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4.3: Abundancia de ARN - Biología

4.3: Abundancia de ARN - Biología


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La disponibilidad de sondas de ADN clonadas para muchos genes ha facilitado enormemente el análisis de cantidades de ARN en diferentes células o en diferentes condiciones. Por ejemplo, es muy común marcar una sonda de ADN que se hibridará con el ARNm; el ADN proviene de un clon de ADNc o de un clon genómico que contiene un exón. Luego, la sonda marcada se hibrida con ARN total o que contiene poliA (este último se llama ARN poliA + y es aproximadamente equivalente al ARNm) de una célula. La concentración de la sonda es mucho mayor que la concentración del ARNm diana para el gen específico, por lo que la sonda está en exceso y todo el ARNm del gen de interés debe conducirse a un dúplex con la sonda. La cantidad de sonda protegida de la digestión por una nucleasa específica de una sola hebra, como la nucleasa S1, da una medida de la cantidad de ARNm específico que se encuentra en la célula. (Esta situación difiere en algunos aspectos importantes del material sobre la estimación del número de genes expresados ​​y la abundancia de la cinética de las reacciones impulsadas por el ARN. En ese material, uno estaba mirando poblaciones enteras de ARNm, mientras que en esta situación, uno solo está mirando un ARNm, el complementario de la sonda marcada).

[Dos notas técnicas: el ensayo de diagnóstico aquí mide la cantidad de ADN marcado en dúplex y se digiere el ADN sin hibridar. Si la sonda de ADN es originalmente de doble hebra, inicialmente se desnaturaliza antes de la hibridación, pero ahora, ¿cómo se distingue entre la protección de nucleasas que surge de los dúplex de ADN-ARNm frente a las que surgen de las dos hebras del recocido del ADN? El enfoque más limpio es simplemente sintetizar y etiquetar la cadena de ADN complementaria al ARNm; esto se puede hacer mediante la elección apropiada de cebadores para la síntesis de ADN a partir de plásmidos que llevan el ADN utilizado como sonda. Alternativamente, se puede preparar una sonda de ADN dúplex marcada que se extienda más allá de la porción codificante de ARNm de un gen, de modo que el dúplex de ADN-ADN resultante de la reasociación sea mayor que el dúplex de ADN-ARN resultante de la hibridación con ARNm. Además, se utilizan condiciones de hibridación con altas concentraciones de sal y formamida que favorecen los dúplex de ADN-ARN sobre los dúplex de ADN-ADN. (2) Un enfoque equivalente es sintetizar una sonda de ARN derivada del ADN clonado; este "ARN complementario" forma un dúplex más fuerte con el ARNm que el ADNc; Los dúplex de ARN-ARN son más fuertes que los dúplex de ARN-ADN en condiciones de altas concentraciones de sal y formamida. A continuación, se detectan los fragmentos protegidos de la digestión por RNasas.]

a) Las células de eritroleucemia murina (MEL) son equivalentes a los proeritroblastos, inmortalizados por el complejo del virus Friend para que puedan crecer continuamente en cultivo. El tratamiento con pequeños compuestos orgánicos como el dimetilsulfóxido (DMSO) los inducirá a madurar en eritroblastos, con un aumento sustancial en la expresión de genes específicos de eritroides (el mecanismo de esta inducción aún se desconoce). Digamos que aisló el ARN total tanto de células no inducidas (no tratadas) como de un número igual de células inducidas por DMSO. Las muestras de ARN se hibridaron con un exceso de una sonda de ADN radiomarcada de un gen de b-globina de ratón, y la cantidad de sonda hibridada con el ARNm se determinó mediante el tratamiento de las muestras con nucleasa S1, electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y midiendo la cantidad de radiactividad en el fragmento resultante del dúplex de ARNm-ADN. A continuación se muestra una ilustración del heterodúplex, el tratamiento con nucleasa S1 y la autorradiografía resultante del gel. El fragmento protegido de células no inducidas tenía 10.000 cpm y el fragmento protegido de células inducidas tenía 500.000 cpm. Un control negativo con ARN de una línea celular de linfocitos T, que no produce ARNm de globina, no proporcionó protección, es decir, 0 cpm para el fragmento de diagnóstico. ¿Cuánto se induce la expresión de este gen de b-globina en células MEL tratadas con DMSO?

b) El ensayo anterior da las cantidades relativas de ARNm en las dos condiciones, y este es un ensayo extremadamente poderoso y ampliamente utilizado. Pero, ¿qué significa esto en términos de moléculas de ARNm por célula, es decir, cómo cambia la abundancia tras la inducción? Se puede alterar un poco este ensayo para obtener una medida de abundancia, similar en principio a los cálculos de la Sección VIIF. Primero, se necesita una medida del número de moléculas de ARNm por célula. Digamos que cosechó 107 células MEL y aisló 3 mg de poliA + ARN (esencialmente ARNm). ¿Cuál es el número total de moléculas de ARNm por célula MEL, asumiendo una longitud promedio de ARNm de 2000 nucleótidos?

c) Si se marca el ARN en las células MEL, p. ej. al hacer crecer las células en presencia de [3H] uridina, que se incorpora solo en el ARN, entonces el ARN poliA + marcado y aislado se puede hibridar con un exceso del ADN (ahora sin marcar) complementario al ARNm de interés. El ARN en dúplex con el ADN puede detectarse mediante su protección frente a la digestión mediante nucleasas como la ARNasa A y la ARNasa T1; la autorradiografía resultante tendría un aspecto similar al que se muestra a continuación, con bandas que contienen más radiactividad representadas como un relleno más oscuro. Dado que el ADN todavía está en exceso, todo el ARNm complementario a la sonda debe conducirse a un dúplex, y se puede medir fácilmente la fracción de ARN poliA + complementario de cada sonda. La siguiente tabla proporciona algunos datos representativos e idealizados para el ARN poliA + de células MEL no inducidas e inducidas, incluido el ARN de entrada total (no tratado con nucleasas) y la cantidad protegida de la digestión de nucleasas por hibridación con un exceso de ADN del gen b-globina, ADN que codifica el factor de transcripción eritroide GATA1, y el ADN que codifica la ovoalbúmina (que no se expresa en las células MEL, es decir, es un control negativo). ¿Qué fracción del ARNm (o ARN poliA +) se compone de ARNm de estos tres genes y cuál es su abundancia en las células inducidas y no inducidas?

Sonda de ADNcélulas MEL no inducidas protegidas por cpmcélulas MEL inducidas protegidas con cpm
[entrada etiquetada como ARN][1,000,000][1,000,000]
b-globina5,000250,000
GATA12525
ovoalbúmina00

d) En general, ¿cuál es la distribución de los ARNm en un tipo particular de célula diferenciada, es decir, cuán abundantes son las diferentes clases de complejidad de ARNm?

Uso de bases de datos de secuencias, mutaciones y datos funcionales.

4.6 Usamos la biosíntesis de arginina para ilustrar el análisis de complementación y la construcción de una vía. Los pasos involucrados en la síntesis de arginina también forman parte del ciclo de la urea. Una de las enzimas cataliza la formación de citrulina a partir de carbamoil fosfato y ornitina. Averigüemos más sobre esta enzima, llamada ornitina transcarbamoilasa o de venta libre.

Utilice su navegador web favorito para ir a la URL de NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica).

  • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
  • Haga clic en el botón Entrez. Entrez proporciona un portal a muchos tipos de información en este servidor. Comencemos con las secuencias de ADN y proteínas.
  • Haga clic en el botón Nucleótidos.
  • Ingrese "X00210" y presione el botón Buscar. No ingrese las comillas, que son ceros y un uno, no O o l.
  • Debería obtener un informe sobre el gen de OTC en E. coli, llamado argI.
  1. ¿Qué tamaño tiene la región que codifica la proteína, desde el codón de inicio de la traducción hasta el codón de terminación? ¿Qué tan grande es la proteína codificada?
  2. Dónde está el argI gen en el E. coli¿cromosoma? Regrese al servidor de Entrez (donde hizo clic en Nucleotides antes). Haga clic en Genomas y luego seleccione Escherichia coli. Ingrese "argI" en la ventana de búsqueda (no ingrese las comillas, y esa es la letra I "ojo", no un "uno").

4.7 ¿Es el E. coli ¿Proteína de venta libre relacionada con otras proteínas en las bases de datos de secuencias? Necesita obtener la secuencia de proteínas, lo que puede hacer haciendo clic en argImientras está en el mapa del genoma, o puede volver a la entrada del gen (número de acceso X00210). Si está en el Informe GenBank para la entrada X00210, debe hacer clic en el botón Proteína en la parte superior de la página y luego seleccionar Informe FastA en la página siguiente. (Si toma la ruta predeterminada del Informe GenPept, está bien, también puede obtener el Informe FastA desde allí). Haga una copia de esta secuencia OTC en formato FastA (es posible que desee guardarla en otro programa, por ejemplo, su procesador de texto favorito, para mayor comodidad).

Ahora haga clic en el botón Explosión en la parte superior de la página y, en la página siguiente, seleccione Búsqueda básica de explosión. En el servidor Blast, seleccione blastp en el menú desplegable junto a Program (esto alinea las secuencias de proteínas; el blastn predeterminado alinea las secuencias de nucleótidos) y pegue el E. coliOTCsequence en formato FastA en la ventana de entrada. Tenga en cuenta que el menú desplegable le da la opción de ingresar el número de acceso (40962) en lugar de la secuencia. Las bases de datos de secuencia predeterminadas son nr, la compilación no redundante de bases de datos de EE. UU., Europa y Japón. Lo usaremos, pero tenga en cuenta que un menú desplegable le permite seleccionar otras bases de datos.

a) Haga clic en el botón Enviar consulta. Cuando el trabajo finalmente se ejecuta (esto puede tardar un minuto o más cuando el servidor está ocupado), ¿qué ve?

b) ¿Es el E. coli ¿Proteína de venta libre relacionada con cualquier proteína humana? Desplácese hacia abajo en la tabla de resultados, pasando por muchos OTC bacterianos (Neisseria, Pyrococcus...) hasta que te encuentras con algunos mamíferos. Con una puntuación de 172, debería encontrar un hipervínculo a sp | P00480 | OTC_HUMAN ORNITHINE CARBAMOYLTRANSFERASE PRECURSOR. Haga clic en este hipervínculo.

4.8 La entrada para OTC humana (P00480, que es lo mismo que 400687) es bastante larga.

a) ¿Qué ocupa gran parte de la tabla de funciones? ¿Qué te dice esto sobre el cuerpos de cadetes militaresgen en humanos?

b) Usando la tabla de características para la entrada de GenBank 400687 (o P00480) o mejor aún, regrese a la página de inicio de NCBI y haga clic en el botón OMIM para ir a la herencia Medeliana en el hombre en línea (de Victor McKusick, MARYLAND). ¿Dónde está el gen? ¿Qué sucede en la deficiencia de OTC?

4.9 ¿Qué le dicen las secuencias de aminoácidos alineadas de las proteínas bacterianas y humanas? ¿Las regiones conservadas se correlacionan con las regiones funcionales? Por ejemplo, ¿la mutación de algún aminoácido en las regiones conservadas conduce a un fenotipo en humanos?

Dado que la búsqueda de Blast generó tantos resultados con puntuaciones más altas que la E. coli- par humano, tendremos que usar una herramienta diferente para ver la alineación. En la página superior del servidor Blast (donde antes seleccionó la búsqueda básica de Blast), seleccione las secuencias de Blast 2. Esta utilidad le permite ingresar dos secuencias y generar una alineación por pares mediante el programa Blast2. Deberías usar el humano y E. coli Secuencias de proteínas de venta libre o sus números de acceso, y asegúrese de elegir blastp como programa. Al hacer esto en julio de 1998, me encontré con un problema con la utilidad que hacía un duplicado de cada secuencia que ingresé (no sé si eso fue un problema para mí o para ellos); es probable que se trate de una afección temporal. Si encuentra un problema, pruebe con un servidor diferente, como el servidor de análisis de secuencia en genome.cs.mtu.edu/sas.html. Elija Pairwise Sequence Alignment, ingrese sus secuencias y ejecute GAP o SIM en secuencias de proteínas.

Cromatina

4.10 Una de las primeras pruebas importantes que ayudó a definir la estructura del nucleosoma fue el patrón de escisión de nucleasas en la cromatina. En este experimento, la cromatina se trató brevemente con una enzima, nucleasa microcócica, que degrada el ADN, luego se eliminó toda la proteína y el ADN purificado se resolvió por electroforesis. Se observó un patrón regular de bandas anchas; los tamaños medios de los fragmentos de ADN eran múltiplos de 200 pb, es decir, 200, 400, 600, 800 pb, etc. ¿Qué le dice este resultado sobre la estructura de la cromatina? Las bandas de bandas de ADN eran más gruesas y extendidas que afiladas; ¿Qué le dice esto acerca de las posiciones de escisión por nucleasa microcócica?

4.11 ¿Qué histonas se encuentran en el núcleo del nucleosoma? ¿Cuáles son las interacciones proteína-proteína en el núcleo? ¿Qué dominios de proteínas median estas interacciones?

4.12 El virus de mamífero SV40 tiene minicromosomas en los que el ADN dúplex circular está empaquetado en nucleosomas. Cuando se eliminan las histonas de los minicromosomas, se encuentra que el ADN resultante está superenrollado negativamente. ¿Qué te dice esto sobre el estado del ADN en los minicrosomas y la ruta del ADN alrededor del nucleosoma?

4.13 ¿Son las siguientes afirmaciones verdaderas o falsas?

  1. El ADN se enrolla alrededor de las histonas alrededor de 1,65 vueltas por núcleo nucleosómico.
  2. El ADN de la cromatina que contiene genes transcritos de forma activa suele ser más sensible a las ADNasas que el ADN de la cromatina no transcrita.

4.14 La relación de empaquetamiento de un complejo de ácido nucleico-proteína es la relación entre la longitud del ADN desnudo en forma B normal y la longitud de la estructura proteína-ADN. Por ejemplo, si un conjunto de proteínas plega una molécula de ADN de 100 Å en una estructura de 25 Å de largo, esta estructura tiene una relación de empaquetamiento de 4.

a) Dadas las dimensiones de la estructura del nucleosoma, ¿cuál es la proporción de empaquetamiento del ADN en el núcleo del nucleosoma? Tenga en cuenta que el tono es la distancia entre los puntos medios del dúplex de ADN a medida que gira alrededor de las histonas en el núcleo.

b) Si los nucleosomas están empaquetados en un solenoide con 6 nucleosomas por turno, ¿cuál es la proporción de empaquetamiento ahora? Suponga que cada vuelta del solenoide se traduce en 110 Å, es decir, la distancia entre los puntos medios de los nucleosomas en vueltas sucesivas del solenoide es de 110 Å.

4.15 ¿Qué tan cerca están los bordes del ADN cuando se curva alrededor de la superficie del núcleo nucleosómico?


Un elemento WLE2 mínimo no es suficiente para la localización apical directa en ausencia de ARN que contengan el 3'UTR sin alas de longitud completa

Los ARNm codificados por el homólogo de Drosophila Wnt-1, sin alas, se localizan en una pequeña región del citoplasma apical en las células epiteliales embrionarias tempranas. Esto requiere la actividad de secuencias que actúan en cis dentro de la región no traducida 3 'llamada elementos de localización sin alas (WLE). Uno de estos, WLE2, se identificó inicialmente como una secuencia de acción cis que dirigía la localización apical de ARNm expresados ​​in vivo en embriones de Drosophila de 4-5 horas. Para determinar la actividad precisa de WLE2 durante la localización apical sin alas, realizamos una mutagénesis en profundidad de esta secuencia. Usando ensayos transgénicos tanto de inyección directa como in vivo, determinamos que WLE2, por sí mismo, no es suficiente para la unión directa de factores de acción trans que median el transporte de ARN apical en células embrionarias. Más bien, los ARN que contienen solo WLE2 se transportan apicalmente solo en presencia de un segundo ARN que contiene otras secuencias de localización que actúan en cis de la región no traducida 3 'sin alas. Este co-requisito para WLE2 y secuencias adicionales de 3'UTR sin alas es probablemente una función requerida durante la localización apical, ya que las mutaciones dentro de WLE2 pueden modificar la actividad de localización apical de moléculas de ARN que contienen otras señales de localización sin alas. Esto sugiere que, al igual que otros ARNm localizados como bicoide, la localización sin alas puede requerir interacciones ARN-ARN específicas, así como el reconocimiento por complejos de localización de ARN citoplasmático.


Introducción

La edición de ARN, la modificación de nucleótidos específicos en secuencias de ARN, amplía la diversidad de proteínas y mecanismos de regulación de genes [1, 2]. El tipo más frecuente de edición de ARN en células humanas es la edición A-to-I, que se refiere a la desaminación de adenosina (A) a inosina (I) y es catalizada por las adenosina desaminasas que actúan sobre la familia de enzimas ARN (ADAR) [ 3]. Tres genes ADAR están codificados en el genoma humano, a saber, ADAR1, ADAR2 y ADAR3. ADAR1 y ADAR2 catalíticamente activos se expresan ampliamente en los tejidos. Por el contrario, ADAR3 se expresa exclusivamente en determinadas regiones del cerebro y es catalíticamente inactivo [4]. Como la inosina se reconoce como guanosina (G) en la traducción y secuenciación, la edición A-to-I también se conoce como edición A-to-G. Aunque se han revelado millones de eventos de edición en el transcriptoma humano, solo una pequeña proporción de los eventos de edición se han caracterizado funcionalmente. Los efectos de la mayoría de los sitios de edición, principalmente dentro de regiones sin codificación, aún no se han descubierto [5, 6].

La creciente evidencia ha establecido la importancia de la desregulación de la edición de ARN en el cáncer. Varios estudios han delineado mecanismos a través de los cuales los sitios de edición de ARN individuales, que en su mayoría causan eventos de recodificación (es decir, cambios de aminoácidos), promueven o suprimen el desarrollo de tumores [7,8,9,10]. Además de funcionar en la tumorigénesis, las transcripciones de ARN editadas pueden traducirse en péptidos editados, que pueden reconocerse como antígenos del cáncer y activar una respuesta inmunitaria antitumoral [11, 12]. Además, en varios tipos de cáncer, se observaron aberraciones de todo el genoma en la edición de ARN y se asociaron con características clínicas [13, 14, 15]. Dentro de cada tipo de cáncer, los niveles de edición generalmente aumentaron o disminuyeron en los tumores, en comparación con las muestras normales emparejadas. Los niveles de edición de sitios específicos se correlacionaron con el estadio del tumor, el subtipo y la supervivencia del paciente, y para un subconjunto más pequeño de sitios no sinónimos, la edición de la proliferación celular alterada y la sensibilidad al fármaco en experimentos de líneas celulares [13]. Dado que la edición de ARN tiene el potencial de informar el desarrollo de mejores diagnósticos de cáncer y tratamientos específicos del paciente, se necesita una investigación exhaustiva de las funciones precisas y los mecanismos reguladores de los muchos cambios de edición de ARN específicos del tipo de cáncer [10].

En la progresión del cáncer, la activación de la transición epitelio-mesenquimatosa (EMT) facilita la metástasis al permitir que las células tumorales adquieran un fenotipo invasivo, se infiltran en los sistemas circulatorio y linfático y lleguen a sitios distantes para la colonización [16,17,18]. Hasta ahora, se han asociado algunos sitios de edición de ARN con este proceso. Específicamente, se demostró que la edición de eventos en SLC22A3, FAK, COPA, RHOQ y miR-200b acelera la metástasis [12, 19,20,21,22,23]. Mientras que miR-200b normalmente se dirige a ZEB1 y ZEB2, que son factores de transcripción inductores de EMT clave, la edición altera sus objetivos y mejora la invasividad y la motilidad celular [23]. El evento de recodificación SLC22A3 también promovió la EMT, lo que provocó cambios en la expresión de genes marcadores EMT [19]. En contraste, un evento de recodificación en GABRA3 inhibió la metástasis y estuvo presente solo en líneas celulares no invasivas y tumores no metastásicos [22]. Estos estudios destacan la relevancia funcional de la edición de ARN en la metástasis y el mérito de una investigación más exhaustiva.

A continuación, presentamos un análisis global y una comparación de los perfiles de edición de ARN entre los fenotipos epitelial (E) y mesenquimal (M) de tumores primarios en múltiples tipos de cáncer. Usando datos de RNA-seq derivados de tumores masivos y células individuales, observamos distintos patrones de edición entre fenotipos, con diferencias de edición a menudo enriquecidas entre los genes de la vía de respuesta inmune. Con el apoyo de pruebas experimentales, mostramos que los sitios de edición diferencial afectan la abundancia de ARNm del gen del huésped e identificamos un mecanismo novedoso de estabilización dependiente de la edición de ARNm por ILF3. Uno de los genes diana de ILF3 es EIF2AK2, que codifica la proteína quinasa R (PKR), un actor clave en la respuesta inmunitaria y viral.


Mediciones de ARNm y proteínas.

Concentraciones, producción y tasas de renovación de ARNm y proteínas en estado estacionario

A partir de las tecnologías anteriores, ahora tenemos mediciones de las concentraciones absolutas de ARNm y proteínas de varios organismos, incluidas células de mamíferos, gusanos, moscas, levaduras y algunas especies de bacterias 1,5,19. En general, tanto en bacterias como en eucariotas, las concentraciones celulares de proteínas se correlacionan con la abundancia de sus correspondientes ARNm, pero no de manera muy significativa. A menudo muestran un coeficiente de correlación de Pearson al cuadrado de & # x0223c0.40, lo que implica que & # x0223c40% de la variación en la concentración de proteína puede explicarse conociendo las abundancias de ARNm 1,19 (Figura 2a). También se han observado correlaciones más altas 1,19. Para explicar el & # x0223c60% restante de la variación, es necesario invocar alguna combinación de regulación postranscripcional y ruido de medición.

a | La abundancia de transcritos de ARNm se correlaciona solo parcialmente con la abundancia de proteínas, lo que típicamente explica aproximadamente de uno a dos tercios de la variación en los niveles de proteína en estado estacionario, dependiendo del organismo. Esta tendencia es evidente en los datos de las células de fibroblastos de ratón NIH3T3. B | En células de mamífero, como se muestra aquí para una línea celular de meduloblastoma DAOY humano, & # x0223c30 & # x0201340% de la variación en la abundancia de proteínas se explica por la abundancia de ARNm. Una fracción de varianza igualmente grande puede explicarse por otros factores, lo que es indicativo de la regulación postranscripcional y traduccional y la degradación de proteínas 5,24. C | No obstante, los niveles de ARNm son un excelente proxy (en general) de la presencia de una proteína & # x02014 o, más precisamente, de su detectabilidad utilizando las tecnologías proteómicas actuales. La & # x02018 función de paso lento & # x02019 resultante se ha observado en bacterias, levaduras y cultivos de células humanas: más allá de una determinada concentración de ARNm, la probabilidad de detectar una proteína en la muestra no aumenta más. D | La evidencia preliminar también sugiere que, al considerar los ortólogos de especies muy divergentes, las abundancias de proteínas están más conservadas que las abundancias de los ARNm correspondientes 39,40, lo que sugiere que la abundancia de proteínas puede verse favorecida evolutivamente. (Los números indican coeficientes de correlación de rango de Spearman entre abundancias moleculares). Datos como estos apoyan un papel importante para los mecanismos reguladores que ocurren aguas abajo de la configuración de los niveles de ARNm. Panel a de esta figura está adaptada, con permiso, de REF. 5 & ​​# x000a9 (2011) Macmillan Publishers Ltd. Todos los derechos reservados. Panel B de esta figura está adaptado de REF. 24. Panel C de esta figura está adaptada, con permiso, de REF. 42 & # x000a9 (2009) Oxford University Press. Panel D de esta figura está adaptada, con permiso, de REF. 40 y # x000a9 (2010) Wiley.

La concentración de proteínas en poblaciones de células en estado estacionario bajo diferentes condiciones de crecimiento puede variar. Esta variación a menudo se expresa como una relación logarítmica de las abundancias medidas y se denota aquí como abundancia relativa (RECUADRO 1). Las abundancias relativas de proteínas pueden ocurrir o no en proporción a sus niveles relativos de ARNm. Por ejemplo, en células de levadura haploides versus diploides, una correlación moderada (R = 0,46 a 0,68) entre la abundancia relativa en proteínas y ARNm (al menos los bien medidos) 20. De manera similar, las abundancias relativas solo se predijeron parcialmente por las abundancias relativas de ARNm en tres líneas celulares humanas (correlación de Spearman = 0,63) 21.

Las abundancias de proteínas y ARNm mencionadas anteriormente están determinadas por las relaciones entre las velocidades de los procesos que producen y degradan las moléculas participantes. Las estimaciones iniciales a gran escala ahora también están disponibles para estas tasas de los diferentes procesos de expresión de proteínas (Figura 1). En las células de mamíferos, los ARNm se producen a una velocidad mucho menor que las proteínas en promedio, una célula de mamífero produce dos copias de un ARNm determinado por hora, mientras que produce docenas de copias de la proteína correspondiente por ARNm por hora. De manera similar, los ARNm son menos estables que las proteínas (con una vida media promedio de 2.6 & # x020137 horas frente a 46 horas, respectivamente) 5,22. Las largas semividas de las proteínas han sido confirmadas por estudios independientes en otros sistemas 17,18 y sugieren un papel potencialmente importante de la & # x02018dilución & # x02019 & # x02014, es decir, la disminución de la concentración de proteínas debido a la división celular 17. Las vidas medias largas de los ARNm de mamíferos contrastan fuertemente con las vidas medias de los ARNm bacterianos medidos, que promediaron aproximadamente 7 minutos 23.

Todas estas comparaciones resumen las propiedades promedio y las tendencias globales entre los genes. Cualquier proteína en particular puede tener tasas o abundancias que son muy diferentes de la investigación promedio de sus tasas y abundancias particulares, por lo que puede ayudar a iluminar una biología interesante que es relevante para la proteína, tal vez apuntando a una regulación transcripcional o postranscripcional extremadamente fuerte. Por ejemplo, los ARN y las proteínas de los genes metabólicos de los mamíferos tienden a ser muy estables 5 y tienen altas proporciones proteína por ARNm 24, por el contrario, las proteínas que participan en la organización de la cromatina y la regulación transcripcional tienden a degradarse rápidamente 5. Por tanto, la regulación de la abundancia de proteínas refleja funciones biológicas específicas: es posible que las proteínas reguladoras deban producirse y degradarse muy rápidamente para reaccionar a un estímulo, mientras que las proteínas estructurales o de mantenimiento tendrían una vida mucho más prolongada.

Niveles de ARNm y proteínas en respuesta a la perturbación.

Además de las mediciones de estado estacionario, los esfuerzos ahora también se han dirigido a sistemas perturbados (RECUADRO 1). Para caracterizar los cambios dinámicos en los proteomas, son necesarias mediciones dependientes del tiempo. Dichos estudios habían estado limitados hasta hace poco por factores como el ruido de medición, un número bastante pequeño de etiquetas isotópicas disponibles y la naturaleza secuencial & # x02014 en contraposición a la naturaleza fácilmente paralelizable & # x02014 de los experimentos de espectrometría de masas, lo que reduce el número de muestras. que se puede analizar. Sin embargo, trabajos recientes nos han proporcionado conjuntos de datos detallados que arrojan resultados paradójicos. Por ejemplo, la levadura se sometió a estrés de osmolaridad y se midieron los cambios de expresión dependientes del tiempo [25]. Los autores encontraron que para los genes regulados al alza, las concentraciones máximas de ARNm y proteínas están bien correlacionadas, pero esta tendencia no es cierta para los genes regulados a la baja. En un estudio de series de tiempo diferente, la levadura que había sido sometida a estrés oxidativo no mostró este comportamiento, pero indicó una regulación postranscripcional sustancial de una gran fracción de los genes independientemente de su regulación hacia arriba o hacia abajo 26,27. Lo mismo parece ser cierto para las bacterias en las que los análisis del curso del tiempo de los sistemas perturbados revelan grandes diferencias entre los cambios en la abundancia de proteínas y ARNm 28,29. Claramente, nuestra comprensión de los sistemas perturbados aún es incompleta y requiere más análisis.

Niveles de ARNm y proteínas en células individuales

Los métodos unicelulares han avanzado enormemente en los últimos años y ahora son capaces de realizar análisis detallados de alto rendimiento de muchos genes, y los hallazgos de estos ensayos contrastan con los de los análisis de toda la población (RECUADRO 1). (Para una excelente revisión de los análisis unicelulares, consulte la REF.30.) Una encuesta reciente a gran escala de Escherichia coli Las células sugieren que la abundancia de proteínas bacterianas y ARNm no están correlacionados en absoluto 13, aunque estas mediciones aún no se han recopilado de manera exhaustiva ni se han verificado de forma independiente. No obstante, el promedio poblacional de las señales de muchas mediciones unicelulares produce correlaciones que son comparables a las mediciones masivas en poblaciones celulares, y las concentraciones de ARNm explican el & # x0223c54 & # x0201377% de la varianza en los niveles promedio de proteína 13. La falta de correlación entre el ARN y la concentración de proteínas en células individuales puede explicarse por las diferentes vidas útiles de las moléculas: los ARNm bacterianos tienen una vida corta y se producen pocas copias por célula, lo que hace que sus concentraciones en células individuales fluctúen mucho más que las de las células individuales. las proteínas correspondientes de vida más larga. Al promediar entre poblaciones, estas fluctuaciones desaparecen y las concentraciones de ARNm y proteínas se correlacionan.

Además, la regulación de la traducción tiene un papel en la falta de correlación: cuando se comparan diferentes clases de genes en células de levadura, las concentraciones de proteínas en el mismo complejo son menos ruidosas en comparación con proteínas que no están dentro de un complejo 31, aunque esto no es cierto a nivel de ARNm 32. Las contribuciones del ruido biológico tanto intracelular como intercelular son un área activa de investigación y se revisan en otros lugares (por ejemplo, REF. 33).


4.3: Abundancia de ARN - Biología

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Base de datos de abundancia de ARN (RAD)

RAD, como se describió originalmente, proporcionó un esquema y un enfoque para capturar datos genómicos funcionales destinados principalmente a medir la abundancia de transcripciones. Se configuró una implementación de RAD para brindar acceso a los estudios de los colaboradores de CBIL, así como para mostrar las características de RAD. Debido a los cambios en la tecnología y la financiación, el sitio web de la RAD ya no está disponible (a continuación se proporciona una descripción histórica). RAD como esquema todavía está muy activo e incorporado en el sistema de base de datos GUS (Genomics Unified Schema) utilizado por CBIL (EuPathDB, Beta Cell Genomics) y otros. El esquema para RAD se puede ver junto con los otros espacios de nombres GUS a través de nuestro navegador de esquemas.

El sitio web de RAD era un recurso para estudios de expresión génica, que almacenaba estudios (es decir, experimentos) altamente curados y compatibles con MIAME que empleaban una variedad de tecnologías, como matrices de filtros, micromatrices de 2 canales, chips Affymetrix, SAGE, MPSS y RT-PCR. Los datos estaban disponibles para su consulta y descarga en función de la ontología, las publicaciones o los genes de MGED. En este sitio web estaban disponibles estudios tanto públicos como privados (estos últimos solo pueden verlos los usuarios que tengan los inicios de sesión y los permisos adecuados).

RAD se sometió a importantes renovaciones en 2003 (descrito en Manduchi et al., Bioinformática, 2004). Esto fue motivado por el esfuerzo continuo de estándares de microarrays de MGED, nuestra experiencia con estudios de microarrays y un movimiento para colocar RAD dentro de un sistema de bases de datos integrado, GUS. La versión original de RAD descrita en Stoeckert et al. (Bioinformática, 2001) fue reemplazado por la versión basada en GUS.

Estudios en el sitio web de la RAD: RAD se utilizó para mostrar y dar acceso a los estudios de nuestros colaboradores. Muchos de ellos estaban relacionados con nuestro trabajo como parte del Consorcio de Páncreas Endocrino y el Consorcio de Biología Celular Beta. Estos estudios se pueden encontrar en la sección Beta Cell Genomics del sitio web Beta Cell Biology. Los estudios restantes se asociaron principalmente con un proyecto de biología cardiovascular en colaboración con el profesor Peter Davies y su grupo en Penn. Para acceder a estos estudios vaya a la página de Biología Cardiovascular. Si llegó aquí mientras buscaba información complementaria para uno de estos estudios, encontrará los enlaces relevantes en esta página.

Comuníquese con nosotros mediante el enlace de la barra de menú si tiene preguntas o solicitudes adicionales relacionadas con RAD.


La oscilación del ARNt en tres posiciones de codones compromete la fidelidad del decodificador de traducción

La traducción sin sentido, la llamada lectura completa del codón de parada, puede resultar de la decodificación aberrante de los codones de parada por parte de los ARNt de aminoacilo no afines (ejemplos son Gln [CAG /CAA], Tyr [UAU/ UAC] y Lys [AAG /AAA] para los codones de terminación UAA y UAG respectivamente Trp [UGGRAMO], Arg [AGA] y Cys [UGU/ UGC] para el codón de terminación UGA) [2, 33]. La ocurrencia de tal lectura completa resalta la posibilidad de que las posiciones 3 y 1 se tambaleen en la maquinaria de traducción y proporciona una indicación de cuán común es la codificación errónea de traducción en los organismos vivos. En los ciliados, la determinación del perfil de los ribosomas ha demostrado que los tres codones de terminación pueden estar mal codificados, mientras que las tasas de este tipo de codificación errónea dependen de la posición dentro de la molécula de ARNm (región codificante o el extremo) [34]. El bamboleo de la posición 1 ocurre no solo en los codones de terminación sino también en los codones de sentido, como la lectura incorrecta de la arginina CGU/CCodones GC como cisteína UGU/UCodones GC [35, 36]. By using the prokaryote ortholog of elongation factor Tu (EF-Tu) for targeted mass spectrometry, it has been reported that even position 2 can be misdecoded by noncognate tRNAs, as illustrated by the detection of the arginine CGRAMOU codon misdecoded by tRNA GAG -Leu [5]. Thus, substantial misdecoding at all three positions is possible [2, 5] (Table 1). This consequently compromises the fidelity of the translation decoder.

It has been reported that G•T mismatching occurs in both DNA and RNA duplex following tautomerization and ionization, and this plays important roles in replication and translation errors [37, 38]. The Watson-Crick-like mismatch can evade fidelity checkpoints and appears to occur with probabilities (10 −3 to 10 −5 ) that strongly imply a universal role of this mismatch in translation errors [38]. The rG•rT mismatch at position 3 may not lead to mistranslation in decoding center, because NNU and NNC (rG•rC/rU) code for the same amino acids in such twice-degenerated codons, and the same holds true for NNG and NNA (rU•rA/rG) (Fig 3). However, more mistranslation results if rG•rT mismatch takes place at position 1 and 2 [5, 35, 36]. Hence, in toto a picture emerges—that amino acid misincorporation in the nascent peptide chain is prone to occur mainly because of the absence of fully Watson-Crick pairing tRNAs and by excessive wobbling at all three codon positions [5].


5 Applications of Type VI CRISPR-Cas Systems

In the years following their discovery, biochemical and structural characterization, type VI CRISPR-Cas systems have attracted much attention because of efficient, highly specific, and programmable RNA-targeting properties and autonomous pre-crRNA processing. Transcriptome editing by Cas13 effectors also has important advantages over CRISPR-based genome editing: it is safer because of its transient and reversible nature, and the extent of editing is dose-dependent and can be modulated to suit various purposes. In addition, type VI CRISPR-Cas systems exhibit collateral ssRNA cleavage activity in bacteria and in vitro, which can be utilized for diagnostic applications. Thus, an increasing number of studies have aimed to develop type VI CRISPR-Cas systems into tools for basic research, biotechnology, and therapeutics. Most of these studies have recently been extensively reviewed and compared to other RNA-targeting tools elsewhere. [ 24, 33, 35, 36, 70-79 ] This article will give an overview of the reported applications, their principles and drawbacks before discussing possible strategies for optimizing efficiency and safety of the Cas13-based tools.

5.1 Transcriptome Engineering in Basic Research and Therapeutics

Cellular RNA, both protein-coding and noncoding, is fundamentally involved in a plethora of biological processes, including conveying genetic information for protein synthesis and playing diverse regulatory roles by interacting with proteins, DNA and other RNA molecules. Conversely, the fate of cellular RNA is determined by similarly diverse protein- and RNA-mediated regulation and modifications. While substantial advances in our understanding of these processes have been made through genome-scale observational studies, their functional characterization has been largely obstructed due to limited precision, efficiency, and utility of the commonly used tools for RNA manipulation such as RNAi and antisense nucleotides. [ 35 ] Recent studies, however, show that type VI CRISPR-Cas systems can overcome these barriers and provide new strategies for RNA manipulation (Figura 5). Additionally, Cas13-based transcriptome engineering for therapeutic purposes holds promise as safer and more versatile approach compared to the DNA-targeting CRISPR-Cas systems.

In one of the earliest reports on Cas13 application, Cox et al. linked C-terminally truncated catalytically inactive Prevotella sp. P5-125 Cas13b (dPspCas13b) to the hyperactive mutant of deaminase domain of ADAR2 (adenosine deaminase acting on RNA 2) to develop a tool termed REPAIRv2 (RNA editing for programmable A to I replacement version 2) that can be packaged into adeno-associated viral (AAV) vector for cell delivery. [ 42 ] Accompanied with crRNA sequence targeting the gene of interest, REPAIRv2 conducts reversible and directed adenosine-to-inosine (A-to-I) edits on RNA transcripts since inosine mimics guanosine in translation and splicing, REPAIRv2 can be used to study or treat disease-relevant G to A mutations. [ 42 ] Further engineering of REPAIRv2 aimed at relaxing substrate preferences of ADAR2 deaminase domain yielded a new tool termed RESCUE (RNA editing for specific C to U exchange), which is capable of carrying out cytidine-to-uridine (C-to-U) conversions while retaining the original adenosine deaminase activity. [ 80 ] Although both REPAIRv2 and RESCUE exhibit high specificity (20 or less transcriptome-wide off-target edits detected upon transfection of 10 ng of REPAIRv2 vector, and 103 C-to-U and 139 A-to-I transcriptome-wide off target edits detected upon transfection of 150 ng of RESCUE vector), their current efficiency (up to 30% of on-target A-to-I edits by REPAIRv2 and ≈76% of on-target C-to-U edits by RESCUE) still has room for improvement. [ 42, 80 ]

Xu y col. established the first high-throughput phenotypic assay for functional studies of long noncoding (lnc) RNAs using Leptotrichia wadei Cas13a (LwaCas13a), which solves the problems observed with methods based on RNAi or antisense nucleotides, such as poor specificity, off-target effects, and ambiguity in assigning phenotypes to a single lncRNA. [ 81 ] In the assay, a library of K562 chronic myeloid leukemia cells stably expressing LwaCas13a and a unique crRNA targeting one of lncRNA transcripts was exposed to cancer drug-induced cellular stress, after which the roles of the studied lncRNAs in K562 cell viability were inferred from depletion or enrichment of each crRNA in the assayed cell population. [ 81 ]

Mapping RNA–protein interactions is essential for better understanding of various cellular processes. [ 82 ] Although efficient and robust methods such as cross-linking immunoprecipitation sequencing and RNA immunoprecipitation sequencing are broadly applied to identify RNAs bound to proteins of interest, currently available methods for detection of proteins bound to a specific RNA have severe limitations, including nonspecific binding and inability to detect weaker or transient interactions. [ 83, 84 ] To overcome these limitations, two Cas13-based methods have recently been developed for the RNA-centered study of RNA–protein interactions under natural conditions. [ 83, 84 ] The first method, termed CRUIS (CRISPR-based RNA-united interacting system), employs catalytically inactivated LwaCas13a (dLwaCas13a)-crRNA module to bind the RNA of interest, after which the bacterial ligase proteasomal accessory factor A (PafA) fused to dLwaCas13a ligates the small protein prokaryotic ubiquitin-like protein PupE to RNA-bound neighboring proteins. [ 83 ] The second method uses dRfxCas13d fused with (1) the double-stranded RNA-binding domain from human protein kinase R that would enhance and stabilize binding to targeted RNA after initial recognition by the dRfxCas13d-gRNA and (2) the modified plant peroxidase APEX2 which catalyzes 1 min promiscuous biotinylation of transiently interacting proteins for proximity labeling. [ 84 ] The two methods were successfully used to identify new endogenous interacting partners of the noncoding RNA activated by DNA damage (NORAD) and human telomerase RNA, respectively. [ 83, 84 ] It should be noted that careful design and screening of gRNAs is required for these two methods to find appropriate targeting sites within RNA of interest, as secondary RNA structure and possible steric hindrance caused by the size of Cas13 effectors may negatively affect target RNA binding and/or detection of some interacting proteins. [ 83, 84 ]

Type VI CRISPR-Cas systems also have considerable potential for implementation in research on various model organisms. Aiming to establish a cost-efficient and robust technique that would circumvent cytotoxic and off-target effects of the commonly used morpholinos, Kushawah et al. recently assessed the utility of type VI CRISPR-Cas systems in studying gene function in early development of teleost embryos. [ 85 ] Among investigated Cas13 effectors, RfxCas13d was found to efficiently and precisely disrupt maternal and zygotic gene function in zebrafish embryos without inducing toxicity, developmental abnormalities, direct off-target or collateral cleavage effects. [ 85 ] The study also demonstrated that coinjection of RfxCas13d protein and gRNAs can further accelerate knockdown of targeted maternal mRNA in dose-dependent manner and provide more penetrant phenotypes. [ 85 ] The established technique can be effectively used in other vertebrate embryos, including those of medaka, killifish, and mouse. [ 85 ] In another study related to model organisms, Jing et al. showed that type VI CRISPR-Cas systems can be used for RNA knockdown and single-base RNA editing in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, an important model organism used for studying cellular mechanisms conserved from yeast to humans. [ 86 ]

To investigate one potential therapeutic application, Konermann et al. delivered dRfxCas13d to cells via AAV vector to manipulate pathological alternative splicing of tau pre-mRNA in a neuronal model of frontotemporal dementia. [ 39 ] Later, Zhao et al. showed that Cas13 effectors can also be considered for therapeutic knockdown of oncogenes for which the use of small molecule inhibitors has thus far proven unsuccessful. [ 45 ] Programmed by crRNA to specifically target oncogenic kirsten rat sarcoma virus (KRAS) mutant and not wild-type KRAS mRNA transcripts, LwaCas13a efficiently decreased levels of mutant KRAS mRNA, inducing cell apoptosis in pancreatic cancer cells and tumor shrinkage in mice with pancreatic cell xenografts. [ 45 ] Furthermore, He et al. delivered active RfxCas13d to mouse liver for simultaneous and reversible knockdown of RNA transcripts associated with metabolic regulation, thus laying the groundwork for the use of type VI CRISPR-Cas systems in treatment of metabolic diseases. [ 87 ]

In addition to transcriptome manipulation, Cas13-based tools can also be used for studying and therapeutic regulation of epitranscriptome. One of the most prominent and abundant mRNA modifications is the N 6 -methyladenosine (m 6 A), a form of reversible and selective posttranscriptional methylation of adenosine residues that influences alternative splicing, conformation, expression, translation, and degradation of mRNA transcripts. [ 88, 89 ] The effects of m 6 A modifications on mRNA are mediated by m 6 A reader, writer, and eraser proteins. [ 88, 89 ] Previous transcriptome-wide m 6 A mappings suggest that distribution and pattern of m 6 A modifications are dynamic and associated with cell differentiation and various diseases such as cancers however, the lack of appropriate tools and methods has hitherto hindered deeper understanding of involvement of m 6 A-mediated epitranscriptome regulation in cellular processes and diseases. [ 88, 89 ] To study m 6 A regulation on individual RNA transcripts, Rauch and Dickinson recently designed a protocol in which dCas13b effectors fused to the functional output domains of the m 6 A reader proteins YTH domain-containing family protein 1 and 2 (YTHDF1 and YTHDF2) were transfected to cells along with crRNA targeting methylated sites in RNA transcript of interest, followed by assessment of protein levels with dual luciferase assay or RT-qPCR for evaluation of RNA levels. [ 90 ] In another study, the m 6 A eraser protein RNA demethylase alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5 (ALKBH5) was linked to the C-terminus of dPspCas13b. [ 91 ] When combined with gRNA, the dPspCas13b-ALKBH5 fusion protein (named dm 6 ACRISPR) successfully demethylated targeted mRNA transcripts containing single or multiple m 6 A sites in human cell culture with low off-target effects. [ 91 ] dm 6 ACRISPR was also used to target m 6 A-modified transcripts of the oncogenes EGFR and MYC, which suppressed proliferation of HeLa cells and demonstrated that dm 6 ACRISPR can be applied in gene repression and regulation of cellular functions. [ 91 ] In the third study, Zhao et al. developed a photoactivable RNA m 6 A editing system using CRISPR-dCas13 (PAMEC) that includes two main components: (1) an RNA anchor probe consisting of the catalytically inactive Porhyromonas gulae Cas13b (dPguCas13b) fused to CIBN, a truncated variant of the light-sensitive protein calcium- and integrin-binding 1 (CIB1) that mediates light-dependent interaction with the photylase homology region of the cryptochrome circadian regulator (CRY2PHR), and (2) an m 6 A effector probe consisting of CRY2PHR fused to either m 6 A demethylase fat-mass and obesity-associated protein (FTO) for m 6 A erasure or the METTL3-METTL14 m 6 A methyltransferase complex for m 6 A writing. [ 92 ] The system enables efficient and robust m 6 A editing in cells illuminated by blue light, and it has been further optimized by adding an MS2 aptamer at 3′ end of crRNA for increased efficiency and by coupling it with an upconversion nanoparticle film for deep tissue m 6 A editing. [ 92 ] Considering significant attention that has lately been given to research on m 6 A-mediated epitranscriptome regulation and promising prospects of Cas13 effectors, it is likely that even more Cas13-based tools fused to various m 6 A reader/writer/eraser proteins will be developed in the near future.

5.2 Nucleic Acid Detection and Diagnostics

By harnessing the collateral cleavage activity and stringent crRNA-activator RNA complementarity requirements of type VI CRISPR-Cas systems, Gootenberg et al. designed a rapid, cheap, and ultrasensitive portable nucleic acid diagnostic platform named SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking). [ 43 ] SHERLOCK uses a Cas13-crRNA module that, once activated by a strictly complementary activator RNA from tested sample, promiscuously cleaves quenched fluorescent reporter RNA molecules at high turnover rate, thus generating a detectable and quantitative fluorescent signal (Figura 6). [ 43 ] The preceding recombinase polymerase amplification of samples followed by T7 transcription enables detection of both RNA and DNA samples at zeptomolar level. [ 43, 44 ] Subsequent development and standardization of the platform allowed detection of multiple target molecules using orthogonal type VI CRISPR-Cas systems, enhanced signal output by adding the type III CRISPR effector nuclease Csm6, simplified sample preparation by introducing the method termed HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases) and adapted the platform for convenient visual readout of results on a lateral flow strip. [ 44, 93, 94 ] SHERLOCK has been applied in diagnostics of viral infections, including COVID-19, cancer mutations, health-related single nucleotide polymorphisms (SNPs), and genetic traits in plants. [ 43, 44, 94-100 ] The utility of SHERLOCK as a cheap and reliable tool for diagnosing COVID-19 was recently evaluated on a larger scale in a clinical study conducted in Thailand. [ 101 ] Validated on 154 clinical COVID-19 samples, SHERLOCK exhibited 100% specificity and high sensitivity with both in-tube fluorescence and lateral flow readouts (96% and 88% sensitivity, respectively), successfully detected asymptomatic cases and its results were in full concordance with those from the commonly used RT-PCR tests. [ 101 ] SHERLOCK has also been adapted for simple, fast, and cheap monitoring of graft rejection and opportunistic infections by cytomegalovirus and BK polyomavirus in kidney transplant patients. [ 102 ] Available in form of qualitative lateral-flow readout that can be evaluated by a smartphone-based software, the test enables frequent and personalized point-of-care testing for early prevention of post-transplantation complications. [ 102 ]

As the COVID-19 pandemic highlighted the need for faster and less labor-intensive diagnostic tools with minimal equipment usage, SHERLOCK was recently further simplified into the diagnostic platform termed SHINE (SHERLOCK and HUDSON integration to navigate epidemics). [ 95 ] SHINE uses optimized protocol for HUDSON to speed up viral inactivation in nasopharyngeal swabs and saliva samples and combines the recombinase polymerase amplification, T7 transcription, and Cas13-mediated detection steps of SHERLOCK into a single-step reaction, thereby reducing time for obtaining COVID-19 test results to ≈50 min while maintaining 100% specificity and 90% sensitivity compared to RT-PCR tests. [ 95 ] In addition to lateral flow readout, SHINE test results can be visualized via in-tube fluorescent readout and interpreted by a smartphone application to avoid sample contamination and user bias. [ 95 ]

Apart from SHERLOCK, other Cas13-based diagnostic tools have been developed for various purposes, such as quantitative detection of microRNA or quantitative virus detection using automated microfluidic device. [ 48, 103, 104 ] Among these tools, CARMEN (combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids) should be noted for its capability to perform large-scale simultaneous testing of multiple samples for diverse pathogens at species, strain and SNP level—a feature particularly valuable for surveillance of spreading and evolution of infectious diseases. [ 104 ]

5.3 Nucleic Acid Imaging

Subcellular localization of RNA transcripts is spatiotemporally dynamic and directly associated with their function and fate. [ 78 ] Although fluorescent tools such as molecular beacons, the MS2-MCP system and fluorogenic RNA aptamers are available, their limitations make tracking individual RNA species in live cells difficult (Figura 7A–C). [ 78, 105 ] Wang and co-workers demonstrated that catalytically inactive dPspCas13b and dPguCas13b fused to enhanced green fluorescent protein can be employed as robust and fast RNA-labeling tools for real-time RNA imaging and tracking in living cells, with signal-to-noise ratio lower than that of MS2-MCP systems. [ 106 ] Both Cas13b orthologs were capable of efficient binding to cellular RNAs with medium level of abundance, and could be combined with an orthogonal dCas13 or MS2-MCP system for dual-color RNA–RNA imaging, or with a dCas9 system for RNA–DNA imaging (Figure 7A). [ 106 ] More recently, the same research group also published a detailed protocol for the aforementioned dCas13b-mediated imaging of RNA in living cells. [ 107 ] The protocol thoroughly describes every step, including gRNA design, selection of fluorescent proteins, preparation of cells for microscopy, data analysis, and troubleshooting. [ 107 ] Moreover, inactive RfxCas13d coupled with fluorescent-labeled crRNA has been used along with a dCas9-fluorescent crRNA system for real-time simultaneous visualization of transcript RNA and genomic DNA in the method known as CRISPR LiveFISH (live-cell fluorescent in situ hybridization). [ 108 ]

5.4 Antiviral Applications

Vaccines and commonly used antivirals (i.e., small-molecule inhibitors and monoclonal antibodies) are often hindered by costliness, long development time, and viral resistance that arises from high mutation rates. [ 109 ] Considering the importance of viral genome replication for completion of viral life cycle in host cells, viral inhibition through CRISPR-Cas-mediated degradation of highly conserved and essential genetic elements could potentially be used as cheaper and more efficient antiviral strategy. The efficacy and feasibility of this strategy was initially explored with CRISPR-Cas9 systems, which hold considerable promise in curing chronic viral infections caused by viruses with characteristic latency state such as human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, herpes viruses and human papillomavirus. [ 110 ] However, ≈51%, 44%, and 70% of genera infecting humans, vertebrate animals, and plants, respectively, are ssRNA viruses that do not use DNA intermediates during their life cycles. [ 109, 111, 112 ] Even though the RNA-targeting CRISPR-Cas9 systems can be used, the exclusively ssRNA-targeting type VI CRISPR-Cas systems are more suitable for targeting ssRNA viruses (Figura 8).

The potential use of Cas13 systems in protecting plants against viruses was first demonstrated with LshCas13a, which was transgenically expressed in monocot and dicot plants to interfere with replication of economically important RNA viruses LshCas13a maintained its pre-crRNA processing activity in plants and did not cause cytotoxic effects. [ 47, 113, 114 ] RfxCas13d also exhibits robust and specific antiviral activity against RNA viruses in plants, at which it outperformed LwaCas13a and PspCas13b in both transient and stable overexpression assays in the study, RfxCas13d did not exert collateral cleavage effect in plants and was able to efficiently target two RNA viruses in parallel when crRNAs targeting both viruses were expressed in tested plants. [ 111 ] Recently published protocol describing transient expression of LbuCas13a and cognate CRISPR array in Nicotiana benthamiana will allow more extensive research on potential application of type VI CRISPR-Cas systems for antiviral defense in plants. [ 115 ]

Antiviral properties of Cas13 have also been tested against high doses of three distinct ssRNA viruses in mammalian cell lines lacking functional innate immune system, displaying potent viral inhibitory activity without affecting cell viability. [ 97 ] The authors of the study coupled Cas13-mediated virus targeting with SHERLOCK to create a comprehensive platform for diagnosis and treatment of viral diseases termed CARVER (Cas13-assisted restriction of viral expression and readout). [ 97 ] In the wake of COVID-19 pandemic and demands for alternative therapeutic approaches created by the lack of effective treatments and time required for vaccine development, Abbott et al. demonstrated the potential of Cas13-based therapy in combating emerging viral diseases. [ 116 ] Selecting RfxCas13d due to absence of PFS-imposed cleavage restrictions, robust and highly specific RNA interference and its compact size that would facilitate packaging and delivery, the authors developed PAC-MAN (prophylactic antiviral CRISPR in human cells) strategy for inhibiting SARS-CoV-2 and influenza A virus, as well as the majority of other coronavirus and influenza virus strains, by simultaneously targeting multiple highly conserved viral genomic regions. [ 116 ] The RfxCas13d-based PAC-MAN was shown to efficiently cleave SARS-CoV-2 RNA fragments and inhibit influenza A virus replication in human lung epithelial cell cultures, with greater inhibition at higher crRNA concentrations and lower viral titers. [ 116 ] The results of the study indicated that PAC-MAN could be effectively used for preventing new viral infections or as a complementary strategy along with traditional pharmaceuticals and vaccines. [ 116 ]

A variety of RNA viruses also infect domestic animals, thereby causing substantial economic losses. To investigate feasibility of repressing RNA virus infections in animals and humans with CRISPR-Cas13b systems, Cui et al. used PspCas13b to target two essential genes of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infected mammalian cells and almost completely inhibited viral gene transcription and expression. [ 117 ] Taking into account that delivery of Cas effector and gRNAs/CRISPR array via separate plasmids negatively affects targeting efficiency due to inconsistent expression levels of each component, the authors of the study also developed a single-vector delivery system that facilitates multiplexed targeting and further increases interference levels. [ 117 ]

In addition to potential application in targeting viruses in plants and mammals, type VI CRISPR-Cas systems could also be used in mosquitoes for suppressing mosquito-borne viral diseases such as dengue fever, chikungunya, and Zika. Tng et al. tested PspCas13b against a chimeric firefly luciferase reporter carrying the chikungunya virus (CHIKV) genomic sequence corresponding to the region encoding the nonstructural protein 2 (nsP2) and a CHIKV split replication system mimicking replication of viral RNA. [ 118 ] Guided by two gRNAs targeting nsP2 or CRISPR array targeting multiple sites in viral genome, PspCas13b performed efficiently against both the chimeric luciferase reporter and the CHIKV split replication system and significantly reduced viral RNA expression. [ 118 ] Interestingly, the two gRNAs targeting nsP2 were also capable of knocking down viral RNA in the absence of PspCas13b further investigation indicated that addition of PspCas13b enhanced viral RNA knockdown when U6 promoter-driven guides were used but did not increase suppression in cases when in vitro transcribed gRNAs were directly delivered to cells. [ 118 ] Since this phenomenon has not been observed in mammalian and plant cells, it is likely specific for mosquito cells, possibly because insect cells are generally more reliant on endogenous RNA interference systems that could utilize gRNAs to target viral sequences independently of PspCas13b. [ 118 ]


Scientists create tiny RNA molecule with big implications for life's origins

An extremely small RNA molecule created by a University of Colorado at Boulder team can catalyze a key reaction needed to synthesize proteins, the building blocks of life. The findings could be a substantial step toward understanding "the very origin of Earthly life," the lead researcher contends.

The smallest RNA enzyme ever known to perform a cellular chemical reaction is described in a paper published in the procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias. The paper was written by CU graduate student Rebecca Turk, research associate Nataliya Chumachenko and Professor Michael Yarus of the molecular, cellular and developmental biology department.

Cellular RNA can have hundreds or thousands of its basic structural units, called nucleotides. Yarus' team focused on a ribozyme -- a form of RNA that can catalyze chemical reactions -- with only five nucleotides.

Tom Blumenthal, a professor and chair of the MCDB department, noted that Tom Cech, a Nobel laureate and distinguished professor of chemistry and biochemistry at CU, and Professor Norman Pace of MCDB, independently discovered that RNA can act as an enzyme, carrying out chemical reactions. That "pioneering work" has been carried on further by Yarus, Blumenthal said.

Because proteins are complex, one vexing question is where the first proteins came from, Blumenthal said. "It now appears that the first catalytic macromolecules could have been RNA molecules, since they are somewhat simpler, were likely to exist early in the formation of the first life forms, and are capable of catalyzing chemical reactions without proteins being present," he said.

"In this paper the Yarus group has made the amazing discovery that even an extremely tiny RNA can by itself catalyze a key reaction that would be needed to synthesize proteins," Blumenthal said. "Nobody expected an RNA molecule this small and simple to be able to do such a complicated thing as that."

The finding adds weight to the "RNA World" hypothesis, which proposes that life on Earth evolved from early forms of RNA. "Mike Yarus has been one of the strongest proponents of this idea, and his lab has provided some of the strongest evidence for it over the past two decades," Blumenthal said.

Yarus noted that the RNA World hypothesis was complicated by the fact that RNA molecules are hard to make. "This work shows that RNA enzymes could have been far smaller, and therefore far easier to make under primitive conditions, than anyone has expected."

If very simple RNA molecules such as the product of the Yarus lab could have accelerated chemical reactions in Earth's primordial stew, the chances are much greater that RNA could direct and accelerate biochemical reactions under primitive conditions.

Before the advent of RNA, most biologists believe, there was a simpler world of chemical replicators that could only make more of themselves, given the raw materials of the time, Yarus said.

"If there exists that kind of mini-catalyst, a 'sister' to the one we describe, the world of the replicators would also jump a long step closer and we could really feel we were closing in on the first things on Earth that could undergo Darwinian evolution," Yarus said.

"In other words, we may have taken a substantial step toward the very origin of Earthly life," he said. "However, keep well in mind that the tiny replicator has not been found, and that its existence will be decided by experiments not yet done, perhaps not yet imagined."

"Dr. Yarus has brought an innovative approach to bear on the key question of how complex processes originated," said Michael Bender, a biologist who oversees protein synthesis grants at the National Institutes of Health's National Institute of General Medical Sciences. "By showing that a tiny segment of RNA can perform a key step of protein synthesis, this study has provided evidence that fundamental, protein-mediated cellular processes may have arisen from RNA-based mechanisms."

Yarus' work is supported by a $415,610 grant from the NIH. In 2008 he was named a fellow of the American Association for the Advancement of Science for "meritorious efforts to advance science or its applications."


Agricultural and Related Biotechnologies

4.25.4.4 Chloroplast Codon Optimization

It is well recognized that various organisms utilize certain codons in preference to others. Such preferential codon usage also occurs in chloroplasts. For example, the chloroplast of C. reinhardtii displays such codon bias, with codons containing adenine or uracil nucleotides in the third position favored over those with guanine or cytosine. 12,44 Codon usage bias is an important factor in limiting foreign gene expression in chloroplasts. 12,44 The adaption of foreign genes to the preferred codon usage of highly expressed chloroplast genes from Clamidia may be another effective strategy for increasing recombinant protein expression in algal chloroplasts. Franklin y col. 39 demonstrated that the optimization of a GFP reporter to reflect chloroplast codon usage increased its expression at least 80-fold as compared to its nonoptimized counterpart. Similarly, Mayfield and Schultz 45 showed increased expression of the bacterial luciferase reporter when a chloroplast codon-optimized version of this gene was transformed into the chloroplast of C. reinhardtii. These results may indicate the necessity for codon optimization of any gene for which high levels of protein production are desired when using algal chloroplasts as an expression platform.


Ver el vídeo: Traducción del ARN: Síntesis de proteínas (Mayo 2022).