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¿Hay alguna razón para usar un microscopio vertical sobre un microscopio invertido?

¿Hay alguna razón para usar un microscopio vertical sobre un microscopio invertido?


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En realidad, nunca he tenido un microscopio invertido, pero parece que solo tiene ventajas en comparación con un microscopio vertical: muestras más altas y pesadas; sin chocar el objetivo contra el portaobjetos de vidrio; más fácil de operar, etc.

Entonces, ¿por qué la gente todavía usa microscopios verticales normales? ¿Hay alguna desventaja que me falta?


Como ya se mencionó en los comentarios, el costo es una de las razones principales cuando busca microscopios de luz simples. Los osciloscopios invertidos tienen ópticas más complejas, junto con el factor de conveniencia de poder examinar muestras más grandes, generalmente con un marco más estable, etc. Todo esto conduce a un mayor costo.

Una ventaja en la que puedo pensar para los osciloscopios verticales más pequeños es la capacidad de usarlos como un osciloscopio de disección, donde la muestra es opaca y es necesario verla desde arriba. Otra ventaja es esta:

Muchos microscopios de fluorescencia están en posición vertical, ya que hay una cantidad significativa de equipo adicional que debe montarse además del ocular, incluidos láseres, motores de escenario, cámaras y otros detectores. Esto puede tomar un lote de espacio, y por conveniencia, a menudo es más fácil montarlo en la parte superior donde sea accesible.


¿Qué es un microscopio invertido?

Los microscopios se utilizan en muchos procesos científicos, especialmente cuando se trata de observar objetos pequeños, incluidas las células.

Ya sea para la ciencia médica tradicional o la medicina forense, los microscopios son instrumentos esenciales. Sin embargo, a medida que avanza la ciencia, se diseñan nuevos avances tecnológicos para proporcionar un mayor aumento para lograr mejores resultados. Aquí es donde entra en escena un microscopio invertido.

Pero, si es nuevo en esta innovación en el campo de la ciencia, siga leyendo este artículo para obtener más información sobre el microscopio invertido.


INTRODUCCIÓN

En términos más generales, las técnicas de microscopía óptica se pueden dividir en dos categorías: campo claro y fluorescencia. En la microscopía de campo claro, la fuente de luz y el objetivo de detección se colocan en lados opuestos de la muestra, y se obtiene una imagen de la muestra por su efecto sobre la luz que la atraviesa a medida que la muestra absorbe, dispersa o desvía la luz. Debido a que la mayoría de las células son delgadas y transparentes, no absorben mucha luz y, por lo tanto, son difíciles de ver sin agregar una óptica que permita ver el cambio de fase de la luz inducida por las células. Las dos técnicas más utilizadas para visualizar este cambio de fase son el contraste de fase, que hace que las células aparezcan oscuras sobre un fondo claro, y el contraste de interferencia diferencial (DIC), que da una apariencia sombreada pseudo-tridimensional (3D) a las células ( Murphy y Davidson, 2012). El campo claro sin contraste de fase o DIC suele ser suficiente para ver los contornos generales de las células, pero el contraste de fase o DIC es necesario para lograr imágenes detalladas de campo claro de alto contraste.


Diferentes microscopios

La forma más simple de un microscopio es una lupa. Puede que no lo considere un microscopio, ¡pero lo es! Amplía una imagen, pero no la invierte ni la amplía lo suficiente como para ver realmente cosas diminutas como estructuras celulares u otros detalles que son necesarios para estudios científicos microscópicos.

Lo que normalmente clasificaría como microscopio es lo que ve en el aula de una escuela o en un programa de televisión científico, y estos se denominan microscopios compuestos. ¡Los microscopios compuestos invierten imágenes! Lo hacen por las dos lentes que tienen y por su mayor nivel de aumento. Eso es también lo que los hace reconocibles.

Obviamente, otros tipos de microscopios también invierten las imágenes, y hay otros con una lente adicional que invierte la imagen a su orientación original. Esto significa que la imagen que ve se ha invertido y luego se ha invertido nuevamente para que esté en la misma posición en la que estaba originalmente.

Muchos microscopios, incluidos los microscopios electrónicos y los microscopios digitales, no le mostrarán imágenes invertidas. Los microscopios binoculares y de disección tampoco mostrarán una imagen invertida debido a su mayor nivel de aumento. Dónde estás y qué tipo de trabajo estás haciendo tiene mucho que ver con qué tipo de imagen estás mirando.

Incluso con una imagen invertida, los microscopios pueden aumentar la ampliación de una imagen de manera espectacular. Han ayudado al mundo a progresar ayudando a médicos, ingenieros, estudiantes y a todos los demás a ver un mundo más allá del que vemos a simple vista. Han logrado hazañas asombrosas en el campo de la medicina con tejidos y células, así como con enfermedades y antibióticos.

No solo nos ayuda a progresar en las estructuras que creamos y los procedimientos que realizamos, sino que también nos ayuda en campos como la ciencia forense, la biología y el estudio de gérmenes, virus y bacterias. Las imágenes microscópicas nos ayudan a ver el mundo desde una nueva perspectiva que sería imposible sin ellas. ¡Solo necesitamos reconocer cuando la imagen está boca arriba!

Brandon es un entusiasta, aficionado y aficionado en el mundo de la microscopía. Su amor por la ciencia y todo lo microscópico lo mueve a compartir todo lo que sabe sobre microscopía y microbiología.

Mensajes recientes

Aprender a ver el mundo desde un punto de vista minúsculo crea una inmensa diferencia en nuestra perspectiva de la vida. Ya sea que sea un profesor, un estudiante o simplemente un entusiasta de los microscopios, estos son fascinantes.

Al comprender los microorganismos que viven más allá de lo que el ojo humano puede ver, podemos comprender mejor nuestra historia como seres vivos. Entre este mundo microscópico de organismos se encuentran.


Olympus FV3000: funcionamiento básico del microscopio

Nota importante: el FV3000 es un microscopio invertido, lo que significa que las personas utilizarán una amplia variedad de recipientes para sus muestras. También existe la opción de utilizar la incubadora de nivel superior, que eleva aún más las muestras. Lo que esto significa es que el plano focal puede estar y estará por todas partes, y debe estar preparado para tomarse un tiempo para encontrarlo para su muestra.

I. Control del movimiento XYZ

Estos controles están en el lado derecho de la mesa de aire. Si gira las perillas de enfoque hacia usted, los objetivos se elevarán (hacia la muestra) y si se alejará de usted, se reducirán los objetivos. Cuando utilice objetivos de aceite con distancias de trabajo cortas, debe utilizar principalmente la perilla de enfoque fino. Las perillas X-Y deben usarse exclusivamente para mover el escenario.

Este dispositivo controla el modo de vista (oculares o confocal), la forma de iluminación de los oculares (Epi-fluorescencia o campo brillante DIC), los objetivos y le permite grabar 8 coordenadas xy separadas para que pueda enviar el escenario. a regiones de interés.

El botón "Escape" baja la torreta de objetivos, que es necesaria para el uso de objetivos de aceite (se explica en detalle más adelante).

La función "Focus Search" es un buen atajo que encuentra el cubreobjetos. Si el dispositivo afina con éxito el cubreobjetos, escuchará un pitido (bueno). Si no puede, escuchará 3 pitidos (mal). Si falla, la causa más probable es un usuario anterior que utilizó un contenedor de muestras muy diferente y cambió el plano focal. Su mejor opción es ir al objetivo 2x para enfocarse en el borde de un cubreobjetos o pozo, luego volver al objetivo 10x para encontrar su objetivo. Luego puede restablecer el origen Z y el límite Z (si es necesario) en el software Fluoview. La función de búsqueda también fallará si el ZDC DM está "Fuera" en lugar de "Dentro" (pestaña "Microscopio" en el software Fluoview).

La pestaña "EPI" le permite controlar el cubo de filtro:

Hay 3 filtros disponibles: DAPI, FITC (verde / amarillo flúor) y TRITC (naranja / rojo flúor). No hay filtros para ver tintes que emiten fluorescencia en el rango de más de 600 nm, pero podrá verlos en modo confocal con el láser de 640 nm.

La opción de pantalla "DIA" se usa más comúnmente para ajustar la intensidad de la luz.

Puede elegir entre insertos de 3 etapas para sus muestras fijas: 1) el soporte de la placa de pocillos, 2) el soporte de portaobjetos universal (que puede usar para un portaobjetos único o un plato de 60 mm o más pequeño) y 3) el portaobjetos de 4 portaobjetos poseedor. Recuerde colocar el cubreobjetos hacia abajo. Si usa un recipiente de plástico, está limitado a los objetivos aéreos (2x, 10x y 20x). Si desea usar un objetivo de aceite, debe usar un fondo de vidrio o un cubreobjetos del grosor adecuado (

IV. El recinto del escenario Tokai Hit

Nuestro sistema incluye un recinto de escenario porque nuestra habitación tiene corrientes de aire y no podemos controlar el termostato. Para especímenes fijos, puede dejar la trampilla delantera hacia arriba. Para un escaneo de lapso de tiempo de gran longitud, tiene la opción de bajar esta tapa para mantener el entorno del escenario más estable. Este gabinete introduce un paso adicional para inclinar el condensador hacia atrás (lo que debe hacer al colocar insertos de escenario o engrasar / limpiar objetivos).

Para abrir el espacio alrededor del condensador, empuje los dos deslizadores (flechas rojas) hacia afuera. A continuación, puede empujar hacia arriba y hacia atrás las perillas de enfoque del condensador para inclinarlo hacia atrás. Puede dejar la parte superior abierta si no es necesario mantener las corrientes de aire fuera del escenario. La única desventaja de esta disposición es que es muy fácil olvidarse de inclinar el condensador hacia atrás. Si no obtiene una imagen en modo confocal, lo primero que debe hacer es mirar a la izquierda para comprobar si ve esto. Los láseres se bloquearán a menos que el condensador esté apagado.

V. Cambio de objetivos aéreos a petroleros

Un microscopio invertido le permite obtener imágenes de muestras en placas de pocillos o platos o portaobjetos de pocillos con objetivos de aceite N / A más altos colocando esos objetivos debajo, de modo que el aceite no contamine la muestra. La desventaja es que engrasar los objetivos es más complicado que para un sistema vertical. La gota de aceite en una configuración invertida se colocará un poco precariamente en la punta de la lente del objetivo, y debe permanecer entre la lente y el fondo del cubreobjetos / plato. Demasiado poco aceite y no tendrá un camino adecuado para la luz. Demasiado aceite y comenzará a correr por los lados del objetivo una vez que haga contacto con la otra pieza de vidrio. Conseguir esa gota de aceite utilizable entre las piezas de vidrio es una forma de arte, e incluso los usuarios experimentados pueden tener que intentarlo varias veces. Una vez que lo coloques correctamente, puedes mover el escenario dentro de los límites de tu gota de aceite y tomar múltiples imágenes. Pero cuando tenga que tomar imágenes más allá del rango de su gota de aceite actual, o esté cambiando muestras, deberá limpiar todo el aceite del objetivo con el papel para lentes y aplicar una nueva gota. Es una molestia, pero necesaria, porque fluye demasiado aceite, lo cual es malo por múltiples razones.

Si está utilizando una placa de pocillos, deberá engrasar previamente el objetivo de aceite que planea usar antes de colocar su placa en el escenario.

Tenemos 2 tipos de aceite: la botella azul (ne = 1.518) para el objetivo 60x, y la botella verde Aceite de silicona (ne = 1.406) para los objetivos 30x y 40x Si.

Algunos detalles más sobre el cambio de objetivo

Hay un botón en la parte inferior izquierda del recinto del escenario que encenderá una luz para iluminar ese espacio, lo que hace que sea más fácil de ver para aceitar los objetivos. Recuerde apagarlo antes de comenzar a tomar imágenes. La perilla al lado controla el brillo.

El inserto de platina universal es el más fácil de usar al engrasar objetivos, ya que hay un espacio abierto alrededor de su portamuestras para usar para acceder al objetivo. Con el inserto de 4 diapositivas, hay suficiente espacio abierto en el lado izquierdo o derecho para usar, incluso si monta 4 diapositivas. Si está utilizando una placa de pocillos o la incubadora de la parte superior de la platina, deberá preengrasar su objetivo y luego cambiar a 2x o 10x antes de colocar la muestra / la cámara en la abertura de la platina.

Cuando un objetivo se “escapa”, no toque ninguna perilla de enfoque. Si lo hace, se “liberará” y volverá a subir. El objetivo de utilizar esta función es evitar colisiones entre los objetivos y el inserto de escenario. El software Fluoview estará atenuado e inactivo mientras un objetivo se haya escapado.

Para quitar el aceite de su portaobjetos, seque con papel para lentes (en la caja en el escritorio de la computadora) y luego limpie el resto con un poco de etanol. NO use Kimwipes en objetivos o cualquier cosa (como diapositivas o platos) que estarán cerca de los objetivos. Los portamuestras deben estar libres de aceite cuando los lleve al Núcleo, especialmente si los ha visto previamente con aceite en una marca diferente de microscopio. Cada fabricante de microscopios tiene su propia versión de aceites de inmersión, con diferentes índices de refracción, por lo que no son compatibles.


Microscopios metalúrgicos verticales

Lo que diferencia a los microscopios metalúrgicos verticales de los demás es que el sistema de iluminación está ubicado sobre la platina de la muestra, lo que permite que la luz se dirija (desde los objetivos) a la muestra y de regreso a los oculares.

El microscopio puede venir con un soporte de columna o el soporte de base típico según las necesidades del usuario. Por ejemplo, mientras que el soporte de base típico permite una mayor estabilidad del microscopio que se utiliza para muestras relativamente pequeñas, el soporte de columna permite una mayor flexibilidad que permite ver muestras de diferentes tamaños.

Algunas de las características del microscopio vertical incluyen un control de intensidad ajustable, una dioptría, oculares de campo amplio de 10x, así como objetivos planos acromáticos corregidos al infinito.

Reseñas metalúrgicas verticales MicroscopeMaster:

Si bien los diferentes tipos de microscopios metalúrgicos presentan una ventaja dependiendo de su uso previsto, se ha demostrado que el microscopio invertido tiene una serie de ventajas sobre el microscopio vertical. Éstos incluyen:

Mas libertad - Con el microscopio invertido, la óptica se ubica debajo de la platina del microscopio, mientras que la muestra generalmente se coloca por encima de los objetivos. Esto elimina las limitaciones que enfrenta el microscopio vertical con respecto al tamaño de la muestra.

Aquí, el usuario se beneficia de la mayor distancia de trabajo, que permite colocar muestras más grandes y pesadas en el microscopio para observaciones (hasta 30 kg).

Eficiencia - Al utilizar un microscopio invertido, los usuarios se benefician del hecho de que ven más muestras en un período de tiempo más corto.

Para un microscopio vertical, ver la muestra implica una serie de pasos que incluyen bajar la platina, ajustarla, tener cuidado de proteger la muestra en el soporte de la platina, etc. Este no es el caso con el microscopio invertido dado que el usuario simplemente puede colocar el objeto en el escenario e imagínelo después de enfocar.

El enfoque se mantiene para diferentes aumentos, lo que significa que para el mismo tipo de muestra, el usuario podría ver más fácilmente.

El objetivo está protegido - El objetivo del microscopio invertido se encuentra debajo de la platina además de la presencia de una funcionalidad de parada de enfoque (con algunos microscopios) que protege el objetivo en todo momento minimizando las posibilidades de daño. Este no es el caso de los microscopios verticales donde el objetivo está por encima de la plataforma de la muestra, donde puede entrar en contacto con la muestra u otros objetos duros en cualquier momento.


Autores Biografía e información de contacto de amp

Bio: Robert Berdan es un fotógrafo de naturaleza profesional que vive en Calgary, AB, y se especializa en fotografía de naturaleza, vida silvestre y ciencia. Robert se retiró de la investigación de Cell Neurobiology para dedicarse a la fotografía a tiempo completo hace años. Robert ofrece orientación fotográfica e instrucción privada en todos los aspectos de la fotografía de la naturaleza y capacitación en Adobe Photoshop, incluida la fotomicrografía y la macrofotografía. Retrato de Robert Berdan con fotografías de algunas de sus publicaciones científicas tomadas por el Dr. Sharif Galal. Su primer microscopio de investigación se muestra a la derecha.


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¿Hay alguna razón para usar un microscopio vertical sobre un microscopio invertido? - biología

Stephen M. Wolniak
Profesor
Departamento de Biología Celular y Genética Molecular Amp
Universidad de Maryland
College Park, Maryland, 20742
[email protected]

Intereses docentes - Microscopía

Proporciono la información que se presenta a continuación para los estudiantes que generalmente saben poco sobre los conceptos básicos de la formación de imágenes en el microscopio óptico. Si desea utilizar esta información, tenga la amabilidad de acreditarme (culparme) por el esfuerzo que tomó generar el documento.

Principios de microscopía


Microscopía de campo claro

El microscopio que está disponible para su uso general en este laboratorio es un sofisticado instrumento óptico que puede proporcionarle imágenes de alta resolución de una variedad de muestras. La calidad de la imagen se basa en gran medida en su capacidad para utilizar correctamente el microscopio. A continuación, encontrará información básica que probablemente haya escuchado antes, pero información que rara vez se presenta de manera exhaustiva.

La ampliación de cosas pequeñas es una faceta necesaria de la investigación biológica, pero los detalles finos en las células y en los componentes subcelulares requieren que cualquier sistema de imágenes sea capaz de proporcionar información espacial a distancias pequeñas. La resolución se define como la capacidad de distinguir dos objetos muy pequeños y muy poco espaciados como entidades separadas. La resolución es mejor cuando la distancia que separa los dos objetos diminutos es pequeña. La resolución está determinada por ciertos parámetros físicos que incluyen la longitud de onda de la luz y el poder de captación de luz de las lentes objetivo y condensador. Una ecuación matemática simple define la distancia más pequeña (dmin) separando los dos objetos muy pequeños:


Dmin = 1,22 x longitud de onda / N.A. objetivo + N.A. condensador

Este es el poder de resolución teórico de un microscopio óptico. En la práctica, la calidad de la muestra suele limitar dmin a algo mayor que su límite inferior teórico.

N.A. (Apertura numérica) es un cálculo matemático de la capacidad de captación de luz de una lente. El N.A. de cada lente objetivo está inscrito en el tubo de metal y varía entre 0,25 y 1,4. Cuanto mayor sea el N.A., mejores serán las propiedades de captación de luz de la lente y mejor será la resolución. Los valores de N.A. más altos también significan distancias de trabajo más cortas (debe acercar la lente al objeto). Los valores N.A. por encima de 1.0 también indican que la lente se usa con algún líquido de inmersión, como aceite de inmersión.

De la ecuación anterior, debe tener en cuenta que el N.A. del condensador es tan importante como el N.A. de la lente del objetivo para determinar la resolución. Es por esta razón que el cierre del diafragma del condensador da como resultado una pérdida de resolución. En la práctica, a plena apertura y con buenas lentes de inmersión en aceite (N.A. 1.4 tanto para el condensador como para el objetivo) es posible poder resolver un poco mejor que 0.2 & microm. De la ecuación anterior, también debe quedar claro que la luz de longitud de onda más corta (luz más azul) le proporcionará una mejor resolución (dmin valores). Sin embargo, existen consideraciones prácticas sobre cuán corta puede ser la longitud de onda. A principios de la década de 1950, se diseñó un microscopio UV, pero requería objetivos de cuarzo y un dispositivo de imágenes especializado. Las lentes de cuarzo proporcionaron una resolución ligeramente mejor (dmin = 0.1 & microm), pero la calidad de la imagen adolecía de una incapacidad por parte de los fabricantes para corregir las aberraciones causadas por el cuarzo. El ojo humano está mejor adaptado a la luz verde y nuestra capacidad para ver los detalles puede verse comprometida un poco con el uso de azul o violeta. La mayoría de los fabricantes de microscopios corrigen sus lentes más simples (acromáticos) para la luz verde.


- Ampliación e imágenes -

La mayoría de los microscopios de uso actual se conocen como microscopios compuestos, en los que la lente del objetivo produce una imagen ampliada de un objeto, y esta imagen se amplía mediante un segundo sistema de lentes (el ocular o ocular) para su visualización. Por lo tanto, el aumento final del microscopio depende del poder de aumento del objetivo multiplicado por el poder de aumento del ocular. Los poderes de aumento objetivo varían de 4X a 100X. Un aumento menor no es práctico en un soporte de microscopio compuesto debido a las limitaciones espaciales con la corrección e iluminación de la imagen. Un aumento mayor no es práctico debido a las limitaciones en la capacidad de captación de luz y la corta distancia de trabajo requerida para lentes muy fuertes. Los rangos de aumento ocular suelen ser de 8X-12X, aunque los oculares de 10X son los más comunes. Como resultado, un microscopio estándar le proporcionará un rango de aumento final de

Cada lente objetivo consta de seis o más piezas de vidrio que se combinan para producir una imagen clara de un objeto. Se necesitan seis o más lentes en la lente del objetivo para proporcionar correcciones que produzcan claridad de imagen. La interacción de la luz con el vidrio en una lente produce aberraciones que dan como resultado una pérdida en la calidad de la imagen porque las ondas de luz se doblarán o refractarán de manera diferente en diferentes partes de una lente, y los diferentes colores de luz se refractarán en diferentes grados por el cristal. Aberraciones espaciales (p.ej., aberración esférica) se pueden corregir utilizando lentes con diferente curvatura en sus superficies y cromáticas (es decir., color) las aberraciones se pueden minimizar mediante el uso de varios tipos de vidrio en combinación. Estas correcciones aumentan el costo de la lente hasta el punto de que una lente de objetivo apocromática que exhibe una corrección a todo color y un N.A. extremadamente alto puede costar varios miles de dólares. Esta lente objetivo es aproximadamente del tamaño de su pulgar.

Los objetivos de la mayoría de los microscopios son acromáticos y son los más adecuados para obtener imágenes con luz verde. Los filtros verdes reducen el ancho de banda de la luz y hacen que los objetivos acromáticos sean razonablemente efectivos para la mayoría de los usos rutinarios. Las lentes acromáticas no son adecuadas para imágenes críticas de alta resolución con luz blanca, porque la luz roja y azul no se enfocan en el mismo plano que la luz verde. Las aberraciones cromáticas degradarán la resolución de las imágenes en color obtenidas con objetivos acromáticos. La fotomicrografía en color dirigida al más alto nivel de resolución y claridad de imagen debe realizarse con lentes objetivo apocromáticos totalmente corregidos. Lentes de fluorita, ofrecen niveles intermedios de corrección, mejores que los acromáticos pero no tan buenos como los apocromáticos. Las lentes de fluorita son adecuadas para microscopía de fluorescencia debido a su alta transmitancia de luz de longitud de onda más corta. Los niveles más altos de corrección hacen que las lentes de los objetivos sean más caras, el rango de precios para los objetivos apocromáticos va desde alrededor de $ 3,000 a más de $ 10,000.

Los oculares de la mayoría de los microscopios están diseñados para funcionar de manera óptima con los objetivos del mismo fabricante. Cada fabricante hace algunas de las correcciones espaciales y de color en el objetivo y el resto de las correcciones en el ocular. La mezcla de marcas generalmente dará como resultado una imagen degradada. Además, cuando mira en un microscopio, la imagen ampliada y corregida que ve a través de los oculares es en realidad una imagen virtual (a diferencia de una imagen real). El ocular, diseñado para proporcionar una imagen virtual corregida cuando se ve a simple vista, no es adecuado para la generación de imágenes fotográficas o de video a través del microscopio. Para fotografía o microscopía de video es necesario utilizar una lente de proyección que genere una imagen real corregida. Muchos de los microscopios más nuevos proporcionan correcciones de imagen totales en la lente del objetivo, obviando así muchas de las preocupaciones sobre los componentes de vidrio coincidentes del mismo fabricante. No obstante, es una buena práctica no mezclar piezas de un fabricante con las de otro, ya que puede producirse una degradación no intencionada de la imagen.

Un factor esencial para producir una buena imagen con el microscopio óptico es obtener niveles adecuados de luz en la muestra o en el plano del objeto. No solo es necesario obtener luz brillante alrededor del objeto, sino que para obtener imágenes óptimas, la luz debe ser uniforme en todo el campo de visión. La mejor manera de iluminar la muestra implica el uso de otro sistema de lentes, conocido como condensador. El elemento frontal del condensador suele ser una lente grande y aplanada que se coloca directamente debajo de la muestra. Su ubicación en una rejilla móvil le proporciona los medios para enfocar el haz de luz que pasa por el objeto y maximizar la intensidad y controlar la uniformidad de la iluminación. Dos aberturas en el sistema de iluminación le permiten regular el diámetro del haz de iluminación cerrando o abriendo los diafragmas de iris. Uno de estos diafragmas, ubicado dentro del condensador de campo claro y conocido como diafragma del condensador, le permite aumentar el contraste, pero a costa de empeorar la resolución. El segundo de estos diafragmas, conocido como diafragma de apertura de campo, no afecta la resolución de manera tan dramática y se ajusta regularmente para una iluminación óptima.

La iluminación óptima de una muestra con todos los microscopios fabricados actualmente se logra mediante el uso de una variación de Iluminación Kohler, donde (para aquellos de ustedes que son tecnófilos) el filamento de la fuente de luz está enfocado en el plano focal posterior de la lente del objetivo. Desde el punto de vista operativo, es fácil obtener una iluminación óptima para campo claro (o contraste de fase) colocando primero cualquier muestra en el escenario y enfocándose en el objeto. A continuación, gire el anillo del diafragma de apertura de campo (la apertura más baja del microscopio) de modo que sus bordes oscurezcan la periferia del campo de visión. A continuación, suba o baje el condensador hasta que los bordes del diafragma de apertura de campo estén claramente enfocados. No vuelva a enfocar el objetivo en la muestra mientras ajusta el condensador. Puede que sea necesario centrar el diafragma de apertura de campo, utilizando los tornillos de centrado del condensador. Cuando el microscopio está correctamente iluminado, tanto el objeto como los bordes del diafragma de apertura de campo deben estar en el mismo plano de enfoque y el diafragma de iris de campo debe estar centrado en el campo de visión.


Contraste microscopico

El ojo humano puede percibir cambios en la amplitud (intensidad) de la luz. Las muestras biológicas no teñidas, como las células vivas, son esencialmente transparentes para nuestros ojos, pero interactúan con la luz de una manera bastante uniforme, al retardar (ralentizar) el paso de un haz de luz en aproximadamente 1/4 de una longitud de onda (/>) . Al reducir la velocidad de un rayo de luz en relación con otro rayo de luz que había atravesado el medio circundante, el espécimen biológico altera la fase de los rayos. La intensidad (amplitud) es aditiva y los rayos de luz que están desfasados ​​1/2 /> se perciben como oscuridad. Zernicke se dio cuenta de que si podía retardar la luz que pasa a través de muestras biológicas sin afectar la luz que pasa a través del medio circundante, podría generar cambios en la amplitud dentro de las células vivas. El microscopio de contraste de fase fue inventado por Zernicke en la década de 1930 como un medio para generar contraste en muestras biológicas, cambiando estas diferencias de fase invisibles en diferencias de amplitud visibles.

Zernicke empleó un truco óptico para separar los rayos de luz que interactúan con la muestra de aquellos que no encuentran la muestra. Para separar los haces de luz entre sí, colocó un anillo transparente (conocido como anillo) en un disco opaco e insertó este disco en la trayectoria óptica del microscopio, dentro del condensador. Colocó un anillo complementario dentro de la lente del objetivo. Casi toda la luz que pasa a través de la muestra pero no llega a la muestra, pasa a través de la lente del objetivo a través de este anillo. La mayor parte de la luz que atraviesa la muestra se dispersa y parte de ella entra en la lente del objetivo de tal manera que no atraviesa el anillo de la lente del objetivo, sino que pasa por este plano en alguna otra ubicación. Diseñó la placa de vidrio que sostiene el anillo de modo que toda la luz que falte en el anillo encontrara un 1/4 /> adicional de retardo en relación con los rayos de luz que no habían interactuado con la muestra, colocando los rayos de luz que habían interactuado con la muestra. fuera de fase con los rayos que no habían interactuado con el espécimen en 1/2 />. Descubrió que una reducción en la intensidad de la luz que no había atravesado el espécimen crearía un fondo gris y aumentaría el contraste aún más, con algunas partes del espécimen más oscuras y otras partes del espécimen más brillantes que el fondo.

El funcionamiento de cualquier microscopio en el modo de contraste de fase requiere que primero configure la iluminación de campo claro adecuada, con un diafragma de iris de campo centrado cuyos bordes estén enfocados en el plano de la muestra. A continuación, gire el cilindro de la torreta del condensador hasta que el número en la torreta del condensador coincida con el número grabado en la lente del objetivo. En esta condición, el anillo del condensador se adapta al anillo de fase presente en el objetivo. A continuación, retire uno de los oculares e inserte el telescopio de enfoque de Bertrand en el orificio ocular. Esta lente le permite ver el plano focal trasero de la lente del objetivo, el plano donde reside el anillo. Verá un círculo de luz brillante (el anillo del condensador) y un anillo oscuro (presente dentro del objetivo). El anillo oscuro es estacionario, pero el anillo brillante no. Es posible que deba alinear el anillo con el anillo para que los dos se superpongan. En la parte posterior de su condensador, encontrará dos tornillos de ajuste que permiten realizar esta alineación. Cuando el anillo y el anillo estén alineados, vuelva a colocar el ocular en el microscopio. La diferencia entre el contraste de fase y el campo claro para la observación de células vivas es significativa.

Microscopio fluorescente

En ciertas clases de átomos y moléculas, los electrones absorben luz, se energizan y luego pierden rápidamente esta energía en forma de emisión de luz y calor. Si el electrón mantiene su espín, se dice que entra en un estado singlete, y el tipo de luz que se emite cuando el electrón regresa al estado fundamental se llama fluorescencia. Si el electrón cambia su espín cuando se excita, entra en el estado triplete, y el tipo de luz que se emite cuando el electrón regresa al estado fundamental se conoce como fosforescencia. La fosforescencia es mucho más duradera que la fluorescencia. Tanto las emisiones de fluorescencia como de fosforescencia tienen longitudes de onda particulares para electrones excitados específicos. Ambos tipos de emisión dependen de longitudes de onda específicas de luz de excitación, y para ambos tipos de emisión, la energía de excitación es mayor que la energía de emisión. Described another way, />of excitation light is shorter than />of emission light. In biology, we can utilize fluorescence in localization reactions, to identify particular molecules in complex mixtures or in cells. Fluorescence has the advantage of providing a very high signal-to-noise ratio, which enables us to distinguish spatial distributions of rare molecules. To utilize fluorescence, we need to label the specimen (a cell, a tissue, or a gel) with a suitable molecule (a fluorochrome) whose distribution will become evident after illumination. The fluorescence microscope is ideally suited for the detection of particular fluorochromes in cells and tissues.

The fluorescence microscope that is in wide use today follows the basic "incident-light" design of Ploem, who employed a novel arrangement of filters with a chromatic beam splitter (often wrongly called a dichroic filter both by biologists and microscope sales people). With the incident light fluorescence microscope, the object is illuminated with fluorescence excitation light through the objective lens. The object emits longer-l fluorescence in response to the shorter- excitation light. The objective lens then serves both for illumination and imaging. The chromatic beam splitter transmits or reflects light, depending on its color. For this application, shorter light is reflected and longer light is transmitted by the splitter. Ploem placed the chromatic splitter in the optical path between the objective lens and the ocular, at a 45° angle, so that it would reflect shorter light downward toward the objective. The longer- fluorescence emission light would be transmitted through the chromatic beam splitter toward the ocular.

The microscopes that you have utilized in this and other courses all operate in the same general fashion. Light beams pass through a condenser lens system and provide illumination of an object at many points simultaneously. For incident light fluorescence microscopy, the objective lens also acts as a condenser for the excitation light beam. In its interaction with the object, some of this light is absorbed, some of this light is scattered, some of this light is reflected, and some of this light is slowed or retarded (relative to a beam of light that does not pass through the object). A portion of the light that has interacted with the object then passes through the imaging lens system of the microscope where it provides us with visual or pictorial image information about the object. Like the process of illumination, the process of image generation operates in a parallel fashion, where large numbers of light beams contribute to the image simultaneously. Resolution is limited by the closeness of overlapping points of brightness or darkness. In a practical sense, the limit of resolution is 0.18-0.2 µm with the best available objective lenses and a good specimen.

To observe cells with the fluorescence microscope, it is important to know the spectral characteristics of the fluorochrome that has been employed. In order to excite the fluorochrome properly and then observe its fluorescence emission, the appropriate filter packages must be present in the microscope. The fluorochrome may not fluoresce at all if the cells are illuminated with the inappropriate filter pack present in the optical path. Finally, for any kind of fluorescence localizations to be performed, it is essential to have the appropriate controls, to be sure that the cells do not exhibit excessive autofluorescence (that is, they do not glow in the absence of the fluorochrome), and that the fluorochrome is responsible for the localization pattern observed. In the laboratory, we have several microscopes equipped for incident light fluorescence microscopy.

Confocal Scanning Optical Microscopy

In the incident light fluorescence microscope, a light beam passes through a chromatic beam splitter and then the objective lens to illuminate a specimen. This light beam is used to excite electrons in fluorochrome molecules present in the object. As some of those excited electrons return to their ground state, the emission of light is detectable through the oculars of the microscope, or with a camera or video printer. The image is generated continuously, across the entire field of view. A primary problem with the fluorescence images generated in this way is that out-of-focus fluorescence appears as 'flare' in the object, and reduces the signal substantially. In addition, human eyes are not sufficiently sensitive photodetectors for the lowest levels of fluorescence, and most video-based imaging systems are only slightly better than your eyes. Under conditions where there is sufficient signal for you to easily observe fluorochrome distribution patterns, the excitation light can be of sufficient intensity to photooxidize (es decir., burn) your specimen. Much information can be lost with just a few seconds of exposure to the excitation lamp. The Confocal Scanning Optical Microscope, an expensive piece of instrumentation that illuminates the object with a small beam of light in a point-by-point (es decir., serial) fashion, eliminates most of the photoxidation problems, permitting the observation of objects for extended periods at very high resolution with little loss of signal. The placement of a small aperture in the beam path generates a small depth of field, and effectively eliminates out of focus information in image formation.

The confocal scanning optical microscope is designed to illuminate an object in a serial fashion, point by point, where a small beam of light (from a LASER) is scanned across the object rapidly in an X-Y raster pattern. The raster pattern can be created in several ways, but in one of the more popular instruments, it occurs as a consequence of the simultaneous rotation and vibration of a polygonal mirror. The vibration is caused by the activity of a servogalvanometer, while the rotation is caused by the activity of a small electric motor. Thus, a bright spot of light scans across an object from top to bottom, line by line. The image is also generated point-by-point. Image formation is translated into intensities at each spot in the X-Y raster by a photomultiplier tube. The intensity information is digitized and stored in a computer. A complex image processing software package permits visualization and manipulation of the images. Resolution is limited by spot size for the LASER and approaches 0.12-0.15 µm for an ideal specimen and with the best available objective lenses.

The manufacturers of confocal scanning optical microscopes include a pinhole diaphragm at a very special place in the optical path, near to the site of the photomultiplier tube. This pinhole is situated in a plane where the light from the in-focus part of the image converges to a point. Light from object planes above or below that of the focused image do not converge at the spot in the optical path occupied by the pinhole. Because of this design, out of focus image information is darkened to the extent that it is not detectable. The consequence is that all out of focus information is removed from the image and the confocal image is basically an 'optical section' of what could be a relatively thick object. The 'thickness' of the optical section may approach the limit of resolution, but in practice, the resolution in the Z-direction is somewhat greater, approximately 0.4-0.8 µm. The value of optical sectioning is best realized with fluorescence microscopy, where out-of-focus information alters, distorts, or even degrades the image. Because the confocal images are stored in a computer, it is possible to stack them up and generate three-dimensional reconstructions. The image processing programs also enable us to rotate these images and observe three-dimensional aspects of cellular structure. It may be clear to you that the computer responsible for these image manipulations must be fast and powerful. The biggest problem is one of image storage, where single images can routinely occupy >1,000,000 bytes of space. In rather short periods of use, it is easy to accumulate sufficient numbers of images to fill the largest of hard disks.

Two of the three the confocal scanning optical microscopes located on campus were manufactured by Carl Zeiss, located in Germany. The newest instrument (model 510) has three lasers and four photomultipliers and is designed so that we could illuminate with two or three colors of light in rapid succession and detect as many as three superimposed signals (essentially) simultaneously. The signals are separated from each other on the basis of color, using an acoustical optical tunable filter (AOTF). The optical microscope is an inverted stand. The most important operational difference between this microscope and the upright microscope in most laboratories is that with this instrument, the slide is placed in the stage holder upside-down. Like most modern research microscopes, this microscope is equipped for phase contrast, differential interference contrast and fluorescence microscopy and can be used with these imaging techniques for conventional imaging. However, it is equipped with a number of very highly corrected (read expensive) objective lenses attached to the turret, just below the stage. These lenses are necessary for high resolution confocal microscopy. The confocal part of this microscope is contained in a box that is attached to the inverted stand through an access port. As is the case with incident light fluorescence, the laser light passes through the objective lens to illuminate the specimen. An air suspension table is designed to eliminate vibrations present in the building.

Deconvolution Microscopy and Image Reconstruction

An alternative approach for eliminating flare from fluorescent image stacks is to perform intensive, iterative image analysis and processing, from objects that have been illuminated and photographed at multiple, adjacent focal planes. The images are obtained with a high-performance CCD camera, operating at very high magnification, using standard incident light fluorescence microscopy. The excitation source is a mercury arc lamp, and bandwidth for excitation and emission are controlled by filters placed in rotating filter wheels. The lamp is stabilized and the beam is randomized for uniform illumination of the specimen. Unlike confocal scanning instruments, the whole field of view is illuminated simultaneously with this microscope. It is possible to perform rapid sequential imaging (4 colors) from multiple fluorochromes with this microscope. At very high magnification, fluorescence from any spot in a cell acts as a point source. By knowing the image spread functions above and below the plane of focus, it is possible to determine points of origin for fluorescence, and spreading beams of light from that point source, above and below the plane of focus. An iterative algorithm, which is essentially a linear combination is performed by a computer on the adjacent pixels within a single image plane, and in successive image planes through the thickness of the object. Spreading light beams are subtracted from reconstructed image stack, and that light is added back to the source, thereby reducing noise and increasing signal, respectively. We have recently acquired a sophisticated DeltaVision microscope from Applied Precision, Inc., which is designed to acquire these images and then perform the computer-intensive operations. This kind of microscope is particularly well suited for generating three-dimensional fluorescence images from small, living cells.

Polarization Light Microscopy

When light passes through an object, it interacts with some or all of the atoms and molecules present in that object. In these interactions, sometimes light of a particular (es decir., color) is absorbed by the atoms or molecules, while sometimes light is scattered. The interaction of light with a translucent object often results in a slight reduction in the velocity of the light beam. The extent of this reduction in velocity can be measured as the refractive index of the object. For certain kinds of objects, especially those with high order in particular axes of the object, such a crystalline or paracrystalline arrays, the interaction with light beams is vastly different, depending on the orientation of the object relative to the impinging light beam. As a result, the refractive indices are measurably different in different axes of the object. Such an object with multiple refractive indices is termed birefringent. Birefringence (multiple refractive indices) results from the alignment of atoms or molecules in particular planes of an object these atoms or molecules interact strongly with light beams impinging on them from a particular direction, and to a far lesser extent with light beams impinging on them from a different direction. There are two kinds of birefringence, intrinsic birefringence, which results from atomic or molecular order in a crystalline or paracrystalline array (es decir., calcite crystals, membranes) and form birefringence, which results from supramolecular associations in paracrystalline arrays (es decir., microtubules in a spindle).


- Polarized Light and Birefringent Retardation -

Any light beam shining in a particular direction vibrates in all directions around the axis of travel. Light beams whose vibration has been restricted to a single plane, or to a few planes is known as polarized light. Birefringence is directly observable as differences in intensity in different axes of crystalline or paracrystalline objects when they are viewed with polarized light. Since birefringence results from differences in the number of interactions between the light beam and atoms or molecules in the object in different directions, in practice, the object is rotated around the plane of vibration for the polarized light beam to maximize the intensity differences in the object (usually, the dominant object axis is at a 45o angle relative to the plane of polarization). The extent of the difference in refractive indices in different axes of the object is a measurable quantity known as birefringent retardation (BR). BR is measured (as a distance) by placing an object with known birefringent retardation into the light beam, and, by rotating the calibrated object around the optic axis, extinguishing the brightness in the sample. Using this compensation technique, BR has been shown to be directly related to the number of aligned microtubules in mitotic spindles in living cells. This principle and procedure can be of importance in studying microtubule dynamics, where mitotic spindles of developing sea urchins can be visualized in a totally noninvasive way.


Stereo Dissecting Microscope Focusing

If you are trying to get a stereo microscope into focus, the body of the microscope is either too far away or too close to your sample. If you know the working distance for the stereo microscope, you can properly set up the microscope so the head is the correct distance from the stand. Working distance is the distance that is required between the lens of the stereo microscope body and the top of your sample in order for your sample to appear in focus when looking through the microscope.

Keep in mind that when you add or remove a stereo microscope auxiliary lens, the working distance of your stereo microscope will change as well.


Ver el vídeo: Microscopía Magnificación, poder y límite de resolución (Enero 2023).