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En las bacterias CRISPR, ¿cómo se integran los genomas virales en los espaciadores de CRISPR? Además, en su uso, ¿dónde corta Cas9 el ADN?

En las bacterias CRISPR, ¿cómo se integran los genomas virales en los espaciadores de CRISPR? Además, en su uso, ¿dónde corta Cas9 el ADN?


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He estado fuera de Biología durante aproximadamente un año puliendo mis habilidades de programación. Sé que CRISPR / Cas9 permite el 'corte' dirigido de ADN a través de la guía de ARN. Pocas preguntas al respecto.

  1. Con respecto a su fenómeno natural, cuando un virus infecta a un microbio con capacidades CRISPR, ¿cómo se integra el genoma en los 'espaciadores' de la región CRISPR en comparación con otras partes del genoma procariota para que cuando se transcriban, las enzimas Cas sepan que es un ADN extraño? elemento al que apuntar? Mi comprensión de las infecciones por virus también es un poco confusa; Estoy pensando en transposiciones aleatorias.

  2. Lo estoy investigando ahora, así que puedo resolver esto antes de que alguien responda, pero cuando el ADN objetivo se encuentra a través del ARN guía, ¿dónde decide 'cortar' la enzima Cas9, haciéndolo inútil, el ADN, y ¿cómo identifica la ubicación?

-EDIT- Ah. La secuencia objetivo también debe incluir una secuencia 'PAM' corriente abajo (motivo adyacente protospacer), que permite la unión del complejo de riboproteína (ARN guía + Cas9), y la magia de la bioquímica lo corta ~ 3-4 bases corriente arriba de la PAM). cita: https://www.addgene.org/CRISPR/guide/

  1. Solo pensé en otra pregunta, si el ADN se corta en un lugar aparentemente específico, ¿es la reparación del ADN que se produce corriente abajo totalmente al azar? Siento que sería lo mejor para el organismo (antropomorfogénico, uy), y la evolución generalmente dice que lo hace, tener un mecanismo para repararlo a su estado original.

Este documento debería aclarar mucho más de lo que nadie puede realmente sobre el sistema CRISPR.

CRISPR / Cas9 es muy singular, incluso en comparación con otras proteínas purificadas de bacterias como Taq Poly.

La razón se debe a lo complejo que es en realidad inducir esta proteína. Básicamente, está transfectando un plásmido con la proteína Cas9 y su ARN guía (ARNg) en el vector. La transfección en sí no es fácil, sin mencionar que esencialmente está agregando un mecanismo a una célula que intenta eliminar genes y tiene un puñado. De hecho, hacer eso para una línea celular, y notar los efectos de lo que eliminó, sería suficiente para producir un artículo en una revista bastante impactante. (Imagen de: https://www.systembio.com/)

Además, algunos avances recientes en CRISPR incluyen:

  • CRIPSR / Cas9 inducido por la luz (regulación más fácil de la actividad enzimática)

Básicamente, estos investigadores estaban tratando de deducir un método que permitiera un mayor control de la técnica CRISPR, ya que CRISPR ha tenido problemas con los efectos fuera del objetivo. Si bien no es un cambio en cómo funciona CRISPR, o incluso dónde, el cambio es cuánto puede controlar la reacción. En pocas palabras, idearon una forma que le permite encender / apagar CRISPR usando la luz, lo que permite un control más preciso de su actividad. Seguramente será útil reducir los efectos fuera del objetivo.

"Esto se logró fusionando las proteínas heterodimerizantes inducibles por luz CRY2 y CIB1 a un dominio de transactivación y el d Cas9 catalíticamente inactivo, respectivamente". (Lauren R Polstein y Charles A Gersbach)

  • Cpf1 para reemplazar Cas9 como proteína de corte (actividad más precisa)

Este es un poco más interesante porque es un cambio directo al sistema CRISPR en sí. Cas9 ha sido la proteína de corte estándar utilizada para el sistema CRISPR, aunque ha tenido controversia debido a su corte algo impreciso. Se ha demostrado que Cpf1 es más preciso (así lo dicen sus datos) y ahora algunos lo están implementando para ver si este es realmente el caso. Combinado con el sistema "inducido por luz" anterior, esto reduce CRISPR a niveles más seguros cuando se habla de efectos fuera del objetivo.

Aquí hay algunos buenos seminarios en línea para comenzar:

  1. CRISPR / Cas9 de principio a fin
  2. Mejore los experimentos de CRISPR-Cas9 con ARN guía diseñados racionalmente

Realmente no puedo comentar directamente sobre estos seminarios porque explican todo muy bien por sí mismos. Cualquier cosa que diga realmente solo restará mérito a lo que están enseñando, ya que de ninguna manera soy un experto en CRISPR, sino simplemente alguien que está considerando la posibilidad de usarlo para mi laboratorio. En este momento hay una gran cantidad de material de guía sobre cómo formatear correctamente sus experimentos CRISPR, pero mi opinión personal es darle a la técnica tal vez uno o dos años más cuando sea más estándar para la investigación.

Eso es a menos que desee investigar directamente el método y mejorarlo a su manera.

Hágame saber si esto responde suficientemente a sus preguntas.

Lamento no poder hacer mucho más en términos de explicar los enlaces. Los estudios no son a los que pueda acceder fácilmente a menos que esté en el trabajo, ya que suelo acceder a ellos a través de la universidad.

En lo que respecta al mecanismo de reparación (su pregunta n. ° 3), realmente no puedo responder eso con seguridad, pero recientemente recibí un folleto que describe cómo garantizar que las células usen HJ en lugar de NHEJ.


Los principales linajes bacterianos están esencialmente desprovistos de los sistemas de defensa viral CRISPR-Cas

El conocimiento actual de las interacciones entre microorganismos y virus, que dan forma a la evolución y el funcionamiento de los ecosistemas de la Tierra, se basa principalmente en organismos cultivados. Aquí investigamos miles de genomas virales y microbianos recuperados utilizando un enfoque independiente del cultivo para estudiar la frecuencia, variedad y distribución taxonómica de los mecanismos de defensa viral. Los sistemas CRISPR-Cas que confieren a los microorganismos inmunidad a los virus están presentes en solo el 10% de los 1.724 microorganismos muestreados, en comparación con informes anteriores de 40% de ocurrencia en bacterias y 81% en arqueas. Atribuimos esta gran diferencia a la falta de sistemas CRISPR-Cas en los principales linajes bacterianos que no tienen representantes cultivados. Correlacionamos la ausencia de CRISPR-Cas con la falta de capacidad de biosíntesis de nucleótidos y un estilo de vida simbiótico. Los sistemas de restricción están bien representados en estos linajes y podrían proporcionar tanto una defensa viral no específica como acceso a nucleótidos.


Abstracto

Los virus dependen de sus anfitriones para completar sus ciclos de replicación; explotan los receptores celulares para la entrada y secuestran las funciones celulares para replicar su genoma, ensamblar viriones descendientes y diseminarse. Recientemente, se han utilizado cribados CRISPR-Cas a escala genómica para identificar los factores del huésped necesarios para la replicación del virus, incluida la replicación de virus clínicamente relevantes como el virus del Zika, el virus del Nilo Occidental, el virus del dengue y el virus de la hepatitis C. En esta revisión, discutimos los aspectos técnicos de las pantallas knockout a escala del genoma utilizando la tecnología CRISPR-Cas, y comparamos estas pantallas con tecnologías alternativas de detección genética. La relativa facilidad de uso y reproducibilidad de CRISPR – Cas lo convierten en una herramienta poderosa para sondear las interacciones virus-anfitrión y para identificar nuevos objetivos antivirales.

Los virus son patógenos intracelulares obligados que dependen de los componentes celulares del huésped para su replicación. Se unen a los receptores de la superficie celular para ingresar a las células y cooptan las funciones celulares y los orgánulos para replicarse. Las células huésped pueden contrarrestar las infecciones detectando patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), como los ácidos nucleicos virales, y activando posteriormente la expresión de genes antivirales. La identificación y caracterización de los factores del hospedador que promueven y restringen la replicación viral puede proporcionar información importante sobre los aspectos básicos de la biología celular y las relaciones virus-hospedador, y puede conducir a la identificación de nuevos objetivos para terapias antivirales.

El uso de cribados genéticos avanzados ha proporcionado una estrategia integral e imparcial para descubrir los factores del huésped que promueven o restringen la replicación del virus. Originalmente, el uso de estas pantallas genéticas se limitaba a organismos modelo genéticamente manipulables, como levaduras, moscas de la fruta, gusanos redondos y pez cebra, y se basaba en el uso de rayos X o mutágenos químicos para introducir mutaciones. Estas pantallas genéticas avanzadas han contribuido notablemente a nuestra comprensión de muchos procesos biológicos fundamentales 1, 2, 3, 4, pero su aplicación a células de mamíferos cultivadas fue un desafío. Con avances tecnológicos como el ARNi y la mutagénesis por inserción en células haploides humanas, fue posible interrumpir la expresión génica a escala genómica en cultivos de células de mamíferos 5,6,7. Recientemente, el sistema inmune adaptativo procariota CRISPR-Cas ha sido diseñado para inducir eficazmente mutaciones knockout en casi cualquier tipo de célula, lo que ha revolucionado la investigación biológica 8,9,10 (Cuadro 1). En contraste con los enfoques de eliminación de genes, como ARNi, la eliminación de alelos por CRISPR-Cas a menudo da como resultado fenotipos más marcados, una mayor relación señal-ruido y la identificación de menos falsos positivos 11,12,13,14. Los alelos knockout son generados por la endonucleasa Cas9, que se dirige a una región genómica específica mediante un ARN de guía única (sgRNA) a través del emparejamiento de bases Watson-Crick. Cas9 crea una ruptura de doble hebra (DSB) en el sitio objetivo, que luego se repara mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ). Esto a menudo da como resultado una mutación de desplazamiento del marco de lectura y la expresión de proteínas truncadas o no funcionales. La facilidad de dirigir Cas9 a loci específicos, combinada con el diseño de grupos multiplexados de sgRNA que abarcan todo el genoma humano 14,15,16,17, ha permitido la identificación a escala genómica de los factores del huésped que son cruciales para la replicación del virus.

En esta revisión, describimos cómo las pantallas genéticas han contribuido a nuestra comprensión de la biología virus-huésped y cómo las pantallas CRISPR-Cas se han utilizado para expandir nuestro conjunto de herramientas para identificar factores del huésped que son importantes para la replicación del virus. Brindamos consejos prácticos sobre cómo configurar las pantallas CRISPR – Cas y damos ejemplos de descubrimientos recientes que se han realizado utilizando la tecnología CRISPR – Cas para virus que causan enfermedades humanas importantes, incluido el virus del dengue (DENV), el virus Zika (ZIKV), Occidente Virus del Nilo (VNO), virus de la hepatitis C (VHC) y norovirus. También discutimos el potencial de la tecnología CRISPR-Cas más allá de las aplicaciones de detección genética, y cómo podría mejorar nuestra comprensión de la patogénesis viral y el desarrollo de terapias antivirales.

Recuadro 1: Inmunidad adaptativa mediada por CRISPR-Cas

El sistema CRISPR-Cas es un sistema inmunológico adaptativo que protege las bacterias y arqueas contra bacteriófagos y plásmidos. La inmunidad CRISPR-Cas está mediada por CRISPR RNA (crRNA) y una liberación de endonucleosis Cas que se dirige a elementos genéticos 141. El modo de acción consta de tres pasos distintos: adquisición, expresión e interferencia (ver figura). En el paso de adquisición, los ácidos nucleicos extraños se integran direccionalmente, como nuevos espaciadores CRISPR, en una matriz CRISPR que está separada por secuencias repetidas, creando así una memoria de elementos genéticos invasores 142 (ver la figura, paso 1). En el paso de expresión, el locus CRISPR se transcribe en una transcripción de ARN pre-CRISPR (pre-crRNA), que luego se procesa en un crRNA maduro que contiene secuencias espaciadoras CRISPR parciales unidas a repeticiones CRISPR parciales 132. El locus CRISPR también codifica un ARN transactivante (tracrRNA) que tiene complementariedad con las regiones repetidas de las transcripciones de crRNA 143. Además de la matriz CRISPR, el locus CRISPR codifica una o varias nucleasas Cas (por ejemplo, Cas9) (consulte la figura, paso 2). En la etapa de interferencia, se forma un híbrido crRNA-tracrRNA mediante la unión de las secuencias de la región repetida complementaria, y este híbrido de RNA guía a la nucleasa Cas hacia secuencias de ADN complementarias, lo que conduce a la selección y escisión de elementos genéticos invasores 144. La mayoría de las proteínas efectoras CRISPR se basan en un motivo adyacente a un protoespaciador (PAM, por ejemplo, NGG para Cas9) en el ácido nucleico diana. El PAM es esencial para el reconocimiento, la escisión y la distinción entre ADN propio y no propio 145,146,147 (ver la figura, paso 3). Para Cas9, la complementariedad perfecta impulsará un cambio conformacional en la endonucleasa que conduce a un estado estructural competente para la escisión 148,149,150,151,152,153. Los componentes de proteína y ARN del Streptococcus pyogenes El sistema CRISPR de clase 2 se ha adaptado para funcionar en eucariotas, incluso en células humanas. Un Cas9 optimizado para codones humanos se fusiona con una señal de localización nuclear (NLS) para dirigir Cas9 al núcleo en células de mamíferos 8,9,10. Para generar RNA de guía única (sgRNA) para la edición del genoma que imitan el híbrido natural de crRNA-tracrRNA, las secuencias similares a crRNA se fusionan con un tracrRNA parcial a través de un tallo-bucle sintético.


Introducción

Los virus de las plantas infectan diversas especies de plantas en todo el mundo. Durante las infecciones exitosas, los virus desencadenan una serie de interacciones con insectos vectores o plantas hospedantes. Algunos virus de plantas han adquirido componentes extravirales, verbigracia., Satélites de ADN, satélites de ARN y virus satélite (Mansoor et al., 1999 Briddon et al., 2001 Palukaitis, 2016). Los virus de las plantas han provocado una reducción significativa de la productividad de los cultivos en Asia, África, Europa y América del Sur, lo que ha provocado pérdidas de aproximadamente 30 mil millones de dólares estadounidenses al año (Sastry y Zitter, 2014). Por ejemplo, en la última década, la enfermedad del mosaico de la yuca provocó una reducción de aproximadamente 25 millones de toneladas en la producción de yuca en todo el mundo (Legg y Thresh, 2000 Thresh y Cooter, 2005). Millones de plantas de cítricos han sido destruidas anualmente por el virus Citrus Tristeza (CTV) (Moreno et al., 2008 Harper, 2013). El virus del enrollamiento de la hoja de la papa ha provocado una pérdida de aproximadamente US & # x0024100 millones en los Estados Unidos y alrededor de & # x00A350 millones en el Reino Unido (Wale et al., 2008 Sastry y Zitter, 2014). De manera similar, durante el período comprendido entre 1992 y 9197, la enfermedad del enrollamiento de la hoja del algodón causó una pérdida de alrededor de US $ 00245 mil millones (Briddon et al., 2001) para la economía de Pakistán.

Un enfoque eficaz para el control de virus requiere métodos de detección eficientes y conocimientos posteriores sobre la arquitectura genómica de los virus objetivo. Varios enfoques, incluido el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el análisis de enzimas de restricción, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), se han utilizado regularmente como una herramienta de detección inicial. La mayoría de estas técnicas de diagnóstico se basan en el conocimiento previo de los genomas virales, por lo que los virus desconocidos pueden pasar desapercibidos. Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) han revolucionado el campo de la biología molecular, especialmente la virología vegetal, al desenterrar de manera integral los datos genómicos a un nivel que antes no era posible. Las tecnologías actuales de NGS pueden secuenciar todos los tipos de moléculas de ácido nucleico al mismo tiempo. Las tecnologías NGS han permitido la detección de nuevos virus patógenos que no han sido detectados debido a un título viral bajo o niveles de umbral de detección (Villamor et al., 2019). Estas tecnologías NGS facilitan el descubrimiento de especies de virus de plantas que se pasan por alto y ayudan a ampliar nuestra comprensión de los fitoviromas.

La recombinación se ha utilizado como una herramienta para modificar los genomas procarióticos, pero este enfoque fue menos específico y de bajo rendimiento. El descubrimiento de cuatro endonucleasas específicas de secuencia como las meganucleasas, la nucleasa de dedo de zinc (ZFN), el activador de la transcripción como la nucleasa efectora (TALEN) y las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) - proteína asociada a CRISPR 9 (CRISPR-Cas9) ( Zhang et al., 2013) mejoraron sustancialmente la edición del genoma (GE) en organismos superiores (Wiedenheft et al., 2011 Jinek et al., 2012, 2013 Gaj et al., 2013). Entre ellos, el sistema CRISPR-Cas es la herramienta de GE más simple, eficiente y versátil que permite la mutagénesis dirigida al sitio en la posición genómica deseada (Gaj et al., 2013 Bortesi y Fischer, 2015).

Los sistemas CRISPR-Cas se derivan de sistemas inmunes procarióticos que proporcionan inmunidad autóctona contra los ácidos nucleicos invasores (Figura 1). Los sistemas CRISPR-Cas son diversos y se pueden dividir en dos clases principales, seis tipos diferentes y múltiples tipos (Makarova et al., 2020). Los principales componentes de los sistemas CRISPR-Cas más utilizados son las endonucleasas Cas9, que se derivan de diferentes microorganismos, como Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, y Francisella novicida, y forman parte de sistemas de clase II tipo II (Makarova y Koonin, 2015 Makarova et al., 2020). Estas proteínas Cas9 están acompañadas por CRISPR-RNA (crRNA) y CRISPR-RNA trans-activador (tracrRNA) para la escisión dependiente de la secuencia de ácidos nucleicos extraños (Hille et al., 2018 Makarova et al., 2020). La invención de un ARN de guía única (ARNsg) aumentó las aplicaciones potenciales de los sistemas CRISPR-Cas (Jinek et al., 2012). Como paso inicial en la inmunidad procariótica basada en CRISPR-Cas, los fragmentos de ácido nucleico de los patógenos invasores se integran en el locus CRISPR durante la infección. Por tanto, las infecciones posteriores activan la transcripción de estos fragmentos más pequeños como parte de la matriz CRISPR que coordinan con la maquinaria proteica asociada a CRISPR (Cas) para reconocer, unir y escindir los elementos extraños de ADN / ARN.

Figura 1. Un modelo de inducción de resistencia generalizado basado en CRISPR-Cas. La identificación, el reclutamiento y la escisión del patógeno invasor y el ácido nucleico (hongos, bacterias, virus y / o fitoplasmas) se logran en tres pasos fundamentales. 1. Adquisición: el ADN invadido (barra en color rojo) se integra en la matriz CRISPR (rectángulos blancos) como nuevos espaciadores 2. Expresión: la maquinaria pre-CRISPR y crRNAs se activa y expresa en la célula invadida 3. Interferencia: el crRNA maduro se hibridó con el genoma del patógeno invasor y posteriormente fue reconocido por las proteínas Cas. La coordinación de Cas helicasa y nucleasa con la maquinaria de ARN CRISPR da como resultado la escisión del ácido nucleico invasor.

Además de los conocidos sistemas CRISPR-Cas9, las aplicaciones biotecnológicas para varios de los otros tipos y subtipos de CRISPR también se encuentran en desarrollo activo. Los sistemas CRISPR-Cas se clasifican en dos clases principales según el tipo de interferencia: Clase I y Clase II. Las clases I y II se clasifican además en seis tipos según el tipo de ácido nucleico al que se dirigen (Makarova y Koonin, 2015). La clasificación evolutiva de los sistemas CRISPR-Cas, especialmente la clase II y sus variantes, ha sido evaluada por Makarova et al. (2020). Entre los sistemas de proteínas Cas individuales de clase II, estos incluyen Cas12 (tipo V), Cas9 (tipo II), Cas13a-d (tipo VI) y Cas14a-c (tipo VF) (Burstein et al., 2017 Shmakov et al. , 2017).Al igual que Cas9, Cas12 se dirige al ADN de doble hebra (ds), sin embargo, las proteínas efectoras Cas13 (tipo VI): Cas13a (C2c2) (Abudayyeh et al., 2016), Cas13b (C2c6) (Cox et al., 2017), Cas13c (C2c7) (Shmakov et al., 2017) y Cas13d (Yan et al., 2018) se caracterizan como ribonucleasas guiadas por ARN en genomas microbianos.

A diferencia de los sistemas de clase 2, los sistemas de clase 1 están compuestos por múltiples proteínas Cas, en diferentes combinaciones, dependiendo del tipo y subtipo. Específicamente, los complejos de tipo I generalmente se componen de Cas5, Cas6, Cas7, Cas8 y Cas11, y el dsDNA diana, mientras que los complejos de tipo III están compuestos de Cas5, Cas6, Cas8 y Cas10 y están muy extendidos en el sistema inmunológico de casi una cuarta parte de las especies bacterianas (Koonin et al., 2017). El CRISPR de tipo III se divide en dos subtipos, es decir, el tipo III-A y el tipo III-B, según dos efectores Cas principales (Cas10-Csm y Cas10-Cmr). El tipo II se compone de Cas5, Cas6, Cas7 y Csf1. Curiosamente, estos sistemas de tipo III no requieren un PAM y, en su lugar, se dirigen a los ARNm nacientes y al ADN correspondiente en complejos transcripcionalmente activos.

En los últimos años, las aplicaciones de la tecnología CRISPR-Cas se han extendido a todos los campos de las biociencias, incluyendo líneas celulares animales y humanas (Belhaj et al., 2015), así como virus humanos (tanto ARN como ADN) ( Hadidi et al., 2016). La tecnología CRISPR tiene amplias aplicaciones que abarcan la inserción y / o deleción de un segmento particular de ADN, la introducción de mutagénesis dirigida al sitio, la expresión y / o represión de genes y la remodelación del epigenoma. Los sistemas CRISPR-Cas ofrecen grandes ventajas que incluyen facilidad de clonación, bajo costo y multiplexación, donde múltiples sitios en el genoma pueden ser dirigidos simultáneamente (Shin et al., 2017 Manghwar et al., 2019 Lee et al., 2020). Varios estudios han demostrado la efectividad de la tecnología CRISPR-Cas debido a sus aplicaciones rápidas y fáciles de usar en especies recalcitrantes, que pueden usarse de manera efectiva para introducir o eliminar diferentes genes (a la vez) y no requieren muchas herramientas de manipulación. Desde la primera aplicación de GE basada en CRISPR-Cas en plantas en 2013, esta técnica se ha utilizado continuamente para diseñar resistencia contra una variedad de virus de plantas (Scheben et al., 2017 Vats et al., 2019 El-Mounadi et al. , 2020).

Se han sugerido tres enfoques generales para diseñar mecanismos antivirales utilizando CRISPR-Cas: (1) el complejo Cas9 / sgRNA recluta elementos genéticos virales como el origen de la replicación (ori) y evita la unión de proteínas asociadas a la replicación, (2 ) el complejo Cas9 / sgRNA diseca directamente el ácido nucleico viral para prevenir la replicación del ADN viral, y (3) el complejo Cas9 / sgRNA muta el genoma viral en ciertas posiciones a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) (Chaparro-García et al. , 2015). Además de Cas9, una endonucleasa recientemente descubierta Cas12a (anteriormente denominada Cpf1) ofrece actividad de nucleasa dual como endoribonucleasa para el procesamiento de crRNA y como endo-desoxirribonucleasa para diseccionar el ácido nucleico y producir roturas ds (DSB), respectivamente (Alok et al. ., 2020). Otro hito en la GE basada en CRISPR-Cas es el descubrimiento reciente de otra proteína efectora, Cas13, un análogo de ARNi en eucariotas para dirigirse directamente a los genomas de ARN de virus vegetales (Abudayyeh et al., 2017). Este sistema aún no se ha aprovechado contra virus de ADN. Sin embargo, se puede usar para apuntar al ARNm de virus de ADN durante la infección (Loriato et al., 2020). En geminivirus, el sistema CRISPR-Cas se puede emplear para inhibir eficazmente la acumulación de virus al apuntar a cualquier región genómica y apilar diferentes ARNsg contra un solo virus o múltiples virus y sus satélites de ADN asociados (Iqbal et al., 2016 Rahman et al., 2017 Dahan & # x2212Meir et al., 2018 Ali et al., 2019 Roy et al., 2019).

Los avances en las tecnologías NGS y GE están revolucionando los campos de la genética, la genómica, la biología molecular y otros, incluida la virología vegetal. Las tecnologías NGS ayudaron en el surgimiento y evolución de tecnologías modernas de silenciamiento génico y GE, como la interferencia de ARN (RNAi) y CRISPR-Cas, respectivamente. En este artículo de revisión, discutimos el papel de las tecnologías NGS y CRISPR-Cas en la virología vegetal.


3. Detección de ácidos nucleicos por CRISPR-Cas

Recientemente se ha descrito un gran conjunto de diferentes métodos basados ​​en CRISPR utilizados para detectar ácidos nucleicos. Las primeras tecnologías utilizaban la proteína Cas9 canónica de los sistemas CRISPR-Cas de tipo II [52] o su proteína Cas9 (dCas9) modificada nucleolíticamente nula o muerta [53]. Un gran salto hacia el desarrollo de diagnósticos moleculares basados ​​en CRISPR fue el descubrimiento de la actividad colateral proteica de Cas12, Cas13 y Cas14, una propiedad que puede aprovecharse para amplificar la señal específica en el objetivo [43]. Hoy en día, se han introducido muchas modificaciones y mejoras en las plataformas moleculares basadas en CRISPR que dependen de la actividad colateral de las proteínas CRISPR-Cas tipo V y tipo VI, pero el concepto general permanece inalterado.

Hasta la fecha, los sistemas CRISPR-Cas se aprovechan de forma rutinaria como herramientas para la edición de genes, la remodelación del epigenoma, la regulación de la transcripción de genes y la visualización de secuencias de ADN / ARN en células vivas [53]. Otra aplicación de CRISPR-Cas como instrumento de diagnóstico molecular demostró ser posible solo en los últimos años. Los métodos moleculares para detectar ácidos nucleicos basados ​​en sistemas CRISPR-Cas parecen ser muy sensibles, específicos y capaces de detectar en un solo paso tanto el ARN como el ADN.

3.1. Detección de ácidos nucleicos mediante sistemas CRISPR-Cas tipo I

Actualmente, hay un solo estudio que informa el desarrollo de un ensayo de diagnóstico CRISPR basado en sistemas CRISPR de tipo I-E. Este ensayo se denominó detección de ácido nucleico operada por Cas3 (CONAN) [50]. Yoshimi et al., Demostraron que Cas3 exhibe actividad colateral con varios tipos de PAM al reconocer el objetivo. La escisión no específica de las sondas de ADN monocatenarias tras la activación de Cas3 proporciona un medio rápido y sensible para detectar ácidos nucleicos. CONAN se desarrolló en dos formatos, ya sea con detección fluorescente por lector de microplacas o ensayo de flujo lateral.

3.2. Detección de ácidos nucleicos mediante sistemas CRISPR-Cas tipo II

Zhang y col. (2017) crearon una prueba de diagnóstico basada en dos proteínas dCas9 fusionadas con dominios divididos de la enzima luciferasa [54]. La unión de dos proteínas dCas9 al ADN diana adyacente da como resultado la reconstitución de la luciferasa y la emisión de una señal luminiscente que puede detectarse fácilmente con un luminómetro. Como prueba de concepto, se demostró que esta tecnología detecta Tuberculosis micobacteriana con alta especificidad y sensibilidad [54].

En 2017, Wang et al. desarrolló un método multiplex para detectar el virus del papiloma humano (VPH) mediante la proteína Cas9 dirigida a los genes virales L1 y E6 / E7 amplificados mediante PCR (ctPCR) [55]. Esta tecnología emplea un protocolo de detección de ADN de 3 pasos: (1) amplificación de ADN mediante PCR (2) escisión nucleolítica de amplicones de PCR mediante Cas9 y (3) amplificación de fragmentos escindidos mediante PCR. Los productos de PCR resultantes se detectan mediante electroforesis en gel o fluorescencia. Según Wang et al., Este método aumenta la sensibilidad de la prueba diagnóstica y ayuda a diferenciar las cepas de HPV16 y HPV18 [55]. Esta prueba se ha actualizado recientemente para proporcionar una detección cuantitativa de HPV16 / 18 utilizando qPCR (ctPCR3.0) [56]. Otro método de detección basado en Cas9 llamado PCR inversa (CARP) asociado a Cas9 / sgRNA [50] consta de tres pasos, a saber (1) escisión del ADN diana en dos sitios mediante la endonucleasa Cas9 (2) ligación intermolecular e intramolecular de la escisión productos por ADN ligasa T4 y (3) amplificación por PCR del ADN ligado. CARP detectó con éxito tan solo 0,002 & # x000a0ng del gen HPV16 L1 y permitió la discriminación específica de los subtipos HPV16 y HPV18.

Pardee y sus colegas desarrollaron una técnica llamada división NASBA-CRISPR (NASBACC), que se basa en el principio de los sensores de contacto y la capacidad de la proteína Cas9 para escindir selectivamente el ADN diana [17]. Los sensores de contacto del pie representan riborreguladores sintéticos programados capaces de controlar la traducción mediante la unión del ARN disparador. Los riborreguladores llevan una estructura de horquilla que bloquea la traducción. en cis secuestrando el sitio de unión del ribosoma y el codón de inicio. Cuando un riborregulador se une a un ARN activador complementario, el sitio de unión del ribosoma y el codón de inicio se liberan y se habilita la traducción. El objetivo de ARN es luego amplificado por NASBA de modo que el ARN de interés se transcribe de forma inversa y se une al riborregulador. El sistema de amplificación NASBA utiliza una batería de 3 enzimas: transcriptasa inversa, RNasa H y polimerasa T7. En el método NASBA, el ARN diana se convierte en un híbrido de ADNc-ARN usando cebadores específicos RNasa H y luego destruye el ARN en este dúplex. A continuación, se agrega un cebador a la mezcla de reacción para producir moldes sintéticos reconocidos por la polimerasa T7. Los resultados de la reacción se detectan mediante colorimetría [17]. Esta tecnología detecta eficazmente los virus del Zika y el dengue con la sensibilidad de 1 & # x020133 fM.

Otro hito en el diagnóstico CRISPR fue el desarrollo de CRISPR-Chip [57]. CRISPR-Chip combina los principios de CRISPR con un transistor electrónico hecho de grafeno (una sola capa de átomos de carbono) [58]. CRISPR-Chip utiliza una proteína dCas9 que se une, pero no corta, el ADN diana. Las proteínas dCas9 están inmovilizadas en transistores de grafeno. Después de agregar ADN aislado de muestras biológicas, dCas9 se une al ADN objetivo, alterando así la conductividad eléctrica del grafeno y las características eléctricas del transistor. CRISPR-Chip es altamente sensible, capaz de detectar tan solo 1,7 fM de ADN diana, y el procedimiento es extremadamente rápido, y solo toma 15 & # x000a0min. CRISPR-Chip se ha utilizado para detectar mutaciones genéticas en muestras clínicas de pacientes con distrofia muscular de Duchenne [57].

Los métodos de amplificación isotérmica son particularmente importantes para realizar diagnósticos moleculares en áreas remotas y en laboratorios sin personal especialmente capacitado. El método de amplificación por desplazamiento de hebra mediada por endonucleasas de corte activado por CRISPR-Cas9 (CRISDA) utiliza una combinación de tecnología CRISPR-Cas9 y métodos de amplificación isotérmica. Utiliza ninasas Cas9 (proteínas Cas9 con una mutación en un dominio nucleolítico que hace que la proteína sea capaz de cortar una sola hebra de ADN) y amplificación por desplazamiento de hebra única (SDA) de fragmentos diana seguida de detección de la señal por ácido nucleico peptídico fluorescente. Medición de punto final mediada por invasión. La intensidad de la señal se puede medir con un fluorímetro. La tecnología CRISDA ayuda a detectar ácidos nucleicos diana con una especificidad de 1 nucleótido [59].

Quan y sus colegas describieron el hallazgo de secuencias de baja abundancia mediante el método de hibridación (FLASH), desarrollado para detectar patógenos resistentes a la terapia antimicrobiana [60]. FLASH utiliza una batería de sgRNA junto con proteínas Cas9 que cortan el gen de interés en pequeños fragmentos adecuados para la secuenciación adicional de Illumina de próxima generación. Los extremos de ADN / ADNc primero se bloquean con fosfatasa para evitar la ligadura con los adaptadores utilizados en el siguiente paso y luego se cortan con Cas9. El ADN de interés se escinde nucleolíticamente dando como resultado fragmentos con extremos no bloqueados y, por lo tanto, puede unirse con adaptadores universales, amplificarse mediante PCR y secuenciarse. Los autores confirmaron la utilidad de esta tecnología en modelos de neumonía causada por bacterias grampositivas que incluyen S. aureus y de causantes de malaria Plasmodium falciparum [60] .

De manera similar, el método de reacción de amplificación exponencial activada por CRISPR-Cas9 (Cas-EXPAR) combina las ventajas de Cas9 para introducir cortes específicos del sitio en el ADN diana con el método EXPAR isotérmico con detección de señal fluorescente [61]. En comparación con otros métodos de amplificación isotérmica, como NASBA, RCA, SDA, LAMP o RPA, EXPAR se caracteriza por una eficacia y velocidad relativamente altas de amplificación del producto. Hasta ahora, EXPAR no se utilizaba ampliamente en el diagnóstico molecular y se aplicaba principalmente para la detección de microARN cortos [62]. Esta utilidad limitada se debió a una propiedad inherente de EXPAR que no permite usar secuencias de ADN extendidas como cebadores para la amplificación. Sin embargo, CRISPR-Cas9 se puede programar para cortar moléculas de ADN en fragmentos lo suficientemente cortos como para implementar EXPAR con éxito. SpCas9 de tipo salvaje puede apuntar y cortar solo moléculas de ADN de doble hebra, pero el uso de los denominados PAM-mer (plantillas de ADN de una sola hebra complementaria a las plantillas de una sola hebra con una secuencia de PAM) permite que SpCas9 reconozca y escinda de una sola hebra. moléculas de ARN o ADN de cadena. La sensibilidad informada de Cas-EXPAR es & # x000a0

& # x000a01 amol & # x0201310 fmol, y el límite de detección fluctúa alrededor de 0,82 amol [61]. Estos valores son comparables a los observados usando diagnósticos de PCR. Debido a la alta especificidad de Cas-EXPAR, esta tecnología se puede utilizar para detectar ADN metilado después de la conversión de bisulfito, que cambia todas las citosinas del ADN en uracilo, excepto las citosinas metiladas (5-metilcitosina), que permanecen intactas. Por tanto, un sitio de ADN con citosina convertida en uracilo durante la conversión de bisulfito no será reconocido ni escindido por la proteína Cas9 cuando el sgRNA se dirige a la secuencia original (no convertida). Como resultado, la amplificación isotérmica de tales moldes por EXPAR procede con baja eficacia. Por el contrario, la 5-metilcitosina permanece intacta durante los sitios de conversión de bisulfito, por lo que la 5-metilcitosina puede ser reconocida y cortada eficazmente por Cas9, amplificada eficazmente por EXPAR y detectada utilizando métodos de fluorescencia convencionales.

Para evitar el uso de muchas nucleasas diferentes, proteínas accesorias y costosas sondas fluorescentes, Wang y sus coautores [63] combinaron el ensayo de ácido nucleico de flujo lateral con una herramienta CRISPR-Cas9. Esta tecnología, denominada ensayo de ácido nucleico de flujo lateral mediado por CRISPR-Cas9 (CASLFA), integra el sistema CRISPR-Cas9 con un dispositivo de flujo lateral para detectar dsDNA objetivo (Fig. 1). La diana se amplifica primero mediante PCR o métodos de amplificación isotérmica con cebadores biotinilados, se incuba con CRISPR-Cas9 RNP y luego se filtra sobre la almohadilla de muestra. En la superficie de la almohadilla conjugada, las sondas de AuNP-ADN se unen a un andamio de ARNgs modificado. En esta tecnología, la estructura de tallo-bucle del sgRNA se extiende mediante la inserción de nucleótidos adicionales que son reconocidos por sondas universales de AuNPs-DNA. A continuación, los amplicones biotinilados complejados con CRISPR-Cas9 fluyen a la línea de prueba y toda la mezcla es capturada por la estreptavidina. Esta señal de color se visualiza en la línea de prueba. En la línea de control, las sondas de ADN de AuNP se hibridan con la estreptavidina prerrecubierta y generan una banda coloreada. En resumen, CASLFA es un método simple, que consiste en un paso de amplificación de PCR / RPA con cebadores biotinilados y un ensayo de flujo lateral corto (3 & # x020135 & # x000a0min) que detecta el ADN diana con alta especificidad y sensibilidad (LOD es & # x02248 varias copias de genes ). En conclusión, los autores prevén varias mejoras técnicas en CASLFA, como la detección multiplex de diferentes objetivos mediante la introducción de cebadores con diferentes etiquetas y la combinación de CALSFA con tecnología de microfluidos en una plataforma de diagnóstico avanzada.

Esquemas del método de diagnóstico CRISPR basado en CRISPR-Cas9 CASLFA. (A) Estructura del dispositivo de flujo lateral. El dispositivo de flujo lateral consta de una almohadilla de muestra donde se aplica el aislado, una almohadilla de conjugado con sondas de AuNP-ADN preensambladas, una línea de prueba y una línea de control. En la línea de prueba, los complejos de CRISPR-Cas con las sondas de ADN biotinilado objetivo y AuNP-ADN, hibridadas con la región de tallo-bucle de sgRNA, interactúan con estreptavidina prerrecubierta en la almohadilla de prueba para producir una señal visible. Al mismo tiempo, las sondas de AuNP-DNA avanzan e interactúan con la estreptavidina en la línea de control. Las sondas de AuNP-DNA contienen tres regiones, a saber (1) poliA-polyT (poli A utilizado para marcar con Au y polyT como enlazador) (2) área púrpura para hibridación con la sonda incrustada en la línea de control y (3) área amarilla utilizado para la hibridación con la región de tallo-bucle diseñado en sgRNA. (B) Esquemas del procedimiento CASLFA. El ADN aislado se amplifica con cebadores biotinilados usando RPA o PCR. Los amplicones se mezclan con el complejo de detección CRISPR-Cas9 y sondas de ADN y, después de una breve incubación, se aplican al dispositivo de flujo lateral. La imagen fue creada en BioRender. (Para la interpretación de las referencias al color en la leyenda de esta figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).

3.3. Detección de ácidos nucleicos por CRISPR-Cas tipo V y VI

En 2018, Doudna y sus colegas presentaron la plataforma de diagnóstico CRISPR-Cas denominada reportero trans CRISPR dirigido a endonucleasas de ADN (DETECTR) (Fig. 2) [51]. Este método se basa en la actividad colateral de la proteína Cas12a activada después del reconocimiento del ARN diana por Cas12a. Los autores demostraron que la proteína Cas12a de Bacteria Lachnospiraceae ND2006(LbCas12a) exhibe una actividad colateral no específica y degrada todas las moléculas de ADN adyacentes después de reconocer el ssDNA o dsDNA diana. Si la reacción con la proteína Cas12a y el crRNA dirigido se complementa con informadores de ADN monocatenarios (sondas) y luego se mezcla con la muestra biológica, el reconocimiento dependiente del crRNA de ácidos nucleicos patógenos por Cas12a activa una actividad colateral que destruye las sondas de ADN. Las sondas de ADN se diseñan de forma similar a las sondas TaqMan convencionales, en las que un extremo del indicador está unido por un fluoróforo y el opuesto está unido a un extintor. La degradación de las sondas de ADN libera fluoróforos y da como resultado una señal fluorescente fuerte y estable detectada por un fluorímetro. Además, DETECTR se ha combinado con un paso de preamplificación isotérmica para enriquecer las secuencias diana (RPA). RPA mejora la sensibilidad analítica de la prueba de diagnóstico y ayuda a evitar la necesidad de equipos sofisticados y costosos.

Esquemas de la plataforma de diagnóstico CRISPR-Cas DETECTR y OR-DETECTR. (A) Oleoducto DETECTR. La molécula de ADN se amplifica utilizando el método RPA de amplificación isotérmica seguido de la adición de la mezcla Cas12a con sgRNA y sondas fluorescentes. Cas12a reconoce el ADN diana y destruye las sondas fluorescentes mediante actividad colateral para producir una señal fluorescente. (B) Oleoducto OR-DETECTR. La mezcla CRISPR-Cas y la mezcla RT-RPA se separan físicamente para evitar la apertura del tubo y la posible contaminación cruzada de las muestras. La imagen fue creada en BioRender.

Otras proteínas ortólogas de diferentes organismos - AsCas12a (Acidaminococcus sp.), FnCas12a (Franciella novicida), AaCas12b (Alycyclobacillus acidoterrestris) [43] & # x02013 también poseen actividad colateral y pueden usarse para crear plataformas de diagnóstico por el mismo principio que DETECTR.

DETECTR se utilizó provisionalmente para detectar el VPH y diferenciar entre el VPH16 y el VPH18, los tipos de VPH más pro-oncogénicos. En este contexto, se diseñaron dos crRNA para apuntar al bucle V hipervariable del gen L1, que difiere en solo 6 nucleótidos entre los tipos HPV16 y HPV18. En cultivo celular, DETECTR discriminó eficazmente entre estos tipos de VPH. En extractos de ADN crudo, DETECTR identificó HPV16 en 25 de 25 casos y HPV18 en 23 de 25 casos, determinado provisionalmente por PCR. En particular, el análisis DETECTR tarda solo 1 & # x000a0h en completarse [51].

También en 2018, Doudna et al. caracterizó por primera vez una familia muy diversa de sistemas CRISPR-Cas similares a CRISPR-Cas tipo V [46]. En este sistema, la proteína característica Cas14 PAM escinde de forma independiente moléculas de ADN monocatenarias. Al igual que las proteínas Cas12, Cas14 exhibe actividad colateral y corta cualquier molécula de ADN adyacente, lo que hace que las proteínas Cas14 sean útiles en diagnósticos basados ​​en CRISPR. A diferencia de Cas12, Cas14 tiene menor tolerancia a los desajustes de nucleótidos entre el sgRNA y la plantilla diana, la secuencia de siembra interna es muy sensible a los desajustes de nucleótidos, lo que reduce en gran medida la actividad en el objetivo de Cas14. Esta propiedad es fundamental para el uso de Cas14 para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en el ADN. El uso de Cas14 en la plataforma DETECTR permitió la identificación de SNP en el gen HERC2 humano, responsable de la coloración de los ojos [46].

Más recientemente, se utilizó el sistema CRISPR-Cas de tipo V para desarrollar un sistema de detección de fase de solución completa de alto rendimiento para detectar el virus de la peste porcina africana (ASFV). El virus de la peste porcina africana infecta a los cerdos domésticos y a los jabalíes, provocando brotes masivos de enfermedades con una tasa de mortalidad de casi el 100%. El virus de la peste porcina africana es otra amenaza global que afecta a la industria alimentaria, el suministro de alimentos y el comercio internacional. Las proteínas Cas12a con crRNA que se dirigen al ADN del ASFV se activan e inducen la degradación de los indicadores fluorescentes del ssDNA mediante la actividad colateral. Esta prueba proporcionó los medios para una detección muy rápida (dentro de 2 & # x000a0h) y precisa (límite de detección de 1 & # x000a0pM) del virus de la peste porcina africana, distinguiendo secuencias de ADN diana estrechamente relacionadas [64]. La amplificación isotérmica aumenta la sensibilidad del sistema, lo que permite la detección de concentraciones femtomolares (límite de detección de 100 fM) de ADN utilizando un fluorómetro de diseño personalizado. Acoplamiento del ensayo CRISPR-Cas12a con un sistema de punto de atención de sobremesa desarrollado previamente con un láser portátil y un mini espectrómetro.

En general, esta técnica es adecuada para entornos de bajos recursos y detección masiva. Según los autores, el sistema AFSV avanzado es económico, automatizado, liviano y no requiere operadores capacitados. La detección de ASFV mediante CRISPR-Cas12a es uno de los primeros ejemplos que fortalecen la unificación de los diagnósticos CRISPR-Cas para las ciencias veterinarias.

Otro grupo aprovechó la proteína Cas12a para desarrollar el sistema de sistema altamente eficiente multipropósito de una hora y bajo costo (HOLMES) [65]. En lugar de la amplificación isotérmica utilizada por el método DETECTR para enriquecer los ácidos nucleicos diana, HOLMES utiliza la PCR. Utilizando HOLMES, los autores detectaron virus de ADN como el virus de la encefalitis japonesa y el virus de la enfermedad de Aujeszky & # x02019s en 1 & # x0201310 attomolaramounts [65]. Sin embargo, la necesidad de amplificación por PCR requiere un equipo costoso y agrega un paso adicional que requiere mucho tiempo.

El método HOLMESv2 modificado utiliza la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos mediante amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y el reconocimiento de las plantillas de ADN monocatenarias o bicatenarias diana mediante la proteína Cas12b, seguido de la degradación de las sondas fluorescentes de ADN monocatenario mediante la actividad colateral de Cas12b [ 66]. La actividad colateral máxima se alcanza dentro de los 10 & # x000a0min después del reconocimiento de las moléculas de ADN monocatenarias objetivo por Cas12b, y cambia a 30 & # x000a0min cuando Cas12b reconoce el ADN bicatenario. Esta propiedad indica las intrincadas diferencias entre Cas12b y Cas12a, siendo la primera proteína más activa hacia el ADN de doble hebra. Alicyclobacillus acidoterrestrisCas12b (AacCas12b) reconoce y escinde el ADN de doble hebra diana con la secuencia PAM adyacente 5 & # x002b9-TTN-3 & # x002b9 y exhibe actividad colateral [67]. Entre las plantillas diana con diferentes regiones PAM, solo el ADN bicatenario con secuencias PAM 5 & # x002b9-TTC-3 & # x002b9 y 5 & # x002b9-TAC-3 & # x002b9 después del corte activa la actividad colateral de Cas12b y la degradación asociada de las sondas de ADN fluorescentes, lo que indica que no todos los sitios de ADN de doble hebra reconocidos por Cas12b pueden activar eficazmente la actividad colateral de la proteína de edición de genes. Tras la unión al ADN monocatenario, se demostró que la actividad colateral de Cas12b era independiente de PAM, siempre activada después de la interacción con un objetivo apropiado. La concentración más baja del ADN monocatenario o bicatenario diana detectada por Cas12b fue de alrededor de 1 & # x000a0nM. La combinación de las tecnologías Cas12b y LAMP proporciona una detección específica de tan solo 0,01 fM de ADN, lo que equivale a la sensibilidad de Cas12a. HOMLESv2 también permite la detección de trazas de ADN y ARN, si el aislado se transcribe de forma inversa durante la preparación de la muestra. Para reducir el tiempo necesario para realizar la transcripción inversa y la amplificación del ARN, los autores propusieron el uso de ADN polimerasas con 5 & # x002b9 & # x021923 & # x002b9 polimerización de ADN y actividad de transcriptasa inversa (por ejemplo, ADN polimerasa Bst) [68].

En 2017, Feng Zhang y sus colegas presentaron SHERLOCK (Fig. 3), una plataforma de diagnóstico basada en el sistema CRISPR-Cas tipo VI [18], [69]. SHERLOCK se basa en los mismos principios que DETECTR, pero se basa en la actividad de la nucleasa Cas13 de Leptotrichia wadei. Cas13 reconoce y escinde específicamente solo ARN, en lugar de ADN como Cas12a, por lo que degrada de manera no específica las moléculas de ARN vecinas. La transcripción in vitro del aislado permite la detección de dianas de ADN. La amplificación isotérmica RPA se puede utilizar para enriquecer las moléculas diana y aumentar la sensibilidad. Los fragmentos de ARN amplificados se mezclan con ARNr de proteína Cas13 y sondas de ARN fluorescentes. Si las moléculas diana están presentes en la muestra, Cas13 las reconoce a través de crRNA y escinde indiscriminadamente (por actividad colateral) sondas de RNA fluorescentes, interrumpiendo la interacción entre el fluoróforo y el extintor. La presencia e intensidad de la señal fluorescente indican por tanto la cantidad del objetivo en la muestra biológica. Los autores demostraron que SHERLOCK detecta el virus del Zika, el virus del dengue, diversas bacterias patógenas y SNP en el ADN con sensibilidad attomolar. Todos los componentes de la reacción de SHERLOCK pueden liofilizarse y utilizarse después de largos períodos de almacenamiento sin afectar la sensibilidad y especificidad de la prueba [18]. SHERLOCK tenía un gran inconveniente: era cualitativo, no cuantitativo, pero un año después, los autores presentaron la segunda versión de la plataforma, SHERLOCKv2 (Fig. 3) [70]. SHERLOCKv2 puede detectar simultáneamente objetivos en 4 canales fluorescentes diferentes, porque las proteínas Cas13 de diferentes organismos - LwaCas13a (L. wadei), CcaCas13b (Apnocytophaga canimorsus Cc5), LbaCas13a (L. bacteria[cepa NK4A179]) y PsmCas13b (Prevotella sp. MA2016)) - Destruye moléculas de ARN y ADN adyacentes preferentemente en ciertos sitios de dinucleótidos (AU, UC, AC y GA, correspondientemente). Al generar sondas enriquecidas en diferentes dinucleótidos y vinculadas a diferentes fluoróforos, los autores demostraron la capacidad de SHERLOCKv2 para detectar hasta 4 dianas. SHERLOCKv2 también evalúa cualitativamente muestras con la sensibilidad de 2 attomols, optimizada para dar como resultado una fuerte correlación entre la intensidad de la señal y la concentración del objetivo. La sensibilidad de la señal se incrementó dramáticamente sobre la de SHERLOCK al agregar proteína Csm6 a la mezcla de reacción. La amplificación de la señal se hace posible porque la actividad colateral de LwaCas13a y PsmCas13b destruye el ARN, generando extremos 5 & # x002b9 hidroxilados y homopolímeros lineales de adenina que terminan con fosfatos cíclicos 2 & # x002b9,3 & # x002b9. Este último activa Csm6, que destruye nuevas moléculas sonda y amplifica la señal específica. Al probar proteínas Csm6 de muchas especies diferentes, los autores demostraron que Csm6 de Enterococcus italicus y Lactobacillus salivarius se activaron más eficazmente mediante extremos fosfato cíclicos 2 & # x002b9,3 & # x002b9. Finalmente, SHERLOCKv2 fue diseñado para producir una lectura colorimétrica visual en tiras de flujo lateral comerciales que no requieren ningún equipo especial. En este escenario, la presencia del objetivo se determina inspeccionando visualmente las tiras con diferente intensidad de tinción. Toda la reacción de SHERLOCKv2 se realiza en un solo paso aplicando directamente la muestra biológica a la tira reactiva sin purificar ni aislar los ácidos nucleicos. Para concluir, SHERLOCKv2 es una plataforma de diagnóstico cuantitativo de alta sensibilidad adecuada para la detección de señales multiplex y la detección visual / colorimétrica en tiras de flujo lateral [70].

Esquemas de las plataformas de diagnóstico CRISPR-Cas SHERLOCK / v2. Canalización SHERLOCK / SHERLOCKv2. Las moléculas de ADN o ARN se amplifican isotérmicamente usando RPA o RT-RPA, correspondientemente. El ADN se transcribe en ARN mediante la reacción de transcripción de T7 in vitro. Cas13 reconoce las moléculas de ARN diana y escinde las sondas fluorescentes mediante actividad colateral. Pueden usarse diferentes preferencias de nucleótidos de proteínas Cas13 de diferentes especies para la escisión preferencial de sondas fluorescentes en dinucleótidos específicos. Por tanto, este método se puede utilizar para la detección multiplex con sondas diseñadas. Alternativamente, los resultados de la reacción se pueden visualizar en tiras de flujo lateral usando reacción cromogénica. La imagen fue creada en BioRender.

La mayoría de las herramientas de diagnóstico CRISPR implican varios pasos de pipeteo, que implican la apertura de tubos de reacción con producto amplificado y un alto riesgo de contaminación de la muestra. Este problema se aborda con elegancia en la plataforma de detección de un tubo con tecnología OR-DETECTR / OR-SHERLOCK (Fig. 2 B) [71]. Aquí, la muestra extraída se agrega a la mezcla de RPA en la parte inferior del tubo de centrífuga, mientras que la mezcla DETECTR / SHERLOCK se separa físicamente en el lado interno de la tapa del tubo. Después de la amplificación de RPA, los componentes de RPA y los componentes de CRISPR-Cas se mezclan mediante centrifugación corta. El objetivo amplificado puede entonces ser reconocido por los complejos CRISPR-Cas. La señal se puede visualizar usando un ensayo de flujo lateral o fluorescencia.

En un intento por desarrollar un ensayo en un recipiente, Arizti-Sanz con los coautores crearon un procedimiento de Resaltado optimizado de infecciones para navegar por epidemias (SHINE) [72] para la detección sensible y específica de ácidos nucleicos de muestras no extraídas. Desarrollaron el procedimiento SHERLOCK en una reacción de un solo paso con concentraciones óptimas de sales monovalentes, magnesio, pH y concentraciones de imprimación. Aunque la combinación de RT-RPA y SHERLOCK altera drásticamente la sensibilidad del ensayo de detección de ácido nucleico, la adición de RNasa H mejoró la sensibilidad de la prueba al aumentar la eficiencia de la RT. Además, desarrollaron una aplicación para teléfonos inteligentes que garantiza la detección e interpretación imparciales de las sondas iluminadas.

Del mismo modo, Joung et al. [73] describió un protocolo simplificado para la detección de SARS-CoV-2 en un recipiente que combina la prueba SHERLOCK con un paso de extracción de ARN simplificado (lisis y concentración de perlas magnéticas de ARN sin pasos de elución y lavado con etanol) y amplificación isotérmica LAMP. El ensayo en una olla fue posible usando un termoestable Alicyclobacillus acidiphilus (AapCas12b) que, según se informa, puede funcionar a temperaturas de hasta 65 & # x02103. Sin embargo, AapCas12b no funcionó bien en ensayos de un recipiente a 55 & # x000a0 & # x02103 y más. Joung con sus coautores analizaron 94 aditivos e identificaron que la adición de taurina mejora la cinética de reacción. Este protocolo se llama prueba SHERLOCK en un recipiente (STOP) y está optimizado para la detección de SARS-CoV-2 (STOPCovid). La prueba se puede realizar a una sola temperatura (60 & # x000a0 & # x02103) en una hora. La sensibilidad de STOPCovid supera a la prueba CDC RT-qPCR con el límite de detección (LOD) & # x0224833 copias de ARN por ml. Aparentemente, la aplicación de nuevas proteínas Cas termoestables con un rendimiento mejorado y la optimización de las mezclas de reacción puede mejorar sustancialmente la sensibilidad y la velocidad de los diagnósticos CRISPR de un solo recipiente. En un estudio diferente, se desarrolló un ensayo en un recipiente llamado ensayo All-In-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) [74] para la detección rápida y específica de ácidos nucleicos con un riesgo mínimo de contaminación cruzada de amplicones. AIOD-CRISPR tiene un sistema de reacción de un solo recipiente que consta de un paso de preamplificación de RPA y una mezcla de detección de LbaCas12a. Todas las reacciones se llevan a cabo a 37 & # x02103, el proceso tarda 40 & # x000a0min. Los LOD de AIOD-CRISPR son 1,2 copias de dianas de ADN y 4,6 copias de dianas de ARN.

Myhrvold y sus colegas emparejaron el protocolo SHERLOCK con un método de calentamiento de muestras de diagnóstico no extraídas para eliminar la nucleasa (HUDSON), cuyo objetivo es detectar los ácidos nucleicos y evitar el paso lento del aislamiento del ácido nucleico [75]. El protocolo HUDSON se agregó para crear diagnósticos desplegables en el campo, necesarios en áreas remotas sin infraestructura desarrollada y diagnósticos de laboratorio. Los recientes brotes de infecciones virales en África, América del Sur y China destacan la urgente necesidad de desarrollar pruebas de diagnóstico que requieran pasos, reactivos y equipos mínimos. Al calentar, inactivar químicamente las ribonucleasas y lisar las partículas virales, HUDSON permite el análisis directo de patógenos virales en muestras de sangre completa, plasma, suero, orina o saliva. HUDSON se puede utilizar para prácticamente cualquier plataforma de diagnóstico basada en CRISPR, lo que permite el análisis directo de patógenos virales de los fluidos corporales.

De manera similar, la tubería HUDSON-SHERLOCK puede detectar varios objetivos en una muestra clínica [75]. Usando muestras biológicas predefinidas, los autores demostraron que la prueba detectó el virus del dengue con alta sensibilidad (el límite de detección fue de 45 copias de los genomas virales en 1 & # x000a0mL de sangre total y 1 copia del genoma viral en 1 & # x000a0mL de saliva ) con el tiempo de respuesta total informado de menos de 1 & # x000a0h [75]. Debido a que la diversidad viral puede afectar la sensibilidad y la especificidad de la prueba, los autores luego diseñaron ARNr de SHERLOCK para discriminar entre el virus del Zika y el virus del dengue. HUDSON-SHERLOCK logró diferenciar 4 serotipos de los virus del dengue y del Zika en muestras biológicas de diferentes regiones del mundo, en su mayoría con un 100% de especificidad, un 100% de sensibilidad y un 100% de concordancia entre las muestras [75].

Dai y sus colegas crearon el sistema E-CRISPR que está equipado con un módulo de detección de señal electroquímica que utiliza Cas12a trans-actividad de escisión y reportero de ssDNA modificado con una etiqueta electroquímica de azul de metileno adherida a la superficie del sensor [80]. En presencia de la secuencia diana, las proteínas Cas12a escinden el informador ssDNA-MB disminuyendo el nivel de señal electroquímica que se transduce. Los autores lograron una sensibilidad picomolar para detectar los ácidos nucleicos del VPH16 y del parvovirus B-19. Además, los autores diseñaron una cascada E-CRISPR basada en aptámeros para la detección de proteínas. La plataforma utiliza aptámeros para la proteína de interés y Cas12a-crRNA diseñado para dirigirse específicamente al aptámero. Se aplica E-CRISPR para evaluar la concentración restante de aptámero en la muestra. Los autores confirmaron la eficacia de la plataforma mediante la detección de proteínas TGF - & # x003b21 en muestras clínicas. Por lo tanto, la tecnología E-CRISPR se puede utilizar potencialmente para una amplia variedad de ácidos nucleicos y proteínas.

Además de E-CRISPR, se diseñaron una serie de nuevas estrategias de prueba sin amplificación. La escisión interfacial mediada por CRISPR-Cas12a del indicador de ADN en horquilla para la prueba de detección electroquímica de ácido nucleico [83] utiliza indicadores electroquímicos de ADN en horquilla interfase inmovilizado (ADNhp) que son escindidos por Cas12a tras el reconocimiento del ADN diana. La escisión del HpDNA cambia las propiedades electroquímicas del biosensor dando como resultado una señal fuerte y específica. En comparación con E-CRISPR, que utiliza un informador de ssDNA lineal convencional como interfaz de detección, el hpDNA tiene una mayor accesibilidad a las nucleasas Cas12a, lo que mejora drásticamente el cambio de respuesta electroquímica y la sensibilidad analítica del método. Se pueden detectar tan solo 30 & # x000a0pM de ADN diana sin amplificar en & # x0224860 & # x000a0min.

Choi et al. [89] para desarrollar una prueba sin amplificación basada en CRISPR-Cas12a. En el nanosensor de AuNP desarrollado, el paso de amplificación se reemplazó con una mejora de la señal mediante la fluorescencia mejorada con metal de nanopartículas de oro funcionalizadas con ADN. La señal se puede medir mediante análisis de fluorescencia o colorimetría con el LOD en el rango de 1 fM a 100 & # x000a0pM.

Fozouni con sus coautores ha informado recientemente de un nuevo ensayo basado en CRISPR-Cas13 que no tiene un paso de preamplificación [92]. Los autores lograron aumentar la activación de Cas13a y la intensidad de la fluorescencia combinando múltiples crRNA para el objetivo y midiendo la fluorescencia a lo largo del tiempo en lugar de la fluorescencia del punto final. La combinación de 2 & # x020133 crRNAs permite la detección de tan solo 30 copias / & # x003bcL del ARN objetivo del SARS-CoV-2. La aplicación de varios crRNA también asegura la especificidad del método y aumenta las posibilidades de detectar moléculas de RNA mutadas. Este ensayo utiliza una cámara de teléfono móvil con una iluminación láser de bajo costo y una colección de ópticas para detectar la señal fluorescente y, lo que es más importante, traduce directamente la señal fluorescente en cargas virales. Entre el trabajo requerido para introducir esta prueba en la práctica, es necesario introducir un protocolo libre de extracción, minimizar el número de pasos, mejorar la sensibilidad con componentes CRISPR-Cas optimizados y mezclas de reacción y, posiblemente, desarrollar un sensor embebido que de forma inalámbrica envía los resultados a un teléfono móvil.

Tian et al. [93] que desarrolló un ensayo Cas13a ultralocalizado, una reacción isotérmica de un solo paso (Fig. 4). En este ensayo, la muestra aislada junto con la mezcla de detección de Cas13a quedan atrapadas en reactores de tamaño similar a una célula. El confinamiento de la mezcla de reacción mejora las concentraciones locales del objetivo y los complejos de ribonucleoproteína CRISPR-Cas y proporciona & # x000a0 & # x0003e & # x000a010.000 veces más en la sensibilidad de la prueba.La reacción acumula una fuerte señal fluorescente en una gota de tamaño pico de una sola molécula de ARN. Las microgotitas fluorescentes se detectan y cuentan mediante microscopía fluorescente.

Pipeline y principio del ensayo Cas13a ultralocalizado. (A) Esquemas del ensayo Cas13a ultralocalizado. Se mezclan gotitas del tamaño de un pico con el ARN diana y la reacción de detección CRISPR-Cas13a. La señal positiva da como resultado la iluminación de las gotas que se pueden contar con un microscopio fluorescente. (B) El principio del efecto de confinamiento sobre la concentración local de moléculas diana. Al disminuir el volumen analítico, la concentración local de moléculas diana aumenta inversamente. La imagen fue creada en BioRender.

Finalmente, un procedimiento de diagnóstico CRISPR desarrollado recientemente CRISPR-ENHANCE [90] (Análisis mejorado de ácidos nucleicos con extensiones CrRNA) empleó crRNA modificados genéticamente con extensiones específicas 7-mer 3 & # x02032 que logran una sensibilidad significativamente mayor de los ensayos CRISPR-Cas12a. Nguyen et al., Demostraron que CRISPR-ENHANCE puede obviar la necesidad de un paso de preamplificación mediante una simple modificación de los crRNA. CRISPR-ENHANCE se puede utilizar en dos formatos diferentes: (1) ensayo de flujo lateral y (2) ensayo fluorescente.

Hasta ahora se ha ideado una gran cantidad de nuevas herramientas y enfoques de diagnóstico basados ​​en CRISPR, pero la mayoría de las primeras invenciones se basaron en sistemas CRISPR-Cas9 tipo II, que por sí mismos no inducen una señal fuerte y específica relacionada con la presencia de ácidos nucleicos diana. en la muestra. En cambio, estas tecnologías utilizaron la preamplificación de ácidos nucleicos mediante PCR, un enfoque que compromete las amplias perspectivas de los diagnósticos CRISPR.

Los métodos más complicados, como CRISDA [59], funcionan en condiciones completamente isotérmicas, pero son costosos (requieren muchas enzimas) y consumen mucho tiempo (el tiempo de respuesta total para CRISDA es superior a 3 & # x020134 & # x000a0h). Aunque varios métodos, como FLASH [60], se pueden aplicar en ciertas áreas específicas del diagnóstico molecular, la mayoría de las primeras tecnologías enumeradas en la Tabla 2 no demuestran ninguna ventaja obvia sobre la PCR.

Tabla 2

Tipos de herramientas de diagnóstico basadas en CRISPR-Cas, sus aplicaciones y características.

Por el contrario, DETECTR (Fig.2), SHERLOCK / SHERLOCKv2 (Fig.3) y CRISPR-Chip pueden considerarse avances en el diagnóstico molecular, representando pruebas de diagnóstico casi ideales que pueden usarse en condiciones completamente isotérmicas, con un mínimo de equipo y manos. -en la formación del personal. El flujo de trabajo de DETECTR y SHERLOCK / v2 se describe en la Fig.1. Especialmente importante es que SHERLOCKv2 ya se ha adoptado para la detección colorimétrica y visual de patógenos en tiras de flujo lateral, de modo que estas pruebas se pueden utilizar para la detección masiva y el diagnóstico rápido en prácticamente cualquier región geográfica [70]. La alta sensibilidad y especificidad de los sistemas CRISPR-Cas amplían su aplicación potencial más allá de la detección cualitativa y cuantitativa de diferentes patógenos para genotipar y detectar SNP únicos en genomas humanos.

En 2020, Ackerman et al., Desarrollaron las reacciones combinatorias en matriz para la evaluación multiplexada de ácidos nucleicos (CARMEN) combinadas con el método de detección Cas13 (CARMEN-Cas13) (Fig. 5) [95]. CARMEN se basa en una tecnología de microfluidos que utiliza una colección de emulsiones de gotitas con entradas amplificadas por PCR o amplificadas por RPA y mezclas de detección CRISPR-Cas (proteína Cas13, crRNA específicos e informadores). Luego, cada muestra experimental o mezcla de detección se combina con un código de color fluorescente basado en solución que sirve como identificador óptico.

Esquemas del método de detección CARMEN-Cas13. (1) amplificación de ácidos nucleicos diana y su emulsificación con códigos de color. (2) Generación de emulsiones con sistemas de detección CRISPR-Cas. (3) Combinación de dos mezclas. (4) Carga de emulsiones mixtas en el chip. (5) Representación esquemática de una gota con moléculas diana (gota de muestra) y una gota con mezcla de detección CRISPR / Cas (gota de detección CRISPR). Después de fusionarse, el sistema CRISPR-Cas interactúa con las moléculas objetivo, produciendo una señal fluorescente específica. La imagen fue creada en BioRender.

Las soluciones codificadas por colores se emulsionan luego en aceite fluorado, luego se combinan y se muestrean en micropocillos. Al aplicar el campo eléctrico, las gotitas en los pozos se fusionan para iniciar reacciones de detección simultáneamente en todos los pozos. Además, los autores generaron un conjunto de 1.050 códigos de color basados ​​en soluciones y, posteriormente, diseñaron el chip de capacidad masiva que permite ejecutar más de 4.500 pruebas por chip y reduce sustancialmente el tiempo de respuesta y aumenta la capacidad de rendimiento. La sensibilidad y la especificidad de CARMEN-Cas13 coincidieron con las de SHERLOCK. Según se informa, CARMEN-Cas13 permite la detección simultánea de 169 virus que infectan a los humanos, lo que representa una plataforma altamente multiplexada para la detección rápida y sensible de patógenos humanos. Ackerman et al., También demostraron que CARMEN-Cas13 permitió la identificación de mutaciones virales clínicamente relevantes en un formato multiplex, proporcionando subtipificación completa de cepas del virus de la influenza A humana y detección de docenas de mutaciones de resistencia a los medicamentos del VIH. CARMEN-Cas13 también tuvo éxito en la detección de secuencias de Zika.

Se desarrollaron muchas pruebas CRISPR con diferentes lecturas para proporcionar una detección rápida y precisa de ácidos nucleicos patógenos. Tecnologías de este tipo: sistema basado en CRISPR-Cas que permiten la lectura a simple vista (CRISPR-Cas12a-NER [81], opvCRISPR [86], CASdetec [82]), utilizando biosensores electroquímicos (E-CRISPR [80], chip COMET CRISPR -Ensayo Cas13a [94], PGMs-CRISPR [85]), colorimetría (NASBACC [17], CRISPR-Cas acoplado con nanopartículas funcionalizadas con ADN [89]), potenciometría (CRISPR-Chip [57]), microscopía fluorescente (ultralocalizada Ensayo Cas13a [93]), detección óptica de anisotropía (CODA [87]), lectores fluorescentes como fluorímetros (CARMEN [95], CRISPR-ENHANCE [90], CRISPR-FDS [84], CALIBURN [88], STOPCovid [ 73], CDetection [79], CAS-EXPAR [61]), teléfonos inteligentes (microscopía de teléfonos móviles [92], SHINE [72]) o ensayos de flujo lateral.

En cuanto a la pandemia de COVID-19 en curso, la FDA aprobó las primeras herramientas de diagnóstico basadas en CRISPR. SHERLOCKv2 desarrollado por Zhang et al. [70], [96], se convirtió en la primera prueba CRISPR admitida para uso clínico. Incluye tres pasos, a saber (1) amplificación isotérmica de 25 minutos de ácidos nucleicos extraídos por RPA, (2) detección de 30 minutos por Cas13 y (3) incubación de 2 minutos requerida para visualizar los resultados en varillas de papel. Más recientemente, Broughton et al., Informaron sobre la detección basada en DETECTR del ARN del SARS-CoV-2 a partir de extractos de hisopos en 30 & # x0201340 & # x000a0min y los resultados se visualizaron en tiras de flujo lateral utilizando moléculas indicadoras de FAM-biotina [97]. Antes de la reacción, las moléculas de ARN diana se amplifican previamente mediante amplificación RT-LAMP isotérmica. La comparación del ensayo de qRT-PCR de CDC y el ensayo de flujo lateral DETECTR demostró que el método basado en PCR tiene un rendimiento analítico de 1 copia por & # x000b5l, mientras que para DETECTR tiene un valor de 10 copias por & # x000b5l. Las muestras falsas negativas fueron posibles en títulos virales por debajo del límite de detección para DETECTR. La concordancia entre DETECTR y la detección por PCR del SARS-CoV-2 fue del 95 & # x02013100%. De manera similar, Lucia et al., Presentaron los resultados de la detección rápida, ultrasensible y portátil del SARS-CoV-2 utilizando un método basado en LbCa12a combinado con una preamplificación isotérmica RPA [98]. Los parámetros del sistema de detección reportados por Lucia et al. [98], son comparables con el método CRISPR basado en DETECTR [97]. Se demostró que CARMEN-Cas13 se redirige rápidamente para fines clínicamente relevantes [95]. Como tal, una nueva prueba para detectar SARS-CoV-2 se incorporó rápidamente a la plataforma CARMEN-Cas13, lo que permitió el análisis de & # x000a0 & # x0003e & # x000a0400 muestras por chip. En general, los sistemas de detección CRISPR-Cas pueden beneficiarse mucho cuando se combinan con la tecnología CARMEN altamente multiplexada y de alto rendimiento.

Aunque los trabajos descritos brindan perspectivas interesantes que pueden convertirse en un área enorme de investigación y diagnóstico molecular, muchos desafíos se interponen en el camino. Los resultados muy alentadores que demuestren la especificidad y sensibilidad de ensayos similares a la PCR deben probarse en situaciones del mundo real. Se pueden introducir muchas modificaciones en los ensayos existentes para aumentar la sensibilidad de las pruebas y el tiempo necesario para realizar las pruebas de diagnóstico. Además, la especificidad de los diagnósticos CRISPR también puede ser una preocupación, ya que las proteínas Cas pueden tolerar desajustes de nucleótidos y reconocer moldes no específicos, comprometiendo la validez del ensayo. Tampoco está del todo claro cuán discrepantes podrían ser los resultados de tales pruebas cuando se manejan por personal diferente o con diferentes calidades de muestras biológicas.


SISTEMAS QUE INDUCEN PERSISTENCIA Y MUERTE CELULAR PROGRAMADA

Toxinas-antitoxinas

Tanto los sistemas TA de tipo I como los de tipo II se caracterizaron originalmente como "módulos adictivos" que están codificados en plásmidos y garantizan su persistencia en un linaje huésped después de una división celular (103, 104). El componente de toxina de todos los sistemas TA es una proteína que mata las células si se expresa por encima de cierto nivel, mientras que el componente de antitoxina inactiva reversiblemente la toxina y / o regula su expresión, evitando así la muerte celular. A diferencia de la toxina, la antitoxina es metabólicamente inestable, de modo que, a menos que la antitoxina se exprese continuamente, la toxina libre puede acumularse en cantidades suficientes para matar una célula (25, 105-108). Una vez que se han secuenciado los primeros genomas, quedó claro que numerosos sistemas de TA están presentes no solo en los plásmidos sino también en los cromosomas de bacterias y arqueas (25, 107).

Este sorprendente descubrimiento estimuló un debate sobre las funciones de los sistemas de TA cromosómicos y provocó una serie de estudios genómicos y experimentales comparativos que dieron como resultado el descubrimiento de docenas de nuevos sistemas de TA. Estos hallazgos y las ideas actuales sobre las funciones biológicas de los sistemas de AT se resumen en varias revisiones recientes (19, 26, 109-111). En resumen, parece que los sistemas de TA proporcionan un mecanismo de persistencia celular para hacer frente a diversas condiciones de estrés (23, 24, 111). La mayoría de las toxinas de tipo II se dirigen a diferentes componentes de los sistemas de traducción, especialmente el ARNm (112, 113), mientras que las toxinas de tipo I afectan la integridad de la membrana (114). Sin embargo, también se han identificado otros objetivos de las toxinas, como la ADN girasa (115) y la división celular GTPasa FtsZ (116). Debido a que las toxinas de tipo I nunca han estado implicadas en la resistencia a los virus y no se observan con frecuencia en islas de defensa, no las consideramos aquí. En su lugar, nos centramos en los sistemas de TA de Tipo II, en particular variantes mal caracterizadas (Tabla complementaria S3), y discutimos los resultados de los esfuerzos recientes para identificar nuevas familias de TA utilizando en silico enfoques.

Los enfoques computacionales para la predicción de nuevos sistemas de TA pueden clasificarse en tres grupos: (i) 'culpa por asociación' cuando se predice una nueva toxina o antitoxina en virtud del enlace, en genomas bacterianos y arqueales, con genes que pertenecen a antitoxinas conocidas o familias de toxinas (27, 117) (ii) identificación de pares de genes con rasgos característicos de los sistemas de TA, como un estrecho enlace de genes que codifican proteínas pequeñas, propensión a HGT y presencia en plásmidos o dentro de islas genómicas con otros genes de defensa (5, 27 ) y (iii) análisis estadístico de clones de secuenciación del genoma completo con el objetivo de identificar genes que no son clonables (tóxicos) en E. coli ( 118 ).

Los nuevos sistemas de AT previstos generalmente se validan experimentalmente en E. coli mediante un ensayo de muerte / rescate en el que se espera que la sobreexpresión de una toxina inhiba el crecimiento celular o la mate, mientras que la coexpresión de la toxina y la antitoxina restaura el crecimiento (117). Sin embargo, el reciente estudio exhaustivo reveló numerosos genes que parecen no ser clonables en E. coli pero no cumplen con la definición de sistemas TA, incluidas muchas enzimas metabólicas y genes informativos como las proteínas ribosómicas (118, 119). Aunque no todos estos genes forman operones de dos genes que son típicos de los sistemas de TA, estos hallazgos indican que el desequilibrio de dosis o la toxicidad de un sustrato intermedio puede resultar en la toxicidad de un gen que puede mitigarse mediante una regulación adecuada o coexpresión mediante enzima utilizando un producto tóxico, imitando el comportamiento de TA. Por lo tanto, la predicción de nuevos sistemas de TA a partir de resultados experimentales obtenidos con este enfoque requiere precaución y debe implicar la evaluación de las funciones conocidas y predichas y la organización operónica de los genes candidatos. Varios sistemas de TA validados experimentalmente (por ejemplo, GinA y GinC) no forman dos operones de genes conservados evolutivamente, lo que sugiere modos de acción distintos del mecanismo típico de toxina-antitoxina (120). Por ejemplo, GinA, un homólogo cercano de la proteína Gam del inhibidor de la nucleasa del huésped del fago Mu, que inhibe la unión de RecBCD a los extremos del dsDNA (121), y su 'antitoxina' Sak, una proteína de hibridación de una sola hebra (122), a menudo están unidas a otras enzimas involucradas en la recombinación y reparación (120). En consecuencia, parece más probable que GinA y GinC también estén involucrados en funciones relacionadas con la reparación. Estas complicaciones asociadas con la interpretación de las predicciones de culpabilidad por asociación y los experimentos de validación estándar indican que se requieren enfoques experimentales adicionales para determinar si algunos sistemas identificados recientemente son sistemas de asistencia técnica auténticos.

En la Tabla complementaria S3 se dan ejemplos adicionales de sistemas de TA pobremente caracterizados (predichos). Uno de los sistemas TA predichos más abundantes, que es particularmente común en las arqueas hipertermofílicas, consiste en una proteína que contiene el dominio HEPN, la nucleotidiltransferasa mínima (MNT). Entre los dos componentes de este sistema TA, la proteína del dominio HEPN es probablemente la toxina (118) que se predice que funcionará como una ARNasa que probablemente se dirija a un ARN durante la traducción (54, 55), mientras que el MNT es la antitoxina. Aunque el módulo HEPN-MNT comparte todas las características típicas de los sistemas TA (27), el mecanismo molecular de este sistema, y ​​en particular el papel de la actividad nucleotidiltransferasa de la antitoxina, sigue sin estar claro. Las proteínas HEPN en estos sistemas pertenecen a dos grupos, uno de los cuales está sobrerrepresentado en los termófilos y el otro en los mesófilos (27). Los dominios HEPN y MNT a menudo se fusionan entre sí, lo que no es típico de otros pares de TA. Además, paRep1 / paRep8 ( Pyrobaculum aerophilum familia repetitiva) de dominios HEPN, que está representada casi exclusivamente en termófilos y se expande específicamente en crenarchaea, no está asociada con MNT, por lo tanto, queda por determinar si estas proteínas son toxinas de una familia distinta de sistemas TA utilizando un sistema aún no identificado. antitoxina.

Otro sistema de dos componentes en el que una de las proteínas es una nucleotidiltransferasa predicha es DUF1814-COG5340. Se detectaron más de 700 apariciones de este sistema en 430 genomas secuenciados de la mayoría de los principales linajes de arqueas y bacterias, incluidas varias especies de Mycoplasma con pequeños genomas. Se ha demostrado la homología de la familia DUF1814 con las familias ABI AbiG (123) y AbiE (124) (5). En este caso, sin embargo, la nucleotidiltransferasa (DUF1814) parece funcionar como la toxina, mientras que la proteína COG5340 que contiene un dominio HTH predicho es la antitoxina [(5), ver también la Tabla complementaria S4]. Ambos sistemas ABI parecen actuar en la etapa de replicación del ADN del fago, pero sus mecanismos moleculares siguen siendo desconocidos (22).

Otra nueva toxina putativa es COG2856, una proteasa de la superfamilia de metzincina asociada con una antitoxina potencial, una proteína de dominio HTH de la familia Xre, a menudo fusionada con la proteasa (125). Estos supuestos operones abundan en genomas, fagos y plásmidos de bacterias y arqueas, con expansiones específicas de linaje en varias bacterias. Curiosamente, en la bacteria Deinococcus radiodurans , un gen COG2856 ( IrrE ) es un determinante importante de la resistencia a la radiación (126).

El análisis genómico comparativo completo de la distribución y co-ocurrencia de familias conocidas y previstas de toxinas y antitoxinas conduce a las siguientes conclusiones principales:

La abundancia de sistemas TA en los genomas escala superlinealmente con el tamaño del genoma (5, 27).

Hasta ahora, no se han detectado sistemas de TA en la mayoría de los endosimbiontes y, entre las arqueas, en Termoplasmatales , varios metanótrofos con pequeños genomas, y la única arqueona simbiótica conocida, Nanoarchaeum equitans ( 27 , 117 , 127 , 128 ).

La distribución de los sistemas de AT a través de phyla es claramente no uniforme, con muchos sistemas significativamente sobre o subrepresentados en varios taxones (27, 117).

La ocurrencia genómica de los sistemas TA muestra una variabilidad excepcional incluso en genomas estrechamente relacionados (27, 117).

Los sistemas de TA son propensos a la HGT y pueden considerarse parte del mobiloma procariótico (27).

La red de asociaciones entre diferentes familias de toxinas y antitoxinas contiene un componente gigante conectado y solo unos pocos sistemas aislados (Figura 5). La existencia de una red tan fuertemente conectada se debe a la modularidad de los sistemas de TA, por lo que las toxinas y antitoxinas normalmente pueden tener más de un socio. Los ejes principales de la red de sistemas de asistencia técnica son las toxinas PIN y RelE y las antitoxinas RHH y Xre (Figura 5) (27).

La alta prevalencia de genes de toxina y antitoxina independientes (& gt 50% de los genes en las familias más grandes no pertenecen a pares TA) sugiere un potencial en trans interacción entre toxinas y antitoxinas que quedan por descubrir experimentalmente (27, 117, 128).

Un gráfico de red de las relaciones entre diferentes familias de toxinas y antitoxinas. Toxinas conocidas y predichas (magenta) (círculos rojos) y antitoxinas (círculos azules) y sus organizaciones de operones. Los bordes conectan genes con cinco o más operones de dos componentes identificados, el grosor de un borde es proporcional a la abundancia del operón respectivo.

Un gráfico de red de las relaciones entre diferentes familias de toxinas y antitoxinas. Toxinas conocidas y predichas (magenta) (círculos rojos) y antitoxinas (círculos azules) y sus organizaciones de operones.Los bordes conectan genes con cinco o más operones de dos componentes identificados, el grosor de un borde es proporcional a la abundancia del operón respectivo.

En conjunto, todos estos hallazgos indican que los sistemas de asistencia técnica comprenden una red extremadamente compleja, versátil y ciertamente no completamente investigada de elementos móviles "semi-egoístas" que impregna el mundo procariota. El papel principal de los sistemas TA en bacterias y arqueas parece ser la inducción de la latencia o la muerte celular programada en respuesta al estrés, en particular a la infección por virus. Sin embargo, actualmente es imposible descartar que los sistemas TA realicen funciones celulares adicionales.

Sistemas ABI (exclusión de fagos)

Los sistemas ABI (exclusión de fagos) representan otro grupo extendido de mecanismos de defensa que anulan la infección por virus en diferentes etapas, a menudo provocando la muerte de la célula infectada (21, 22). Además, algunos de los sistemas ABI son módulos de dos componentes con todas las propiedades de los sistemas TA (por ejemplo, los sistemas TA Tipo III antes mencionados). Numerosos sistemas ABI fueron identificados principalmente por métodos genéticos en bacterias del ácido láctico y E. coli , pero solo para algunos de ellos se conoce el mecanismo molecular (21). La Tabla complementaria S4 resume brevemente la información disponible sobre estos sistemas junto con los resultados del análisis computacional que podrían ayudar a realizar más estudios experimentales. Estos hallazgos indican un amplio uso compartido de dominios entre los sistemas ABI y TA y respaldan la observación de que la mayoría de los sistemas de ambas clases actúan induciendo la muerte celular o la inactividad. Por ejemplo, se predice que el sistema AbiG de dos componentes mencionado anteriormente funcionará como un sistema TA (5). Muchas proteínas ABI o superfamilia de dominios que incluyen AbiD, AbiF, AbiJ, AbiU2, AbiV y el dominio C-terminal de AbiA pertenecen a la endoribonucleasa HEPN y se prevé que se dirijan al sistema de traducción (54). También se predice que un dominio HEPN es responsable de la actividad anticodón tRNasa de PrrC y RloC [(54), Figura 6]. AbiI, una nucleasa de superfamilia de ribonucleasa H predicha, tiene un potencial similar. Varios sistemas ABI de membrana a menudo causan la fuga de la membrana de manera similar a los sistemas TA de Tipo I (129, 130). Varios sistemas ABI, incluidos AbiU1, AbiL y AbiR, a menudo están asociados y pueden interactuar con los sistemas R-M (5, 131). Finalmente, existe un fuerte vínculo con los elementos móviles a través del dominio de transcriptasa inversa de las proteínas AbiA y AbiK (132), aunque, a diferencia de la transcriptasa inversa típica, AbiK cataliza la síntesis sin plantilla de ADN de secuencia aleatoria que permanece unido covalentemente a la proteína y contribuye a ABI (133).

Ejemplos de loci genómicos que codifican diferentes sistemas de inmunidad y que contienen dominios HEPN y PD- (D / E) xK. Los genes se representan como flechas de bloques de colores. El dominio HEPN se muestra mediante una forma de color verde claro con un contorno rojo. El dominio PD- (D / E) xK (similar a RecB) se muestra mediante una forma amarilla con un contorno rojo. HEPN, dominio de unión a nucleótidos de eucariotas superiores y procariotas, endoribonucleasa predicha (54) Sir2, ParB y PD- (D / E) xK, DEDD son nucleasas de distintas superfamilias. Los nombres de genes CRISPR-Cas siguen la nomenclatura y clasificación de (18) Los nombres R-M siguen la nomenclatura y clasificación de (38). ( A ) Asociaciones de dominios HEPN. ( B ) Asociaciones de dominio PD- (D / E) xK.

Ejemplos de loci genómicos que codifican diferentes sistemas de inmunidad y que contienen dominios HEPN y PD- (D / E) xK. Los genes se representan como flechas de bloques de colores. El dominio HEPN se muestra mediante una forma de color verde claro con un contorno rojo. El dominio PD- (D / E) xK (similar a RecB) se muestra mediante una forma amarilla con un contorno rojo. HEPN, dominio de unión a nucleótidos de eucariotas superiores y procariotas, endoribonucleasa predicha (54) Sir2, ParB y PD- (D / E) xK, DEDD son nucleasas de distintas superfamilias. Los nombres de genes CRISPR-Cas siguen la nomenclatura y clasificación de (18) Los nombres R-M siguen la nomenclatura y clasificación de (38). ( A ) Asociaciones de dominios HEPN. ( B ) Asociaciones de dominio PD- (D / E) xK.

Los ∼30 sistemas ABI actualmente conocidos provienen de solo dos organismos modelo, lo que sugiere que representan solo una fracción menor de la diversidad total de este tipo de módulos de defensa en bacterias y arqueas. De hecho, el análisis de islas de defensa seleccionadas revela numerosas familias de genes no caracterizados que podrían ser candidatos para sistemas de defensa similares a ABI (5).


Abstracto

La investigación sobre las floraciones de algas y cianobacterias nocivas (HAB y CHAB) ha aumentado drásticamente debido a su creciente distribución, frecuencia e intensidad global. Estas floraciones ponen en peligro la salud pública, la función del ecosistema, la sostenibilidad y pueden tener impactos económicos negativos. Se han establecido numerosos programas de monitoreo utilizando microscopía óptica, cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS), ELISA y espectrofotometría para monitorear brotes de HAB / CHAB. Recientemente, se han integrado métodos moleculares basados ​​en ADN / ARN en estos programas para reemplazar o complementar los métodos tradicionales mediante el análisis de ADN y ARN ambientales (eDNA / eRNA) con técnicas como la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR), la hibridación fluorescente in situ (FISH ), ensayo de hibridación en sándwich (SHA), métodos de amplificación isotérmica y micromatrices. Estos han permitido la detección de especies raras o crípticas, mejorado el rendimiento de las muestras y reducido los costos y la necesidad de experiencia taxonómica visual. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones, como la necesidad de una gran inversión de capital en equipos o incertidumbres de detección, incluida la determinación de si los organismos son viables. En esta revisión, discutimos el potencial de la tecnología de diagnóstico molecular recientemente desarrollada basada en proteínas Cas / repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR / Cas), que utiliza los sistemas inmunes adaptativos procariotas de bacterias y arqueas. Las plataformas basadas en Cas12 y Cas13 pueden detectar tanto ADN como ARN con sensibilidad attomolar en una hora. El diagnóstico CRISPR / Cas es una tecnología rápida, económica, específica y ultrasensible que, con un poco de desarrollo adicional, proporcionará muchas plataformas nuevas que se pueden utilizar para la investigación y el biomonitoreo de HAB / CHAB.


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MATERIALES Y MÉTODOS

P. furiosus cepas y condiciones de crecimiento

Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria S1. Pyrococcus furiosus las cepas se cultivaron anaeróbicamente a 95 ° C en un medio definido con celobiosa como fuente de carbono (69). Los cultivos se hicieron crecer durante la noche en frascos de cultivo anaeróbicos o durante 65 h en un medio solidificado con Gelrite al 1% peso / volumen (Research Product International). Para el crecimiento de cepas auxotróficas de uracilo, el medio definido contenía uracilo 20 μM. Para el crecimiento de cepas transformadas con plásmidos con TrpAB, el medio definido carecía de triptófano. La transformación del plásmido se realizó como se describió previamente (69). Todos los ensayos se realizaron con tres repeticiones.

Construcción de plásmido

Los plásmidos se construyeron mediante técnicas de clonación estándar. Las secuencias de oligonucleótidos de ADN utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla complementaria S2 y los plásmidos se muestran en la Tabla complementaria S3. Para generar plásmidos diana, los oligonucleótidos se hibridaron y luego se digirieron con BamHI y NdeI.Para construir plásmidos con casetes de integración del genoma (pMS030 y pMS088), se amplificaron regiones homólogas a partir de P. furiosus Genoma JFW02 y gdh-promotor-pyrF se amplificó a partir del plásmido pJFW18. Los productos amplificados se ensamblaron mediante reacción en cadena de la polimerasa solapada (PCR) y se ligaron en el plásmido pHSG298 usando el kit de clonación sin costura GENEART (Thermo Fisher). Para construir casetes de sobreexpresión, Cas1, Cas2, Cas4-1, Cas4-2 y las regiones codificantes de Cas3 y las regiones promotoras se amplificaron a partir del P. furiosus genoma de tipo salvaje (WT) y el Thermococcus kodakarensis (Tko) Genoma de WT. Los productos amplificados se ensamblaron mediante PCR superpuesta y se ligaron con el plásmido pJE47 (Cas1, Cas2, Cas4-1, Cas4-2 casete de sobreexpresión: Tko csg promotor-Cas2 (PF1117), Tko gdh promotor-Cas4-2 (PF1793), slp promotor-Cas4-1 (PF1119), PRP sintetasa promotor Cas1 (PF1118)) o pJE64 (casete de sobreexpresión Cas3: Tko csg promotor-Cas3 (PF1120)), respectivamente. Los casetes de sobreexpresión se digirieron mediante NotI y EcoRV y se ligaron con pMS030 o pMS088 para producir plásmidos de integración del genoma. Los sitios activos de HD nucleasa y helicasa de Cas3 (Figura complementaria S1) se mutagenizaron mediante QuikChange PCR usando el plásmido pMS098 como molde. Los plásmidos se secuenciaron para confirmar la secuencia del inserto.

Construcción de deformación

Para crear Cas1 / Cas2 / Cas4-1 cepas de sobreexpresión y el Cas4-1, los plásmidos pMS032 o pMS087 linealizados con NruI se transformaron en TPF17. Los plásmidos se enumeran en la Tabla complementaria S3. Se realizaron dos rondas de purificación de colonias colocando en placa 10-3 diluciones de cultivos transformantes en medio de placa selectiva (sin uracilo) y recogiendo las colonias aisladas en medio líquido selectivo. Después de la sustitución del marcador de la región de interés, se usó 5-FOA, un sustrato pyrF tóxico, para seleccionar las células que experimentaron un desprendimiento del marcador pyrF mediante recombinación homóloga. El Cas1 / Cas2 / Cas4-1 / Cas4-2 cepa de deleción (Δad) y ΔCas4-2 se crearon usando la estrategia de reemplazo del marcador emergente como se describió anteriormente (70). Los productos de PCR transformados se generaron mediante PCR solapada. La secuencia de oligonucleótidos de ADN utilizada se muestra en la Tabla complementaria S2.

Ensayos de interferencia de plásmidos

Cultivos definidos en medios líquidos de P. furiosus se dejaron crecer durante la noche a 90 ° C durante aproximadamente 16 h (fase de crecimiento logarítmica de media a tardía). En condiciones aeróbicas, 200 ng del plásmido de control sin diana o del plásmido diana (que contiene un protoespaciador que coincide con el crRNA 7.01) se transformaron en 100 μl de un cultivo nocturno y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min a 1 h. Estas transformaciones se dividieron y se sembraron en tres placas de medios sólidos definidos que carecían de uracilo (para seleccionar el plásmido transformado). Las placas se sellaron anaeróbicamente en cámaras y se incubaron a 90 ° C durante 3 días. Se observó y contó el crecimiento de las colonias.

Ensayo de adaptación y secuenciación de alto rendimiento de productos de PCR de matriz expandida

Las transformaciones, el crecimiento de colonias y la preparación de bibliotecas de amplicones de adaptación se realizaron como se describió anteriormente (63). Brevemente, el ADN genómico se aisló de P. furiosus Las células de 1 ml de cultivo durante la noche utilizando el kit de minipreparación rápida de gDNA (Zymo Research) y las matrices CRISPR se amplificaron mediante PCR utilizando un conjunto de cebadores en los que el cebador directo se hibridaba dentro de la región líder de la matriz CRISPR y el cebador inverso aparecía a el espaciador existente más cercano al líder. Los productos de PCR expandidos se separaron de los productos no expandidos mediante electroforesis en gel seguida de recuperación de ADN (Zymo Research). Los cebadores de PCR incluían un saliente correspondiente a parte del adaptador necesario para la secuenciación de Illumina. Se realizaron PCR adicionales para seleccionar más productos de matriz expandida y agregar códigos de barras de Illumina. Las bibliotecas de amplicones purificadas en gel finales se agruparon de acuerdo con la intensidad de la banda, se normalizaron de acuerdo con la concentración y el número de muestras representadas en el grupo y se secuenciaron en un Illumina MiSeq para producir 250 por 50 lecturas de extremos emparejados, las secuencias de lectura 1 de 250 bases se usaron en este estudio. Después de la secuenciación, las muestras se demultiplexaron por índice y se extrajo de cada lectura la secuencia correspondiente a un nuevo espaciador. Luego, las secuencias espaciadoras se alinearon y analizaron, como se describió anteriormente, para caracterizar la distribución del tamaño del espaciador, la fuente del protoespaciador, PAM y los patrones de distribución del protoespaciador a lo largo del genoma y cualquier plásmido utilizado en el ensayo (63).

Pistas de densidad espaciadora

Para hacer pistas de densidad de espaciador, se utilizaron alineaciones de espaciador totales para generar archivos de cobertura base (bedtools, (71)), y luego se mostraron en un centro de pistas personalizado en UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/ cgi-bin / hgHubConnect). Para la pista de densidad PAM, se generó un archivo de alineación en silico para incluir un único protoespaciador de 37 pb adyacente a cada NGG PAM en el genoma y el plásmido. Este archivo de alineación se convirtió en un archivo de cobertura base y se mostró en UCSC Genome Browser junto con las pistas de densidad del espaciador. Para las pistas de densidad del espaciador y PAM, se aplicó la opción de ventana "media" a los valores de cobertura del contenedor para su visualización.


10. Conclusión y sugerencias para la labor futura

En esta revisión, hemos descrito una amplia gama de trabajos experimentales y teóricos sobre el sistema CRISPR-Cas de procariotas. Los tres mecanismos de adaptación, expresión e interferencia pueden describirse como un proceso de Markov y hacen uso de una variedad de proteínas específicas de CRISPR para proteger la célula huésped. La inmunidad contra elementos genéticos móviles se logra con secuencias espaciadoras registradas en el locus CRISPR. Las estructuras de secuencia modular ayudan al complejo de proteínas crRNA: Cas en el reconocimiento eficiente y específico de la diana, y los cambios conformacionales de las proteínas regulan la escisión de la diana. HGT parece haber facilitado el intercambio inicial de los sistemas CRISPR-Cas entre diversas especies, pero existe una selección contra CRISPR en organismos que actualmente dependen de HGT para su patogenicidad. De manera más general, la eficacia de CRISPR-Cas es un factor determinante de la evolución o eliminación de los loci. La diversificación de la población de los loci CRISPR se produce rápidamente, ya que cada cepa se adapta para combatir a sus atacantes individuales. El modelado matemático ha ayudado a comprender la dinámica coevolutiva de las bacterias y los fagos CRISPR. La actividad de CRISPR está regulada para minimizar el costo asociado con la preparación para diversas amenazas y maximizar la eficiencia energética. Algunas especies utilizan sus sistemas CRISPR para la autorregulación y la virulencia de genes, y sin duda se descubrirán usos únicos adicionales. CRISPR-Cas proporciona una plataforma versátil para una variedad de edición de genes, regulación de genes e imágenes para aplicaciones biotecnológicas en bacterias, plantas y humanos.

10.1. Mecanismos de inmunidad adaptativa

  • ¿Cuál es la escala de tiempo precisa de la adquisición y utilización de la inmunidad CRISPR-Cas por parte de una bacteria, y cómo coincide esto con la escala de tiempo de la infección por fagos?
  • ¿Un modelo de Markov representa con justicia los procesos CRISPR? Algunos trabajos experimentales han sugerido más un entrelazamiento de mecanismos y la ocurrencia de procesos como la adaptación preparada, lo que implica una dependencia de la historia o un espacio de estados más grande.
  • Se ha demostrado que el locus CRISPR tiene una longitud máxima de espaciadores y se produce una eliminación del espaciador para permitir nuevas adquisiciones. El trabajo teórico podría explorar la plausibilidad de que una célula bacteriana tenga una longitud de locus máxima dinámica, adaptable a diferentes situaciones ambientales. ¿Cuál sería la relación entre el número máximo de espaciadores en el locus y la diversidad y la tasa de evolución de los fagos en el medio ambiente?

10.2. Evolución de los loci CRISPR-Cas

  • ¿Cuáles son los principios que han regido la evolución de los muy diversos tipos y subtipos de CRISPR en diferentes especies?
  • Para que un sistema inmunológico CRISPR-Cas sea eficaz, debe contener espaciadores que protejan a las bacterias contra los fagos que las atacan específicamente. ¿Cuál es el beneficio relativo de obtener un sistema CRISPR completo con o sin espaciadores útiles a través de HGT en comparación con tener ya un sistema CRISPR sin espaciadores útiles y necesitar adquirir nuevos útiles? Es posible que los eventos HGT tengan una probabilidad menor, pero son relevantes en escalas de tiempo más largas.
  • Los fagos pueden escapar del reconocimiento de CRISPR-Cas mutando su protoespaciador. Por encima de un cierto umbral de tasa de mutación de fagos, se postula que CRISPR ya no es útil en bacterias. Si las bacterias se encuentran en un entorno con múltiples tipos de fagos que tienen diferentes tasas de mutación, ¿bajo qué condiciones es más o menos probable que las bacterias tengan CRISPR?

10.3. Estabilidad y actividad fuera del objetivo

  • El método de administración y los antecedentes de la enfermedad son factores importantes a considerar cuando se intenta implementar terapias basadas en CRISPR en humanos. ¿Pueden los modelos de inmunogenicidad de la proteína Cas determinar la reacción inmunológica de un individuo y ayudar a diseñar de manera efectiva sistemas de edición CRISPR-Cas estables y entregables?
  • Se necesita un modelo más preciso de la distribución de los efectos fuera del objetivo para las aplicaciones de la biotecnología, especialmente en las células humanas. ¿Qué nivel de detalle en el modelado matemático o las simulaciones de cálculo es necesario para predecir la especificidad de Cas9: sgRNA?
  • Actualmente, Cas9 es la proteína CRISPR más popular utilizada en ingeniería genómica, debido a su doble capacidad de unión y escisión de ADN. Aunque la maquinaria de interferencia de otros sistemas CRISPR puede ser más difícil de aprovechar, es decir, coordinar la unión en cascada y la escisión de Cas3, ofrecen un control más específico, ya que la eliminación de una de las subunidades puede eliminar la unión fuera del objetivo. ¿Cómo afecta el uso de una cascada modificada a la cinética de unión entre el sgRNA modificado y la secuencia de ADN diana y la eficiencia de escisión de Cas3?