biología Sintética en el MIT. "La pregunta que forma el núcleo de la biología sintética es, '¿Por qué la biología no puede ser más fácil y más predecible de diseñar?'"

De hecho, para los biólogos sintéticos no es suficiente tener interruptores genéticos y máquinas biológicas cuidadosamente construidos. “En este momento, la gente, especialmente los estudiantes de posgrado, simplemente dedica una cantidad excesiva de tiempo a fabricar ADN y a descubrir cómo unir el ADN”, dice Jeffrey Way, científico senior del personal del Instituto Wyss, que está casado con Silver. "Lleva mucho tiempo".

Al principio, dice, la biología sintética se inspiró en la industria de las computadoras, donde los primeros estándares comunes para los chips de computadora permitieron combinar múltiples circuitos. Una de las aspiraciones clave del campo es la modularidad: la capacidad de mezclar y combinar partes genéticas. En un artículo en Científico americano En 2006, Church, Collins y varios otros investigadores describieron los principios de lo que llamaron una “fábrica biológica”, un conjunto de estándares y métodos para hacer que los circuitos genéticos sean más fáciles de construir y recombinar. "Parte de la visión era que se debería poder abstraer parte de cómo funciona la biología y no tener que preocuparse por los detalles", dice Way, quien trabajó en el Instituto de Ciencias Moleculares, un laboratorio de investigación independiente en California, donde muchos de Los principios de la biología sintética fueron concebidos inicialmente. "Un programador de computadoras nunca se preocupa por cómo funciona un chip de computadora; en realidad, no necesita saber cómo la máquina ejecuta los comandos".

Sin embargo, los investigadores reconocen que el progreso hacia tal abstracción ha sido desigual. "¿Qué necesita saber para utilizar una pieza?" pregunta Silver, que es miembro de la junta directiva de la organización sin fines de lucro BioBricks Foundation, que promueve la visión de la biofabricación. "¿Qué constituye una caracterización?" El camino va más allá, cuestionando la analogía entre circuitos y seres vivos. “En biología, la diferencia clave es que el equivalente a los chips de computadora (piezas de ADN, proteínas, etc.) son todos hechos por la naturaleza y no por diseño humano”, dice. “Pueden parecer modulares, pero es una pregunta abierta si esa es la forma en que es la biología o si es un artefacto del entendimiento humano”.

Por ahora, dice Way, los biólogos sintéticos todavía deben ceñirse a los contornos de la naturaleza, estudiando de cerca los sistemas biológicos para identificar y hacer uso de propiedades especiales. Por ejemplo, en un proyecto publicado esta primavera, él y Silver colaboraron con Collins para diseñar "reporteros" bacterianos. Una vez alimentadas a los ratones, las bacterias se instalan en el intestino, donde detectan la presencia de la anhidrotetraciclina, una molécula similar a un antibiótico, y la registran activando un interruptor genético. Silver y Way, ambos formados como biólogos moleculares, hicieron uso de un cambio natural bien estudiado del bacteriófago lambda (un virus que infecta a las bacterias) que tiene dos propiedades convenientes. Es extraordinariamente estable, mantiene su estado a través de múltiples generaciones de bacterias e impone una carga insignificante sobre el huésped bacteriano, ayudándolo a sobrevivir en el intestino del ratón. Silver y Way estuvieron presentes en Harvard en la década de 1980 cuando se realizó un trabajo clave sobre el fago lambda, lo que les dio una profunda familiaridad con el interruptor genético del virus. "Diseño racional es realmente factible, siempre que sepa lo suficiente sobre el sistema ”, dice Way. "Conocer todas las cosas extravagantes sobre la biología de un organismo fue fundamental para que todo funcionara".

La biología sintética rehace la naturaleza

A veces la vida es demasiado difícil de entender. Tal fue la conclusión del actual profesor de Stanford Drew Endy, entonces en el MIT, después de varios años intentando modelar computacionalmente el bacteriófago T7. El virus es uno de los sistemas biológicos más simples y mejor estudiados, y después de 60 años de investigación, pensó Endy, los científicos deberían tener T7 hasta una T. Pero esto resultó estar lejos de ser así: sus simulaciones, que buscaban predecir cómo las mutaciones afectaría el desarrollo viral, simplemente no coincidió con los resultados experimentales.

Ante la complejidad biológica, Endy decidió deshacerse de ella. En 2005, él y sus colaboradores publicaron un informe sobre un virus al que llamaron "T7.1", una versión de T7 que diseñaron para que fuera fácil de entender y manipular. La evolución puede haber sido responsable de la diversidad de funciones biológicas, pero para un científico humano, esas funciones podrían parecer bizantinas e imposibles de comprender, y mucho menos de ingeniar. T7, por ejemplo, tenía múltiples genes superpuestos, lo que significa que las mutaciones en un gen podrían afectar a otros de manera impredecible. El equipo de Endy construyó "T7.1", separando los genes del virus en partes discretas, lo que es mejor para el diseño racional. "T7.1" sobrevivió a la reordenación masiva del genoma, aunque apenas. En comparación con T7, su aptitud se redujo considerablemente.

"'T7.1' es un ejemplo perfecto de lo que hace que la biología sintética sea diferente de otras disciplinas posgenómicas en las ciencias de la vida", dice Sophia Roosth, profesora asistente de historia de la ciencia. Como estudiante de posgrado en el MIT, Roosth realizó un estudio etnográfico de biología sintética y realizó un extenso trabajo de campo en el laboratorio de Endy. En su próximo libro, Sintético: cómo se hizo la vida, utiliza proyectos como "T7.1" como lentes para examinar los conceptos de naturaleza y diseño que motivan el trabajo de los biólogos sintéticos. “En lugar de intentar reconstruir el modelo, el equipo de Endy quería reconstruir el fago para que fuera más comprensible. Ese es un síntoma del movimiento hacia la fabricación en las ciencias de la vida: la comprensibilidad se convierte en un principio de diseño y la fabricación se convierte en una forma de investigación. El conocimiento sobre cómo funciona la vida se fomenta no experimentando con la vida, sino creando nuevas formas de ella ".

De hecho, la misión de la biología sintética de hacer que la biología sea más fácil de diseñar ha implicado ocasionalmente rehacer. Los comportamientos celulares inesperados aún pueden complicar los planes mejor diseñados. El diseño básico del interruptor de palanca, por ejemplo, siguió un modelo computacional que el laboratorio de Collins había desarrollado antes de comenzar los experimentos, pero sin embargo, tomó varios meses de prueba y error ajustar el interruptor de modo que un gen no dominara al otro. La construcción de un circuito biológico sigue siendo un esfuerzo mucho más incierto que la construcción de su contraparte electrónica. “El ambiente dentro de las células es muy ruidoso”, dice Collins. “Hay muchas fluctuaciones que dificultan tener circuitos genéticos que se comporten de manera confiable. Y debido a que las células son densas y muy complejas con su maquinaria host en funcionamiento, los circuitos que estamos construyendo interactúan con el host de formas que no comprendemos completamente ".

Una rama de la biología sintética tiene como objetivo disminuir esta imprevisibilidad mediante la creación de organismos “chasis” mínimos, diseñados para servir como fondos neutrales y bien caracterizados sobre los cuales se pueden construir circuitos genéticos. Por ejemplo, el Instituto J. Craig Venter (JCVI), fundado y dirigido por el pionero homónimo de secuenciación del genoma, ha eliminado un gen a la vez de Mycoplasma genitalium, la bacteria con el genoma celular más pequeño conocido, con el fin de identificar el conjunto más pequeño de genes necesarios para llevar a cabo funciones básicas y autosuficientes del metabolismo y la replicación celular. De los 482 genes que codifican proteínas del organismo (los seres humanos tienen un estimado de 20.000), el equipo de Venter estimó que de 265 a 350 son necesarios para la supervivencia. Planean sintetizar un genoma alterado que consiste en este conjunto mínimo y trasplantarlo a Micoplasma células cuyos propios genomas han sido eliminados, formando un organismo al que llaman “Mycoplasma laboratorium.

Otros investigadores se están centrando en la construcción de cromosomas de chasis.“Imagínese si tuviera un fragmento de ADN y supiera todo sobre él, no hay misterios”, dice Silver. Su laboratorio está trabajando con el Instituto Venter para diseñar un cromosoma artificial de mamífero, en el que los complejos procesos de regulación de genes de mamíferos se caracterizarían y comprenderían más completamente. A principios de este año, investigadores de la Universidad de Nueva York y Johns Hopkins anunciaron la creación de un cromosoma de levadura artificial, con casi uno de cada seis pares de bases del andamio genético modificado para facilitar la inserción y eliminación de genes. El cromosoma artificial es el primer paso en la construcción de levadura sintética, cuyo genoma completo se rediseña de manera similar.

Esta remodelación masiva del genoma también se presta a posibilidades más radicales. El laboratorio de Church, por ejemplo, está trabajando para alterar el código genético. Todos los seres vivos tienen una maquinaria celular que interpreta las instrucciones del ADN, mapeando secuencias de tres nucleótidos llamadas codones en los aminoácidos que forman las proteínas. En 2011, el grupo de Church informó que había rediseñado masivamente el E. coli genoma, reemplazando cada instancia del codón "TAG" con "TAA" (ver "Vida: la versión editada", noviembre-diciembre de 2011, página 14). Ambos son codones de parada, lo que indica que una serie de instrucciones genéticas está completa, pero cada codón se interpreta utilizando una maquinaria celular diferente. Con el codón "TAG" desaparecido, los investigadores eliminaron la maquinaria que manejaba su traducción. En su ausencia, si un virus invadiera el organismo modificado, denominado “rE. coli ”, los codones virales“ TAG ”serían ignorados, condenando su intento de infección. Usando técnicas como las que construyeron “rE. coli ”, dice Church, algún día podría ser posible diseñar humanos para que estén igualmente libres de virus.

"Hoy estamos en el punto de la ciencia y la tecnología en el que los humanos podemos duplicar y luego mejorar lo que la naturaleza ya ha logrado", escribió Church en la introducción del libro de divulgación científica que fue coautor. Regenesis: cómo la biología sintética reinventará la naturaleza y nosotros mismos. “Nosotros también podemos convertir lo inorgánico en orgánico. Nosotros también podemos leer e interpretar genomas, así como modificarlos. Y nosotros también podemos crear diversidad genética, añadiéndola a la considerable suma que la naturaleza ya ha producido ”.

Vida con correa

Proyectos de tal alcance hacen que muchos observadores se detengan. Un mosaico de frescos religiosos, reordenado y recombinado, adorna la portada de Church's Regenesis, colocando al frente y al centro el lenguaje y las imágenes que frecuentemente han dominado el discurso público sobre el campo. En su libro, Roosth describe cómo las nociones de "diseño", importadas a la biología sintética desde la ingeniería, a veces conservan resonancias religiosas, especialmente en relación con términos como "creación". En 2008, Radiolab publicó un segmento sobre biología sintética titulado "¿Diseño inteligente?"

Uno de los actos más inquietantes de recreación biológica a gran escala se produjo en 2002, cuando los investigadores pudieron producir poliovirus infecciosos vivos mediante la síntesis de su genoma. En 2005, los investigadores de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades utilizaron métodos similares para reconstruir el virus responsable de la pandemia de gripe española de 1918. En 2006, utilizando direcciones e identidades privadas, los reporteros de El guardián Pudimos ordenar por correo un pequeño segmento del genoma de la viruela, aunque se habría requerido equipo y experiencia adicionales para ensamblar el genoma completo y dar vida al virus.

De hecho, el extremo lógico de hacer que la biología sea más fácil de diseñar es que cualquiera podría hacerlo. En un ensayo de 2007, "Our Biotech Future", publicado en el Revisión de libros de Nueva York, el físico Freeman Dyson hizo una analogía con la industria de la computación, prediciendo un mundo en el que la ingeniería genética era literalmente un juego de niños. "El último paso en la domesticación de la biotecnología serán los juegos biotecnológicos", escribió, "diseñados como juegos de computadora para niños hasta la edad de jardín de infantes, pero que se juegan con huevos y semillas reales en lugar de imágenes en una pantalla".

"Hay distintos desafíos que surgen de la biología sintética", dice Kenneth A. Oye, Ph.D. '83, profesor de ciencias políticas en el MIT. "La modularidad y la reutilización reducen potencialmente las barreras a la difusión, y el potencial de más organismos artificiales hace que los enfoques regulatorios sean obsoletos que se basan en listas estandarizadas de organismos salvajes peligrosos".

Oye trabaja con biólogos sintéticos para estudiar cuestiones de seguridad planteadas por las nuevas tecnologías como parte del Centro de Investigación en Ingeniería de Biología Sintética, o Synberc, financiado por la National Science Foundation (NSF). "Creo que los ingenieros y científicos deben aceptar la responsabilidad de abordar o comprometerse con los riesgos asociados con lo que están creando", dice. "Por 'responsable', lo que quiero decir es tener un interés activo en identificar y hacer investigación para identificar problemas potenciales, y no simplemente responder o reaccionar a los problemas que otros plantean".

Las preocupaciones gemelas de la seguridad y la protección, esta última centrada en prevenir el uso malévolo, han llevado a los biólogos sintéticos y a los formuladores de políticas a examinar de cerca las oportunidades y desafíos del nuevo campo. “Creo que algo que los científicos y el público no especializado olvidan es cuánta ingeniería de seguridad se dedica a un campo maduro”, dice Church. “Miras un coche y no hace falta mucha reflexión para recordar que tienen cinturones de seguridad, bolsas de aire, guardabarros aplastables. También hay otras cosas que no ves tanto, como licencias, controles de velocidad y alcoholímetros. Es más difícil hacerlo en un campo nuevo porque ni siquiera saber lo que no sabes y eso asusta a la gente ".

El laboratorio de Church trabaja activamente tanto en la construcción como en la prueba de los equivalentes biológicos de los cinturones de seguridad, que podrían diseñarse en futuros organismos de chasis. "Estamos construyendo organismos genéticamente modificados que no pueden escapar y no pueden influir en el ecosistema porque están genéticamente y metabólicamente aislados", dice. "Tienen una correa muy corta". Con un código genético alterado, argumenta, un organismo sintético no podría dar ni recibir ADN, ya que procesaría las instrucciones genéticas de manera diferente a sus parientes silvestres. Su laboratorio genéticamente recodificado "rE. coli ”ya no puede vivir más de unos minutos sin un compuesto económico que solo está disponible en el laboratorio, dice Church. Además, "estamos construyendo organismos recodificados de forma más radical que, literalmente, no pueden utilizar el ADN natural de su entorno, ya que debe ser procesado por la maquinaria celular de la que carecen estos organismos". El laboratorio de Collins ha ideado otra solución, el desarrollo de un "interruptor de muerte" genético que responde a ciertas sustancias químicas produciendo proteínas tóxicas que matan la célula.

Se están construyendo otras salvaguardias para la biología sintética y muchas de ellas son, igualmente, autoimpuestas. Después El guardián expuso la facilidad de solicitar ADN de patógenos, las empresas de síntesis de ADN crearon voluntariamente consorcios de colaboración para analizar los pedidos en bases de datos de patógenos y toxinas conocidos y señalar comportamientos sospechosos. Todos los competidores de la competencia de bioingeniería iGEM deben presentar sus proyectos para que los revise un comité de seguridad, que trabaja con equipos para modificar los proyectos que provocan preocupación, y varias agencias federales también han patrocinado programas educativos para sensibilizar a los competidores sobre los problemas de bioseguridad.

De hecho, dice Oye, la biología sintética está en camino de desarrollar lo que él llama una "cultura de la responsabilidad". Su objetivo es aumentar en lugar de suplantar las medidas reguladoras tradicionales, dice, y puede influir tanto en la naturaleza de la regulación como en la forma en que los investigadores piensan sobre los proyectos que persiguen. Por ejemplo, cuando Silver y Way dirigieron un equipo que diseñó cianobacterias para producir azúcares de manera más eficiente a través de la fotosíntesis, su equipo y el grupo de Oye llevaron a cabo un ejercicio conjunto de evaluación de riesgos. Ecologistas, microbiólogos y reguladores de la Agencia de Protección Ambiental se reunieron para discutir las implicaciones ambientales de la liberación de los organismos modificados, prestando atención a la competencia con bacterias silvestres, por ejemplo, así como a la posible transferencia y evolución de genes.

“Por 'cultura de la responsabilidad', lo que quiero decir es la inculcación de un conjunto de valores y costumbres”, dice Oye. “A largo plazo, marca una gran diferencia. Marca la diferencia en el tipo de proyectos que la gente decide hacer. Hace una diferencia en términos de su disposición a trabajar con otros para desalentar las malas actividades y apoyarse fuertemente en el lado de la apertura y la conducta responsable ”.

Imaginando el futuro

Las cuestiones de responsabilidad científica ocuparon un lugar destacado en la década de 1970, cuando surgieron preocupaciones similares cuando los científicos comenzaron a aprender a manipular los genes de los organismos. En 1974, los investigadores que trabajaban en ingeniería genética emprendieron una moratoria voluntaria para evaluar los impactos de su trabajo, una moratoria que terminó con la convocatoria de la histórica Conferencia Asilomar de 1975 sobre ADN recombinante. Allí, un grupo de biólogos moleculares líderes discutió las salvaguardas para el nuevo campo, designando vías de investigación que no deberían perseguirse y decidiéndose por una estrategia de contención autoimpuesta para reducir el riesgo de que los organismos modificados escaparan del laboratorio.

Últimamente se han hecho pedidos de un segundo Asilomar para abordar las nuevas posibilidades de la biología sintética, pero para algunos observadores, la conferencia frecuentemente invocada no satisface las necesidades actuales. En un ensayo de la próxima colección. Paisajes oníricos de la modernidad: imaginarios sociotécnicos y la fabricación del poder, que investiga cómo los estados conceptualizan de diversas maneras los roles de la ciencia y la tecnología, el profesor asistente de la Universidad Estatal de Arizona J. Benjamin Hurlbut, Ph.D. '10, examina la influencia de lo que él denomina "Asilomar-in-memory", documentando cómo la conferencia, controvertida en su momento, ha llegado a ser considerada como un ejemplo de responsabilidad y moderación científicas. “Asilomar es recordado como un éxito porque, en retrospectiva, se mantuvieron importantes formas de autonomía científica, y de ahí surgió una poderosa biología molecular y biotecnología, con algunas buenas consecuencias sociales y económicas”, dice. "Pero también hubo consecuencias sociales y políticas en las que nos hemos puesto al día, porque esas preguntas se dejaron de lado intencionalmente en ese momento".

Los asistentes de Asilomar eran casi en su totalidad biólogos moleculares y, como resultado, el alcance del debate de la conferencia se redujo considerablemente, argumenta la profesora de ciencia y tecnología de Pforzheimer Sheila Jasanoff, asesora graduada de Hurlbut y editora de Paisajes oníricos de la modernidad—En su libro de 2005 Diseños sobre la naturaleza: ciencia y democracia en Europa y Estados Unidos. Asilomar puso entre corchetes a propósito las cuestiones de ética y bioterrorismo, dice. En cuestiones legales, los asistentes a la conferencia se centraron principalmente en la regulación de productos y la evaluación de riesgos, dejando de lado cuestiones más generales sobre los procesos mediante los cuales se crearon los organismos.

De manera más problemática, argumenta Hurlbut, Asilomar asumió y reforzó la mentalidad de que los científicos, en virtud de su conocimiento especializado, estaban mejor posicionados para definir qué cuestiones surgidas de la ingeniería genética merecían preocupación, una mentalidad que perdura en la actualidad. “Lo que está en juego es cómo hacemos preguntas sobre lo que se debe hacer”, dice. “¿Qué tipo de futuros tecnológicos queremos? ¿En qué tipo de mundo queremos vivir y cómo pueden y deben contribuir los proyectos de ciencia y tecnología? Ese es un problema muy difícil, pero no es un problema de quién sabe mejor en el científico sentido de quién tiene el mejor conocimiento. Es una cuestión de quién sabe mejor en un democrático sentido, de cómo hacemos preguntas colectivamente sobre lo que es bueno para nosotros ".

Jasanoff advierte que, en comparación con iniciativas de investigación anteriores financiadas con fondos federales como el Proyecto Genoma Humano y la Iniciativa Nacional de Nanotecnología, Synberc tiene muchas menos vías de financiación disponibles para que investigadores no afiliados estudien las implicaciones legales, sociales y éticas de la biología sintética. Los investigadores principales principales del consorcio (13 actualmente, incluidos Silver y Church) se eligen entre las cinco universidades asociadas del programa: las Universidades de California en Berkeley y San Francisco, así como Stanford, Harvard y MIT, y nominan y votan por aprobar a otros investigadores afiliados Oye es el único investigador principal que no es ingeniero.

“En este país, parece que estamos estructurando nuestra supervisión para que nos arraiguemos cada vez más, integrados en las ciencias y tecnologías que estamos tratando de supervisar”, dice Jasanoff. "Hasta cierto punto, se está volviendo a imponer el viejo modelo de autorregulación que surgió de la era Asilomar en biología molecular, con aún menos espacio para la supervisión pública". En un simposio de 2009 en Washington, D.C., titulado "Oportunidades y desafíos en el campo emergente de la biología sintética", planteó varias preguntas marco para el campo en desarrollo. “¿Cómo le damos sentido a la innovación? Quién es responsable tanto de las buenas como de las malas consecuencias ”, preguntó. "¿Quién puede imaginar el futuro?"

Una respuesta directa vino de la activista Vandana Shiva, como se cita en la declaración "Principios para la supervisión de la biología sintética", publicada por el grupo ambientalista Amigos de la Tierra. "La biología sintética, la próxima ola de ingeniería genética", escribió, "permite que las empresas de semillas, pesticidas y aceite rediseñen la vida para que puedan ganar más dinero con ella". De hecho, en el punto de la propiedad, la biología sintética evidencia profundas divisiones. Algunas ramas de la biología sintética se han alineado estrechamente con los ideales del código abierto. La Fundación BioBricks tiene la misión de hacer que sus partes biológicas estén disponibles de forma gratuita, y alberga OpenWetWare, la versión de campo de Wikipedia, completa con protocolos experimentales y cuadernos de laboratorio, a veces con detalles exhaustivos. Por el contrario, el Instituto Venter ha solicitado una patente sobre el genoma mínimo de “Mycoplasma laboratorium”, lo que provocó desafíos legales en respuesta.

Una segunda respuesta proviene de algunos de los partidarios más inverosímiles del campo. La biología Do-It-Yourself (DIYbio) o comunidad de "biohackers", en un giro en la metáfora de la industria informática favorita del campo, se diseña a sí misma según la subcultura de la programación hacker, con el objetivo de transformar la ingeniería genética en una actividad que los aficionados pueden hacer en sus casas o garajes. En una lista de correo electrónico abierta con líneas de asunto como "¿Sistema de electroforesis en gel de bajo costo?" y "Necesito un documento, por favor", sus profesionales intercambian consejos y trucos de ingeniería genética. Los hackerspaces comunales organizan talleres para enseñar técnicas básicas de laboratorio. Si bien algunos biohackers son nuevos en el laboratorio, muchos tienen una formación significativa e incluso títulos avanzados en biología. "En muchos sentidos, creo que DIYbio se trata de dónde investigas, más que de quién eres", dice Roosth, quien observó los inicios del movimiento en Cambridge en 2008. “Al hacer investigación biológica en casa, los biohackers están criticando la forma en que se ha hecho la biotecnología en los últimos 30 años: el movimiento hacia la gran ciencia, hacia el patentamiento de partes biológicas”.

De hecho, en un ensayo titulado “A Biopunk Manifesto”, la biohacker Meredith Patterson defendió la necesidad de la ciencia ciudadana (ver “Popular Science”, enero-febrero de 2014, página 54). "Los biopunks deploran las restricciones a la investigación independiente, porque el derecho a llegar de forma independiente a una comprensión del mundo que nos rodea es un derecho humano fundamental", escribió. "Ven, investiguemos juntos".

Prueba de Rorschach de biología sintética

Desde los inicios de la biología sintética, sus practicantes nunca han tenido reparos en compartir sus nobles objetivos. Aprovechar la biología podría significar nuevos combustibles, plásticos y alimentos, moléculas de fármacos más diversas y vacunas desarrolladas más rápidamente. Los métodos más precisos para la edición del genoma significan que la terapia génica, después de los primeros contratiempos, se está desarrollando rápidamente como una opción para tratar la enfermedad. Es posible que en poco tiempo sea posible realizar una reingeniería de especies que se han extinguido. “La biología sintética ha hecho que las personas sientan que pueden soñar con cosas y asumir riesgos”, dice Silver. Ella cita uno de los lemas del campo: "Ingeniería de la biología para el bien del mundo".

No es de extrañar, entonces, que la biología sintética haya ejercido una influencia tan enorme en la imaginación del público. La National Science Foundation ha patrocinado una iniciativa llamada "Estética sintética" que une a científicos investigadores con diseñadores. Sus productos iniciales se publicaron esta primavera en un libro de mesa de café del mismo nombre. El primer festival de cine de biología sintética, en 2011, atrajo a 130 participantes, y un segundo se llevará a cabo en Viena este octubre. Este año, iGEM atrajo a 245 equipos universitarios y 54 de escuelas secundarias. Se estima que 15,000 estudiantes, instructores y asesores han participado en la competencia desde sus inicios como un curso de enero en el MIT en 2003. El año pasado, en una campaña financiada por la multitud, un El laboratorio comunitario en San Francisco llamado BioCurious recaudó casi medio millón de dólares para construir plantas que están programadas para llegar al mercado este otoño.

Este fervor ha llevado a algunos críticos a descartar el campo como nada más que una exageración. "Al igual que en otros campos nuevos y de moda, la biología sintética se ha definido de manera tan vaga que puede parecerle todo a todas las personas", señaló un artículo de 2009 en Nature News. Como bromeó Kristala Prather, profesora asociada de ingeniería química del MIT, en el artículo: "Si le pides a cinco personas que definan la biología sintética, obtendrás seis respuestas".

Quizás en su esencia, la biología sintética es un espacio sobre el que tanto científicos como no científicos proyectan sus propias imaginaciones. Para los biólogos, significa repensar las metáforas. Si una célula es una computadora y los genes son circuitos, ¿cuál será la naturaleza de la nueva colección de animales? En otras partes de la conciencia pública, la biología sintética se ha encontrado en el centro de muchos debates sociales sobre el papel apropiado de la ciencia y la tecnología, destacando y a menudo socavando la forma establecida en la que se ha hecho la biología, exigiendo una respuesta a la pregunta de qué es Siguiente.

Cualquiera que sea la intención original de los biólogos sintéticos, el campo se ha convertido en una prueba científica de Rorschach, compuesta por partes iguales de novedad científica y la suma de las esperanzas y ansiedades colectivas de la sociedad. Como dice Hurlbut, "la biología sintética es menos un campo o un conjunto de tecnologías que un grupo de personas con una visión".

Quizás sea apropiado que la biología sintética haya cobrado vida propia.

Actualizado el 29 de agosto de 2014: Se ha eliminado una referencia incorrecta al físico Freeman Dyson como premio Nobel. Lamentamos el error.


Marcado T7 en biología sintética - Biología

Nuestra incapacidad para predecir el comportamiento de los sistemas biológicos obstaculiza gravemente el progreso en bioingeniería y aplicaciones biomédicas.No podemos predecir el efecto de los cambios de genotipo sobre el fenotipo, ni extrapolar el comportamiento a gran escala de experimentos a pequeña escala. Las técnicas de aprendizaje automático alcanzaron recientemente un nuevo nivel de madurez y son capaces de proporcionar el poder predictivo necesario sin una comprensión mecanicista detallada. Sin embargo, requieren una gran cantidad de datos para ser entrenados. La cantidad y la calidad de los datos requeridos solo pueden producirse mediante una combinación de biología sintética y automatización, a fin de generar una gran diversidad de sistemas biológicos con alta reproducibilidad. Una inversión sostenida en la intersección de la biología sintética, el aprendizaje automático y la automatización impulsará la biología predictiva y producirá algoritmos de aprendizaje automático mejorados.

Letras
SelProm: una herramienta de selección de vectores de expresión predictiva y consultable para Escherichia coli
  • Adrian J. Jervis,
  • Pablo Carbonell,
  • Sandra Taylor,
  • Rehana Sung,
  • Mark S. Dunstan,
  • Christopher J. Robinson,
  • Rainer Breitling,
  • Eriko Takano y
  • Nigel S. Scrutton*

La creación rápida de prototipos y la optimización de la expresión génica recombinante basada en plásmidos es uno de los pasos clave en el desarrollo de sistemas bacterianos de bioingeniería. A menudo, es necesario coexpresar múltiples genes o módulos de genes y, para este fin, se han desarrollado sistemas de plásmidos inducibles compatibles. Sin embargo, los sistemas de expresión inducible no se ven favorecidos en los procesos industriales, debido a su coste prohibitivo y, por tanto, a menudo se desea la conversión a sistemas de expresión constitutivos. A continuación, presentamos un conjunto de plásmidos de expresión constitutiva para este propósito, que se compararon con genes informadores fluorescentes. Para facilitar aún más la conversión entre sistemas de expresión inducibles y constitutivos, desarrollamos SelProm, una herramienta de diseño que sirve como depósito de partes de la fuerza de expresión del plásmido y predice reglas de portabilidad entre plásmidos constitutivos e inducibles a través de la comparación de modelos y el aprendizaje automático. La herramienta SelProm está disponible gratuitamente en http://selprom.synbiochem.co.uk.

Artículos
Un sistema automatizado de selección de biomodelos (BMSS) para diseños de circuitos genéticos
  • Jing Wui Yeoh,
  • Kai Boon Ivan Ng,
  • Ai Ying Teh,
  • JingYun Zhang,
  • Wai Kit David Chee y
  • Chueh Loo Poh*

La construcción de un circuito genético funcional complejo compuesto de diferentes partes biológicas modulares para lograr el rendimiento deseado sigue siendo un desafío sin una comprensión adecuada de cómo se comporta el módulo individual. Para abordar esto, los modelos matemáticos sirven como una herramienta importante hacia una mejor interpretación al cuantificar el rendimiento del circuito genético general, proporcionar información y guiar los diseños experimentales. Dado que diferentes circuitos de genes pueden requerir exclusivamente representaciones matemáticas diferentes en forma de ecuaciones diferenciales ordinarias para capturar sus comportamientos dinámicos transitorios, un desafío recurrente en el desarrollo del modelo es la selección del modelo apropiado. Aquí, desarrollamos un sistema automatizado de selección de biomodelos (BMSS) que incluye una biblioteca de modelos preestablecidos con características intuitivas o no intuitivas derivadas de una amplia gama de perfiles de expresión. La selección de modelos se basa en los criterios de información de Akaike (AIC). Probamos la plataforma automatizada utilizando datos de caracterización de sistemas inducibles de uso rutinario, sistemas de expresión constitutiva y varios sistemas de puertas lógicas diferentes (puertas NOT, AND y OR). El BMSS logró un buen acuerdo para todos los diferentes conjuntos de datos de caracterización y logró seleccionar el modelo más apropiado en consecuencia. Para permitir el intercambio y la reproducibilidad de los modelos de diseño de circuitos genéticos, la plataforma BMSS también genera diagramas de circuitos genéticos compatibles con Synthetic Biology Open Language (SBOL) y archivos de salida de Systems Biology Markup Language (SBML). Todos los aspectos del algoritmo se programaron de manera modular para facilitar los esfuerzos de los usuarios en las extensiones o personalizaciones del modelo. En conjunto, el BMSS que se implementa en Python ayuda a los usuarios a derivar el mejor modelo matemático candidato de una manera rápida, eficiente y automatizada utilizando datos de caracterización de piezas / circuitos.

SBOL-OWL: un enfoque ontológico para la representación formal y semántica de información de biología sintética
  • Göksel Mısırlı* ,
  • Renee Taylor,
  • Ángel Goñi-Moreno,
  • James Alastair McLaughlin,
  • Chris Myers,
  • John H. Gennari,
  • Phillip Lord, y
  • Anil Wipat

La representación estándar de datos es clave para la reproducibilidad de diseños en biología sintética. El Lenguaje Abierto de Biología Sintética (SBOL) ya ha surgido como un estándar de datos para representar información sobre circuitos genéticos, y se basa en la captura de datos mediante gráficos. El lenguaje proporciona la sintaxis mediante un documento de texto libre que es accesible solo para humanos. Este artículo describe SBOL-OWL, una ontología para una definición de SBOL comprensible para la máquina. Esta ontología actúa como una capa semántica para los diseños de circuitos genéticos. Como resultado, las herramientas computacionales pueden comprender el significado de las entidades de diseño además de analizar los datos SBOL estructurados. SBOL-OWL no solo describe cómo se pueden construir circuitos genéticos computacionalmente, sino que también facilita el uso de varias herramientas de Web Semántica existentes para la biología sintética. Este documento demuestra algunas de estas características, por ejemplo, para validar diseños y verificar inconsistencias. Mediante el uso de SBOL-OWL, las consultas se pueden simplificar y volverse más intuitivas. Además, los razonadores existentes se pueden utilizar para inferir información sobre diseños de circuitos genéticos que no se pueden recuperar directamente mediante los mecanismos de consulta existentes. Esta representación ontológica del estándar SBOL proporciona una nueva perspectiva para la verificación, representación y consulta de información sobre circuitos genéticos y es importante para incorporar información de diseño compleja a través de la integración de ontologías biológicas.

Notas técnicas
PySBOL: un paquete de Python para la automatización y estandarización del diseño genético
  • Bryan A. Bartley* ,
  • Kiri Choi,
  • Meher Samineni,
  • Zach Zundel,
  • Tramy Nguyen,
  • Chris J. Myers y
  • Herbert M. Sauro

Este artículo presenta pySBOL, una biblioteca de software para el diseño asistido por computadora de sistemas biológicos sintéticos en el lenguaje de programación Python. Esta biblioteca proporciona una interfaz de programación de aplicaciones (API) orientada a objetos y fácil de usar con una barrera de entrada baja para los desarrolladores de aplicaciones de biología sintética. La biblioteca pySBOL permite la reutilización de piezas y diseños genéticos mediante el intercambio de datos estandarizados con repositorios de piezas biológicas y herramientas de software que se comunican mediante el lenguaje abierto de biología sintética (SBOL). Además, pySBOL admite la gestión de datos de los flujos de trabajo de diseño, construcción, prueba y aprendizaje para laboratorios individuales, así como para grandes equipos distribuidos de biólogos sintéticos. PySBOL también permite a los usuarios agregar datos personalizados a archivos SBOL para respaldar los requisitos de datos específicos de su investigación. Esta extensibilidad ayuda a los usuarios a integrar cadenas de herramientas de software y desarrollar flujos de trabajo para nuevas aplicaciones. Estas características y otras hacen de la biblioteca pySBOL una herramienta valiosa para respaldar las prácticas de ingeniería en biología sintética. Las instrucciones de instalación y documentación se pueden encontrar en pysbol2.readthedocs.io.

Especificación de diseños combinatorios con el lenguaje abierto de biología sintética (SBOL)
  • Nicholas Roehner* ,
  • Bryan Bartley,
  • Jacob Beal,
  • James McLaughlin,
  • Matthew Pocock,
  • Michael Zhang,
  • Zach Zundel y
  • Chris J. Myers

A medida que las mejoras en la tecnología de síntesis de ADN y los métodos de ensamblaje hacen que el ensamblaje combinatorio de construcciones genéticas sea cada vez más accesible, los métodos para representar construcciones genéticas también deben mejorar para manejar el crecimiento exponencial del espacio de diseño combinatorio. Con este fin, presentamos una extensión aceptada por la comunidad del estándar de datos SBOL que permite la codificación eficiente y flexible de diseños combinatorios. Esta extensión incluye estructuras de datos para representar diseños genéticos con componentes "variables" que se pueden implementar eligiendo uno de los muchos diseños vinculados para las partes o construcciones genéticas existentes. Demostramos el poder de representación de la extensión del diseño combinatorio SBOL a través de estudios de casos sobre el diseño de vías metabólicas y el diseño de circuitos genéticos, e informamos sobre la expansión de la herramienta de software SBOLDesigner para ayudar a los usuarios a crear y modificar diseños combinatorios en SBOL.

TASBE Flow Analytics: un paquete para el análisis de citometría de flujo calibrado
  • Jacob Beal* ,
  • Cassandra Overney,
  • Aaron Adler,
  • Fusun Yaman,
  • Lisa Tiberio y
  • Meher Samineni

La citometría de flujo es un método poderoso para la medición de precisión de alto rendimiento de la fluorescencia y el tamaño de las células. Sin embargo, el uso eficaz de esta herramienta para la cuantificación de dispositivos y circuitos de biología sintética generalmente requiere una aplicación cuidadosa de flujos de trabajo complejos de varias etapas para la calibración, el filtrado y el análisis con estadísticas adecuadas. El paquete TASBE Flow Analytics proporciona una implementación gratuita, abierta y accesible de dichos flujos de trabajo en una forma diseñada para el análisis de alto rendimiento de grandes conjuntos de datos de biología sintética. Dado un conjunto de muestras y controles experimentales, este paquete puede procesarlos para generar datos calibrados, análisis cuantitativos y comparaciones, cifras generadas automáticamente e informes detallados de depuración y diagnóstico tanto en formato legible por humanos como legible por máquina. TASBE Flow Analytics se puede utilizar a través de una sencilla interfaz de Excel interactiva y fácil de usar, como una biblioteca que admite sesiones interactivas de Matlab, Octave o Python, o como un componente integrado en flujos de trabajo automatizados.

Artículos
Un lenguaje de programación lógica para dispositivos de ácidos nucleicos computacionales

Los dispositivos computacionales de ácido nucleico muestran un gran potencial para permitir una amplia gama de aplicaciones biotecnológicas, incluidas sondas inteligentes para la investigación de biología molecular, ensamblaje in vitro de compuestos complejos, diagnóstico de enfermedades in vitro de alta precisión y, en última instancia, teranóstica computacional dentro de células vivas. Esta diversidad de aplicaciones está respaldada por una variedad de estrategias de implementación, que incluyen el desplazamiento de la cadena de ácido nucleico, la localización en sustratos y el uso de enzimas con funcionalidad polimerasa, ninasa y exonucleasa. Sin embargo, las herramientas de diseño computacional existentes no pueden dar cuenta de estas estrategias de manera unificada. Este artículo presenta un lenguaje de programación lógica que permite diseñar y analizar una amplia gama de sistemas computacionales de ácidos nucleicos. El lenguaje amplía la programación lógica estándar con una nueva teoría de ecuaciones para expresar motivos moleculares de ácidos nucleicos. Identifica automáticamente los motivos coincidentes presentes en todo el sistema, para aplicar una transformación específica expresada como una regla lógica. El lenguaje admite la definición de predicados lógicos, que proporcionan restricciones que deben cumplirse para que se aplique una regla determinada. El lenguaje es lo suficientemente expresivo para codificar la semántica de sistemas de desplazamiento de cadenas nucleicas con topologías complejas, junto con el cálculo realizado por una amplia gama de enzimas, y es fácilmente extensible a nuevas estrategias de implementación. Nuestro enfoque sienta las bases para un marco unificador para el diseño de dispositivos computacionales de ácidos nucleicos.

Un flujo de trabajo computacional para la generación automatizada de modelos de diseños genéticos
  • Göksel Misirli,
  • Tramy Nguyen,
  • James Alastair McLaughlin,
  • Prashant Vaidyanathan,
  • Timothy S. Jones,
  • Douglas Densmore,
  • Chris Myers* , y
  • Anil Wipat*

Los modelos computacionales son esenciales para diseñar sistemas biológicos predecibles y ampliar este proceso para sistemas complejos. El modelado computacional a menudo requiere conocimientos y datos de expertos para construir modelos. Claramente, la creación manual de modelos no es escalable para diseños grandes. A pesar de varios enfoques de construcción de modelos automatizados, aún no se han establecido las metodologías computacionales para unir el conocimiento en los repositorios de diseño y el proceso de creación de modelos computacionales. Este artículo describe un flujo de trabajo para la generación automática de modelos computacionales de circuitos genéticos a partir de datos almacenados en repositorios de diseño utilizando estándares existentes. Este flujo de trabajo aprovecha la herramienta de software SBOLDesigner para crear modelos estructurales que luego se enriquecen con la API del repositorio de piezas virtuales utilizando datos de Systems Biology Open Language (SBOL) extraídos del repositorio de diseño SynBioHub. A continuación, se utiliza la herramienta de software iBioSim para convertir esta descripción SBOL en un modelo computacional codificado mediante el lenguaje de marcado de biología de sistemas (SBML). Finalmente, este modelo SBML se puede simular utilizando una variedad de métodos. Este flujo de trabajo proporciona a los biólogos sintéticos herramientas fáciles de usar para crear sistemas biológicos predecibles, ocultando la complejidad de construir modelos computacionales. Este enfoque se puede incorporar en otros flujos de trabajo computacionales para la automatización del diseño.

Notas técnicas
I B io S im 3: una herramienta para el diseño de circuitos genéticos basados ​​en modelos
  • Leandro Watanabe* ,
  • Tramy Nguyen* ,
  • Michael Zhang* ,
  • Zach Zundel* ,
  • Zhen Zhang* ,
  • Curtis Madsen* ,
  • Nicholas Roehner* , y
  • Chris Myers*

La herramienta iBioSim se ha desarrollado para facilitar el diseño de circuitos genéticos mediante una estrategia de diseño basada en modelos. Este artículo ilustra las nuevas características incorporadas en la herramienta para el diseño de circuitos de ADN, análisis de diseño y síntesis de diseño, todo lo cual puede usarse en un flujo de trabajo para la construcción sistemática de nuevos circuitos genéticos.

Punto de vista
Impresión 3D para la fabricación de materiales vivos funcionales basados ​​en biopelículas
  • Srikkanth Balasubramanian,
  • Marie-Eve Aubin-Tam y
  • Anne S. Meyer*

Las biopelículas bacterianas son redes tridimensionales de células enredadas en una matriz polimérica extracelular autogenerada compuesta de proteínas, lípidos, polisacáridos y ácidos nucleicos. Las biopelículas pueden establecerse en prácticamente cualquier superficie accesible y provocar diversos impactos que van desde enfermedades infecciosas hasta la degradación de sustancias químicas tóxicas. Las biopelículas exhiben una alta rigidez mecánica y son inherentemente tolerantes a condiciones adversas, incluida la presencia de antibióticos, contaminantes, detergentes, altas temperaturas, cambios en el pH, etc. Estas características hacen que las biopelículas sean resistentes, lo que es beneficioso para aplicaciones en entornos dinámicos como la biolixiviación, la biorremediación. , producción de materiales y depuración de aguas residuales. Recientemente hemos descrito un método fácil y rentable para la impresión 3D de bacterias y hemos ampliado esta tecnología para la impresión 3D de biopelículas de Escherichia coli modificadas genéticamente. Nuestra plataforma de impresión 3D utiliza una química de alginato simple para imprimir una mezcla de bioinyector de alginato y bacterias en superficies de agar que contienen calcio, lo que da como resultado la formación de hidrogeles que encapsulan bacterias con geometrías variables. Las bacterias de estos hidrogeles permanecen intactas, con patrones espaciales y viables durante varios días. La impresión de bacterias manipuladas para producir biopelículas inducibles conduce a la formación de estructuras tridimensionales multicapa que pueden tolerar tratamientos químicos agresivos. Los enfoques de biología sintética y ciencia de materiales brindan la oportunidad de agregar una amplia gama de funcionalidades útiles a estas biopelículas impresas en 3D. En este artículo, describimos la amplia gama de aplicaciones futuras posibles para la aplicación de biopelículas funcionales impresas en 3D a la construcción de materiales vivos derivados de biopelículas a gran escala y de manera ambientalmente estable.

Letras
El promotor de ARNr 5S para la expresión de ARN guía habilitó la edición de genoma CRISPR / Cas9 altamente eficiente en Aspergillus niger
  • Xiaomei Zheng,
  • Ping Zheng* ,
  • Kun Zhang,
  • Timothy C. Cairns,
  • Vera Meyer,
  • Jibin Sun* , y
  • Yanhe Ma

El sistema CRISPR / Cas9 es una herramienta de edición del genoma revolucionaria. Sin embargo, en eucariotas, la búsqueda y optimización de un promotor adecuado para la expresión de ARN guía es un desafío técnico significativo. Aquí utilizamos el hongo de importancia industrial, Aspergillus niger, para demostrar que el gen de ARNr 5S, que está altamente conservado y expresado de manera eficiente en eucariotas, puede usarse como promotor de ARN guía. El sistema de edición de genes se estableció con tasas del 100% de modificaciones génicas de precisión entre docenas de transformantes utilizando ADN de donante homólogo corto (40 pb). Este sistema también fue aplicable para la generación de cromosomas de diseño, como lo demuestra la deleción de un grupo de genes de 48 kb requerido para la biosíntesis de la micotoxina fumonisina B1. Además, este sistema también facilitó la mutagénesis simultánea de múltiples genes en A. niger. Anticipamos que el uso del gen de ARNr 5S como promotor de ARN guía se puede aplicar ampliamente para la ingeniería de conjuntos de herramientas de CRISPR / Cas9 eucariotas altamente eficientes. Además, el sistema informado aquí permitirá el desarrollo de cromosomas de diseño en hongos modelo y de importancia industrial.

Activación CRISPR específica del tipo de célula con interruptor AcrllA4 sensible a microARN

Las proteínas anti-CRISPR tienen el potencial de regular los sistemas CRISPR-Cas de una manera específica para el tipo de célula. Para editar selectivamente el genoma en las células diana, controlamos la expresión de AcrllA4, un inhibidor de Streptococcus pyogenes Cas9, basado en la actividad de microARN endógeno (miARN). Diseñamos un interruptor AcrllA4 que responde a miARN, que es un ARNm sintético que contiene una secuencia completamente complementaria a un miARN arbitrario en la región 5'-UTR y codifica AcrllA4. Junto con el complejo de ARN guía Cas9 o dCas9-VPR, este interruptor funciona como un activador Cas9 o dCas9-VPR específico de la célula que induce la desactivación o activación de genes dependiendo del miARN objetivo. Al detectar miARN intracelulares, el sistema condicional CRISPR-Cas9 ON que informamos podría proporcionar una herramienta poderosa para futuras aplicaciones terapéuticas e ingeniería del genoma.

Represión, activación y cómputo CRISPR-Cas programables con objetivos y disparadores independientes de la secuencia
  • Mike Jin,
  • Nicolas Garreau de Loubresse,
  • Youngeun Kim,
  • Jongmin Kim* , y
  • Peng Yin*

La capacidad de programación de Cas9 derivada de CRISPR como una proteína de dirección de ADN específica de secuencia la ha convertido en una herramienta poderosa para la manipulación genómica en la investigación biológica y aplicaciones de traducción. La actividad de Cas9 se puede diseñar de manera programada para responder a los ácidos nucleicos, pero estos esfuerzos se han centrado principalmente en el control de una sola entrada de Cas9 y, hasta hace poco, estaban limitados por la dependencia de la secuencia entre partes del ARN guía y la secuencia a detectar. Aquí, no solo diseñamos y presentamos ARN guía condicional de detección de ADN y ARN (cgRNA) que no tiene tales restricciones de secuencia, sino que también demostramos un conjunto completo de cálculos lógicos utilizando estos diseños en entradas de secuencias de ADN y ARN, incluidos AND, OR , NAND y NOR. El desarrollo de sistemas CRISPR-Cas9 de detección de ácidos nucleicos independientes de secuencia con capacidades de cálculo lógico de múltiples entradas podría conducir a una mejor ingeniería y regulación del genoma, así como a la construcción de circuitos sintéticos con una funcionalidad más amplia.

Artículos
Invertir una vía de transferencia de electrones extracelular para la reducción de acetoína impulsada por electrodos

La electrosíntesis microbiana es una tecnología emergente con el potencial de almacenar simultáneamente energía generada de manera renovable, fijar dióxido de carbono y producir compuestos orgánicos de alto valor. Sin embargo, la comprensión limitada de la ruta de los electrones hacia la célula sigue siendo un obstáculo para el desarrollo de una plataforma robusta de electrosíntesis microbiana. Para abordar este desafío, aprovechamos la vía de transferencia de electrones extracelular nativa en Shewanella oneidensis MR-1 para conectar un electrodo extracelular con una reacción de reducción intracelular. El sistema utiliza proteínas Mtr nativas para transferir electrones desde un electrodo al grupo de quinonas de la membrana interna. Posteriormente, los electrones se transfieren de las quinonas a NAD + por las NADH deshidrogenasas nativas. Este funcionamiento inverso de las NADH deshidrogenasas es termodinámicamente desfavorable, por lo tanto, agregamos una bomba de protones impulsada por la luz (proteorrodopsina) para generar la fuerza motriz del protón para impulsar esta actividad. Finalmente, utilizamos la reducción de acetoína a 2,3-butanodiol a través de una butanodiol deshidrogenasa heteróloga (Bdh) como sumidero de electrones. Bdh es una enzima dependiente de NADH, por lo tanto, la observación de la reducción de acetoína apoya nuestra hipótesis de que los electrones catódicos se transfieren al NAD + intracelular. Varias líneas de evidencia indican el funcionamiento adecuado del sistema de electrosíntesis diseñado: el flujo de electrones del cátodo está influenciado por la disponibilidad de luz y acetoína, y la producción de 2,3-butanodiol es más alta cuando están presentes tanto la luz como un electrodo equilibrado. El uso de una cepa de fondo de S. oneidensis deficiente en hidrogenasa dio como resultado una correlación más fuerte entre la transferencia de electrones y la producción de 2,3-butanodiol, lo que sugiere que la producción de hidrógeno es un sumidero de electrones fuera del objetivo en el fondo de tipo salvaje. Este sistema representa un paso prometedor hacia una plataforma de electrosíntesis microbiana diseñada genéticamente y permitirá un nuevo enfoque en la síntesis de compuestos específicos utilizando energía eléctrica.

Principios de diseño para la compartimentación y organización espacial de circuitos genéticos sintéticos

La compartimentación es un sello distintivo de los sistemas celulares y un ingrediente que se explota activamente en la evolución. También está siendo diseñado y explotado en biología sintética, de múltiples formas. Si bien estos han demostrado importantes capacidades experimentales, la comprensión de los principios de diseño que sustentan la compartimentación de los circuitos genéticos ha sido difícil de alcanzar. Desarrollamos un marco de sistemas para dilucidar la interacción entre la naturaleza del circuito genético, la organización espacial de los compartimentos y su estado operativo (bien mezclado o no). Al hacerlo, revelamos una serie de características inesperadas asociadas con la compartimentación de circuitos sintéticos y basados ​​en plantillas. Estos incluyen (i) las consecuencias de la distribución de circuitos, incluidas las compensaciones y cómo se pueden eludir, (ii) las restricciones ocultas en la realización de un circuito distribuido y (iii) las nuevas características atractivas de los circuitos compartimentados. Nos basamos en esto para examinar aplicaciones ejemplares, que consolidan y amplían los principios de diseño que hemos obtenido. Nuestras ideas, que surgen de las consideraciones más básicas y generales de la compartimentación de circuitos genéticos, son relevantes en una amplia gama de entornos.

Ingeniería metabólica de la vía MEP en Bacillus subtilis para aumentar la biosíntesis de menaquinona-7
  • Yanwei Ma,
  • Dale D. McClure,
  • Mark V. Somerville,
  • Nicholas W. Proschogo,
  • Fariba Dehghani,
  • John M. Kavanagh y
  • Nicholas V. Coleman*

La vitamina K es esencial para la coagulación sanguínea y juega un papel importante en la salud cardiovascular y ósea. La menaquinona-7 (MK-7) es una forma de vitamina K que es especialmente útil debido a su larga vida media en la circulación. MK-7 es difícil de producir mediante síntesis orgánica y, por lo tanto, se produce comúnmente por fermentación. Este estudio tuvo como objetivo modificar genéticamente cultivos de Bacillus subtilis para aumentar su rendimiento de MK-7 y reducir los costos de producción. Construimos 12 cepas diferentes de B. subtilis 168 sobreexpresando diferentes combinaciones de las enzimas limitantes de la velocidad Dxs, Dxr, Idi y MenA. Observamos una mejora de la producción de 11 veces en la cepa de mejor rendimiento, lo que resultó en 50 mg / L de MK-7. El análisis de metabolitos reveló nuevos cuellos de botella en la vía en IspG e IspH, lo que sugiere vías para una mayor optimización. Este trabajo destaca la utilidad de Bacillus subtilis para la producción industrial de compuestos de alto valor.

Optimización de la producción de proteínas de membrana recombinante en la ingeniería Escherichia coli Cepas SuptoxD y SuptoxR
  • Myrsini Michou,
  • Charalampos Kapsalis,
  • Christos Pliotas y
  • Georgios Skretas*

Las proteínas de membrana (MP) ejecutan una amplia variedad de funciones biológicas críticas en todos los organismos vivos y constituyen aproximadamente la mitad de los objetivos actuales para el descubrimiento de fármacos. Como en el caso de las proteínas solubles, la bacteria Escherichia coli también ha servido como un huésped de sobreexpresión muy popular para estudios bioquímicos / estructurales de proteínas de membrana. La producción de proteína de membrana recombinante bacteriana, sin embargo, se ve típicamente obstaculizada por una acumulación celular deficiente y una toxicidad severa para el huésped, lo que conduce a niveles bajos de biomasa final y rendimientos volumétricos mínimos. En trabajos anteriores, generamos las cepas de E. coli modificadas SuptoxD y SuptoxR, que tras la coexpresión de los genes efectores djlA o rraA, respectivamente, pueden suprimir la citotoxicidad causada por la sobreexpresión de MP y producir mejores rendimientos de MP. Aquí, buscamos sistemáticamente la sobreexpresión de genes y las condiciones de cultivo que maximizan la acumulación de MP recombinantes integrados en la membrana y bien plegados en estas cepas. Hemos encontrado que, en condiciones óptimas, SuptoxD y SuptoxR logran una producción recombinante muy mejorada para una variedad de MP, independientemente de su origen arqueal, eubacteriano o eucariota. Además, demostramos que el uso de estas cepas modificadas permite la producción de MP recombinantes bien plegados de alta calidad y con altos rendimientos, que son adecuados para estudios funcionales y estructurales. Anticipamos que SuptoxD y SuptoxR se convertirán en huéspedes de expresión ampliamente utilizados para la producción de MP recombinante en bacterias.

Conjunto de microcompartimento heterólogo en Bacillaceae: Establecer los componentes necesarios para la formación de andamios

Los microcompartimentos bacterianos (BMC) son orgánulos que albergan reacciones bioquímicas específicas para funciones tanto anabólicas como catabólicas. Los BMC modificados morfológicamente diversos que llevan vías enzimáticas heterólogas han mostrado una productividad mejorada para los productos químicos básicos, lo que convierte a los BMC en un foco importante para la ingeniería metabólica. Aún no se ha logrado el control del ensamblaje de BMC y la incorporación de una carga enzimática heteróloga en los termófilos. En este documento, abordamos esto realizando primero un análisis bioinformático detallado del operón de utilización de propanodiol (pdu) en el termófilo Parageobacillus thermoglucosidasius. Luego demostramos, in vivo, la capacidad de ensamblar las BMC nativas a una temperatura elevada de 60 ° C. La expresión heteróloga de las proteínas de la cáscara de Pdu de P. thermoglucosidasius en Bacillus subtilis dio como resultado el ensamblaje de un solo BMC tubular con una longitud promedio de 1,4 μm de BMC ensambladas después de una inducción de expresión de 20 min de los operones de la cáscara. Además, mostramos que es posible dirigir la supercarpeta monomérica GFP (msfGFP) al interior del compartimento mediante la fusión de una secuencia N-terminal de la proteína de utilización de propanodiol (PduP) de al menos 24 aminoácidos. Este estudio establece la viabilidad de construir fábricas de células para moléculas pequeñas en Bacillus y Geobacillus spp. mediante la producción y el montaje de BMC de transporte de carga heteróloga. Además, el estudio proporciona una confirmación experimental de que las BMC se producen en bacterias termófilas, lo que abre un camino para futuras investigaciones sobre la reutilización de los orgánulos nativos para proporcionar una nueva funcionalidad a temperaturas elevadas.

Cifrado de clave simétrica basado en interacciones de bioafinidad

La investigación que se presenta aquí muestra un puente entre la bioquímica y la criptografía. Se utilizaron ensayos basados ​​en enzimas en una nueva metodología vinculada a cifrados y sistemas de cifrado. Se utilizaron tres ensayos enzimáticos separados, fosfatasa alcalina (ALP) (EC 3.1.3.1), lisozima (EC 3.2.1.17) y peroxidasa de rábano picante (HRP) (EC 1.11.1.7), para crear una clave de cifrado con el fin de cifrar un mensaje. Al elegir ciertos parámetros para el experimento de uno que se realizan de la misma manera que una persona que recibe el mensaje, se producirán claves de cifrado y descifrado correctos, lo que resultará en un cifrado y descifrado correctos de un mensaje. Es imperativo que ambas partes realicen el mismo experimento en las mismas condiciones para poder interpretar correctamente el mensaje. Los ensayos basados ​​en bioafinidad, en particular los ensayos enzimáticos, proporcionan un mecanismo específico pero flexible para utilizar en el cifrado de mensajes. Debido a la naturaleza de este proceso, hay una multitud de conjuntos de parámetros que se pueden elegir, cada uno de los cuales daría como resultado la producción de una clave diferente, aumentando la seguridad y la robustez del método. Este artículo muestra que al utilizar este concepto de formar claves de cifrado utilizando un enfoque basado en la bioafinidad, se puede cifrar y descifrar correctamente un mensaje, lo que podría ser viable para otras técnicas basadas en la bioquímica.

Un ensayo universal para realizar configuraciones híbridas de ADN, ARN y ARN-ADN para la manipulación de una sola molécula en dos o tres pasos sin ligadura
  • Ya-Jun Yang,
  • Lun Song,
  • Xiao-Cong Zhao,
  • Chen Zhang,
  • Wen-Qiang Wu,
  • Hui-Juan Tú,
  • Hang Fu,
  • Er-Chi Zhou y
  • Xing-Hua Zhang*

A pesar de tener una gran variedad de topologías, la mayoría de las configuraciones de ADN, ARN y ARN-ADN híbrido (RDH) para la manipulación de una sola molécula se componen de varias cadenas de ADN y ARNss de una sola hebra (ss), con etiquetas funcionales en los dos extremos para anclaje de superficie. Sobre esta base, desarrollamos un ensayo de amplificación-recocido (AA) simple, robusto y universal para realizar todas estas configuraciones en dos o tres pasos sin reacciones ineficaces de digestión y ligación. Como ejemplos, creamos ssDNA, ssDNA corto con asas de ADN de doble hebra (ds), dsDNA con asas de ssDNA, DNA / RDH / RNA en forma de horquilla de replicación, unión de vacaciones de DNA, DNA de tres sitios con múltiples marcas y muescas, torsión- RNA / RDH restringido y ssRNA corto con asas RDH. Además de las técnicas de manipulación de una sola molécula que incluyen pinzas ópticas, pinzas magnéticas y microscopía de fuerza atómica, estas configuraciones también se pueden aplicar en otras técnicas de anclaje de superficie.

Notas técnicas
Un ingeniero B. subtilis Sistema de promotor inducible con un rango dinámico de más de 10000 veces
  • Sebastián M. Castillo-Cabello,
  • Masaya Fujita,
  • Oleg A. Igoshin y
  • Jeffrey J. Tabor*

Bacillus subtilis es el modelo líder de bacteria Gram-positiva y un chasis ampliamente utilizado para la producción industrial de proteínas. Sin embargo, la investigación de B. subtilis está limitada por la falta de sistemas de promotores inducibles con baja filtración y alto rango dinámico. Aquí, diseñamos un sistema de promotor inducible basado en la ARN polimerasa de T7 (T7 RNAP), el represor de lactosa LacI y el promotor quimérico PT7lac, integrado como una sola copia en el genoma de B. subtilis. En ausencia de IPTG, LacI reprime fuertemente T7 RNAP y PT7lac y minimiza las fugas. La adición de IPTG desreprime PT7lac y simultáneamente induce la expresión de T7RNAP, lo que da como resultado una expresión de salida muy alta. Utilizando proteínas indicadoras fluorescentes verdes y de β-galactosidasa, estimamos que este sistema LacI-T7 puede regular la expresión con un rango dinámico de más de 10 000, con mucho el mayor reportado para un sistema promotor inducible de B. subtilis. Además, LacI-T7 responde a concentraciones de IPTG similares y con una cinética similar a la del sistema inducible por IPTG Phy-spank ampliamente utilizado, que mostramos tiene un rango dinámico de como máximo 300 en un contexto genético similar. Debido a su desempeño superior, nuestro sistema LacI-T7 debería tener amplias aplicaciones en estudios de biología y biotecnología fundamentales de B. subtilis.

OpEn-Tag: una caja de herramientas optogenética personalizable para diseccionar la señalización subcelular
  • Wignand W. D. Mühlhäuser,
  • Wilfried Weber y
  • Gerald Radziwill*

La localización subcelular de moléculas de señal es un sello distintivo en la organización de la red de señalización. OpEn-Tag es una caja de herramientas de selección de endomembranas optogenéticas modular que permite alterar la localización y, por tanto, la actividad de los procesos de señalización con la resolución espacio-temporal de la optogenética. OpEn-Tag es un sistema de dos componentes que emplea (1) una variedad de péptidos dirigidos fusionados y, por lo tanto, dictando la localización de la proteína CIBN de unión al criptocromo 2 marcada con mCherry hacia endomembranas distintas y (2) el fotorreceptor citosólico de luz azul marcado con fluorescencia criptocromo 2 como un bloque de construcción personalizable que se puede fusionar con proteínas de interés. La combinación de OpEn-Tag con estimulación del factor de crecimiento o el uso de dos secuencias de anclaje a la membrana permite la investigación de procesos de transducción de señales multicapa como se demuestra aquí para la proteína quinasa AKT.

Producción de proteína de membrana de alto nivel y continua basada en diseño bicistrónico en Escherichia coli
  • Nico J. Claassens* ,
  • Max Finger-Bou,
  • Bart Scholten,
  • Frederieke Muis,
  • Jonas J. de Groot,
  • Jan-Willem de Gier,
  • Willem M. de Vos y
  • John van der Oost

Escherichia coli se ha utilizado ampliamente como microorganismo plataforma tanto para la producción de proteínas de membrana como para la ingeniería de fábricas de células. Los métodos actuales para producir proteínas de membrana en este organismo requieren la inducción de la expresión del gen diana y, a menudo, dan como resultado rendimientos bajos e inestables. Aquí, presentamos un método que combina un promotor constitutivo con una biblioteca de elementos de diseño bicistrónico (BCD), que permite el inicio de la traducción sintonizado sin inductor para una producción óptima de proteínas. Nuestro sistema media la producción constitutiva estable de proteínas de membrana bacteriana con rendimientos que superan a los obtenidos con E. coli Lemo21 (DE3), el estándar de oro actual para la producción de proteínas de membrana bacteriana. Prevemos que la producción continua, fina y de alto nivel de proteínas de membrana mediante nuestro método facilitará enormemente su estudio y su utilización en fábricas de células de ingeniería.

Un marco para el ensamblaje modular y combinatorio de circuitos de genes sintéticos

Los circuitos de genes sintéticos surgen de ciclos iterativos de diseño, construcción y prueba. Más comúnmente, el paso de limitación de tiempo es el proceso de construcción del circuito. Aquí, presentamos un esquema de clonación jerárquica basado en el método de ensamblaje de Gibson generalizado y hacemos que el conjunto de plásmidos construidos esté disponible gratuitamente. Nuestro esquema de clonación modular de dos pasos permite un ensamblaje simple, rápido, eficiente y preciso de circuitos genéticos y bibliotecas de circuitos combinatorios en Escherichia coli. El primer paso implica el ensamblaje de Gibson de unidades transcripcionales de partes constituyentes en plásmidos intermedios individuales. En el segundo paso, estos plásmidos se digieren con conjuntos específicos de enzimas de restricción. Las regiones flanqueantes resultantes tienen superposiciones que impulsan un segundo ensamblaje de Gibson en un solo plásmido para producir el circuito final. Este enfoque reduce sustancialmente el tiempo y los costos de secuenciación asociados con la construcción del circuito genético y permite el ensamblaje modular y combinatorio de circuitos. Demostramos la utilidad de nuestro marco ensamblando un circuito de inversor doble basado en CRISPR y una biblioteca combinatoria de redes de 3 nodos.


Biología sintética: las múltiples facetas de la polimerasa de ARN T7

La ARN polimerasa de T7 dividida proporciona nuevas vías para crear circuitos de genes sintéticos que están desacoplados de los procesos reguladores del hospedador, pero ¿cuántas veces se puede dividir esta enzima y mantener su función? Nueva investigación de Voigt y colegas (Segall-Shapiro et al, 2014) indica que puede ser más de lo que cree.

Los circuitos de genes sintéticos se han convertido en una herramienta invaluable para estudiar los principios de diseño de redes de genes nativos y facilitar nuevas biotecnologías (Way et al, 2014). Los biólogos sintéticos a menudo se esfuerzan por construir circuitos dentro de un marco que permita su operación consistente y robusta en una variedad de hosts y condiciones. Actualmente, sin embargo, cada circuito debe ser afinado y reajustado minuciosamente para que funcione correctamente dentro de un host en particular, lo que lleva a costosos ciclos de diseño y conclusiones esotéricas. Como resultado, los investigadores han invertido mucho en el desarrollo de estrategias que desacoplan los circuitos de genes sintéticos del metabolismo y la regulación del hospedador. En su trabajo reciente, Segall-Shapiro et al (2014) abordan este problema ampliando las capacidades de los sistemas transcripcionales ortogonales en Escherichia coli utilizando mutantes fragmentados de la ARN polimerasa del bacteriófago-T7 (T7 RNAP).

T7 RNAP ha tenido una larga relación con la biotecnología y es conocida por su compacidad y actividad transcripcional. Esta polimerasa de una sola subunidad impulsa fuertemente la transcripción de un minúsculo promotor de 17 pb que está regulado ortogonalmente en E. coli. En este contexto, ortogonal significa que T7 RNAP no transcribirá genes impulsados ​​por nativos E. coli promotores y polimerasas nativas en E. coli no reconocerá el promotor especial de T7 RNAP, es decir, los dos sistemas de transcripción se dejan en paz. Curiosamente, T7 RNAP impulsa la transcripción con tanta fuerza que, si no se regula, puede agotar rápidamente los recursos celulares y provocar la muerte celular. Debido a esto, T7 RNAP se ha aprovechado en muchas situaciones que exigen una sobreexpresión de proteínas (Studier y Moffatt, 1986). Además, los estudios que examinan la unión de T7 RNAP a su promotor han identificado un bucle de especificidad dentro de la enzima que hace contacto directo con el promotor entre los pares de bases -11 y -8. Esto ha llevado a una serie de esfuerzos que han generado mutantes T7 RNAP con especificidades modificadas para los promotores ortogonales al original (Chelliserrykattil et al, 2001 ).

Dado el creciente interés en el desarrollo de circuitos de genes sintéticos, los investigadores han mostrado un interés renovado en T7 RNAP. La ortogonalidad, la actividad transcripcional y la maleabilidad del promotor de T7 RNAP hacen que la enzima sea especialmente adecuada para su uso en circuitos de genes sintéticos. Es importante destacar que cualquier modificación realizada a la enzima aumenta la posible funcionalidad de los circuitos. Por ejemplo, recientemente utilizamos una versión dividida de T7 RNAP junto con mutantes de especificidad del promotor para crear una biblioteca de puertas AND transcripcionales (Shis y Bennett, 2013). La versión dividida de T7 RNAP se descubrió originalmente durante la purificación y se demostró que está activa. in vitro (Ikeda y Richardson, 1987). Si bien el núcleo catalítico y el dominio de unión al ADN están ubicados en el fragmento C-terminal del RNAP de T7 dividido, el fragmento N-terminal es necesario para el alargamiento de la transcripción. Por lo tanto, si las dos mitades del RNAP de T7 dividido se colocan detrás de dos promotores inducibles diferentes, ambas entradas deben estar activas para formar una enzima funcional y activar un gen aguas abajo.Cuando el mutante dividido se combina con mutantes de especificidad del promotor, se crea una biblioteca de puertas AND transcripcionales.

Segall-Shapiro et al lleve la idea de dividir T7 RNAP para nuevas arquitecturas regulatorias un paso más allá. En lugar de conformarse con el único sitio dividido ya descubierto, los autores primero racionalizaron una estrategia de mutagénesis de transposones (Segall-Shapiro et al, 2011) para identificar cuatro sitios de corte novedosos dentro de T7 RNAP. Al expresar T7 RNAP dividido en dos sitios diferentes, crean un T7 RNAP tripartito, una polimerasa que requiere las tres subunidades para su actividad. Los autores designan sugestivamente los fragmentos de la enzima tripartita como 'núcleo', 'alfa' y 'sigma' (Fig 1) y continúan mostrando que el RNAP T7 tripartito no solo se puede usar para crear puertas AND de 3 entradas, pero también funciona como un "asignador de recursos". En otras palabras, la actividad transcripcional de la polimerasa dividida puede regularse limitando la disponibilidad del núcleo y / o fragmento alfa, o expresando fragmentos sigma adicionales. Los autores demuestran estrategias para dar cuenta de los errores comunes en las redes de genes sintéticos, como la toxicidad del huésped y la variabilidad del número de copias del plásmido.

Figura 1. Segall-Shapiro et al ampliar los esfuerzos anteriores para diseñar el RNAP de T7 dividido fragmentando la enzima en dos ubicaciones novedosas para crear un complejo de transcripción tripartito.

  • La coexpresión de diferentes fragmentos sigma con los fragmentos alfa y central permite una red de puertas AND transcripcionales de múltiples entradas.

El tripartito T7 RNAP presentado por Segall-Shapiro et al expande la utilidad de T7 RNAP en circuitos de genes ortogonales. Hasta ahora, aunque T7 RNAP ha sido atractivo para su uso en circuitos de genes sintéticos, la incapacidad para regular su actividad ha impedido a menudo su uso. La división de la proteína en fragmentos y la regulación del complejo de transcripción mediante la disponibilidad de fragmentos acerca la regulación de T7 RNAP a la regulación de polimerasas de ARN procarióticas de múltiples subunidades. Los fragmentos sigma dirigen la actividad del complejo de transcripción de manera muy similar a los factores σ, y el fragmento alfa ayuda a activar la transcripción de la misma manera que los fragmentos α de las polimerasas procarióticas. Para una regulación adicional, los autores señalan que el T7 RNAP tripartito se puede dividir aún más en el sitio de división descubierto anteriormente para crear una enzima de cuatro fragmentos.

Puede ser posible una regulación más matizada usando T7 RNAP dividido con la adición de dominios de heterodimerización que pueden impulsar la asociación específica de fragmentos. Esta estrategia se ha aplicado con éxito para diseñar la especificidad y la diversidad de señales en vías de señalización de dos componentes (Whitaker et al, 2012). La actividad de T7 RNAP también podría dirigirse a varios promotores mediante el uso de múltiples fragmentos sigma simultáneamente, tal como lo hacen los factores σ en E. coli. Finalmente, los circuitos de genes sintéticos impulsados ​​principalmente por T7 RNAP crean la posibilidad de circuitos de genes fácilmente trasplantables. Un circuito de genes sintéticos impulsado completamente por T7 RNAP fragmentado dependería más de la disponibilidad de fragmentos que de interacciones desconocidas con el metabolismo del huésped. Esto permitiría la creación rápida de prototipos de circuitos de genes sintéticos en cepas aptas para el laboratorio o sistemas libres de células (Shin y Noireaux, 2012) antes del trasplante en el huésped deseado.


6. CONCLUSIÓN

El paso de describir la biología a explotarla para nuestros requisitos siempre ha sido parte de la empresa biológica y, por lo tanto, siempre reflejó las principales líneas actuales de investigación biológica. Entonces, dado que la biología molecular ha intentado durante mucho tiempo desentrañar los mecanismos moleculares que son importantes en la función celular, la biotecnología ha explotado este conocimiento y ha adoptado algunos de estos mecanismos para producir productos químicos, enzimas y biofarmacéuticos. Ahora, la biología sintética está adoptando una agenda muy ambiciosa en la construcción de entidades biológicas novedosas en un nivel cada vez más complejo para aplicaciones novedosas.


Biología sintética basada en bacteriófagos para el estudio de enfermedades infecciosas

Las infecciones resistentes a múltiples fármacos han despertado un interés renovado en los bacteriófagos.

La biología sintética ha habilitado tecnologías para la ingeniería de fagos de próxima generación.

Los fagos manipulados y las partes derivadas constituyen un nuevo paradigma antimicrobiano.

Los reporteros basados ​​en bacteriófagos permiten la detección de patógenos específicos.

Los componentes de los fagos forman un conjunto básico de partes en la caja de herramientas de biología sintética.

Desde su descubrimiento, los bacteriófagos han contribuido enormemente a nuestra comprensión de la biología molecular como sistemas modelo. Además, los bacteriófagos han proporcionado muchas herramientas que han avanzado en los campos de la ingeniería genética y la biología sintética. Aquí, discutimos las tecnologías basadas en bacteriófagos y su aplicación al estudio de enfermedades infecciosas. Las nuevas estrategias para la ingeniería de genomas tienen el potencial de acelerar el diseño de nuevos fagos como terapias, diagnósticos y herramientas. Aunque ha pasado casi un siglo desde su descubrimiento, los bacteriófagos continúan teniendo un gran impacto en las ciencias biológicas modernas, especialmente con el crecimiento de bacterias resistentes a múltiples fármacos y el interés en el microbioma.


Biología sintética: entra en la máquina viviente

(Nature) & ndash En 2000, dos artículos emblemáticos iniciaron una revolución en nuestra capacidad para diseñar funciones completamente nuevas dentro de las células. Los autores tomaron dos circuitos electrónicos, un oscilador y un interruptor, y construyeron el equivalente a partir de materia viva. La vida se convirtió en una máquina. Para muchos, incluido yo, este fue un momento profundo: el comienzo del campo de la biología sintética. Ahora, una empresa internacional con el potencial de transformar nuestras vidas, la biología sintética cruza las fronteras de la edad y de la organización, e involucra a grandes corporaciones, pequeñas empresas emergentes, académicos y manitas. En Sintético, la talentosa historiadora de la ciencia Sophia Roosth describe sus observaciones sobre el campo y la evolución temprana de su investigación y mdash es el fruto de integrarse en la vida laboral de los biólogos sintéticos en el Instituto de Tecnología de Massachusetts en Cambridge.

Los puntos de vista, opiniones y posiciones expresadas por estos autores y blogs son suyos y no representan necesariamente los de la Biblioteca de Investigación en Bioética y el Instituto de Ética Kennedy o la Universidad de Georgetown.

Noticias de bioética


Conferencia magistral: Hacia una biología e ingeniería sintéticas escalables más allá del biorreactor (BioSysBio 2009)

La gente ha estado haciendo synbio de & quotOld School & quot; durante mucho tiempo, por supuesto: tome maíz (que vino de Teosinte), perros. Pero, ¿es la cría selectiva realmente equivalente, en cierto sentido, a la biología sintética de la "vieja escuela"? Argumenta que son como synbio porque están diseñados por humanos. Además, sostiene que la principal diferencia es que en synbio, sabes lo que estás haciendo. Biología no sintética: introducción artificial de sapos de caña en Australia, que es un desastre gigantesco. Su punto es que la mayor amenaza para la biodiversidad y la salud humana son las cosas generales que ya existen.

Entonces, el punto de synbio es que podría hacer que las cosas sean más transparentes, eficientes, confiables, predecibles y seguras. ¿Cómo podemos reducir el tiempo y mejorar la fiabilidad de la biosíntesis? piezas estandarizadas, CAD, métodos para ensamblar piezas rápidamente, etc. ¿Pero es el diseño escalable? Las aplicaciones siempre tendrán partes específicas de la aplicación, pero hay conjuntos de funciones comunes o probables en todas las aplicaciones.

Lógicas transcripcionales. ¿Por qué las transcripciones de ARN? Hay muchas formas diferentes, evita las limitaciones del promotor (homogeneidad física) y muchas se rigen por el emparejamiento de bases Watson-Crick (y, por lo tanto, se pueden designar). Puede poner varios atenuadores en serie. También puede juntar diferentes antisentidos para crear diferentes puertas lógicas.

Lógicas de proteínas: aumento del flujo a través de una vía biosintética. Diferentes actividades de varias enzimas & # 8211 diferentes rotaciones. Pérdida de sustrato por escorrentía a otras vías. Solución: construir un andamio para localizar las enzimas y sustratos (importar de eucariotas). Luego dedicó un tiempo a describir las recombinasas y la dinámica de la invertasa.

Los sistemas evolucionados son complejos y sutiles. Los organismos synbio necesitan lidiar con la misma incertidumbre y competencia que los organismos existentes. Pasé algún tiempo hablando sobre el tratamiento del cáncer con bacterias. ¿Por qué las bacterias crecen preferentemente en los tumores? Mejores concentraciones de nutrientes, vigilancia inmunológica reducida, tasas de crecimiento diferenciales y tasas de aclaramiento diferenciales. En los seres humanos, las bacterias que se han probado son patógenos, que te enferman y necesitas MUCHO en el cuerpo. Hay uno que se usa para el cáncer de vejiga y tiene una tasa de éxito del 85%.

Tenga en cuenta que esta publicación es simplemente mis notas sobre la presentación. No se garantiza que sean correctos y, a menos que se indique explícitamente, no son mis opiniones. No reflejan las opiniones de mis empleadores. Cualquier error que puedas asumir felizmente es mío y de nadie más. Estoy feliz de corregir cualquier error que pueda detectar y # 8211 ¡hágamelo saber!


6 Conclusiones y perspectivas

El desarrollo de herramientas fiables y seguras para la entrega de genes es un objetivo urgente, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades monogenéticas y el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. En los últimos años, solo se ha identificado un número limitado de vehículos de suministro que cumplen los requisitos para aplicaciones in vivo. Entre ellos, el AAV ha despertado un gran interés porque la seguridad y funcionalidad de este vector están respaldadas por las aprobaciones de tres terapias basadas en AAV. Sin embargo, a pesar de estos éxitos, todavía estamos lejos de tener un vehículo de entrega de genes universalmente aplicable y adaptable. Los principales obstáculos incluyen la presencia de anticuerpos neutralizantes en la mayoría de las personas, la necesidad de mejorar la orientación de tejidos y tipos de células específicos y la eficiencia limitada de la transferencia de genes. El primer problema juega un papel menor en pacientes muy jóvenes que carecen de un sistema inmunológico completamente entrenado y en su mayoría son seronegativos para los anticuerpos anti-AAV, o para el tratamiento de sitios parcialmente inmunes privilegiados como el cerebro o el ojo. Luxturna para la terapia génica de la retina y Zolgensma para el tratamiento de la atrofia muscular espinal en niños parecen ser frutos maduros a este respecto. Sin embargo, es posible que hayan abierto la puerta al desarrollo y aprobación de terapias adicionales basadas en AAV. Los anticuerpos monoclonales terapéuticos se encontraban en una situación similar hace más de 30 años. Orthoclone OKT3 fue el primer anticuerpo aprobado para uso clínico en humanos, [234, 235] aunque se retiró del mercado en 2010 debido a la disponibilidad de terapias alternativas y más seguras. Sin embargo, al igual que Glybera, fue pionera en una nueva estrategia terapéutica. El origen murino de OKT3 podría causar respuestas de HAMA (anticuerpos humanos anti-ratón) asociadas con síntomas leves a potencialmente mortales. En consecuencia, se han realizado enormes esfuerzos para desarrollar y fabricar anticuerpos terapéuticos humanizados o completamente humanos. [236] En la actualidad, estos anticuerpos se utilizan con éxito para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes. [237] De manera similar, la administración de genes basada en AAV ofrece un enorme potencial para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos, como las terapias de reemplazo de genes, la terapia con profármacos enzimáticos dirigidos por virus o nuevas estrategias de vacunación. La aprobación de terapias basadas en AAV ha provocado un mayor interés en la biología fundamental de este virus y en la ingeniería de nuevos AAV con funciones mejoradas. Ambos temas de investigación van de la mano y se complementan bien. Una comprensión más profunda de, por ejemplo, los mecanismos de captación celular y el tráfico intracelular ayudará a generar AAV con propiedades de transducción mejoradas.

El futuro de AAV como vehículo de administración de genes terapéuticos depende estrictamente de la cuestión de si se puede lograr una amplia aplicabilidad in vivo de AAV.

Los factores adicionales que deben tenerse en cuenta, y que a menudo se subestiman en los entornos académicos, son la viabilidad y el costo de la producción de AAV y el procesamiento posterior. Las estrategias que integran los tres aspectos principales — la ingeniería de AAV, la aplicabilidad general in vivo y la producción factible — son las más desafiantes pero potencialmente las más gratificantes para lograr avances clínicos.

Aquí, la biología sintética proporciona herramientas y conceptos valiosos para abordar los principales desafíos. La incorporación de interruptores químicos y optogenéticos en los diseños de la cápside abre la puerta a la focalización de precisión temporal y espacial en tejidos y células. Estos diseños podrían complementarse aún más con sistemas que restablezcan la capacidad de transducción en respuesta a marcadores de enfermedades endógenas, como proteasas específicas o el pH bajo en el microambiente de los tumores. Dichos enfoques podrían minimizar las transducciones fuera del objetivo y, por tanto, los efectos secundarios, aumentando así la eficacia de los vectores virales. Además, los interruptores biológicos sintéticos permiten la expresión génica ajustable y controlada en el tiempo, lo que podría ser un medio prometedor para medir el tiempo, dosificar y potencialmente minimizar las respuestas inmunitarias contra el gen terapéutico. El desafío de la inmunidad preexistente contra AAV puede abordarse mediante varios enfoques, que incluyen la creación de variantes de cápside nuevas o ancestrales desprovistas de epítopos NAb actuales, la ingeniería de escudos ocultos o el desarrollo de híbridos de vectores virales completamente nuevos. Una ventaja notable de los enfoques sintético-biológicos es la modularidad y flexibilidad de los conceptos de diseño, lo que facilita la personalización y adaptación de las variantes de AAV.

Los ensayos clínicos actuales con cápsides de bioingeniería son prometedores y probablemente desencadenarán una nueva era de investigación y desarrollo basados ​​en AAV. Un factor importante que impactará o incluso definirá futuras investigaciones es la integración de múltiples disciplinas para el diseño o evolución de vehículos AAV de próxima generación. El valor de los desarrollos interdisciplinarios es evidente en otros campos científicos. La combinación de técnicas de biología molecular y biología celular con métodos (bio) químicos, matemáticos, físicos o técnicos ha dado lugar a la aparición de nuevas disciplinas en, por ejemplo, biología sintética, [155, 156, 238] ingeniería de microsistemas, [239 -241] y ciencia de materiales. [179, 242, 243] Se puede anticipar una tendencia similar en la ingeniería de variantes de AAV para abordar los desafíos clínicos actuales. Los avances en biología sintética podrían permitir la ingeniería de vehículos AAV que van más allá de las modificaciones estándar de la cápside y los diseños de casetes de expresión. Aunque es cuestionable si los primeros diseños actuales llegarán alguna vez a la clínica, podrían considerarse como un primer paso hacia los vehículos de entrega de genes de próxima generación. La esperanza que despierta este pequeño virus es grande: las sinergias entre la investigación básica, los diseños racionales y evolutivos y la ingeniería biológico-sintética podrían fomentar la aparición de nuevos enfoques tanto para mejorar las terapias actuales como para abordar enfermedades hasta ahora intratables.


Ver el vídeo: CREANDO VIDA mediante BIOLOGÍA SINTÉTICA. Descubriendo la Biotecnología (Mayo 2022).