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¿Se pueden producir diferentes proteínas durante la traducción de un solo ARNm en eucariotas?

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¿Existe un mecanismo de traducción que los eucariotas puedan usar para producir diferentes proteínas a partir de un solo ARNm transcrito?


Existen múltiples mecanismos que se sabe que conducen a la traducción de proteínas sustancialmente (o completamente) diferentes a partir de un solo ARNm. Si bien estos mecanismos se ven más típicamente en virus, me estoy enfocando en ejemplos documentados dentro del transcriptoma endógeno de eucariotas.

Iniciación a la traducción alternativa

Un proceso que puede llevar a que diferentes proteínas se traduzcan del mismo ARNm en eucariotas es el uso de sitios de inicio de traducción alternativos.1,2 La traducción normalmente comienza con un complejo de preiniciación que reconoce el casquete 5 'y se carga en el ARNm. Este complejo escanea hasta encontrar un sitio de inicio apropiado. La elección del sitio de inicio depende de qué tan bien coincida la secuencia de ribonucleótidos con la secuencia de consenso de Kozak.3 Si la región alrededor del primer AUG no coincide con ese consenso, se produce un proceso conocido como escaneo con fugas y el complejo de preiniciación puede continuar a lo largo del ARNm hasta que se encuentra un sitio de inicio "bueno".

Si bien esto puede dar como resultado proteínas con diferentes funciones, normalmente todavía tendrán grandes regiones de secuencia de aminoácidos en común. Un ejemplo de esto es una quinasa conocida como MK2, que es "un regulador clave de la transcripción, migración, señalización de muerte y regulación génica postranscripcional".4

ARNm policistrónicos

Si bien es más común en procariotas, en algunos casos los eucariotas también tienen transcripciones policistrónicas5,6. Estas transcripciones codifican múltiples proteínas separadas (es decir, de marcos de lectura abiertos independientes). Los ejemplos que he encontrado para mamíferos son todos bicistrónicos (operones con dos genes): LASS1-GDF1, SNRPN-SNURF, MTPN-LUZP6 y MFRP-C1QTNF5. Puede buscar esos pares de genes, pero no parece haber una gran cantidad de información disponible y, en muchos casos, uno de los genes está casi completamente sin caracterizar. Los operones eucariotas (también conocidos como ARNm policistrónicos) son ubicuos en los tripanosomas, parecen ser muy comunes en los nematodos (gusanos redondos) y también se ven con frecuencia en Drosophila (una mosca).6

Lectura traslacional

Lectura traslacional también conocida como. La supresión del codón de parada se produce cuando un codón de parada en marco se ignora estocásticamente o en condiciones específicas y la traducción continúa más allá de ese punto. Esto conduce a una extensión C-terminal de la proteína que en algunos casos se ha demostrado que tiene implicaciones funcionales.7,8. Un ejemplo de esto es el prión [PSI +] en la levadura, que promueve la lectura traslacional en todo el transcriptoma de la levadura al inactivar un factor involucrado en la terminación de la traducción.7

Desplazamientos de fotogramas traslacionales

Esto está bien cubierto en la respuesta de @Dirigible.

Referencias:

1: Kochetov, A. V. (2008). Sitios de inicio de traducción alternativos y potencial de codificación oculto de ARNm eucariotas. Bioensayos, 30 (7), 683-691.

2: Wan, J. y Qian, S. B. (2013). TISdb: una base de datos para el inicio de la traducción alternativa en células de mamíferos. Investigación de ácidos nucleicos, 42 (D1), D845-D850.

3: Acevedo, J. M., Hoermann, B., Schlimbach, T. y Teleman, A. A. (2018). Los cambios en las tasas de elongación o iniciación de la traducción global dan forma al proteoma a través de la secuencia de Kozak. Informes científicos, 8 (1), 4018. 4: Trulley, P., Snieckute, G., Bekker-Jensen, D., Menon, MB, Freund, R., Kotlyarov, A.,… y Gaestel, M. ( 2019). La iniciación de la traducción alternativa genera una isoforma funcionalmente distinta de la proteína quinasa MK2 activada por estrés. Informes de celda, 27 (10), 2859-2870.

5: Tautz, D. (2008). Genes codificadores de péptidos policistrónicos en eucariotas: ¿qué tan extendidos están? Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 8 (1), 68-74.

6: Blumenthal, T. (2004). Operones en eucariotas. Briefings in Functional Genomics, 3 (3), 199-211.

7: Schueren, F. y Thoms, S. (2016). Lectura traslacional funcional: una perspectiva de biología de sistemas. Genética PLoS, 12 (8), e1006196.

8: Loughran, G., Jungreis, I., Tzani, I., Power, M., Dmitriev, R. I., Ivanov, I. P.,… y Atkins, J. F. (2018). La lectura completa del codón de parada genera una variante extendida en el extremo C del receptor de vitamina D humano con una respuesta de calcitriol reducida. Revista de química biológica, 293 (12), 4434-4444.


Aparte del mecanismo del sitio de inicio de traducción alternativo que describe tyersome es el cambio de marco de traducción programado. Esto es independiente del empalme alternativo o modificaciones postraduccionales, y ocurre cuando un ribosoma cambia los marcos de lectura mientras una proteína ya se está traduciendo. Normalmente, este fenómeno está asociado con la traducción viral y permite que los virus codifiquen muchas proteínas en genomas relativamente cortos. Tomemos el VIH como ejemplo: la poliproteína gag-pol requiere un desplazamiento de marco -1 eficaz para la expresión de los productos individuales de los genes gag y pol.

En eucariotas, los ejemplos son más escasos. Echa un vistazo a esta revisión de 2012 -

… Ejemplos de genes de mamíferos que utilizan -1 framehifting son el gen regulado por diferenciación del carcinoma embrionario de ratón (EDR) y su ortólogo humano PEG10. Una secuencia resbaladiza de G GGA AAC, en combinación con un pseudonudo, media un cambio de marco -1 altamente eficiente, similar a los motivos de cambio de marco virales (Clark et al., 2007). Recientemente, se ha identificado un cambio de marco ribosómico -1 programado en el ARNm de la poliposis coli adenomatosa (APC) en Caenorhabditis elegans que está mediado por una secuencia resbaladiza A AAA AAA o A AAA AAC (Baranov et al., 2011). La relevancia funcional de este cambio de marco es incierta.

Los eventos de cambio de marco a menudo están mediados por estructuras secundarias de ARN conservadas, como pseudonudos y bucles de tallo. Para ver algunos ejemplos específicos de los tipos de estructuras involucradas en el cambio de fotogramas, consulte las siguientes publicaciones:

Identificación de un nuevo pseudonudo estimulador de cambio de marco de ARNm de Antizyme +1 en un subconjunto de invertebrados diversos y su ausencia aparente en especies intermedias

Sondeo estructural y análisis mutagénico del tallo-loop requerido para el cambio de marco ribosómico dnaX de Escherichia coli: eficiencia programada del 50%

−1 Se requiere desplazamiento de fotograma en un sitio de hexanucleótido CGA AAG para la transposición de la secuencia de inserción IS1222


Algunos ejemplos más recientes de (potenciales) cambios de marco de traducción programados en eucariotas:

Búsqueda de posibles cambios de marco de lectura en cds de Arabidopsis thaliana y otros genomas

Preimpresión: Amplio cambio de marco ribosómico programado en humanos según lo revelado por un ensayo informador masivamente paralelo


TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN DE ACOPLAMIENTO EN EUCARIOTAS [O & # 8217SHEA LAB]

El dogma central de la biología molecular propone que la información fluye del ADN al ARN a través del proceso de transcripción y del ARN a la proteína a través de la traducción. En eucariotas, estos dos procesos se consideran desconectados: los factores nucleares controlan la transcripción y un conjunto diferente de factores controlan la traducción en el citoplasma. Durante tiempos de estrés, las células exhiben grandes cambios transcripcionales, incluida la regulación positiva de muchos genes importantes para la supervivencia. Al mismo tiempo que estos grandes cambios transcripcionales, las células disminuyen drásticamente la síntesis de proteínas en general, lo que amortigua la respuesta al estrés a nivel de expresión de proteínas. Brian Zid y Erin O’Shea se preguntaron si podría haber una traducción preferencial de las transcripciones en situaciones de estrés. Para averiguarlo, estudiaron la falta de glucosa en la levadura, una condición en la que la traducción se reprime rápidamente mientras se producen grandes cambios transcripcionales.

Utilizando el perfil de ribosomas, una técnica que mide la cantidad de ribosomas en los ARNm mediante secuenciación de próxima generación, los autores encontraron que un subconjunto de ARNm transcripcionalmente regulados al alza se traducían preferentemente durante la inanición de glucosa. Un fenómeno conservado tras el estrés es la formación de agregados de ARNm-proteína, llamados gránulos de estrés. Usando microscopía fluorescente, encontraron que los ARNm que se traducían preferentemente permanecían difusos en todo el citoplasma, mientras que los ARNm transcripcionalmente regulados al alza pero mal traducidos se agregaban en gránulos de estrés.

Sorprendentemente, la información que especifica la localización diferencial y la producción de proteínas de estas dos clases de ARNm no se encuentra directamente en la secuencia de ARNm, sino que está codificada en la secuencia promotora que dirige la producción de ARNm. Los autores encontraron que la capacidad de respuesta del promotor al factor de transcripción factor de choque térmico (Hsf1) especifica la localización citoplásmica difusa y una mayor producción de proteínas tras la inanición de glucosa, mientras que los elementos promotores corriente arriba de los ARNm mal traducidos dirigen estos ARNm a los gránulos de estrés bajo la falta de glucosa.

Esto altera el paradigma actual de que la transcripción y la traducción están desconectadas en eucariotas, en cambio, los autores encuentran que estos procesos espacialmente distintos están acoplados durante la limitación de nutrientes. Un vínculo entre la regulación transcripcional y la localización citoplásmica puede ser una adaptación general durante momentos de estrés, lo que permite que la célula regule de manera coordinada la producción de clases enteras de proteínas. En condiciones sin estrés, la regulación positiva de una clase de transcripciones por un factor de transcripción produciría cantidades similares de proteína de cada uno de los ARNm, ya que la traducción procedería a una velocidad generalmente alta. En condiciones de estrés cuando se reduce la traducción general, puede ser necesaria la traducción selectiva para producir las proteínas necesarias para la adaptación a la nueva condición. Esto sugiere que la traducción de conjuntos de genes se puede coordinar utilizando un solo factor nuclear, sin la necesidad de modular la secuencia de cada ARNm.

Este trabajo, que aparecerá en la edición del 7 de agosto de Nature, ofrece una nueva dirección para investigar si la localización del ARNm dependiente del promotor regula la expresión de proteínas en una variedad de estados celulares. El laboratorio de O'Shea está trabajando actualmente para identificar los factores que pueden estar co-transcripcionalmente cargados en los ARNm para determinar el destino de un ARNm.


Bioquímica. 5ª edición.

El plan básico de síntesis de proteínas en eucariotas y arqueas es similar al de las bacterias. Los principales temas estructurales y mecanicistas se repiten en todos los ámbitos de la vida. Sin embargo, la síntesis de proteínas eucariotas implica más componentes proteicos que la síntesis de proteínas procariotas, y algunos pasos son más complejos. Algunas similitudes y diferencias notables son las siguientes:

Ribosomas. Los ribosomas eucariotas son más grandes. Consisten en una subunidad grande 60S y una subunidad pequeña 40S, que se unen para formar una partícula 80S que tiene una masa de 4200 kd, en comparación con 2700 kd para el ribosoma procariótico 70S. La subunidad 40S contiene un ARN 18S que es homólogo al ARN 16S procariótico. La subunidad 60S contiene tres ARN: los ARN 5S y 28S son las contrapartes de las moléculas procariotas 5S y 23S, su ARN 5.8S es exclusivo de los eucariotas.

ARNt iniciador. En eucariotas, el aminoácido iniciador es metionina en lugar de norte-formilmetionina. Sin embargo, como en los procariotas, un ARNt especial participa en la iniciación. Este aminoacil-tRNA se llama Met-tRNAI o Met-tRNAF (el subíndice & # x0201ci & # x0201d significa iniciación, y & # x0201cf & # x0201d indica que se puede formular in vitro).

Iniciación. El codón de iniciación en eucariotas es siempre AUG. Los eucariotas, a diferencia de los procariotas, no utilizan una secuencia rica en purina específica en el lado 5 & # x02032 para distinguir los AUG iniciadores de los internos. En cambio, el AUG más cercano al extremo 5 & # x02032 del ARNm generalmente se selecciona como el sitio de inicio. Un ribosoma 40S se adhiere a la tapa en el extremo 5 & # x02032 del ARNm eucariota (Sección 28.3.1) y busca un codón AUG moviéndose paso a paso en la dirección 3 & # x02032 (Figura 29.33). Este proceso de exploración en la síntesis de proteínas eucariotas está impulsado por helicasas que hidrolizan el ATP. Emparejamiento del anticodón de Met-tRNAI con el codón AUG del ARNm indica que se ha encontrado la diana. En casi todos los casos, el ARNm eucariota tiene solo un sitio de inicio y, por lo tanto, es la plantilla para una sola proteína. Por el contrario, un ARNm procariota puede tener múltiples secuencias de Shine-Dalgarno y, por tanto, sitios de inicio, y puede servir como molde para la síntesis de varias proteínas. Los eucariotas utilizan muchos más factores de iniciación que los procariotas, y su interacción es mucho más compleja. El prefijo eIF denota un factor de iniciación eucariota. Por ejemplo, eIF-4E es una proteína que se une directamente a la capa de 7-metilguanosina (Sección 28.3.1), mientras que eIF-4A es una helicasa. La diferencia en el mecanismo de iniciación entre procariotas y eucariotas es, en parte, una consecuencia de la diferencia en el procesamiento del ARN. El extremo 5 & # x02032 del ARNm está fácilmente disponible para los ribosomas inmediatamente después de la transcripción en procariotas. Por el contrario, el pre-ARNm debe procesarse y transportarse al citoplasma en eucariotas antes de que se inicie la traducción. Por lo tanto, existe una amplia oportunidad para la formación de estructuras secundarias complejas que deben eliminarse para exponer señales en el ARNm maduro. La tapa 5 & # x02032 proporciona un punto de partida fácilmente reconocible. Además, la complejidad del inicio de la traducción eucariota proporciona otro mecanismo para la expresión génica que exploraremos más a fondo en el capítulo 31.

Alargamiento y terminación. Los factores de elongación eucariotas EF1 & # x003b1 y EF1 & # x003b2 & # x003b3 son contrapartes de los procariotas EF-Tu y EF-Ts. La forma GTP de EF1 & # x003b1 entrega aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma, y ​​EF1 & # x003b2 & # x003b3 cataliza el intercambio de GTP por GDP unido. El EF2 eucariótico media la translocación impulsada por GTP de la misma manera que lo hace el EF-G procariótico. La terminación en eucariotas se lleva a cabo mediante un único factor de liberación, eRF1, en comparación con dos en procariotas. Finalmente, eIF3, como su contraparte procariota IF3, previene la reasociación de subunidades ribosómicas en ausencia de un complejo de iniciación.

Figura 29.33

Iniciación a la traducción eucariota. En eucariotas, el inicio de la traducción comienza con el ensamblaje de un complejo en el casquete 5 & # x02032 que incluye la subunidad 40S y Met-tRNAI. Impulsado por la hidrólisis de ATP, este complejo escanea el ARNm hasta el primer AUG (más.)


Modificaciones del ARN mensajero

La traducción ocurre en el citoplasma. Después de salir del núcleo, el ARNm debe sufrir varias modificaciones antes de ser traducido. Se eliminan las secciones del ARNm que no codifican aminoácidos, llamadas intrones. Se agrega una cola poli-A, que consta de varias bases de adenina, a un extremo del ARNm, mientras que se agrega una tapa de trifosfato de guanosina en el otro extremo. Estas modificaciones eliminan las secciones innecesarias y protegen los extremos de la molécula de ARNm. Una vez que se completan todas las modificaciones, el ARNm está listo para la traducción.


Características del ARNm de procariotas y eucariotas

El ARNm producido a través del proceso de transcripción también se conoce como transcripciones de ARNm. Aunque tienen varias características similares, también tienen varias diferencias. La transcripción de ARNm procariota se puede dividir en varias partes / secciones que incluyen: la región no codificante (ubicada en el extremo 5 'de la transcripción), la secuencia de Shine-Dalgarno, una segunda región no codificante, el codón de inicio , la región codificante, el codón de terminación y otra región no codificante en el extremo 3 '.

El ARNm eucariota, por otro lado, comienza con una tapa 5 'y consiste en un nucleótido de guanina. Este nucleótido está unido a un grupo metilo y unido al nucleótido vecino. El nucleótido de guanina está unido a la región no codificante, similar a la del ARNm procariótico. La siguiente sección es el codón de inicio desde el que se extiende la región codificante.

La región codificante termina en el codón de terminación. A esto le sigue una región no codificante y, por último, la cola poli-A (formada por adeninas y puede constar de hasta 2200 nucleótidos) en el extremo 3 '. En eucariotas, la tapa 5 'y la cola poli-A evitan que el ARNm se degrade.

Aquí, es importante recordar que en los eucariotas, el ARNm debe liberarse en el citoplasma donde tiene lugar la traducción. Por lo tanto, las dos secciones juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad del ARNm. En los procariotas, la transcripción y la traducción pueden ocurrir al mismo tiempo y, por lo tanto, estas secciones no son necesarias.

A diferencia de la transcripción eucariota, este ARNm no tiene que ser transportado a una gran distancia y, por lo tanto, no encuentra varias enzimas que probablemente lo degraden. Como resultado, el ARNm de los procariotas no requiere protección adicional para evitar daños.

Como se mencionó, traducción es el proceso mediante el cual se construyen los componentes básicos de las proteínas (polipéptidos / cadenas de aminoácidos) utilizando la información contenida en el ARNm. Es un proceso importante dado que produce proteínas necesarias para diversas funciones celulares.

Para comprender el proceso, es importante conocer algunos de los componentes y terminologías que se utilizan en la traducción.

Además del ARNm (ARN mensajero), incluyen:

· Polipéptidos - Cadenas de aminoácidos y son las moléculas que componen las proteínas.

· Nucleótidos - Componentes estructurales de ADN y ARN. Ellos mismos están compuestos de nucleósidos y fosfatos e incluyen adenina, timina, citosina y guanina (así como uracilo).

· Codones - Un grupo que consta de tres nucleótidos - Por ejemplo, AUG es un buen ejemplo de un codón - Mientras que los codones sirven como bloques de construcción de aminoácidos, otros detienen el proceso una vez que el polipéptido está completo.

· tRNA (transferencia de ARN) - Actuar como puente entre codones de ARNm y aminoácidos.

· Ribosoma - Los ribosomas consisten en ARNr y proteínas y son las estructuras en las que se fabrican los polipéptidos.


El comienzo del ARNm no se traduce

Curiosamente, no todas las regiones de una molécula de ARNm corresponden a aminoácidos particulares. En particular, hay un área cerca del extremo 5 'de la molécula que se conoce como región no traducida (UTR) o secuencia líder. Esta porción de ARNm se encuentra entre el primer nucleótido que se transcribe y el codón de inicio (AUG) de la región codificante, y no afecta la secuencia de aminoácidos en una proteína (Figura 3).

Entonces, ¿cuál es el propósito de la UTR? Resulta que la secuencia líder es importante porque contiene un sitio de unión al ribosoma. En bacterias, este sitio se conoce como la caja Shine-Dalgarno (AGGAGG), en honor a los científicos John Shine y Lynn Dalgarno, quienes lo caracterizaron por primera vez. Un sitio similar en los vertebrados fue caracterizado por Marilyn Kozak y, por lo tanto, se conoce como la caja de Kozak. En el ARNm bacteriano, el 5 'UTR es normalmente corto en el ARNm humano, la longitud media del 5' UTR es de aproximadamente 170 nucleótidos. Si el líder es largo, puede contener secuencias reguladoras, incluidos sitios de unión para proteínas, que pueden afectar la estabilidad del ARNm o la eficiencia de su traducción.



Procesamiento adicional

Antes de que el ARNm abandone el núcleo, se le dan dos “tapas” protectoras que evitan que los extremos de la hebra se degrade durante su viaje. Los dos extremos de una cadena de ADN se denominan 3 'y 5', que hace referencia a la posición de las moléculas de azúcar en el ADN. La tapa 5 'se coloca en el extremo 5' del ARNm. La cola poli-A, que está unida al extremo 3 ', generalmente está compuesta por una larga cadena de nucleótidos de adenina (A). Estos cambios protegen los dos extremos del ARN de ser degradados por otras enzimas en la célula.

Un azúcar de nucleótido se compone de 5 carbonos cada uno está numerado (el apóstrofo "‘ "se llama" primo "). Los fosfatos se unen al carbono 3 ′ y al carbono 5 ′ de cada azúcar. Un extremo de una molécula de ADN o ARN termina con el carbono 3 ′ expuesto y el otro lado termina con un fosfato unido al extremo 5 ′ del último azúcar. Es por eso que un extremo se denomina 3 ′ y el otro extremo se denomina 5 ′.


¿Se pueden producir diferentes proteínas durante la traducción de un solo ARNm en eucariotas? - biología

El dogma central depende de la existencia y las propiedades de un ejército de moléculas de ARNm que se generan transitoriamente en el proceso de transcripción y, a menudo, poco después, se degradan. Durante el corto tiempo que se encuentran en una célula, estos ARNm sirven como plantilla para la creación de una nueva generación de proteínas. La pregunta que se plantea en esta viñeta es la siguiente: en promedio, ¿cuál es la proporción entre el mensaje traducido y el mensaje en sí?

Aunque hay muchos factores que controlan la relación proteína-ARNm, el modelo más simple apunta a una estimación en términos de unas pocas tasas clave. Para ver eso, necesitamos escribir una "ecuación de velocidad" simple que nos diga cómo cambiará el contenido de proteína en un incremento muy pequeño de tiempo. Más precisamente, buscamos la dependencia funcional entre el número de copias proteicas de un gen (p) y el número de moléculas de ARNm (m) que lo engendran. La tasa de formación de p es igual a la tasa de traducción multiplicada por el número de mensajes, m, ya que cada molécula de ARNm puede considerarse en sí misma como una fuente de proteína. Sin embargo, al mismo tiempo que se sintetizan nuevas proteínas, la degradación de las proteínas está eliminando constantemente las proteínas de la circulación. Además, el número de proteínas que se degradan es igual a la tasa de degradación multiplicada por el número total de proteínas. Estas palabras engorrosas pueden encapsularse mucho más elegantemente en una ecuación que nos dice cómo en un pequeño instante de tiempo cambia el número de proteínas, es decir,

donde α es la tasa de degradación y β es la tasa de traducción (aunque, lamentablemente, la literatura está dividida entre quienes definen la notación de esta manera y quienes usan las letras con exactamente el significado opuesto).

Figura 1: Ribosomas en ARNm como cuentas en una cuerda (de: http://bass.bio.uci.edu/

Nos interesa la solución de estado estacionario, es decir, lo que sucede después de que ha pasado un tiempo suficientemente largo y el sistema ya no está cambiando. En ese caso dp / dt = 0 = βm-αp. Esto nos dice a su vez que la relación proteína / ARNm viene dada por p / m = β / α. Observamos que esto no es lo mismo que el número de proteínas producidas a partir de cada ARNm, este valor requiere que conozcamos también la tasa de renovación del ARNm que tomamos al final de la viñeta. Cual es el valor de B ? Un ARNm traducido rápidamente tendrá ribosomas decorándolo como cuentas en una cuerda, como se captura en la micrografía electrónica clásica que se muestra en la Figura 1. Su distancia entre sí a lo largo del ARNm es al menos del tamaño de la huella física de un ribosoma (≈20 nm , BNID 102320, 105000) que es la longitud de aproximadamente 60 pares de bases (longitud del nucleótido ≈0,3 nm, BNID 103777), equivalente a ≈20 aa. La tasa de traducción es de aproximadamente 20 aa / seg. Por lo tanto, se necesita al menos un segundo para que un ribosoma se mueva a lo largo de su propia huella de tamaño físico sobre el ARNm, lo que implica una tasa de traducción general máxima de b = 1 s -1 por transcripción.

La tasa de degradación efectiva surge no solo de la degradación de las proteínas, sino también de un efecto de dilución a medida que la célula crece. De hecho, de los dos efectos, a menudo predomina el efecto de dilución de la división celular y, por tanto, el tiempo de degradación efectivo global, que tiene en cuenta la dilución, es aproximadamente el intervalo de tiempo de un ciclo celular, τ. Por tanto, tenemos α = 1 / τ.

A la luz de estos números, la relación p / m es, por lo tanto, 1 s -1 / (1 /τ)= τ. Para E. coli, τ es aproximadamente 1000 sy por lo tanto p / m

1000. Por supuesto, si el ARNm no se transcribe a la velocidad máxima, la proporción será menor. Realicemos una verificación de cordura en este resultado. Bajo crecimiento exponencial a tasa de crecimiento media E. coli se sabe que contiene alrededor de 3 millones de proteínas y 3000 ARNm (BNID 100088, 100064). Estas constantes implican que la proporción de proteína a ARNm es ≈1000, precisamente en línea con la estimación dada anteriormente. Podemos realizar una segunda verificación de cordura basada en información de viñetas anteriores. En la viñeta sobre "¿Qué es más pesado un ARNm o la proteína que codifica?" derivamos una relación de masa de aproximadamente 10: 1 para el ARNm y las proteínas que codifican. En la viñeta sobre "¿Cuál es la composición macromolecular de la célula?" mencionamos que la proteína es aproximadamente el 50% de la masa seca en E. coli células, mientras que el ARNm son solo alrededor del 5% del ARN total en la célula, que en sí mismo es aproximadamente el 20% de la masa seca. Esto implica que el ARNm es, por tanto, aproximadamente el 1% de la masa seca total. Entonces, la proporción de ARNm a proteína debería ser aproximadamente 50 veces 10, o 500 a 1. Desde nuestro punto de vista, todos estos controles de cordura se mantienen muy bien juntos.

Figura 2: Medición simultánea de ARNm y proteína en E. coli. (A) Imágenes de microscopía del nivel de ARNm en células de E. coli. (B) Imágenes de microscopía de proteína en células de E. coli. (C) Número de copias de proteína frente a niveles de ARNm obtenidos utilizando métodos de microscopía como los que se muestran en la parte (A) y utilizando métodos basados ​​en secuenciación. De Taniguchi et al. Ciencias. 329, 533 (2010).

Experimentalmente, ¿cómo se determinan estos números en las proporciones de proteína a ARNm? Un método elegante es utilizar microscopía de fluorescencia para observar simultáneamente los ARNm mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH) y sus productos proteicos que se han fusionado a una proteína fluorescente. La Figura 2 muestra imágenes de microscopía tanto del ARNm como de la proteína de fusión traducida correspondiente para un gen particular en E. coli. La Figura 2C muestra los resultados que utilizan estos métodos para múltiples genes y confirma un exceso de 100 a 1000 veces en el número de copias de proteínas sobre sus correspondientes ARNm. Como se ve en esa figura, no solo es útil la visualización directa por microscopía, sino que también se han invocado métodos basados ​​en secuencias.

Para organismos de crecimiento más lento, como levaduras o células de mamíferos, esperamos una proporción mayor con la salvedad de que nuestras suposiciones sobre la tasa de traducción máxima se están volviendo cada vez más tenues y con eso nuestra confianza en la estimación. Para levaduras con tasas de crecimiento medias a rápidas, se informó que el número de ARNm estaba en el rango de 10,000-60,000 por célula (BNID 104312, 102988, 103023, 106226, 106763). Como las células de levadura son 50 veces más grandes en volumen que E. coli, el número de proteínas se puede estimar como mayor en esa proporción, o 200 millones. La relación p / m es entonces ≈2 & # 21510 8/2 & # 21510 4 ≈10 4, en línea con el valor experimental de aproximadamente 5,000 (BNID 104185, 104745). Para la levadura dividida cada 100 minutos, esto es del orden de la cantidad de segundos en su tiempo de generación, de acuerdo con nuestra estimación bruta anterior.

Figura 3: Relación proteína / ARNm en levadura de fisión. (A) Histograma que ilustra el número de copias de ARNm y proteínas determinadas mediante métodos de secuenciación y espectrometría de masas, respectivamente. (B) Gráfico de abundancia de proteínas y abundancia de ARNm gen por gen. Adaptado de S. Marguerat et al., Cell, 151: 671, 2012. Un análisis reciente (R. Milo, Bioessays, 35: 1050, 2014) sugiere que los niveles de proteína se han subestimado y un factor de corrección de aproximadamente 5 veces mayor debe aplicarse, lo que hace que la proporción de proteína a ARNm se acerque más a 104.

Al igual que con muchas de las cantidades descritas a lo largo del libro, la locura de alto rendimiento en todo el genoma también ha afectado al tema de esta viñeta. Específicamente, utilizando una combinación de RNA-Seq para determinar el número de copias de mRNA y los métodos de espectrometría de masas y el perfil ribosómico para inferir el contenido de proteína de las células, es posible ir más allá de las estimaciones y mediciones específicas de gen por gen descritas anteriormente. Como se muestra en la Figura 3 para la levadura de fisión, la distribución de ARNm y proteína en todo el genoma confirma las estimaciones proporcionadas anteriormente que muestran un exceso de proteína a ARNm de más de mil veces en la mayoría de los casos. De manera similar, en líneas celulares de mamíferos se infiere una proporción de proteína a ARNm de aproximadamente 104 (BNID 110236).

Figura 4: Dinámica de la producción de proteínas. (A) Ráfagas en la producción de proteínas como resultado de múltiples rondas de traducción en la misma molécula de ARNm antes de que decaiga. (B) Distribución de tamaños de ráfaga para la proteína beta-galactosidasa en E. coli. (Adaptado de L. Cai et al., Nature, 440: 358, 2006.)

Hasta ahora, nos hemos centrado en el número total de copias de proteínas por ARNm y no en el número de proteínas producidas por ráfaga de producción que se produce a partir de un ARNm determinado. Esta denominada medición del tamaño de ráfaga se muestra en la Figura 4, que muestra la proteína beta-galactosidasa en E. coli la distribución de los tamaños de ráfaga observados, disminuyendo rápidamente del puñado común a muchos menos casos de más de 10.

Finalmente, observamos que hay un tercer significado de la pregunta que da título a esta viñeta, donde podríamos preguntar cuántas proteínas se producen a partir de cada ARNm individual antes de que se degrade. Por ejemplo, en rápido crecimiento E. coli, los ARNm se degradan aproximadamente cada 3 minutos, como se explica en la viñeta sobre "¿Cuáles son las tasas de degradación del ARNm y las proteínas?". Esta escala de tiempo es entre 10 y 100 veces más corta que el tiempo del ciclo celular. Como resultado, para pasar de la afirmación de que la relación proteína / ARNm es típicamente 1000 al número de proteínas producidas a partir de un ARNm antes de que se degrade, necesitamos dividir el número de vidas útiles del ARNm por ciclo celular. Encontramos que en esta rápida división E. coli En el escenario, cada ARNm da lugar a aproximadamente 10-100 proteínas antes de ser degradado.

Un estudio reciente (G. Csardi et al., PLOS genetics, 2015) sugiere revisar la pregunta básica de esta viñeta. El análisis cuidadoso de decenas de estudios sobre los niveles de ARNm y proteínas en la levadura en ciernes, el organismo modelo más común para tales estudios, sugiere una relación no lineal en la que los genes con niveles altos de ARNm tendrán una relación proteína / ARNm más alta que los ARNm poco expresados. Esto sugiere que la correlación entre el ARNm y la proteína no tiene una pendiente de 1 en la escala logarítmica, sino más bien una pendiente de aproximadamente 1,6, lo que también explica por qué el rango dinámico de las proteínas es significativamente mayor que el del ARNm.


Spliceosomes, ensamblados a partir de snRNPs y un pre-mRNA, llevan a cabo el empalme

Incluso antes de que se lograra el empalme in vitro, varias observaciones llevaron a la sugerencia de que pequeños ARN nucleares (snRNA) ayudar en la reacción de empalme. Primero, se encontró que la secuencia de consenso corta en el extremo 5 & # x02032 de los intrones era complementaria a una secuencia cerca del extremo 5 & # x02032 del snRNA llamado U1. En segundo lugar, se encontraron snRNAs asociados con hnRNPs en extractos nucleares. Cinco snRNA ricos en U (U1, U2, U4, U5 y U6), que varían en longitud de 107 a 210 nucleótidos, participan en el empalme del ARN.

En el núcleo de las células eucariotas, los snRNA están asociados con seis a diez proteínas en partículas pequeñas de ribonucleoproteína nuclear (snRNP). Algunas de estas proteínas son comunes a todas las snRNP y algunas son específicas de las snRNP individuales. Los experimentos con un oligonucleótido sintético que se hibrida con la región del extremo 5 & # x02032 del snRNA U1 y estudios posteriores con pre-mRNA que fueron mutados en la secuencia de consenso del sitio de empalme 5 & # x02032 proporcionaron una fuerte evidencia de que el emparejamiento de bases entre el empalme 5 & # x02032 Se requiere el sitio de un pre-ARNm y la región 5 & # x02032 del ARNnn U1 para el corte y empalme del ARN.

Inicialmente se sospechó la participación del ARNnn de U2 en el empalme cuando se encontró que tenía una secuencia interna que es en gran parte complementaria a la secuencia de consenso que flanquea el punto de ramificación en los pre-ARNm (ver Figura 11-14). Mutation experiments, similar to those conducted with U1 snRNA and 5′ splice sites, demonstrated that base pairing between U2 snRNA and the branch-point sequence in pre-mRNA is critical to splicing. These studies with U1 and U2 snRNAs indicate that during splicing they base-pair with pre-mRNA as shown in Figure 11-17. Significantly, the branch- point A itself, which is not base-paired to U2 snRNA, 𠇋ulges out,” allowing its 2′ hydroxyl to participate in the first transesterification reaction of RNA splicing (see Figure 11-16).

Figure 11-17

Diagram of interactions between pre-mRNA, U1 snRNA, and U2 snRNA early in the splicing process. The 5′ region of U1 snRNA initially base-pairs with nucleotides at the 5′ end of the intron (blue) and 3′ end of the 5′ exon (more. )

Similar studies with other snRNAs demonstrated that RNA-RNA interactions involving them also occur during splicing. For example, an internal region of U6 snRNA initially base-pairs with the 5′ end of U4 snRNA. Rearrangements later in the splicing process result in U6 snRNA base pairing with the 5′ end of U2 snRNA, which remains base-paired to the branch-point sequence in the intron. Later in the splicing process, base pairing of U5 snRNA with four exon nucleotides adjacent to the splice sites displaces U1 snRNA from the pre-mRNA.

Based on the results of these experiments, identification of reaction intermediates, and other biochemical analyses, the five splicing snRNPs are thought to sequentially assemble on the pre-mRNA forming a large ribonucleoprotein complex called a spliceosome, which is roughly the size of a ribosome (Figure 11-18). According to the model depicted in Figure 11-19, assembly of a spliceosome begins with the base pairing of U1 and U2 snRNAs, as part of the U1 and U2 snRNPs, to the pre-mRNA (see Figure 11-17). Extensive base pairing between the snRNAs in the U4 and U6 snRNPs forms a complex that associates with U5 snRNP. The U4/U6/U5 complex then associates, presumably via protein-protein interactions, with the previously formed complex consisting of a pre-mRNA base-paired to U1 and U2 snRNPs to yield a spliceosome.

Figure 11-18

Electron micrograph of a spliceosome. Extracts of HeLa cells were mixed with a β-globin pre-mRNA the reaction was interrupted before splicing was completed, so that the spliceosomes, containing snRNPs and the pre-mRNA substrate, could be purified. (more. )

Figure 11-19

The spliceosomal splicing cycle. The splicing snRNPs (U1, U2, U4, U5, and U6) associate with the pre-mRNA and with each other in an ordered sequence to form the spliceosome. This large ribonucleoprotein complex then catalyzes the two transesterification (more. )

After formation of the spliceosome, extensive rearrangements occur in the pairing of snRNAs and the pre-mRNA, as noted previously. The rearranged spliceosome then catalyzes the two transesterification reactions that result in RNA splicing. After the second transesterification reaction, the ligated exons are released from the spliceosome while the lariat intron remains associated with the snRNPs. This final intron-snRNP complex is unstable and dissociates. The individual snRNPs released participate in a new cycle of splicing. The excised intron is rapidly degraded by a �ranching enzyme,” which hydrolyzes the 5′,2′-phosphodiester bond at the branch point, and other nuclear RNases.

It is estimated that at least one hundred proteins are involved in RNA splicing, making this process comparable in complexity to protein synthesis and initiation of transcription. Some of these splicing factors are associated with snRNPs, but others are not. Sequencing of yeast genes encoding splicing factors has revealed that they contain domains with the RNP motif, which interacts with RNA, and the SR motif, which interacts with other proteins and may contribute to RNA binding. Some splicing factors also exhibit sequence homologies to known RNA helicases these may be necessary for the base-pairing rearrangements that occur in snRNAs during the spliceosomal splicing cycle.

Introns whose splice sites do not conform to the standard consensus sequence recently were identified in some pre-mRNAs. This class of introns begins with AU and ends with AC rather than following the usual “GU –𠁚G rule” (see Figure 11-14). Research on the biochemistry of splicing for this special class of introns soon identified four novel snRNPs. Together with the standard U5 snRNP, these snRNPs appear to participate in a splicing cycle analogous to that discussed above.


Recent advances in mRNA vaccine technology

Various mRNA vaccine platforms have been developed in recent years and validated in studies of immunogenicity and efficacy 18,19,20 . Engineering of the RNA sequence has rendered synthetic mRNA more translatable than ever before. Highly efficient and non-toxic RNA carriers have been developed that in some cases 21,22 allow prolonged antigen expression en vivo (Table 1). Some vaccine formulations contain novel adjuvants, while others elicit potent responses in the absence of known adjuvants. The following section summarizes the key advances in these areas of mRNA engineering and their impact on vaccine efficacy.

Optimization of mRNA translation and stability

This topic has been extensively discussed in previous reviews 14,15 thus, we briefly summarize the key findings (Box 1). The 5′ and 3′ UTR elements flanking the coding sequence profoundly influence the stability and translation of mRNA, both of which are critical concerns for vaccines. These regulatory sequences can be derived from viral or eukaryotic genes and greatly increase the half-life and expression of therapeutic mRNAs 23,24 . A 5′ cap structure is required for efficient protein production from mRNA 25 . Various versions of 5′ caps can be added during or after the transcription reaction using a vaccinia virus capping enzyme 26 or by incorporating synthetic cap or anti-reverse cap analogues 27,28 . The poly(A) tail also plays an important regulatory role in mRNA translation and stability 25 thus, an optimal length of poly(A) 24 must be added to mRNA either directly from the encoding DNA template or by using poly(A) polymerase. The codon usage additionally has an impact on protein translation. Replacing rare codons with frequently used synonymous codons that have abundant cognate tRNA in the cytosol is a common practice to increase protein production from mRNA 29 , although the accuracy of this model has been questioned 30 . Enrichment of G:C content constitutes another form of sequence optimization that has been shown to increase steady-state mRNA levels in vitro 31 and protein expression en vivo 12 .

Although protein expression may be positively modulated by altering the codon composition or by introducing modified nucleosides (discussed below), it is also possible that these forms of sequence engineering could affect mRNA secondary structure 32 , the kinetics and accuracy of translation and simultaneous protein folding 33,34 , and the expression of cryptic T cell epitopes present in alternative reading frames 30 . All these factors could potentially influence the magnitude or specificity of the immune response.

Box 1: Strategies for optimizing mRNA pharmacology

A number of technologies are currently used to improve the pharmacological aspects of mRNA. The various mRNA modifications used and their impact are summarized below.

• Synthetic cap analogues and capping enzymes 26,27 stabilize mRNA and increase protein translation via binding to eukaryotic translation initiation factor 4E (EIF4E)

• Regulatory elements in the 5′-untranslated region (UTR) and the 3′-UTR 23 stabilize mRNA and increase protein translation

• Poly(A) tail 25 stabilizes mRNA and increases protein translation

• Modified nucleosides 9,48 decrease innate immune activation and increase translation

• Separation and/or purification techniques: RNase III treatment (N.P. and D.W., unpublished observations) and fast protein liquid chromatography (FPLC) purification 13 decrease immune activation and increase translation

• Sequence and/or codon optimization 29 increase translation

• Modulation of target cells: co-delivery of translation initiation factors and other methods alters translation and immunogenicity

Modulation of immunogenicity

Exogenous mRNA is inherently immunostimulatory, as it is recognized by a variety of cell surface, endosomal and cytosolic innate immune receptors (Fig. 1) (reviewed in Ref. 35). Depending on the therapeutic application, this feature of mRNA could be beneficial or detrimental. It is potentially advantageous for vaccination because in some cases it may provide adjuvant activity to drive dendritic cell (DC) maturation and thus elicit robust T and B cell immune responses. However, innate immune sensing of mRNA has also been associated with the inhibition of antigen expression and may negatively affect the immune response 9,13 . Although the paradoxical effects of innate immune sensing on different formats of mRNA vaccines are incompletely understood, some progress has been made in recent years in elucidating these phenomena.

Innate immune sensing of two types of mRNA vaccine by a dendritic cell (DC), with RNA sensors shown in yellow, antigen in red, DC maturation factors in green, and peptide−major histocompatibility complex (MHC) complexes in light blue and red an example lipid nanoparticle carrier is shown at the top right. A non-exhaustive list of the major known RNA sensors that contribute to the recognition of double-stranded and unmodified single-stranded RNAs is shown. Unmodified, unpurified (part a) and nucleoside-modified, fast protein liquid chromatography (FPLC)-purified (part B) mRNAs were selected for illustration of two formats of mRNA vaccines where known forms of mRNA sensing are present and absent, respectively. The dashed arrow represents reduced antigen expression. Ag, antigen PKR, interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase MDA5, interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 (also known as IFIH1) IFN, interferon m1Ψ, 1-methylpseudouridine OAS, 2′-5′-oligoadenylate synthetase TLR, Toll-like receptor.

Studies over the past decade have shown that the immunostimulatory profile of mRNA can be shaped by the purification of IVT mRNA and the introduction of modified nucleosides as well as by complexing the mRNA with various carrier molecules 9,13,36,37 . Enzymatically synthesized mRNA preparations contain double-stranded RNA (dsRNA) contaminants as aberrant products of the IVT reaction 13 . As a mimic of viral genomes and replication intermediates, dsRNA is a potent pathogen-associated molecular pattern (PAMP) that is sensed by pattern recognition receptors in multiple cellular compartments (Fig. 1). Recognition of IVT mRNA contaminated with dsRNA results in robust type I interferon production 13 , which upregulates the expression and activation of protein kinase R (PKR also known as EIF2AK2) and 2′-5′-oligoadenylate synthetase (OAS), leading to the inhibition of translation 38 and the degradation of cellular mRNA and ribosomal RNA 39 , respectively. Karikó and colleagues 13 have demonstrated that contaminating dsRNA can be efficiently removed from IVT mRNA by chromatographic methods such as reverse-phase fast protein liquid chromatography (FPLC) or high-performance liquid chromatography (HPLC). Strikingly, purification by FPLC has been shown to increase protein production from IVT mRNA by up to 1,000-fold in primary human DCs 13 . Thus, appropriate purification of IVT mRNA seems to be critical for maximizing protein (immunogen) production in DCs and for avoiding unwanted innate immune activation.

Besides dsRNA contaminants, single-stranded mRNA molecules are themselves a PAMP when delivered to cells exogenously. Single-stranded oligoribonucleotides and their degradative products are detected by the endosomal sensors Toll-like receptor 7 (TLR7) and TLR8 (Refs 40,41), resulting in type I interferon production 42 . Crucially, it was discovered that the incorporation of naturally occurring chemically modified nucleosides, including but not limited to pseudouridine 9,43,44 and 1-methylpseudouridine 45 , prevents activation of TLR7, TLR8 and other innate immune sensors 46,47 , thus reducing type I interferon signalling 48 . Nucleoside modification also partially suppresses the recognition of dsRNA species 46,47,48 . As a result, Karikó and others have shown that nucleoside-modified mRNA is translated more efficiently than unmodified mRNA in vitro 9 , particularly in primary DCs, and en vivo in mice 45 . Notably, the highest level of protein production in DCs was observed when mRNA was both FPLC-purified and nucleoside-modified 13 . These advances in understanding the sources of innate immune sensing and how to avoid their adverse effects have substantially contributed to the current interest in mRNA-based vaccines and protein replacement therapies.

In contrast to the findings described above, a study by Thess and colleagues found that sequence-optimized, HPLC-purified, unmodified mRNA produced higher levels of protein in HeLa cells and in mice than its nucleoside-modified counterpart 12 . Additionally, Kauffman and co-workers demonstrated that unmodified, non-HPLC-purified mRNA yielded more robust protein production in HeLa cells than nucleoside-modified mRNA, and resulted in similar levels of protein production in mice 49 . Although not fully clear, the discrepancies between the findings of Karikó 9,13 and these authors 12,49 may have arisen from variations in RNA sequence optimization, the stringency of mRNA purification to remove dsRNA contaminants and the level of innate immune sensing in the targeted cell types.

The immunostimulatory properties of mRNA can conversely be increased by the inclusion of an adjuvant to increase the potency of some mRNA vaccine formats. These include traditional adjuvants as well as novel approaches that take advantage of the intrinsic immunogenicity of mRNA or its ability to encode immune-modulatory proteins. Self-replicating RNA vaccines have displayed increased immunogenicity and effectiveness after formulating the RNA in a cationic nanoemulsion based on the licensed MF59 (Novartis) adjuvant 50 . Another effective adjuvant strategy is TriMix, a combination of mRNAs encoding three immune activator proteins: CD70, CD40 ligand (CD40L) and constitutively active TLR4. TriMix mRNA augmented the immunogenicity of naked, unmodified, unpurified mRNA in multiple cancer vaccine studies and was particularly associated with increased DC maturation and cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses (reviewed in Ref. 51). The type of mRNA carrier and the size of the mRNA–carrier complex have also been shown to modulate the cytokine profile induced by mRNA delivery. For example, the RNActive (CureVac AG) vaccine platform 52,53 depends on its carrier to provide adjuvant activity. In this case, the antigen is expressed from a naked, unmodified, sequence-optimized mRNA, while the adjuvant activity is provided by co-delivered RNA complexed with protamine (a polycationic peptide), which acts via TLR7 signalling 52,54 . This vaccine format has elicited favourable immune responses in multiple preclinical animal studies for vaccination against cancer and infectious diseases 18,36,55,56 . A recent study provided mechanistic information on the adjuvanticity of RNActive vaccines in mice en vivo and human cells in vitro 54 . Potent activation of TLR7 (mouse and human) and TLR8 (human) and production of type I interferon, pro-inflammatory cytokines and chemokines after intradermal immunization was shown 54 . A similar adjuvant activity was also demonstrated in the context of non-mRNA-based vaccines using RNAdjuvant (CureVac AG), an unmodified, single-stranded RNA stabilized by a cationic carrier peptide 57 .

Progress in mRNA vaccine delivery

Eficiente en vivo mRNA delivery is critical to achieving therapeutic relevance. Exogenous mRNA must penetrate the barrier of the lipid membrane in order to reach the cytoplasm to be translated to functional protein. mRNA uptake mechanisms seem to be cell type dependent, and the physicochemical properties of the mRNA complexes can profoundly influence cellular delivery and organ distribution. There are two basic approaches for the delivery of mRNA vaccines that have been described to date. First, loading of mRNA into DCs ex vivo, followed by re-infusion of the transfected cells 58 and second, direct parenteral injection of mRNA with or without a carrier. Ex vivo DC loading allows precise control of the cellular target, transfection efficiency and other cellular conditions, but as a form of cell therapy, it is an expensive and labour-intensive approach to vaccination. Direct injection of mRNA is comparatively rapid and cost-effective, but it does not yet allow precise and efficient cell-type-specific delivery, although there has been recent progress in this regard 59 . Both of these approaches have been explored in a variety of forms (Fig. 2 Table 1).

Commonly used delivery methods and carrier molecules for mRNA vaccines along with typical diameters for particulate complexes are shown: naked mRNA (part a) naked mRNA with en vivo electroporation (part B) protamine (cationic peptide)-complexed mRNA (part C) mRNA associated with a positively charged oil-in-water cationic nanoemulsion (part D) mRNA associated with a chemically modified dendrimer and complexed with polyethylene glycol (PEG)-lipid (part mi) protamine-complexed mRNA in a PEG-lipid nanoparticle (part F) mRNA associated with a cationic polymer such as polyethylenimine (PEI) (part gramo) mRNA associated with a cationic polymer such as PEI and a lipid component (part h) mRNA associated with a polysaccharide (for example, chitosan) particle or gel (part I) mRNA in a cationic lipid nanoparticle (for example, 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniumpropane (DOTAP) or dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) lipids) (part j) mRNA complexed with cationic lipids and cholesterol (part k) and mRNA complexed with cationic lipids, cholesterol and PEG-lipid (part l).

Ex vivo loading of DCs. DCs are the most potent antigen-presenting cells of the immune system. They initiate the adaptive immune response by internalizing and proteolytically processing antigens and presenting them to CD8 + and CD4 + T cells on major histocompatibility complexes (MHCs), namely, MHC class I and MHC class II, respectively. Additionally, DCs may present intact antigen to B cells to provoke an antibody response 60 . DCs are also highly amenable to mRNA transfection. For these reasons, DCs represent an attractive target for transfection by mRNA vaccines, both en vivo y ex vivo.

Although DCs have been shown to internalize naked mRNA through a variety of endocytic pathways 61,62,63 , ex vivo transfection efficiency is commonly increased using electroporation in this case, mRNA molecules pass through membrane pores formed by a high-voltage pulse and directly enter the cytoplasm (reviewed in Ref. 64). This mRNA delivery approach has been favoured for its ability to generate high transfection efficiency without the need for a carrier molecule. DCs that are loaded with mRNA ex vivo are then re-infused into the autologous vaccine recipient to initiate the immune response. La mayoría ex vivo-loaded DC vaccines elicit a predominantly cell-mediated immune response thus, they have been used primarily to treat cancer (reviewed in Ref. 58).

Injection of naked mRNA in vivo. Naked mRNA has been used successfully for en vivo immunizations, particularly in formats that preferentially target antigen-presenting cells, as in intradermal 61,65 and intranodal injections 66,67,68 . Notably, a recent report showed that repeated intranodal immunizations with naked, unmodified mRNA encoding tumour-associated neoantigens generated robust T cell responses and increased progression-free survival 68 (discussed further in Box 2).

Physical delivery methods in vivo. To increase the efficiency of mRNA uptake en vivo, physical methods have occasionally been used to penetrate the cell membrane. An early report showed that mRNA complexed with gold particles could be expressed in tissues using a gene gun, a microprojectile method 69 . The gene gun was shown to be an efficient RNA delivery and vaccination method in mouse models 70,71,72,73 , but no efficacy data in large animals or humans are available. En vivo electroporation has also been used to increase uptake of therapeutic RNA 74,75,76 however, in one study, electroporation increased the immunogenicity of only a self-amplifying RNA and not a non-replicating mRNA-based vaccine 74 . Physical methods can be limited by increased cell death and restricted access to target cells or tissues. Recently, the field has instead favoured the use of lipid or polymer-based nanoparticles as potent and versatile delivery vehicles.

Protamine. The cationic peptide protamine has been shown to protect mRNA from degradation by serum RNases 77 however, protamine-complexed mRNA alone demonstrated limited protein expression and efficacy in a cancer vaccine model, possibly owing to an overly tight association between protamine and mRNA 36,78 . This issue was resolved by developing the RNActive vaccine platform, in which protamine-formulated RNA serves only as an immune activator and not as an expression vector 52 .

Cationic lipid and polymer-based delivery. Highly efficient mRNA transfection reagents based on cationic lipids or polymers, such as TransIT-mRNA (Mirus Bio LLC) or Lipofectamine (Invitrogen), are commercially available and work well in many primary cells and cancer cell lines 9,13 , but they often show limited en vivo efficacy or a high level of toxicity (N.P. and D.W., unpublished observations). Great progress has been made in developing similarly designed complexing reagents for safe and effective en vivo use, and these are discussed in detail in several recent reviews 10,11,79,80 . Cationic lipids and polymers, including dendrimers, have become widely used tools for mRNA administration in the past few years. The mRNA field has clearly benefited from the substantial investment in en vivo small interfering RNA (siRNA) administration, where these delivery vehicles have been used for over a decade. Lipid nanoparticles (LNPs) have become one of the most appealing and commonly used mRNA delivery tools. LNPs often consist of four components: an ionizable cationic lipid, which promotes self-assembly into virus-sized (

100 nm) particles and allows endosomal release of mRNA to the cytoplasm lipid-linked polyethylene glycol (PEG), which increases the half-life of formulations cholesterol, a stabilizing agent and naturally occurring phospholipids, which support lipid bilayer structure. Numerous studies have demonstrated efficient en vivo siRNA delivery by LNPs (reviewed in Ref. 81), but it has only recently been shown that LNPs are potent tools for en vivo delivery of self-amplifying RNA 19 and conventional, non-replicating mRNA 21 . Systemically delivered mRNA–LNP complexes mainly target the liver owing to binding of apolipoprotein E and subsequent receptor-mediated uptake by hepatocytes 82 , and intradermal, intramuscular and subcutaneous administration have been shown to produce prolonged protein expression at the site of the injection 21,22 . The mechanisms of mRNA escape into the cytoplasm are incompletely understood, not only for artificial liposomes but also for naturally occurring exosomes 83 . Further research into this area will likely be of great benefit to the field of therapeutic RNA delivery.

The magnitude and duration of en vivo protein production from mRNA–LNP vaccines can be controlled in part by varying the route of administration. Intramuscular and intradermal delivery of mRNA–LNPs has been shown to result in more persistent protein expression than systemic delivery routes: in one experiment, the half-life of mRNA-encoded firefly luciferase was roughly threefold longer after intradermal injection than after intravenous delivery 21 . These kinetics of mRNA–LNP expression may be favourable for inducing immune responses. A recent study demonstrated that sustained antigen availability during vaccination was a driver of high antibody titres and germinal centre (GC) B cell and T follicular helper (TFH) cell responses 84 . This process was potentially a contributing factor to the potency of recently described nucleoside-modified mRNA–LNP vaccines delivered by the intramuscular and intradermal routes 20,22,85 . Indeed, TFH cells have been identified as a critical population of immune cells that vaccines must activate in order to generate potent and long-lived neutralizing antibody responses, particularly against viruses that evade humoral immunity 86 . The dynamics of the GC reaction and the differentiation of TFH cells are incompletely understood, and progress in these areas would undoubtedly be fruitful for future vaccine design (Box 3).

Box 2: Personalized neoepitope cancer vaccines

Sahin and colleagues have pioneered the use of individualized neoepitope mRNA cancer vaccines 121 . They use high-throughput sequencing to identify every unique somatic mutation of an individual patient's tumour sample, termed the mutanome. This enables the rational design of neoepitope cancer vaccines in a patient-specific manner, and has the advantage of targeting non-self antigen specificities that should not be eliminated by central tolerance mechanisms. Proof of concept has been recently provided: Kreiter and colleagues found that a substantial portion of non-synonymous cancer mutations were immunogenic when delivered by mRNA and were mainly recognized by CD4 + T cells 176 . On the basis of these data, they generated a computational method to predict major histocompatibility complex (MHC) class II-restricted neoepitopes that can be used as vaccine immunogens. mRNA vaccines encoding such neoepitopes have controlled tumour growth in B16-F10 melanoma and CT26 colon cancer mouse models. In a recent clinical trial, Sahin and colleagues developed personalized neoepitope-based mRNA vaccines for 13 patients with metastatic melanoma, a cancer known for its high frequency of somatic mutations and thus neoepitopes. They immunized against ten neoepitopes per individual by injecting naked mRNA intranodally. CD4 + T cell responses were detected against the majority of the neoepitopes, and a low frequency of metastatic disease was observed after several months of follow-up 68 . Interestingly, similar results were also obtained in a study of analogous design that used synthetic peptides as immunogens rather than mRNA 177 . Together, these recent trials suggest the potential utility of the personalized vaccine methodology.

Box 3: The germinal centre and T follicular helper cells

The vast majority of potent antimicrobial vaccines elicit long-lived, protective antibody responses against the target pathogen. High-affinity antibodies are produced in specialized microanatomical sites within the B cell follicles of secondary lymphoid organs called germinal centres (GCs). B cell proliferation, somatic hypermutation and selection for high-affinity mutants occur in the GCs, and efficient T cell help is required for these processes 178 . Characterization of the relationship between GC B and T cells has been actively studied in recent years. The follicular homing receptor CXC-chemokine receptor 5 (CXCR5) was identified on GC B and T cells in the 1990s 179,180 , but the concept of a specific lineage of T follicular helper (TFH) cells was not proposed until 2000 (Refs 181, 182). The existence of the TFH lineage was confirmed in 2009 when the transcription factor specific for TFH cells, B cell lymphoma 6 protein (BCL-6), was identified 183,184,185 . TFH cells represent a specialized subset of CD4 + T cells that produce critical signals for B cell survival, proliferation and differentiation in addition to signals for isotype switching of antibodies and for the introduction of diversifying mutations into the immunoglobulin genes. The major cytokines produced by TFH cells are interleukin-4 (IL-4) and IL-21, which play a key role in driving the GC reaction. Other important markers and functional ligands expressed by TFH cells include CD40 ligand (CD40L), Src homology domain 2 (SH2) domain-containing protein 1A (SH2D1A), programmed cell death protein 1 (PD1) and inducible T cell co-stimulator (ICOS) 186 . The characterization of rare, broadly neutralizing antibodies to HIV-1 has revealed that unusually high rates of somatic hypermutation are a hallmark of protective antibody responses against HIV-1 (Ref. 187). As TFH cells play a key role in driving this process in GC reactions, the development of new adjuvants or vaccine platforms that can potently activate this cell type is urgently needed.


MRNA Splicing


Transcription and processing (which includes splicing) of the newly made mRNA occurs in the nucleus of the cell.
Once a mature mRNA transcript is made it is transported to the cytoplasm for translation into protein.

Figure (PageIndex<1>). (CC BY-NC-SA)

Most eukaryotic genes and their pre-mRNA transcripts contain noncoding stretches of nucleotides or regions that are not meant to be made into protein. These noncoding segments are called intronesand must be removed before the mature mRNA can be transported to the cytoplasm and translated into protein. The stretches of DNA that do code for amino acids in the protein are called exones. During the process of splicing, introns are removed from the pre-mRNA by the spliceosome and exons are spliced back together. If the introns are not removed, the RNA would be translated into a nonfunctional protein. Splicing occurs in the nucleus before the RNA migrates to the cytoplasm. Once splicing is complete, the mature mRNA (containing uninterrupted coding information), is transported to the cytoplasm where ribosomes translate the mRNA into protein.

A Detailed Look at mRNA Splicing

The pre-mRNA Transcript
The pre-mRNA transcript contains both introns and exons. The introns are removed during the process of splicing. In this example, the pre-mRNA contains two exons and one intron.

Introns contain several important and conserved sequences that guide the splicing process: a 5&rsquo GU sequence (the 5&rsquo splice site), an A branch site located near a pyrimidine-rich region (a region with many cytosine and uracil bases) and a 3&rsquo AG sequence (the 3&rsquo splice site).

The Spliceosome
A large protein complex known as the spliceosome controls mRNA splicing. The spliceosome is composed of particles made up of both RNA and protein. These particles are called small nuclear ribonucleoprotein o snRNPs (pronounced &ldquosnurps&rdquo) for short. The snRNPs recognize the conserved sequences within introns and quickly bind these sequences once the pre-mRNA is made and initiate splicing.

The spliceosome is built in distinct steps. First, the U1 snRNP binds the 5&rsquo splice site and the U2 snRNP binds the branch site.

A number of other snRNPs (U4, U6 y U5) bind the pre-mRNA transcript forming the mature spliceosome complex. This causes the intron to form a loop and brings the 5&rsquo splice site and 3&rsquo splice site together.

Now that the spliceosome is assembled, splicing can begin. First the 5&rsquo end of the intron is cut. The 5&rsquo GU end of the intron is then connected to the A branch site, which creates a lariat structure.

At this stage the U1 and U4 snRNPs are released and the 3&rsquo splice site is cleaved. Once the intron has been fully cleaved, the two exons are attached to each other. The intron in the form of a lariat is released along with U2, U5 and U6 snRNPs.

The intron will be degraded and the snRNPs are used again to splice other pre-mRNAs. The mature mRNA transcript is now ready to be exported to the cytoplasm for translation.

Alternative Splicing

The example of a gene with a single intron and two exons used above is a very simple model of RNA splicing. Many genes contain multiple exons as well as multiple introns. A process known asalternativa splicing allows for different combinations of exons to be included in the final mature mRNA, making different versions of proteins (called isoformas) that are all encoded by the same gene. Alternative splicing of mRNA allows for many proteins to be made, with different functions, all produced from a single gene. One of the most dramatic examples of alternative splicing is the Dscam gene in Drosophila melanogaster (a fruit fly). This single gene contains 116 exons! Some exons are always included, others may or may not be included. Over 18,000 different proteins from this single gene have been found in Drosophila! Theoretically, this system is capable of producing 38,016 different proteins all from a single gene!

Below is an example of alternative splicing of a pre-mRNA transcript. In this case, there are two different, alternatively spliced mRNAs that can be made from this pre-mRNA. The two mature mRNAs can contain either the yellow or the green exon. This produces two distinct protein isoforms when the mRNAs are translated into protein.

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mRNA Splicing Tutorial by Dr. Katherine Harris is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0 Unported License.


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