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4.1: Purificación de proteínas - Biología

4.1: Purificación de proteínas - Biología


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Ensayos, actividad específica, fraccionamiento inicial

Un procedimiento exitoso de purificación de proteínas puede ser asombroso. Si está comenzando con una proteína recombinante que se produce en E. coli, o tratando de aislar una proteína de algún tejido de mamífero, normalmente comienza con cantidades en gramos de una mezcla compleja de proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, etc., de la cual es posible que deba extraer cantidades de miligramos (¡o microgramos!) de la proteína deseada. con alta pureza y, con suerte, con alto rendimiento.

El primer paso en cualquier purificación es el desarrollo de un ensayo especifico para la proteína de interés. El ensayo específico puede basarse en algunos característica única de la proteína de interés

  • Actividad enzimatica
  • Actividad inmunologica
  • Características físicas (por ejemplo, masa molecular, propiedades espectroscópicas, etc.)
  • Actividad biológica
  • Idealmente, un ensayo debe ser
    • Específico (no quieres un falso positivo)
    • rápido (no quieres esperar una semana para ver los resultados)
    • sensible (no desea consumir toda su muestra para analizarla)
    • cuantitativo (necesita una forma precisa de medir la cantidad de su proteína en cada paso de la purificación)

Western Blot

Los anticuerpos pueden usarse en un método llamado Western blot, que es útil para determinar los niveles de expresión de proteínas y para analizar proteínas durante la purificación. Este método generalmente implica los siguientes pasos:

  1. Una muestra de proteína se somete a electroforesis en gel de poliacrilamida.
  2. Después de esto, el gel se coloca sobre una hoja de nitrocelulosa y la proteína en el gel se transfiere electroforéticamente a la nitrocelulosa.
  3. A continuación, la nitrocelulosa se empapa en gelatina para "bloquear" su capacidad de unirse a proteínas de forma no específica.
  4. Luego, la nitrocelulosa se incuba con el anticuerpo específico para la proteína de interés.
  5. A continuación, la nitrocelulosa se incuba con un segundo anticuerpo que es específico para el primer anticuerpo. Por ejemplo, si el primer anticuerpo se generó en conejos, el segundo anticuerpo podría denominarse "inmunoglobulina anticonejo de cabra". Lo que esto significa es que se utilizaron inmunoglobulinas de conejo para provocar una respuesta de anticuerpos en cabras. Los anticuerpos de cabra (policlonales) incluirán aquellos que reconocen la región conservada en los anticuerpos de conejo. Dado que la región Fc se conserva, se unirá a todos y cada uno de los anticuerpos de conejo, incluidos los del papel de nitrocelulosa.
  6. El segundo anticuerpo típicamente tendrá una enzima unida covalentemente que, cuando se le proporcione un sustrato cromogénico, provocará una reacción de color.
  7. Por tanto, el peso molecular y la cantidad de la proteína deseada se pueden caracterizar a partir de una mezcla compleja (por ejemplo, extracto celular crudo) de otras proteínas.

En una variación de lo anterior, la muestra de proteína se puede secar directamente en un papel de nitrocelulosa (llamado mancha de puntos) sin correr primero un gel. Esto puede ser deseable si, por ejemplo, el anticuerpo es monoclonal y reconoce un epítopo que depende de la estructura nativa (que se destruiría al ejecutar una SDS PAGE).

Además de sus variados usos, los anticuerpos también se pueden utilizar para purificar proteínas.

  • Si se pueden obtener cantidades relativamente grandes de un anticuerpo, se pueden unir covalentemente a una resina de cromatografía (por ejemplo, perlas de Sephadex).
  • Si un extracto celular crudo se pasa por una columna de este tipo, solo la proteína de interés debería unirse y todo lo demás fluirá a través de ella.
  • A continuación, se puede eluir la proteína unida. Esto se logra típicamente en condiciones de pH moderadamente bajo (usando ácido acético). Siempre que la proteína de interés no se desnaturalice irreversiblemente por tales condiciones, el método funcionará bastante bien.
  • Un error potencial implica el de los anticuerpos monoclonales que se utilizan para purificar proteínas mutantes. Las regiones de la proteína que comprenden el epítopo no se pueden modificar sin destruir la capacidad del anticuerpo para unirse. Por tanto, el uso de anticuerpos monoclonales en un esquema de purificación puede excluir su uso en la purificación de ciertos mutantes.

La purificación de proteínas se puede considerar como una serie de pasos de fraccionamiento diseñado para que:

  • La proteína de interés se encuentra casi exclusivamente en una fracción (y con buen rendimiento)
  • Se puede encontrar una cantidad significativa de contaminantes en una fracción diferente

Durante la purificación, deberá controlar varios parámetros, que incluyen:

  1. Volumen total de muestra
  2. Proteína total de la muestra (puede ser estimado por A280; 1,4 ~ 1,0 mg / ml)
  3. Unidades de actividad de la proteína deseada (basado en un ensayo específico)

Esta información básica le permitirá realizar un seguimiento de la siguiente información durante cada paso de la purificación:

  1. % producir para cada paso de purificación
  2. Actividad específica de la proteína deseada (unidades / mg de proteína total)
  3. Mejora de la purificación de cada paso (p. ej., "purificación 3,5x)

Al diseñar un esquema de purificación, normalmente debe equilibrar purificación con producir.

  • Por ejemplo, puede ser relativamente sencillo obtener un 90% de material puro con buen rendimiento.
  • Sin embargo, puede ser difícil mejorar esa pureza un pequeño percentil adicional con buen rendimiento.
  • La aplicación planificada de la proteína purificada determina la pureza objetivo..
  • Si la proteína se va a utilizar para determinar la información de la secuencia de aminoácidos, tal vez el 90% sea aceptable. Sin embargo, si el material se va a utilizar en ensayos clínicos, el 99,99% puede ser la pureza objetivo.

Pasos iniciales en la purificación

Figura 4.1.1: Pasos de purificación

  • Es extremadamente útil tener información no solo sobre las características físicas y químicas generales de la proteína que está tratando de purificar, sino también sobre las contaminando componentes.
  • Por ejemplo, muchos E. coli las proteínas son generalmente bajo peso molecular (<50.000 Da) y algo ácido en punto isoeléctrico

Por lo general, los pasos iniciales en la purificación hacen uso de diferencias físicas y / o químicas generales entre las proteínas solubles y otros componentes celulares.

  • Por ejemplo, las proteínas solubles se pueden separar de los desechos celulares generales y las células intactas mediante centrifugación.
  • Por lo tanto, las células se rompen físicamente (mediante homogeneización o una prensa celular) para permitir la liberación del contenido celular. A continuación, se realiza una centrifugación para separar los componentes generalmente solubles de los insolubles.
  • Es en este punto que comienza la recolección de datos para monitorear la purificación.

Los ácidos nucleicos a veces se pueden eliminar fácilmente de la muestra mediante la adición de compuestos catiónicos grandes como polietilen imina, o sulfato de estreptomicina.

  • Los ácidos nucleicos se unen a estos compuestos a través de interacciones electrostáticas y el complejo precipita y se puede eliminar mediante centrifugación.
  • El mismo resultado general se puede obtener mezclando resinas de intercambio iónico que son intercambiadores de aniones (es decir, las resinas contienen grupos catiónicos) y luego se filtran o centrifugan para eliminarlas. Al igual que con cualquier método, debe confirmarse que la proteína deseada es no atado también.

Los fraccionamientos crudos de proteínas se pueden lograr agregando varias cantidades de precipitantes tales como sulfato de amonio, o polietilenglicol (CLAVIJA).

  • Para este tipo de paso de purificación, se realiza un experimento inicial para controlar la fracción de proteína total, así como la proteína deseada, que permanece en solución (y sedimento) en función de la concentración de precipitante.

Sulfato de amonio (% saturado)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Muestra A280

1000

900

600

200

100

75

50

40

25

20

Ensayo de actividad (unidades)

200

200

200

190

170

100

30

5

0

0

Figura 4.1.2: Actividad proteica en función de la concentración de precipitante

  • En este ejemplo en particular, tenemos suerte: con alrededor del 30% de sulfato de amonio podemos precipitar alrededor del 80% de la concentración total de proteína en nuestra muestra, sin embargo, nuestro ensayo de actividad para nuestra proteína deseada indica que alrededor del 95% de nuestra proteína deseada todavía es soluble. .
  • Al 80% de sulfato de amonio, toda nuestra proteína deseada ha precipitado. Así, a partir de estos resultados haríamos lo siguiente:
  1. Agregue sulfato de amonio a nuestra muestra a una concentración de 30% de saturación.
  2. Centrifugar y desechar el pellet.
  3. Agregue sulfato de amonio al 80% de saturación.
  4. Centrifugar y conservar el pellet. Resuspenda el sedimento en tampón para solubilizar la proteína.
  • Sería de esperar una purificación de aproximadamente 5 veces con un rendimiento de aproximadamente el 95%.

Cromatografía en columna - Intercambio iónico; Diálisis y concentración

Cromatografía de columna

Después de los pasos iniciales de fraccionamiento, el procedimiento típico es pasar a cromatografía de columna.

  • En la cromatografía de columna tenemos un tubo de vidrio (columna) que se llena con un material ("resina") que tiene determinadas características físico-químicas.
  • Estas características le permiten interactuar de diversas formas con diferentes proteínas.
  • Algunos tipos comunes de resinas cromatográficas incluyen:
  1. Intercambio iónico
  2. Hidrofóbico
  3. Filtración en gel
  4. Afinidad

Intercambio iónico

Las resinas de intercambio iónico contienen grupos cargados.

  • Estos pueden ser ácido en la naturaleza (en cuyo caso la resina es un catión intercambiador)
  • o básico (en cuyo caso es un anión intercambiador).
  • Los intercambiadores de cationes y aniones pueden descomponerse aún más en débil y fuerte intercambiadores (que refleja la afinidad de unión).

Tipo de intercambiador

Grupo funcional

Nombre común

Intercambiador de cationes débil

carboximetilo

CM celulosa / sephadex

Intercambiador de cationes fuerte

sulfopropilo

SP sephadex

Intercambiador de aniones débil

dietilaminoetilo

DE celulosa / sephadex

Intercambiador de aniones fuerte

amina cuaternaria

QAE sephadex

  • Normalmente, las muestras se cargan bajo baja fuerza iónica condiciones y el material unido se eluye usando una elución escalonada o en gradiente de tampón con mayor fuerza iónica.
  • En términos generales, una proteína se unirá a una resina de intercambio catiónico si el pH del tampón es más bajo que el punto isoeléctrico (pI) de la proteína, y se unirá a una resina de intercambio aniónico si el pH es más alto que el pI.

Figura 4.1.3: Unión de proteínas a resinas

  • Por lo tanto, el conocimiento del pI de la proteína es útil para diseñar un protocolo de purificación utilizando resinas de intercambio iónico (sin embargo, siempre puede simplemente intenta diferentes resinas para ver cuál funciona mejor).

En términos generales, las columnas de intercambio iónico son cortas y de grandes dimensiones.

Elución de proteínas de resinas de intercambio iónico

  • Las proteínas unidas a las resinas de intercambio iónico se unen a través de interacciones iónicas no covalentes (puente de sal). Podemos competir por estos sitios de unión iónicos en la resina con otros grupos iónicos, a saber, sales
  • Hay dos tipos generales de métodos para eluir con una solución salina: 1. Degradado elución y 2. Paso elucion
  • Una elución en gradiente se refiere a una transición suave de la concentración de sal (de baja a alta) en el tampón de elución. Las proteínas de unión débil eluyen primero y las proteínas de unión más fuertes eluyen al final (es decir, requieren concentraciones de sal más altas en el tampón para competir con ellas fuera de la columna)
  • Se puede hacer una concentración de sal en gradiente usando un fabricante de gradientes. En su forma más simple, consta de dos contenedores (debe tener la misma forma) conectado por un sifón (o tubo en la parte inferior). Un recipiente contiene el tampón bajo en sal y el otro contiene el tampón alto en sal. El tampón se extrae del recipiente bajo en sal:

Figura 4.1.4: Creador de gradientes

  • Esto producirá un gradiente lineal de concentraciones de sal bajas a altas sobre el volumen total del gradiente.

Figura 4.1.5: Concentración y volumen de sal

  • Si conocemos el rango de concentración de sal sobre el que eluirá una proteína de interés, podemos simplemente eluir con un tampón que contenga esa concentración de sal. Esto se conoce como elución escalonada.
  • Las eluciones escalonadas son generalmente más rápidas de ejecutar y eluyen la proteína en un volumen total menor que con las eluciones en gradiente. Por lo general, funcionan mejor cuando los contaminantes eluyen a una concentración de sal significativamente diferente a la de la proteína de interés.

Figura 4.1.6: Paso de elución

Tenga en cuenta que después de la cromatografía de intercambio iónico, la proteína de interés estará en un tampón con una concentración de sal potencialmente alta. Esto debe tenerse en cuenta antes de continuar con el siguiente paso en el esquema de purificación.

Diálisis

  • Después de una etapa de precipitación con sulfato de amonio, o una etapa de cromatografía de intercambio iónico, la proteína de interés puede estar en un tampón con alto contenido de sal. Esto puede ser indeseable por varias razones. ¿Cómo nos deshacemos de la sal en nuestra muestra?
  • Uno de los métodos más comunes es el de diálisis
  • El método de diálisis utiliza membranas semipermeables. En el ejemplo más simple, esta membrana se fabrica en forma de tubo (que se parece mucho a una envoltura de salchicha)
  • La característica principal de esta membrana es que es porosa. Sin embargo, el tamaño de los poros es tal que, si bien los iones de sal pequeños pueden atravesar libremente la membrana, las moléculas de proteína más grandes no pueden (es decir, se retienen). Por tanto, las membranas de diálisis se caracterizan por la masa molecular de la proteína globular típica más pequeña que retendrá.
  • Esto se conoce comúnmente como el cortar del tubo (por ejemplo, el tubo de diálisis Spectrapore # 6 tiene un límite de 1,000 Daltons, lo que significa que el tubo retendrá una proteína de 1,000 Dalton pero que los solutos de menor masa molecular pasarán a través del tubo)
  • La diálisis procede colocando una muestra con alto contenido de sal en el tubo de diálisis (es decir, la "bolsa" de diálisis) y colocándola en el tampón bajo en sal deseado:

Figura 4.1.7: Diálisis

  • Con el tiempo, la concentración de solutos de bajo peso molecular dentro de la bolsa y en el tampón de bajo contenido de sal alcanzará el equilibrio. En términos prácticos (para el caso anterior), las moléculas de sal se difundirán fuera de la bolsa hacia el tampón bajo en sal:

Figura 4.1.8: Difusión de sal

  • En equilibrio, la concentración de sal de la muestra se puede calcular de la siguiente manera:

$$ frac {(muestra : volumen) veces (muestra : sal : concentración) + (tampón : volumen) veces (tampón : sal : concentración)} {total : volumen} = final : sal : concentración $$

Nota

A menudo, la concentración de sal tampón es 0 M

  • El volumen de tampón para la diálisis es una función de la concentración final requerida de sal en la muestra.

Ejemplo 4.1.1:

Ejemplo de diálisis

Tenemos una muestra de proteína de 10 ml de un grupo de elución de columna de intercambio iónico que contiene NaCl 1.0M. Para nuestro siguiente paso en la purificación, no podemos tener más de 1 mM de NaCl en la muestra.

Por lo tanto, el volumen de tampón requerido sería (volumen total - volumen de muestra) = 9,990 L (o ~ 10 L)

  • Por lo tanto, si dializamos 10 ml de muestra (con concentración de NaCl 1,0 M) en 10 L de agua después del equilibrio, la concentración de NaCl en la muestra sería de 1,0 mM.

  • Tenga en cuenta que en el ejemplo anterior esto se denominaría comúnmente diálisis "1: 1.000".
  • Supongamos que no queremos hacer 10 L de tampón. De hecho, podemos lograr los mismos resultados con dos diálisis secuenciales "1:32" (es decir, la raíz cuadrada de la diálisis 1: 1,000; en otras palabras, dos diálisis secuenciales 1:32 equivalen a una única diálisis 1: 1,000):

Primera diálisis versus 310 ml de tampón: la concentración de NaCl de la muestra será (10 * 1.0) / (320) = 31 mM

Segunda diálisis versus 310 ml de tampón: la concentración de NaCl de la muestra será (10 * 0.031) / (320) = 0.97 mM

Por lo tanto, en lugar de hacer 10 L de tampón, podríamos hacer solo 620 ml y lograr los mismos resultados con dos pasos de diálisis.

  • En este caso, quitar la sal tomaría el doble de tiempo, es decir, tenemos que realizar dos Pasos de diálisis. ¿Cuánto tiempo dura la diálisis?

Una regla práctica útil es que para la mayoría de los tipos de tubos de diálisis, la diálisis es 80% competitiva después de cuatro horas.

  • Una consecuencia de la diálisis a tener en cuenta es que mientras los iones de sal se mueven fuera de la bolsa, las moléculas de agua se mueven hacia la bolsa. Por lo tanto, el volumen de la muestra puede aumentar (la bolsa se hinchará) y, por lo tanto, la concentración de proteína disminuirá.
  • En el caso extremo, la bolsa puede hincharse hasta el punto de romperse. Por lo tanto, Es una buena idea no llenar la bolsa por completo, sino dejar un vacío para permitir una posible hinchazón..

Concentración

  • ¿Qué pasa si nuestra muestra de proteína está demasiado diluida para nuestras necesidades? ¿Cómo concentrar nuestras muestras?
  • Un método común es, nuevamente, usar una membrana semipermeable para este propósito.
  • Un método muy simple es colocar nuestra muestra en una bolsa de diálisis y cubrirla con un soluto de alto peso molecular que el tampón puede disolver fácilmente.
  • Por ejemplo, los polietilenglicoles y las polivinilpirrolidonas pueden tener masas moleculares muy grandes (es decir, 20.000 Da). Estos compuestos también se disuelven fácilmente en agua. Si nuestra muestra en una bolsa de diálisis está cubierta con formas secas de los polímeros anteriores, el agua saldrá de la bolsa de diálisis (puede atravesar los poros) e hidratará los polímeros. El resultado es una disminución del volumen de tampón en la bolsa de diálisis (la proteína se concentrará).
  • En otra variación, la membrana semipermeable se fabrica en un disco plano y se coloca en el fondo de un recipiente que contiene nuestra muestra. En un método, el recipiente se presuriza y fuerza el tampón fuera del recipiente (la proteína se retiene y se concentra). En otro método, el recipiente se centrifuga y la fuerza centrípeta logra el mismo objetivo que la presión en el ejemplo anterior.

Tanto para la diálisis como para la concentración, es esencial que la membrana no interactúe con la proteína (es decir, no tenga afinidad por la proteína y no se una a ella)

  • Con los concentradores de tipo presión, la diálisis y la concentración se pueden lograr en conjunto. Por ejemplo, la muestra se puede concentrar y luego agregar tampón a la muestra. A continuación, la muestra se vuelve a concentrar. Cada vez que se agrega tampón, la concentración de sal se reduce. Después de ciclos repetidos de esto, la concentración de sal está al nivel deseado y la muestra se concentra al volumen final deseado.

Resinas de filtración en gel, afinidad e hidrofóbicas; Preparación de resina, fontanería

Filtración en gel

La filtración en gel no depende de ninguna interacción química con la proteína, sino que se basa en una físico propiedad de la proteína, que es la radio molecular efectivo (que se relaciona con la masa de la mayoría de las proteínas globulares típicas).

  • La resina de filtración en gel se puede considerar como perlas que contienen poros de un intervalo de tamaño definido.
  • Las proteínas grandes que no pueden entrar en estos poros pasan alrededor del fuera de de las cuentas.
  • Las proteínas más pequeñas que pueden entrar en los poros de las perlas tienen un camino más largo y tortuoso antes de salir de las perlas.
  • Por lo tanto, una muestra de proteínas que pasa a través de una columna de filtración en gel separar según el tamaño molecular: los grandes eluirán primero y los más pequeños eluirán al final (y las proteínas de tamaño "mediano" eluirán en el medio).

Figura 4.1.9: Filtración en gel

  • Si su proteína es inusualmente "pequeña" o "grande" en comparación con las proteínas contaminantes entonces la filtración en gel puede funcionar bastante bien.

¿Dónde se eluirá una proteína en un experimento de filtración en gel?

  • Hay dos extremos en el perfil de separación de una columna de filtración en gel.
  • Hay una masa molecular crítica (gran masa) que será completamente excluido de las perlas de filtración en gel. Todos los solutos en la muestra que sean iguales o mayores que este tamaño crítico se comportarán de manera idéntica: todos eluirán en el volumen excluido de la columna
  • Hay una masa molecular crítica (masa pequeña) que será completamente incluido dentro de los poros de las perlas de filtración en gel. Todos los solutos en la muestra que sean iguales o menores que este tamaño crítico se comportarán de manera idéntica: todos eluirán en el volumen incluido de la columna
  • Los solutos entre estos dos rangos de masa molecular eluirán entre los volúmenes excluidos e incluidos

Figura 4.1.10: Volumen excluido vs. incluido

Como regla general, el volumen excluido (Vo) es aproximadamente igual a un tercio del volumen de la columna, el volumen incluido es aproximadamente igual a dos tercios del volumen de la columna.

  • En la filtración en gel, la resolución es función de la longitud de la columna (cuanto más larga, mejor)
  • Sin embargo, un inconveniente está relacionado con el volumen máximo de muestra que se puede cargar. Cuanto mayor sea el volumen de muestra cargada, mayor será la superposición entre los picos separados. En términos generales, el tamaño de muestra que se puede cargar está limitado a aproximadamente 3-5% del volumen total de la columna.
  • Por lo tanto, la filtración en gel se guarda mejor para las etapas finales de una purificación , cuando la muestra se puede concentrar fácilmente a un volumen pequeño.
  • La filtración en gel también se puede utilizar para eliminar sales de la muestra, debido a su capacidad para separar componentes "pequeños" de "grandes".
  • Finalmente, la filtración en gel puede estar entre los métodos de purificación más "suaves" debido a la falta de interacción química con la resina.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es un término general que se aplica a una amplia gama de medios cromatográficos. Básicamente se puede pensar en una resina inerte a la que se le ha unido algún compuesto que tiene un afinidad específica para su proteína de interés.

  • Por tanto, un anticuerpo específico unido a una resina inerte sería un tipo de cromatografía de afinidad.
  • Otros ejemplos pueden incluir: un inhibidor de proteasa unido a alguna matriz, diseñado para unirse a una proteasa específica
  • un cofactor unido a alguna matriz, diseñado para unirse a una enzima particular
  • un ión metálico unido a una matriz, diseñado para quelar una proteína con un sitio de unión a un metal, y así sucesivamente.

En cada caso, el tipo de resinas utilizadas y el método de unión pueden variar, al igual que el método de elución. Una generalización con respecto al método de elución es que el ligando unido se puede competir con el grupo funcional de la columna incluyendo en el tampón de elución una alta concentración del grupo funcional libre. Por ejemplo, si el grupo funcional de la columna es un cofactor, entonces la proteína unida puede competir fuera de la columna pasando un tampón que contiene una alta concentración de cofactor (o análogo de cofactor) a través de la columna.

Otros métodos de elución incluyen cambiar las condiciones del tampón de modo que la proteína ya no se encuentre en el estado nativo (ya que es el estado nativo el que confiere la estructura requerida para la interacción de unión específica). Esto se puede lograr cambiando el pH o agregando agentes desnaturalizantes como urea o guanidina.

Con la cromatografía de afinidad, normalmente la purificación lograda en un solo paso puede ser espectacular, del orden de varios miles de veces. Las purificaciones de un solo paso con columnas de afinidad específicas no son desconocidas; de hecho, es un objetivo ideal de la purificación. una matriz que reconoce solo la proteína de interés y ninguna otra.

Resinas hidrofóbicas

Las resinas hidrófobas contienen un grupo funcional apolar, como un alcano o un grupo aromático.

  • Muchas proteínas pueden secuestrar dichos grupos en su superficie y esta exclusión del disolvente proporciona la base de la energía de unión (es decir, el "efecto hidrófobo").
  • Esta interacción se mejora al aumentar la fuerza iónica, de modo que las proteínas pueden se unen en condiciones de alta salinidad y eluir en condiciones de poca sal.
  • Como tales, estas columnas pueden usarse no solo para proporcionar purificación, sino para desalar muestras (por ejemplo, después de una precipitación inicial con sulfato de amonio).
  • Por lo general, no es posible predecir de antemano qué resina particular se unirá a una proteína determinada; esto generalmente se determina empíricamente. Sin embargo, cuanto más largo sea el alcano, o cuanto más grande sea el compuesto aromático, más fuerte será la unión típicamente.

Debido a la naturaleza de las interacciones hidrófobas y la fuerza iónica, la cromatografía hidrófoba y la cromatografía de intercambio iónico se pueden usar convenientemente secuencialmente. Por ejemplo, después del intercambio iónico, la proteína se encuentra en condiciones de alta salinidad, por lo que se puede cargar directamente en una columna hidrófoba. Por el contrario, una columna hidrófoba se eluye con poca sal, que es un requisito para unirse a una resina de intercambio iónico.

Debe hacerse una distinción entre cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de fase inversa.

  • La cromatografía de interacción hidrófoba se realiza en condiciones de disolvente acuoso y se utilizan cambios en la fuerza iónica para eluir la columna. La proteína se une típicamente en el estado nativo a través de grupos hidrofóbicos ubicados en la superficie de la proteína. El estado nativo se conserva durante las condiciones de elución.
  • La cromatografía de fase inversa utiliza un disolvente hidrófobo (típicamente acetonitrilo) y la unión de un ligando es función del reparto de fases entre la naturaleza hidrófoba del disolvente y el grupo funcional de la columna. Las proteínas se desnaturalizan típicamente en dichos disolventes y se unen debido a la naturaleza hidrófoba de la secuencia polipeptídica completa. Dado que la mayoría de los grupos hidrófobos se encuentran en el núcleo de las proteínas globulares, la unión está relacionada con la desnaturalización de la proteína y la accesibilidad de estos grupos a los grupos funcionales de la columna. Las proteínas se pueden purificar mediante cromatografía de fase inversa, pero por lo general se deben replegar de alguna manera para recuperar la funcionalidad (es decir, el estado nativo).

Preparación de resinas

Los pasos para preparar una resina cromatográfica normalmente implican:

  1. Hidratación de resina
  2. Decantación de multas
  3. Equilibrar la resina y preparar una lechada
  4. Desgasificación de la lechada
  • Las resinas vienen secas o pre-hinchadas. Si están secos, necesitan hidratarse. Esto generalmente se logra mezclando la resina seca con tampón y dejándola hidratar lentamente durante la noche (o más rápido a temperaturas más altas
  • Después de que la resina se haya hidratado y asentado, las partículas muy finas se asentarán en la parte superior. Estos "finos" reducen la velocidad de flujo de la resina empaquetada. Por lo tanto, la resina sedimentada se decanta cuidadosamente para descartar estos finos.
  • A continuación, la resina se equilibra en el tampón que se utilizará para el análisis. El equilibrio suele implicar el pH de la resina o intercambios de tampón. Nunca use una barra de agitación al pH de la resina (puede cortar mecánicamente la resina y producir finos), más bien revuelva la suspensión de resina con una varilla de agitación.
  • Una vez que la resina equilibrada se ha asentado, se agrega un volumen igual de tampón para producir un 50% estiércol líquido de resina. Suele ser lo suficientemente "fina" para permitir que las burbujas de aire se escapen al rellenar la columna.
  • Finalmente, la lechada se desgasifica antes de empacar la columna. Esto ayudará a minimizar la formación de burbujas de aire.

Empacando la columna

Las columnas de baja presión se empacan normalmente por gravedad.

  • Agregue una pequeña cantidad de tampón al final de la columna.
  • Coloque un depósito de embalaje en la parte superior de la columna. Como usaremos una suspensión al 50%, tendremos un volumen que es el doble del volumen de la columna y es mejor verter la resina de una vez. Por lo tanto, el depósito de empaque debe tener un volumen igual o mayor que el volumen de la columna.
  • Vierta con cuidado la lechada de resina en el depósito / columna de empaque, evitando la introducción de burbujas de aire tanto como sea posible
  • Deje reposar la columna durante unos 5 minutos para permitir que se escapen las burbujas de aire grandes.
  • Abra la válvula de la columna en la parte inferior y permita que la columna se empaque por gravedad.
  • Tenga en cuenta la parte superior del lecho de resina. Se moverá hacia abajo a medida que se empaqueta la columna. Cuando la columna está empaquetada, la parte superior del lecho de resina ya no se moverá hacia abajo.

Plomería

Los sistemas de cromatografía se pueden ejecutar usando solo gravedad y un vaso de precipitados para recolectar la fracción apropiada. Sin embargo, los sistemas más comunes incluirán los siguientes:

  • Una bomba. Por lo general, una bomba peristáltica con caudal variable y un puerto de comunicaciones para un controlador. Por lo general, la bomba está configurada para empujar tampón a través de la columna, en lugar de succionar el tampón de la columna (lo que puede causar una condición de baja presión con producción de burbujas de aire)
  • Un detector. Esto suele ser un UV (A280) detector. La mayoría de los detectores son del tipo de dos celdas, lo que significa que puede tener un búfer simple como un blanco en el detector mientras analiza las fracciones de la columna. El detector envía la información de absorbancia a un registrador de gráficos para que se muestre (imprima)
  • Un recolector de fracciones. Esto le permite recolectar fracciones por número de gotas (~ 30 por ml) o por tiempo. Junto con una bomba controlable, la recolección de tiempo se traduce en volumen. El colector de fracciones normalmente tendrá un puerto de comunicaciones para emitir una señal cuando cambie fracciones y para recibir comandos del detector / controlador en algunos sistemas sofisticados.
  • Un registrador de gráficos. Esto imprimirá una traza continua de la salida del detector y el marcador de eventos del recolector de fracciones (que indica cuando cambia una fracción). Las fracciones también se pueden leer individualmente en un espectrofotómetro UV si no se dispone de un registrador gráfico.

Figura 4.1.11: Configuración de cromatografía

  • Si se utiliza un sistema de gravedad, se debe instalar un circuito de seguridad para evitar que la columna se seque si el tampón se agota cuando la columna está desatendida.

Figura 4.1.12: Lazo de seguridad

Tenga en cuenta que la parte inferior del lazo de seguridad es más bajo que la salida al colector de fracciones.

Ejecución del experimento, resolución de picos

Lo siguiente representa un ejemplo de un experimento de cromatografía líquida de baja presión (resina de intercambio iónico).

Muestra:

  • Volumen = 90 ml
  • A280 = 1.8
  • Total A280 = 162

Columna:

  • DE-52 (dietilaminoetil celulosa; intercambio aniónico)
  • Tamaño = 1,0 x 12,7 cm
  • Volumen = = 40 mL

Colector de fracciones:

  • 10 ml / fracción (~ 300 gotas / fracción)

El cromatograma de este experimento se ve así:

Figura 4.1.13: Cromatograma

Los siguientes eventos tuvieron lugar durante esta ejecución de cromatografía:

1. Observe las marcas de verificación en el cromatograma.

  • El marcador de "evento" del recolector de fracciones notifica al registrador gráfico cuando se produce un cambio de tubo.
  • El experimento comienza con la marca junto al '0' en el eje x ("marcar 0"); esto indica el comienzode fracción (tubo) número 1.
  • La siguiente marca de verificación ("marca de verificación 1") indica la fin de fracción numero 1, y el comienzo de fracción Número 2.
  • Por lo tanto, las fracciones cubren el espacio Entre las marcas de garrapatas.

2. La carga de la muestra comienza en el tick 0.

3. En algún momento durante la fracción 5 comenzamos a notar que la absorbancia del efluente de la columna aumenta

  • Ha tomado aproximadamente (5 fracciones x 10 ml por fracción) o 50 ml desde el inicio de la carga hasta que el detector nota cualquier absorbancia.
  • Esto se compara bien con el hecho de que el volumen de la columna es de aproximadamente 40 ml y hay algo de volumen asociado con la entrada y salida de la tubería de la columna.
  • Por lo tanto, este 'retraso' desde la carga de la muestra hasta la detección de la muestra es el volumen muerto del sistema

4. Obviamente, algunos materiales no se adhieren a la resina durante el paso de carga. Este es el flujo continuo. ¿Es este algún componente de la muestra que no tiene afinidad por la resina, o representa que hemos superado la capacidad de la resina?

  • Si hemos excedido la capacidad de la resina, entonces el flow-through tendrá una A280 similar a la muestra que se está cargando
  • Además, antes de exceder la capacidad, el flujo continuo tendrá alguna característica A280 que luego pasará a otro A280 (el de la muestra cargada), resultando en un doble meseta cromatograma.
  • En el experimento anterior, las mesetas de flujo alrededor de A280= 0,5 o aproximadamente el 25% de la absorbancia de la carga. Esto parecería indicar que un componente, o componente (s), que representa una cuarta parte de nuestra muestra, no tiene afinidad por la resina en la columna.

5. Alrededor de la fracción 9 comenzamos a lavar la columna.

  • Esto tiene sentido porque 9 fracciones x 10 ml por fracción = 90 ml se han cargado y esto es equivalente a nuestro volumen de muestra original (es decir, toda la muestra se ha cargado)
  • La columna generalmente se lava usando las mismas condiciones de tampón en la muestra de proteína.

6. Alrededor de la fracción 14 notamos la A280 comienza a disminuir

  • Esto tiene sentido dado que determinamos que el volumen muerto del sistema es de aproximadamente 50 ml o 5 fracciones. Por lo tanto, se observa que un lavado que se inició en la fracción 9 disminuye la absorbancia alrededor de la fracción 14
  • Seguimos lavando la columna hasta que la A280 se acerca a 0 (base). En otras palabras, todo el material no aglutinante de la muestra se ha lavado.

7. Después de la A280 vuelve a la línea de base comenzamos nuestro elucion protocolo. En este experimento particular usaremos un gradiente lineal de concentración creciente de sal (NaCl) (en tampón de lavado) para competir con el material unido a la resina de intercambio iónico.

8. Nuestra elución ha producido dos picos: un pico pequeño centrado alrededor de la fracción 42 y un pico más grande centrado alrededor de la fracción 50

  • Tendremos que analizar cada pico (y el flujo a través) para averiguar dónde se ha ido nuestra proteína de interés.
  • Los dos picos de elución están bastante bien resueltos. Podríamos combinar las fracciones 40-44 y llamar a eso "pico 1", y combinar las fracciones 46-55 y llamarlo "pico 2".

9. ¿Queda algún material en la columna? Las áreas integradas (es decir, sumando la A280de cada fracción en un conjunto) del flujo continuo, el pico 1 y el pico 2 son los siguientes

  • Flujo a través: 4
  • Pico 1: 2
  • Pico 2:10
  • Esto da un área integrada total de 16. Cada fracción es de 10 ml, por lo que esto da un total de A280 = 16 x 10 = 160 que está bastante cerca del total A280 de nuestra muestra cargada.
  • En otras palabras, parece que nuestro cromatograma representa todos los componentes de nuestra muestra original.

10. Si nuestra proteína de interés era realmente el pico 1 (y si nuestro rendimiento era del 100%), entonces esta columna ha proporcionado una purificación de ocho veces (2 x 10/162).


Resolución de picos

  • Los picos contaminantes no necesariamente estarán completamente separados del pico que contiene nuestra proteína de interés.
  • En la siguiente imagen se están resolviendo dos componentes y están presentes en cantidades equimolares (por lo tanto, la pureza inicial es del 50%). El rendimiento y la pureza se enumeran para la situación en la que debíamos agrupar cada pico dividiéndolos en el punto medio entre ellos (en este ejemplo en particular, el rendimiento y la pureza son idénticos en cada caso)

Figura 4.1.14: Contaminando peaks

  • Esto le da una idea de la cantidad de contaminación cruzada en cada pico en función de su separación entre sí.
  • El software para ajustar gaussianos a un cromatograma puede proporcionar este tipo de información

Agrupando para la pureza, los versos rinden

¿Intentamos agrupar para maximizar el rendimiento o maximizar la pureza?

Por lo general, probablemente estará agrupando fracciones de tal manera que maximice la recuperación de la proteína de su interés. Sin embargo, siempre tiene la opción de combinar para aumentar la pureza, y si tiene muchas proteínas con las que trabajar, esto puede permitirle lograr la pureza deseada con menos pasos. A continuación, se muestra un ejemplo de cómo se hace:

Figura 4.1.15: Rendimiento frente a pureza

  • Todos estos son el mismo cromatograma, sin embargo, podemos combinarlos de manera diferente para obtener una mejor pureza (a expensas del rendimiento
  • El pico azul es el pico de interés y no se resuelve a partir de un pico contaminante (en rojo).
  • La línea vertical representa la fracción más a la izquierda que usamos para agrupar el pico (agrupamos todas las fracciones a la derecha de la línea vertical para obtener nuestra proteína de interés)
  • En el último panel, vemos que podemos lograr aproximadamente un 98,8% de pureza si estamos dispuestos a deshacernos de la mitad de nuestra proteína.

Seguimiento de la depuración

¿Cómo saber cuándo ha terminado de purificar una proteína?

Hay varios criterios. Un criterio es que no podemos mejorar el actividad específica de nuestra muestra. Este valor se refiere a la actividad funcional de nuestra muestra en relación con la concentración de proteína total de la muestra.

  • En las etapas iniciales de purificación este valor será bajo (poca actividad en relación con la cantidad total de proteína).
  • Este valor aumentará después de cada paso de purificación a medida que retirar otras proteínas de la muestra.
  • En algún momento, la actividad específica meseta, y por definición, si es puro no podemos incrementar la actividad específica.
  • Puede haber un valor publicado para la actividad específica con el que podamos comparar la nuestra.

Además, cada paso de la purificación debe controlarse mediante electroforesis en gel.

  • En las etapas iniciales de purificación probablemente veremos una variedad de bandas, de varios pesos moleculares, en nuestro gel.
  • Después de los diferentes pasos de purificación, deberíamos ver la desaparición de ciertas bandas concomitante con el aumento de la concentración de una determinada banda (o bandas) que representan nuestra proteína.
  • Si hemos purificado con éxito nuestra proteína (y si es un único polipéptido) deberíamos llegar a una actividad específica constante y una sola banda en un gel.
  • Los métodos analíticos como la HPLC o el barrido con densitómetro de un gel teñido pueden darnos una idea cuantitativa de la pureza de nuestra muestra final.

El siguiente cuadro representa los datos típicos que se monitorearían durante una purificación:

Paso
Proteína total (mg)
Actividad total (unidades)
Actividad específica (unidades / mg)
Purificación
% Producir
Lisado celular crudo
5500
6600
1.2
30-70% de sulfato de amonio cortado
1020
5910
5.8
4.8
89.5
Piscina DEAE Sephadex
187
5070
27.1
4.7
85.8
Piscina CM Sephadex
102
4420
43.3
1.6
87.2
Grupo de fenil sefarosa
56
3930
70.2
1.6
88.9
Piscina de filtración de gel
32
2970
92.8
1.3
75.6
Resina de afinidad tipo piscina n. ° 1
5.8
2520
434.5
4.7
84.8
Piscina de resina de afinidad tipo n. ° 2
5.3
2390
450.9
1.0
94.8
Purificación total
376
Rendimiento total (%)
36

Purificación de proteínas: significado, estrategias principales, evaluación y otros detalles

Lea este artículo para conocer el significado, estrategias principales, selección y combinación de técnicas de purificación, purificación de una proteína etiquetada, evaluación del rendimiento de purificación, concentración de proteína purificada y análisis de proteínas aisladas.

Introducción:

La purificación de proteínas es una serie de procesos destinados a aislar un solo tipo de proteína de una mezcla compleja.

La purificación de proteínas es vital para la caracterización de la función, estructura e interacciones de la proteína de interés. El material de partida suele ser un tejido biológico o un cultivo microbiano.

Los diversos pasos del proceso de purificación pueden liberar la proteína de una matriz que la confina, separar las partes proteicas y no proteicas de la mezcla y, finalmente, separar la proteína deseada de todas las demás proteínas. La separación de una proteína de todas las demás es típicamente el aspecto más laborioso de la purificación de proteínas. Los pasos de separación aprovechan las diferencias en el tamaño de las proteínas, las propiedades fisicoquímicas y la afinidad de unión.

La purificación puede ser preparativa o analítica. Las purificaciones preparativas tienen como objetivo producir una cantidad relativamente grande de proteínas purificadas para su uso posterior.Los ejemplos incluyen la preparación de productos comerciales tales como enzimas (por ejemplo, lactasa), proteínas nutricionales (por ejemplo, aislado de proteína de soja) y ciertos biofarmacéuticos (por ejemplo, insulina).

La purificación analítica produce una cantidad relativamente pequeña de proteína para una variedad de propósitos analíticos o de investigación, incluida la identificación, cuantificación y estudios de la estructura, las modificaciones postraduccionales y la función de la proteína. Entre las primeras proteínas purificadas se encuentran la ureasa y la concanavalina-A.

Estrategias principales:

La mayoría de los protocolos de purificación requieren más de un paso para lograr el nivel de pureza deseado. Cada paso del proceso provocará alguna pérdida de producto, se asume un rendimiento del 80% en cada paso, por lo que es recomendable tener el menor número de pasos de purificación posible. La elección de un material de partida es clave para el diseño de un proceso de purificación.

En una planta o animal, una proteína en particular no se distribuye normalmente de manera homogénea por todo el cuerpo, diferentes órganos o tejidos tienen concentraciones más altas o más bajas de la proteína. El uso de solo los tejidos u órganos con la concentración más alta disminuye los volúmenes necesarios para producir una cantidad determinada de proteína purificada.

Si la proteína está presente en baja abundancia, o si tiene un valor alto, los científicos pueden usar tecnología de ADN recombinante para desarrollar células que producirán grandes cantidades de la proteína deseada (esto se conoce como un sistema de expresión). estar etiquetados, por ejemplo, con una etiqueta His, para facilitar la purificación, lo que significa que la purificación se puede realizar en menos pasos. Además de esta expresión recombinante, generalmente comienza con una fracción más alta de la proteína deseada que la que está presente en una fuente natural.

Con información de antecedentes, ensayos y procedimientos de muestra implementados, se pueden considerar las estrategias de purificación de tres fases. La depuración tiene tres fases de captura, depuración intermedia y pulido, cada una con un objetivo específico. En la fase de captura los objetivos son aislar, concentrar y estabilizar el procedimiento objetivo.

Durante la fase de purificación intermedia, el objetivo es eliminar las impurezas a granel, como otras proteínas, ácidos nucleicos, endotoxinas y virus. En la fase de pulido, el objetivo es eliminar cualquier rastro de impurezas y sustancias estrechamente relacionadas. Por lo tanto, la selección y combinación óptima de técnicas de purificación para la captura, purificación intermedia y pulido es necesaria para asegurar un buen rendimiento y un producto puro.

El proceso de purificación final idealmente consiste en la preparación de la muestra, incluida la extracción y clarificación cuando sea necesario, seguida de las tres fases de purificación descritas anteriormente. El número de pasos siempre dependerá de la pureza requerida y del uso previsto de la proteína.

Una purificación analítica generalmente utiliza tres propiedades para separar proteínas. Primero, las proteínas pueden purificarse de acuerdo con sus puntos isoeléctricos haciéndolas pasar por un gel graduado de pH o una columna de intercambio iónico. En segundo lugar, las proteínas se pueden separar de acuerdo con su tamaño o peso molecular mediante cromatografía de exclusión de tamaño o mediante análisis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio).

Las proteínas a menudo se purifican utilizando 2D-PAGE y luego se analizan mediante huellas dactilares de la masa de péptidos para establecer la identidad de la proteína. Esto es muy útil para fines científicos y los límites de detección de proteínas son hoy en día muy bajos y cantidades de nanogramos de proteína son suficientes para su análisis.

Selección y combinación de técnicas de purificación:

El objetivo de esta combinación es desarrollar una ruta más rápida hacia un producto de la pureza requerida. Para cualquier separación cromatográfica, cada técnica diferente ofrecerá un rendimiento diferente en cuanto a recuperación, resolución, velocidad y capacidad. Se puede optimizar una técnica para centrarse en uno de estos parámetros, por ejemplo, la resolución para lograr lo mejor entre dos parámetros, como la velocidad y la capacidad.

Una separación optimizada para uno de estos parámetros producirá un resultado bastante diferente en apariencia a los producidos usando la misma técnica pero enfocados en parámetros alternativos. Por lo tanto, siempre es preferible seleccionar una técnica para cumplir los objetivos en la etapa de purificación.

La capacidad en el modelo simple que se muestra representa la cantidad de proteína diana cargada durante la purificación. En algunos casos, la cantidad que se puede cargar puede estar limitada por el volumen (como en la filtración en gel) o por un gran volumen de contaminantes en lugar de la cantidad de proteínas diana.

La velocidad es de suma importancia al principio, donde los contaminantes como las proteasas deben eliminarse lo más rápido posible. La recuperación se vuelve cada vez más importante a medida que avanza la purificación debido al mayor valor del producto purificado. La recuperación & # 8217 está influenciada por procesos destructivos en las muestras y condiciones desfavorables en la columna.

La resolución se logra mediante la selectividad de la técnica y la eficiencia de la matriz cromatográfica para producir picos estrechos. En general, la resolución es más difícil de lograr en las fases finales de purificación donde la proteína diana y las impurezas tienen propiedades muy similares.

Cada técnica ofrece un equilibrio entre capacidad, velocidad, resolución y recuperación y debe seleccionarse para cumplir con los objetivos de cada paso de purificación. En general, la optimización de cualquiera de estos parámetros se puede lograr solo a expensas de otros y el paso de purificación será un compromiso.

La importancia de cada parámetro variará dependiendo de si se usa una etapa de purificación para captura, purificación intermedia o pulido. Esto dirigirá la optimización de los parámetros críticos, así como la selección de los medios adecuados para el paso.

Purificación de una proteína etiquetada:

Agregar una etiqueta a la proteína le da a la proteína una afinidad de unión que de otro modo no tendría. Por lo general, la proteína recombinante es la única proteína en la mezcla con esta afinidad, lo que ayuda a la separación. La etiqueta más común es la etiqueta de histidina (etiqueta de His) que tiene afinidad por los iones de níquel o cobalto. Por tanto, al inmovilizar iones de níquel o cobalto en una resina, se puede crear un soporte de afinidad que se una específicamente a proteínas marcadas con histidina. Dado que la proteína es el único componente con una etiqueta His, todas las demás proteínas pasarán a través de la columna y dejarán la proteína etiquetada con His unida a la resina.

La proteína se libera de la columna en un proceso llamado elución, que en este caso implica agregar imidazol, para competir con las etiquetas His por la unión del níquel, ya que tiene una estructura de anillo similar a la histidina. La proteína de interés es ahora el único componente proteico en la mezcla eluida y puede separarse fácilmente de cualquier contaminante no deseado menor mediante un segundo paso de purificación, como cromatografía de exclusión por tamaño o RP-HPLC.

Otra forma de etiquetar proteínas es agregar un péptido de antígeno a la proteína y luego purificar la proteína en una columna que contiene el anticuerpo inmovilizado. Esto genera una interacción muy específica que normalmente solo se une a la proteína deseada. Cuando las etiquetas ya no se necesitan, una proteasa puede escindirlas. Esto a menudo implica diseñar un sitio de escisión de proteasa entre la etiqueta y la proteína.

Evaluación del rendimiento de la purificación:

El método más general para monitorear el proceso de purificación es ejecutando una SDS PAGE, de los diferentes pasos. Este método solo da una medida aproximada de las cantidades de diferentes proteínas en la mezcla y no es capaz de distinguir entre proteínas con peso molecular similar.

Si la proteína tiene una característica espectroscópica distintiva o una actividad enzimática, esta propiedad se puede utilizar para detectar y cuantificar la proteína específica y, por lo tanto, seleccionar las fracciones de la separación que contiene la proteína. Si se dispone de anticuerpos contra la proteína, la transferencia Western y ELISA pueden detectar y cuantificar específicamente la cantidad de proteína deseada. Algunas proteínas funcionan como receptores y pueden detectarse durante las etapas de purificación mediante un ensayo de unión de ligando, a menudo usando un ligando radiactivo.

Para evaluar el proceso de purificación en varios pasos, las cantidades de la proteína específica deben compararse con la cantidad de proteína total. Este último puede determinarse mediante el ensayo de proteína total de Bradford o mediante la absorbancia de luz a 280 nm; sin embargo, algunos reactivos utilizados durante el proceso de purificación pueden interferir con la cuantificación.

Por ejemplo, el imidazol (comúnmente utilizado para la purificación de proteínas recombinantes etiquetadas con polihistidina) es un análogo de aminoácido y en concentraciones bajas interferirá con el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para la cuantificación de proteínas totales. Las impurezas en imidazol de bajo grado también se absorberán a 280 nm, lo que resultará en una lectura inexacta de la concentración de proteína de la absorbancia UV.

Concentración de la proteína purificada:

Al final de la purificación de proteínas, la proteína a menudo debe concentrarse.

Existe un método diferente para este propósito es:

1. Liofilización:

Si la solución no contiene ningún otro componente soluble que la proteína en cuestión, la proteína puede liofilizarse (secarse). Esto se hace comúnmente después de una ejecución de HPLC. Esto simplemente elimina todos los componentes volátiles que dejan atrás las proteínas.

2. Ultrafiltración:

La ultrafiltración concentra una solución de proteína utilizando membranas permeables selectivas. La función de la membrana es dejar pasar el agua y las moléculas pequeñas mientras retienen la proteína de estaño. La solución se fuerza contra la membrana mediante una bomba mecánica o presión de gas o centrifugación.

Análisis de proteínas aisladas:

Este análisis se realiza mediante las siguientes técnicas:

1. Electroforesis en condiciones desnaturalizantes:

La electroforesis en gel es una técnica de laboratorio común que se puede utilizar como métodos preparativos y analíticos. El principio de electroforesis se basa en el movimiento de un ion cargado en un campo eléctrico. En la práctica, las proteínas se desnaturalizan en una solución que contiene un detergente (SDS). En estas condiciones, las proteínas se desdoblan y se recubren con moléculas de detergente cargadas negativamente. Las proteínas en SDS-PAGE se separan basándose únicamente en su tamaño.

En los métodos analíticos, la proteína migra como bandas según el tamaño. Cada banda se puede detectar utilizando tintes como el tinte azul de Coomassie o el tinte plateado. Los métodos preparativos para purificar grandes cantidades de proteína requieren la extracción de la proteína del gel electroforético. Esta extracción puede implicar la escisión del gel que contiene una banda o eluir la banda directamente del gel a medida que se escurre por el extremo del gel.

En el contexto de una estrategia de purificación, la electroforesis en condiciones de desnaturalización proporciona una resolución mejorada con respecto a la cromatografía de exclusión por tamaño, pero no escala a una gran cantidad de proteínas en una muestra, así como a las columnas de cromatografía tardía.

2. Electroforesis para condiciones no desnaturalizantes:

Un procedimiento electroforético no desnaturalizante importante para aislar metaloproteínas bioactivas en mezclas de proteínas complejas se denomina & # 8216 electroforesis continua en gel de poliacrilamida nativa cuantitativa & # 8217 (QNC-PAGE).


Cromatografia

La cromatografía en columna es uno de los métodos más comunes de purificación de proteínas. Como muchas de las técnicas de este sitio, es tanto una forma de arte como una ciencia. Las proteínas varían enormemente en sus propiedades, y los diferentes tipos de cromatografía en columna le permiten aprovechar esas diferencias. La mayoría de estos métodos no requieren la desnaturalización de proteínas.

Para ser muy general, una proteína pasa a través de una columna diseñada para atrapar o ralentizar el paso de proteínas en función de una propiedad particular (como el tamaño, la carga o la composición).

Hay tres pasos principales para la purificación de proteínas:

1. Captura. Necesita obtener su proteína en una forma concentrada. Si, por ejemplo, está tratando de aislar una proteína que ha sintetizado en una célula de E. coli, podría estar buscando una proporción de proteína a basura de 1: 1,000,000. Para la purificación de la captura, necesita un método de alta capacidad que también sea rápido. Necesita un método rápido porque es muy probable que su solución cruda también contenga proteasas y estas pueden masticar rápidamente su proteína.

2. Intermedio. La purificación intermedia requiere velocidad y buena resolución.

3. Pulido. Para el paso final de la purificación, necesita un sistema que tenga buena resolución y velocidad. La capacidad suele ser irrelevante en esta etapa.

Algunas de las columnas más comunes incluyen:

IEX: Cromatografía de intercambio de iones. Bueno para captura, intermedio y pulido.

HIC: Columna de interacción hidrofóbica. Bueno para purificación intermedia.

C.A: Cromatografía de afinidad. Bueno para captura y purificación intermedia.

GF: Cromatografía de filtración en gel (exclusión de tamaño). Buen paso de pulido.

Veamos estos tipos de columnas con más detalle.

Cromatografía de intercambio de iones

La cromatografía de intercambio iónico se basa en la carga de la proteína que intenta aislar. Si su proteína tiene una carga positiva alta, querrá pasarla a través de una columna con carga negativa. La carga negativa de la columna se unirá a la proteína cargada positivamente y otras proteínas pasarán a través de la columna. Luego, usa un procedimiento llamado "salado" para liberar la proteína cargada positivamente de la columna cargada negativamente. La columna que hace esto se llama columna de intercambio catiónico y, a menudo, utiliza residuos sulfonados. Del mismo modo, puede unir una proteína cargada negativamente a una columna de carga positiva. La columna que hace esto se llama columna de intercambio aniónico y, a menudo, utiliza residuos de amonio cuaternario.

Salar liberará, o eluirá, su proteína de la columna. Esta técnica utiliza una solución de alta concentración de sal. La solución salina competirá con la proteína en la unión a la columna. En otras palabras, la columna tiene una mayor atracción por la carga de sales que por la proteína cargada, y liberará la proteína a favor de unir las sales. Las proteínas con interacciones iónicas más débiles eluirán con menos sal, por lo que a menudo querrá eluir con un gradiente de sal. Diferentes proteínas eluyen a diferentes concentraciones de sal, por lo que querrá estar seguro de conocer bien las propiedades de sus proteínas para obtener los mejores resultados.

También tenga en cuenta que los cambios de pH alteran las cargas de las proteínas. Asegúrese de conocer el punto isoeléctrico de su proteína (el punto isoeléctrico es el pH al que la carga de una proteína es cero) y asegúrese de que el pH de su sistema esté ajustado y amortiguado en consecuencia.

Los pasos básicos para usar una columna de intercambio iónico son:

1. Prepara la columna. Vierta su tampón sobre la columna para asegurarse de que se haya equilibrado con el pH requerido.

2. Cargue su solución de proteína. Algunas proteínas de la solución no se unen y eluirán durante esta fase de carga.

3. Sal. Aumente la concentración de sal para eluir las proteínas unidas. Es mejor usar un gradiente de sal para eluir gradualmente proteínas con diferentes fuerzas iónicas. Al final, golpee el sistema con una concentración de sal muy alta (2-3 M) para asegurarse de que todas las proteínas estén fuera de la columna.

4. Quite las sales. Use diálisis para eliminar las sales de su solución de proteína.

La temperatura no tiene un gran efecto en la química de la columna. Sin embargo, es mejor trabajar en frío ya que las proteínas son más estables en frío.

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cuando la cromatografía de intercambio iónico se basa en las cargas de las proteínas para aislarlas, la cromatografía de interacción hidrófoba utiliza las propiedades hidrófobas de algunas proteínas. Los grupos hidrófobos de la proteína se unen a los grupos hidrófobos de la columna. Cuanto más hidrófoba sea una proteína, más fuerte se unirá a la columna.

Cargue las proteínas en presencia de una alta concentración de sulfato de amonio (no amonio porsulfato). El sulfato de amonio es un agente caotrópico. Aumenta el caos (entropía) en el agua y, por lo tanto, aumenta las interacciones hidrofóbicas (cuanto más desordenada está el agua, más fuertes son las interacciones hidrofóbicas). El sulfato de amonio también estabiliza las proteínas. Entonces, como resultado de usar una columna HIC, puede esperar que su proteína esté en su forma más estable.

La columna hidrófoba está empaquetada con una matriz de fenil agarosa. En presencia de altas concentraciones de sal, los grupos fenilo de esta matriz se unen a porciones hidrófobas de proteínas. Puede controlar la elución de diferentes proteínas unidas a la columna reduciendo la concentración de sal o añadiendo disolventes.

Cromatografía de afinidad.

La cromatografía de afinidad se basa en las funciones biológicas de una proteína para unirla a una columna. El tipo más común involucra un ligando, una pequeña biomolécula específica. Esta pequeña molécula se inmoviliza y se une a una matriz de columna, como celulosa o poliacrilamida. Luego, la proteína objetivo pasa a través de la columna y se une a ella mediante su ligando, mientras que otras proteínas eluyen. La elución de la proteína objetivo se realiza generalmente pasando a través de la columna una solución que tiene una alta concentración de ligando libre. Este es un método de purificación muy eficaz, ya que se basa en la especificidad biológica de su proteína objetivo, como la afinidad de una enzima por un sustrato.

Cromatografía de filtración en gel (exclusión de tamaño) d

La filtración en gel, o la cromatografía de exclusión por tamaño, separa las proteínas en función de su tamaño. La columna está empaquetada con una matriz de perlas porosas finas.

Funciona como un colador, pero al revés. Las cuentas tienen agujeros muy pequeños. A medida que se vierte la solución de proteína en la columna, pequeñas moléculas entran en los poros de las perlas. Las moléculas más grandes se excluyen de los orificios y pasan rápidamente entre las perlas.

Estas moléculas más grandes se eluyen primero. Las moléculas más pequeñas tienen un camino más largo para viajar, ya que se atascan una y otra vez en el laberinto de poros que van de una cuenta a otra. Estas moléculas más pequeñas, por lo tanto, tardan más en abrirse camino a través de la columna y son eluidas en último lugar.


Purificación de proteínas marcadas con polihistidina

Purificación rápida de proteínas marcadas con polihistidina utilizando resinas magnéticas

Existe una necesidad creciente de métodos de purificación de proteínas de alto rendimiento. Las resinas magnéticas permiten la purificación de proteínas etiquetadas por afinidad sin la necesidad de múltiples pasos de centrifugación y transferencia secuencial de muestras a múltiples tubos. Hay varios criterios que definen una buena resina de purificación de proteínas: mínima unión a proteína inespecífica, alta capacidad de unión para la proteína de fusión y recuperación eficiente de la proteína de fusión. El sistema de purificación de proteínas MagneHis ™ cumple con estos criterios, lo que permite la purificación de proteínas con una amplia gama de pesos moleculares y diferentes niveles de expresión. La naturaleza magnética de las partículas de unión permite que la purificación a partir de lisados ​​brutos se realice en un solo tubo. Además, el sistema se puede utilizar con plataformas automatizadas de manipulación de líquidos para aplicaciones de alto rendimiento.

Sistema de purificación de proteínas MagneHis ™

El sistema de purificación de proteínas MagneHis ™ utiliza partículas de níquel precargadas paramagnéticas (partículas de Ni MagneHis ™) para aislar la proteína etiquetada con polihistidina directamente de un lisado celular crudo. La figura 2 muestra un diagrama esquemático del protocolo del sistema de purificación de proteínas MagneHis ™.La proteína marcada con polihistidina se puede purificar a pequeña escala utilizando menos de 1 ml de cultivo o a gran escala utilizando más de 1 litro de cultivo. Las muestras se pueden procesar con un alto rendimiento utilizando una plataforma robótica como el instrumento Beckman Coulter Biomek® FX o Tecan Freedom EVO®. Las proteínas marcadas con polihistidina se pueden purificar en condiciones nativas o desnaturalizantes (urea 2-8 M o guanidina-HCl). La presencia de suero en el medio de cultivo de células de mamíferos e insectos no interfiere con la purificación. Para obtener más información y un protocolo detallado, consulte el Manual técnico n.º TM060 y el Protocolo automatizado del sistema de purificación de proteínas MagneHis ™.

Figura 2. Diagrama del protocolo del sistema de purificación de proteínas MagneHis ™.

Protocolo: Purificación MagneHis ™ de proteínas expresadas en células bacterianas

Materiales necesarios:
    y protocolo
  • Incubadora a 37 ° C para matraces o tubos
  • criba vibradora
  • soporte de separación magnética
  • Solución de imidazol 1 M (pH 8,0 para purificación a partir de células de insectos o mamíferos o medio de cultivo)
  • tampón de unión / lavado adicional (puede ser necesario si se procesan numerosas muestras de células de insectos, células de mamíferos o medios de cultivo)
  • NaCl sólido (para la purificación a partir de células o medio de cultivo de insectos o mamíferos)

Purificación mediante condiciones desnaturalizantes. Las proteínas expresadas en células bacterianas pueden estar presentes en cuerpos de inclusión insolubles. Para determinar si su proteína se encuentra en un cuerpo de inclusión, realice el paso de lisis usando el Reactivo de Lisis Celular FastBreak ™, 10X, como se describe en el Manual Técnico # TM060. Se sedimentan los restos celulares mediante centrifugación y se comprueba el sobrenadante y el sedimento para detectar la proteína etiquetada con polihistidina mediante análisis en gel.

La purificación eficaz de proteínas insolubles requiere condiciones desnaturalizantes. Dado que la interacción de las proteínas de fusión etiquetadas con polihistidina y las partículas de Ni MagneHis ™ no depende de la estructura terciaria, las proteínas de fusión se pueden capturar y purificar usando condiciones desnaturalizantes agregando un desnaturalizante fuerte como clorhidrato de guanidina 2-8 M o urea a las células. Se deben utilizar condiciones desnaturalizantes durante todo el procedimiento para que las proteínas no se agreguen. Recomendamos preparar tampones desnaturalizantes agregando guanidina-HCl sólida o urea directamente a los tampones de unión / lavado y elución MagneHis ™. Para obtener más información, consulte el Manual técnico n. ° TM060.

Nota: No combine el reactivo de lisis celular FastBreak ™ y desnaturalizantes. Las células se pueden lisar directamente usando desnaturalizantes como urea o guanidina-HCl.

Purificación de células de insectos y mamíferos. Procese las células a una densidad celular de 2 x 10 6 células / ml de cultivo. Las células adherentes pueden eliminarse del recipiente de cultivo de tejidos raspando y resuspendiendo en medio de cultivo hasta esta densidad. Las células se pueden procesar en un medio de cultivo que contenga hasta un 10% de suero. Procesar más del número indicado de células por mililitro de muestra puede resultar en una reducción del rendimiento de proteínas y un aumento de la unión inespecífica. Para las proteínas que se secretan en el medio de cultivo celular, retire las células del medio antes de la purificación. Para obtener más información, consulte el Manual técnico n. ° TM060.

Protocolos del sistema MagneHis ™

Más información y protocolos detallados para el uso del sistema MagneHis ™ están disponibles en el Manual técnico # TM060. También está disponible un protocolo para automatizar el sistema MagneHis ™ en manipuladores de líquidos (# EP011).

Protocolo: Purificación MagZ & trade de proteínas expresadas en lisado de reticulocitos

La purificación de una proteína marcada con polihistidina que se expresa en lisado de reticulocitos de conejo se complica por la copurificación de hemoglobina en el lisado y la proteína de interés. La copurificación de hemoglobina limita las aplicaciones posteriores (por ejemplo, ensayos funcionales basados ​​en fluorescencia, estudios de interacción proteína: proteína) y reduce la cantidad de proteína purificada. El sistema de purificación de proteínas MagZ & trade proporciona un método simple, rápido y confiable para purificar la proteína marcada con polihistidina expresada del lisado de reticulocitos de conejo con una copurificación mínima de hemoglobina. Las partículas de unión paramagnéticas, MagZ & trade precargadas se utilizan para aislar la proteína etiquetada con polihistidina de 50 & ndash500 & mul de lisado de reticulocitos de conejo T n T & reg, lo que da como resultado proteínas etiquetadas con polihistidina que están 99% libres de hemoglobina contaminante.

El sistema MagZ & trade es lo suficientemente flexible como para ser utilizado con diferentes métodos de etiquetado y detección. Las proteínas marcadas con polihistidina expresadas en lisado de reticulocitos de conejo se pueden marcar con metionina [35S] o con el sistema de etiquetado de traducción in vitro FluoroTect & trade GreenLys. Las proteínas marcadas con polihistidina marcadas con colorante FluoroTect & trade pueden visualizarse mediante análisis en gel y analizarse con un instrumento FluorImager & reg. La figura 3 muestra un diagrama esquemático del protocolo del sistema de purificación de proteínas MagZ & trade. Para obtener más información y un protocolo detallado, consulte el boletín técnico n.º TB336.

Materiales necesarios:

Figura 3. Diagrama esquemático del sistema de purificación de proteínas MagZ ™. Una reacción de TnT® que expresa proteínas marcadas con polihistidina se diluye con MagZ ™ Binding / Wash Buffer y se agrega a MagZ ™ Particles. Las proteínas marcadas con polihistidina se unen a las partículas durante la incubación y luego se lavan para eliminar las proteínas no unidas y no unidas específicamente.

Protocolo del sistema MagZ ™

Más información y un protocolo detallado para el uso del sistema MagZ & trade están disponibles en el Manual técnico # TM336.

Purificación de mediana a gran escala de proteínas marcadas con polihistidina en formatos de columna o lote

Los dos materiales de soporte más comunes para la purificación de proteínas marcadas por afinidad a base de resina son la agarosa y el gel de sílice. Como soporte cromatográfico, la sílice es ventajosa porque tiene una estructura mecánica rígida que no es vulnerable al hinchamiento y puede soportar grandes cambios de presión y caudal sin desintegrarse o deformarse. La sílice está disponible en una amplia gama de tamaños de partículas y poros, incluida la sílice macroporosa, que proporciona una mayor capacidad para biomoléculas grandes como las proteínas. Sin embargo, dos de los inconvenientes de la sílice como soporte sólido para la purificación por afinidad son la limitada química de los reactivos que está disponible y la eficacia relativamente baja de la modificación de la superficie.

La resina de purificación de proteínas HisLink ™ (Cat. # V8821, V8823) supera estas limitaciones mediante el uso de un nuevo proceso de modificación para las superficies de sílice que proporciona un soporte sólido tetradentado con quelado metálico con una alta capacidad de unión y elimina concomitantemente la unión inespecífica que es característica de sílice sin modificar. HisLink ™ Resin es una resina de sílice macroporosa modificada para contener un alto nivel de níquel quelado tetradentado (& gt20 mmol de Ni / ml de resina sedimentada). La Figura 4 muestra un diagrama esquemático de la interacción entre la resina HisLink ™ y la etiqueta de polihistidina. La resina HisLink ™ tiene un tamaño de poro que da como resultado capacidades de unión de hasta 35 mg de proteína etiquetada con polihistidina por mililitro de resina.

La resina HisLink ™ permite la captura y purificación eficientes de proteínas etiquetadas con polihistidina expresadas en bacterias. Esta resina también se puede utilizar para aplicaciones generales que requieren una matriz de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) (Porath et al. 1975 Lonnerdal y Keen, 1982). HisLink ™ Resin se puede utilizar en formatos de purificación en columna o en lotes. Para obtener un protocolo detallado, consulte el boletín técnico n.º TB327.

Figura 4. Diagrama esquemático de la interacción de la resina HisLink ™ y la polihistidina. Hay dos sitios disponibles para la unión de etiquetas con polihistidina y se coordinan rápidamente con histidina en presencia de un polipéptido etiquetado con polihistidina.

Purificación basada en columnas con resina HisLink ™

La resina HisLink ™ proporciona un medio convencional para purificar proteínas etiquetadas con polihistidina y solo requiere una columna que pueda empaquetarse al volumen de lecho apropiado. Cuando se empaqueta a 1 ml bajo flujo impulsado por gravedad, la resina HisLink ™ muestra un caudal promedio de aproximadamente 1 ml / minuto. En general, una velocidad de flujo de 1 a 2 ml / minuto por mililitro de resina es óptima para la captura eficiente de proteínas marcadas con polihistidina. El flujo por gravedad de un lisado aclarado sobre una columna HisLink ™ dará como resultado una captura completa y una elución eficiente de las proteínas etiquetadas con polihistidina; sin embargo, la resina también se puede usar con dispositivos de filtración al vacío (p. Ej., Vac-Man® Vacuum Manifold, Cat. # A7231 ) para permitir el procesamiento simultáneo de varias columnas. HisLink ™ Resin también es una excelente opción para la purificación por afinidad utilizando sistemas de cromatografía líquida de presión baja a media, como la cromatografía líquida de rendimiento rápido (FPLC).

Ejemplo de protocolo que utiliza la resina HisLink ™ para purificar proteínas del lisado depurado mediante cromatografía en columna de flujo por gravedad

Materiales necesarios:

  • Resina purificadora de proteínas HisLink ™ (Cat. # V8821) y protocolo
  • Tampón HEPES (pH 7,5)
  • imidazol
  • Tampón de unión HisLink ™
  • Tampón de lavado HisLink ™
  • Tampón de elución HisLink ™
  • columna

Lisis celular: Las células se pueden lisar usando cualquier número de métodos que incluyen sonicación, prensa francesa, molienda de perlas, tratamiento con enzimas líticas (p. Ej., Lisozima) o el uso de un reactivo de lisis celular disponible comercialmente como el reactivo de lisis celular FastBreak ™ (Cat. # V8571) . Si se usa lisozima para preparar un lisado, agregue sal (& gt300 mM NaCl) a los tampones de unión y lavado para evitar que la lisozima se una a la resina. La adición de inhibidores de proteasa como PMSF 1 mM a los lisados ​​celulares no inhibe la unión o elución de proteínas marcadas con polihistidina con la resina HisLink ™ y es muy recomendable para prevenir la degradación de la proteína de interés por proteasas endógenas. Cuando se preparan lisados ​​celulares a partir de cultivos de alta densidad, la adición de DNasa y RNasa (concentraciones de hasta 20 μg / ml) reducirá la viscosidad del lisado y ayudará a la purificación.

  1. Prepare los tampones de unión, lavado y elución HisLink ™
    Nota: Las proteínas marcadas con polihistidina pueden eluirse con imidazol 250-1 000 mM. Las etiquetas de polihistidina que contienen menos de seis histidinas normalmente requieren menos imidazol para la elución, mientras que las proteínas de polihistidina que contienen más de seis polihistidinas pueden requerir niveles más altos de imidazol.
  2. Determine el volumen de columna necesario para purificar la proteína de interés. En la mayoría de los casos, 1 ml de resina sedimentada es suficiente para purificar la cantidad de proteína que se encuentra típicamente en hasta 1 litro de cultivo (densidad celular de 600 y lt 6,0). En casos de niveles de expresión muy altos (por ejemplo, 50 mg de proteína / litro), pueden ser necesarios hasta 2 ml de resina por litro de cultivo.
  3. Una vez que haya determinado el volumen de resina sedimentada requerido, precalibre esta cantidad directamente en la columna pipeteando el volumen equivalente de agua en la columna y marcando la columna para indicar la parte superior del agua. Esta marca indica la parte superior del lecho de resina asentado. Retire el agua antes de agregar resina a la columna.
  4. Asegúrese de que la resina esté completamente suspendida, llene la columna con resina hasta la línea marcada en la columna transfiriendo la resina con una pipeta. Deje que la resina se asiente y ajuste el nivel de resina agregando o quitando resina según sea necesario.
    Nota: Si la resina no se pipetea dentro de los 10 a 15 segundos posteriores a la mezcla, se producirá una sedimentación significativa y será necesario resuspender la resina. Alternativamente, se puede usar una barra de agitación magnética para mantener la resina en suspensión durante la transferencia. Para evitar fracturar la resina, no deje que la resina se agite más tiempo del requerido para pipetear y transferir la resina.
  5. Deje que la columna se drene y equilibre la resina con cinco volúmenes de columna de tampón de unión, permitiendo que el tampón entre por completo en el lecho de resina.
  6. Agregue suavemente el lisado aclarado a la resina hasta que el lisado haya entrado completamente en la columna. La velocidad de flujo a través de la columna no debe exceder de 1 a 2 ml / minuto por cada 1 ml de volumen de columna. En condiciones normales de flujo por gravedad, la velocidad suele ser de aproximadamente 1 ml / minuto. El caudal real dependerá del tipo de columna utilizada y de la medida en que se depuró y filtró el lisado. No deje que la resina se seque después de haber aplicado el lisado a la columna.
  7. Lave las proteínas no unidas de la resina utilizando al menos 10-20 volúmenes de columna de tampón de lavado. Divida el volumen total de tampón de lavado en dos o tres alícuotas y permita que cada alícuota entre completamente en el lecho de resina antes de agregar la siguiente alícuota.
  8. Una vez que el tampón de lavado haya entrado completamente en el lecho de resina, agregue el tampón de elución y comience a recolectar fracciones (fracciones de 0,5 a 5 ml). Los perfiles de elución dependen de las proteínas, pero las proteínas marcadas con polihistidina generalmente eluirán en el primer ml. La elución suele completarse después de recolectar 3-5 ml de tampón por cada 1,0 ml de resina sedimentada, siempre que la concentración de imidazol sea lo suficientemente alta como para eluir eficazmente la proteína de interés.

Purificación de proteínas por lotes con resina HisLink ™

Una de las principales ventajas de la resina HisLink ™ es su uso en la purificación por lotes. En el modo por lotes, la proteína de interés se une a la resina mezclando el lisado con la resina durante aproximadamente 30 minutos en un rango de temperatura de 4–22 ° C. Una vez unida a la proteína, se deja que la resina se asiente en el fondo del recipiente y se retira el lisado gastado. El lavado requiere solo resuspensión de la resina en un tampón de lavado apropiado seguido de un breve período para permitir que la resina se asiente. A continuación, se vierte cuidadosamente el tampón de lavado. Este proceso se repite tantas veces como se desee. La elución final se logra mejor transfiriendo la resina HisLink ™ a una columna para eluir la proteína en fracciones. Las ventajas de la purificación por lotes son: 1) se requiere menos tiempo para realizar la purificación 2) se pueden procesar grandes cantidades de lisado y 3) no se requiere aclarar el lisado antes de la purificación.

Purificación de proteínas marcadas con polihistidina por FPLC

La estructura de partículas rígidas de la base de sílice utilizada en la resina HisLink ™ hace que este material sea una excelente opción para aplicaciones que requieren presión aplicada para cargar el lisado, lavar o eluir la proteína de la resina. Estas aplicaciones involucran sistemas manuales y automatizados que operan bajo presión positiva o negativa (por ejemplo, FPLC y sistemas de vacío, respectivamente). Para demostrar el uso de HisLink ™ Resin en una plataforma automatizada, utilizamos un explorador AKTA de GE Healthcare para purificar cantidades de miligramos de proteína etiquetada con polihistidina de 1 litro de cultivo. El cultivo se lisó en 20 ml de tampón de unión / lavado y se cargó en una columna que contenía 1 ml de resina HisLink ™. Estimamos que la cantidad total de proteína recuperada es del 75 al 90% de la proteína expresada en el lisado original.

Purificación de proteínas en condiciones desnaturalizantes: Las proteínas que se expresan como un cuerpo de inclusión y se han solubilizado con agentes caotróficos como guanidina-HCl o urea se pueden purificar modificando el protocolo para incluir la cantidad apropiada de desnaturalizante (hasta 6 M de guanidina-HCl o hasta 8 M de urea) en los tampones de unión, lavado y elución.

HisLink ™ Resin se puede utilizar en formatos de purificación en columna o en lotes. Para obtener un protocolo detallado, consulte el boletín técnico n.º TB327.


Etiqueta RAP: un nuevo enfoque de purificación de proteínas

Ya sea en nuestras dietas, para fortalecernos o como parte de los avances médicos, no es ningún secreto que las proteínas forman una parte importante de nuestras vidas. El seguimiento de cómo funcionan y se mueven las proteínas en las células y la purificación de proteínas modificadas son herramientas importantes para los investigadores. Los enfoques tradicionales para etiquetar proteínas de interés, llamados "etiquetado", tienen la desventaja de interferir con las características de las proteínas, incluida la función y la localización. A veces, estas etiquetas también pueden tener reacciones cruzadas, lo que hace que la información que proporcionan no sea específica. Un sistema de marcado de proteínas exitoso debe ser altamente específico y tener una alta afinidad.

En un estudio publicado en septiembre de 2020 en Frontiers in Plant Science, investigadores de la Universidad de Tsukuba, dirigidos por el profesor Kenji Miura, han descrito un nuevo sistema de marcado para detectar y purificar proteínas en células vegetales. Este enfoque utiliza una secuencia corta llamada "etiqueta RAP" para marcar proteínas. Entonces, un anticuerpo, PMab-2, puede reconocer específicamente la etiqueta RAP y puede usarse para purificar las proteínas de interés.

Al describir este enfoque, el profesor Miura dice: "La alta afinidad y especificidad de la cromatografía de inmunoafinidad que utiliza anticuerpos monoclonales la convierte en una herramienta muy poderosa, especialmente para la purificación de proteínas expresadas en niveles bajos". Sin embargo, un obstáculo para la aplicación de este enfoque es el alto costo de los reactivos, especialmente el de los anticuerpos.

Para evitar esto, el profesor Miura y sus colegas exploraron si podían producir el anticuerpo PMab-2 en el modelo de planta Nicotiana benthamiana, un pariente de la planta de tabaco. No solo pudieron producir con éxito PMab-2, sino que también demostraron que el PMab-2 producido por plantas se comportaba de manera similar al producido en células animales. Este descubrimiento abre la puerta a la reducción del costo de producción de anticuerpos y podría aplicarse de manera más amplia en todos los campos científicos.

Al probar la viabilidad de un enfoque de purificación por afinidad con RAP / PMab-2, los investigadores luego expresaron proteínas etiquetadas con RAP en células vegetales. Descubrieron que estas proteínas etiquetadas podían identificarse específicamente utilizando el anticuerpo PMab-2. Además, las proteínas recombinantes etiquetadas con RAP, que implican la fusión de secuencias de más de una proteína, y los complejos de proteínas también se expresaron en estas células y se identificaron mediante PMab-2. Estas proteínas también podrían purificarse a partir de células vegetales usando el anticuerpo PMab-2, lo que indica que la etiqueta RAP se puede usar tanto para la detección de proteínas como para la purificación de extractos vegetales solubles.

"Las plantas son un recurso extremadamente valioso para la biología molecular", explica el profesor Miura. "Se pueden usar como biorreactores para producir grandes cantidades de proteínas porque es poco probable que sufran problemas de contaminación que enfrentan los sistemas celulares de bacterias y mamíferos".

Los resultados presentados por el equipo muestran que este enfoque tiene el potencial de aplicarse ampliamente en las ciencias moleculares.


4.1: Purificación de proteínas - Biología

Extracción de proteínas bacterianas - mini escala - Sonicación

1) Resuspenda el sedimento de 10 ml de cultivo celular en 1 ml de tampón de lisis (o 100 ml de cultivo bacteriano para niveles de expresión muy bajos).

Tampón de lisis sugerido : 140 mM NaCl 2,7 mM KCL 10 mM Na2HPO4 1.8 mM KH2correos4 pH 7.3 (PBS)
o NaCl 100 mM TrisHCl 25 mM pH 8,0
opcional 0.02% NaN3 (azida)
inhibidores de proteasa opcionales

Aditivos opcionales para el tampón de lisis
a) PMSF 1 mM o cóctel de inhibidor de proteasa 1: 200 (cóctel para células bacterianas # P-8849 de Sigma)
b) Dnasa 100U / ml o 25-50 ug / ml (SIGMA DN-25). Incubar 10 min 4 & degC en presencia de 10mMMgCl2.
c) Lisozima 0,2 mg / ml. Incubar 10 min 4 ° C.
d) & szligME, DTT o DTE hasta 10 mM para proteínas con muchas cisteínas.
e) 0,1-2% de Triton X-100, NP40 o cualquier otro detergente que no afecte la actividad biológica de su proteína.
f) Glicerol al 10% (para estabilizar la proteína y prevenir la agregación).

2) Someter a ultrasonidos en una cubeta de hielo 3 x 10 segundos o más si las células no se rompen por completo (la lisis se completa cuando la suspensión celular turbia se vuelve translúcida. Evite la desnaturalización de las proteínas mediante la formación de espuma).

3) Girar 5 min 13000 rpm 4 ° C. Separe las proteínas solubles (sobrenadante) de las proteínas insolubles o de cuerpos de inclusión (sedimento).Utilice el sobrenadante para el siguiente paso. Conserve una muestra de 40 ul de sobrenadante para PAGE-SDS y Western blot: proteínas solubles

4) Resuspenda el sedimento en otro tampón de lisis de 1 ml y conserve una muestra de 40 ul para PAGE-SDS y Western blot: proteínas insolubles o células no lisadas .


Tecnologías de descubrimiento de fármacos

3.19.7.3 Paso de captura con etiquetas de afinidad

En la última década, se ha descrito una amplia variedad de proteínas de fusión o péptidos para la purificación y detección simplificada de proteínas. El compañero de fusión está codificado en el plásmido o ADN viral y está unido terminalmente C o N a la proteína de interés. Para etiquetas de fusión más grandes, se considera que la introducción de un sitio de escisión de proteasa apropiado entre la proteína de fusión y la proteína de interés elimina la etiqueta antes de la cristalización. La eliminación cuidadosa de la proteasa antes de comenzar los experimentos de cristalización es muy importante para evitar la escisión de la proteína de interés durante el procedimiento de cristalización.

Plásmidos que contienen ADN que codifica proteínas como el glutatión.S-transferasa, proteína de unión a maltosa 58,59, NusA, péptido de unión a calmodulina, inteína, tiorredoxina, proteína de unión a celulosa y fragmentos Fc de anticuerpos 17 están disponibles comercialmente, junto con las herramientas de purificación de proteínas adecuadas. Muchos de estos grandes socios de fusión aumentan la solubilidad de la proteína de fusión expresada (ver, por ejemplo, Kapust y Waugh 60). A veces, los socios de fusión simulan la solubilidad de la proteína expresada. Después de la eliminación de la etiqueta, la proteína de interés precipita irreversiblemente.

Las etiquetas de afinidad pequeñas, como Poly-His-tag y Strep-tag 61,62, se utilizan ampliamente ya que no cambian las propiedades de las proteínas y no es necesario escindirlas. Cuando se utilizan etiquetas Poly-His para la purificación de proteínas, se debe tener en cuenta que E. coli las cepas producen la proteína SlyD (20 kDa) que contiene un dominio de sitio de unión a metal potencial. Esta proteína se une estrechamente a la cromatografía de quelatos metálicos y, a menudo, se detecta como una banda de contaminación. 63

La cromatografía de etiquetas de afinidad se puede realizar en modo discontinuo, mediante dispositivos de filtro de jeringa o centrífuga, o en equipos cromatográficos con columnas preempaquetadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 58,62,64

En algunos casos, es necesaria la eliminación del agente de elución para mantener la estabilidad de la proteína: las proteínas de fusión del fragmento Fc se eluyen en condiciones ácidas extremas: el pH debe ajustarse a valores neutros inmediatamente después de la elución. El uso de imidazol en altas concentraciones en la elución de proteínas etiquetadas con Poly-His desestabiliza las proteínas y debe eliminarse mediante diálisis.


Contenido

La purificación de proteínas es preparativo o analítico. Purificaciones preparativas tienen como objetivo producir una cantidad relativamente grande de proteínas purificadas para su uso posterior. Los ejemplos incluyen la preparación de productos comerciales como enzimas (por ejemplo, lactasa), proteínas nutricionales (por ejemplo, aislado de proteína de soja) y ciertos productos biofarmacéuticos (por ejemplo, insulina). A menudo se implementan varios pasos de purificación preparativa para eliminar subproductos, como las proteínas de la célula huésped, que representan una amenaza potencial para la salud del paciente. [1] Purificación analítica produce una cantidad relativamente pequeña de una proteína para una variedad de propósitos analíticos o de investigación, incluida la identificación, cuantificación y estudios de la estructura, las modificaciones postraduccionales y la función de la proteína. La pepsina y la ureasa fueron las primeras proteínas que se purificaron hasta el punto de poder cristalizarlas. [2]

Extracción Editar

Si el organismo no secreta la proteína de interés en la solución circundante, el primer paso de cada proceso de purificación es la ruptura de las células que contienen la proteína. Dependiendo de cuán frágil sea la proteína y cuán estables sean las células, uno podría, por ejemplo, usar uno de los siguientes métodos: i) congelación y descongelación repetidas, ii) sonicación, iii) homogeneización por alta presión (prensa francesa), iv ) homogeneización por trituración (molino de perlas), yv) permeabilización por detergentes (por ejemplo, Triton X-100) y / o enzimas (por ejemplo, lisozima). [3] Finalmente, los restos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación para que las proteínas y otros compuestos solubles permanezcan en el sobrenadante.

También se liberan proteasas durante la lisis celular, que comenzarán a digerir las proteínas en la solución. Si la proteína de interés es sensible a la proteólisis, se recomienda proceder rápidamente y mantener el extracto frío para ralentizar la digestión. Alternativamente, se pueden añadir uno o más inhibidores de proteasa al tampón de lisis inmediatamente antes de la rotura celular. A veces también es necesario añadir ADNasa para reducir la viscosidad del lisado celular provocada por un alto contenido de ADN.

Precipitación y solubilización diferencial Editar

En la purificación de proteínas a granel, un primer paso común para aislar proteínas es la precipitación con sulfato de amonio (NH4)2ASI QUE4. [4] Esto se realiza agregando cantidades crecientes de sulfato de amonio y recolectando las diferentes fracciones de proteína precipitada. Posteriormente, el sulfato de amonio se puede eliminar mediante diálisis. Durante la etapa de precipitación con sulfato de amonio, los grupos hidrófobos presentes en las proteínas se exponen a la atmósfera, atrayendo otros grupos hidrófobos y el resultado es la formación de un agregado de componentes hidrófobos. En este caso, el precipitado de proteína normalmente será visible a simple vista. Una ventaja de este método es que se puede realizar de forma económica, incluso con volúmenes muy grandes.

Las primeras proteínas en purificarse son las proteínas solubles en agua. La purificación de proteínas integrales de la membrana requiere la rotura de la membrana celular para aislar una proteína en particular de otras que se encuentran en el mismo compartimento de la membrana. A veces, una fracción de membrana particular se puede aislar primero, como aislar las mitocondrias de las células antes de purificar una proteína ubicada en una membrana mitocondrial. Se puede usar un detergente como el dodecilsulfato de sodio (SDS) para disolver las membranas celulares y mantener las proteínas de la membrana en solución durante la purificación; sin embargo, debido a que el SDS causa la desnaturalización, se pueden usar detergentes más suaves como Triton X-100 o CHAPS para retener la proteína nativa. conformación durante la purificación completa.

Ultracentrifugación Editar

Centrifugación es un proceso que utiliza la fuerza centrífuga para separar mezclas de partículas de diferentes masas o densidades suspendidas en un líquido. Cuando un recipiente (típicamente un tubo o botella) que contiene una mezcla de proteínas u otra materia particulada, como células bacterianas, se gira a altas velocidades, la inercia de cada partícula produce una fuerza en la dirección de la velocidad de las partículas que es proporcional a su masa. La tendencia de una partícula dada a moverse a través del líquido debido a esta fuerza es compensada por la resistencia que el líquido ejerce sobre la partícula. El efecto neto de "hacer girar" la muestra en una centrífuga es que las partículas masivas, pequeñas y densas se mueven hacia afuera más rápido que las partículas menos masivas o las partículas con más "arrastre" en el líquido. Cuando se "centrifugan" suspensiones de partículas en una centrífuga, se puede formar un "gránulo" en el fondo del recipiente que está enriquecido para las partículas más masivas con bajo arrastre en el líquido.

Las partículas no compactadas permanecen mayoritariamente en el líquido denominado "sobrenadante" y pueden retirarse del recipiente separando así el sobrenadante del sedimento. La velocidad de centrifugación está determinada por la aceleración angular aplicada a la muestra, típicamente medida en comparación con la gramo. Si las muestras se centrifugan el tiempo suficiente, las partículas en el recipiente alcanzarán un equilibrio en el que las partículas se acumulan específicamente en un punto del recipiente donde su densidad de flotación se equilibra con la fuerza centrífuga. Tal centrifugación de "equilibrio" puede permitir una purificación extensa de una partícula determinada.

Centrifugación en gradiente de sacarosa: se genera un gradiente de concentración lineal de azúcar (típicamente sacarosa, glicerol o un medio de gradiente de densidad a base de sílice, como Percoll) en un tubo de manera que la concentración más alta se encuentra en la parte inferior y la más baja en la parte superior. Percoll es una marca comercial propiedad de las empresas GE Healthcare. Luego, se coloca una muestra de proteína en la parte superior del gradiente y se centrifuga a altas velocidades en una ultracentrífuga. Esto hace que las macromoléculas pesadas migren hacia el fondo del tubo más rápido que el material más liviano. Durante la centrifugación en ausencia de sacarosa, a medida que las partículas se alejan cada vez más del centro de rotación, experimentan cada vez más fuerza centrífuga (cuanto más se mueven, más rápido se mueven). El problema con esto es que el rango de separación útil dentro del recipiente está restringido a una pequeña ventana observable. Hacer girar una muestra el doble de tiempo no significa que la partícula de interés llegará el doble de lejos, de hecho, irá significativamente más lejos. Sin embargo, cuando las proteínas se mueven a través de un gradiente de sacarosa, encuentran líquido de densidad y viscosidad crecientes. Un gradiente de sacarosa diseñado adecuadamente contrarrestará el aumento de la fuerza centrífuga para que las partículas se muevan en proporción cercana al tiempo que han estado en el campo centrífugo. Las muestras separadas por estos gradientes se denominan centrifugaciones de "velocidad zonal". Después de separar la proteína / partículas, el gradiente se fracciona y se recoge.

La elección de un material de partida es clave para el diseño de un proceso de purificación. En una planta o animal, una proteína en particular generalmente no se distribuye de manera homogénea por todo el cuerpo, diferentes órganos o tejidos tienen concentraciones más altas o más bajas de la proteína. El uso de solo los tejidos u órganos con la concentración más alta disminuye los volúmenes necesarios para producir una cantidad determinada de proteína purificada. Si la proteína está presente en poca abundancia, o si tiene un valor alto, los científicos pueden usar tecnología de ADN recombinante para desarrollar células que producirán grandes cantidades de la proteína deseada (esto se conoce como sistema de expresión). La expresión recombinante permite marcar la proteína, p. Ej. mediante un His-tag [5] o Strep-tag [6] para facilitar la purificación, reduciendo el número de pasos de purificación necesarios.

Una purificación analítica generalmente utiliza tres propiedades para separar proteínas. Primero, las proteínas se pueden purificar de acuerdo con sus puntos isoeléctricos pasándolas por un gel graduado de pH o una columna de intercambio iónico. En segundo lugar, las proteínas pueden separarse según su tamaño o peso molecular mediante cromatografía de exclusión de tamaño o mediante análisis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio). Las proteínas a menudo se purifican utilizando 2D-PAGE y luego se analizan mediante huellas dactilares de la masa de péptidos para establecer la identidad de la proteína. Esto es muy útil para fines científicos y los límites de detección de proteínas son hoy en día muy bajos y cantidades de nanogramos de proteína son suficientes para su análisis. En tercer lugar, las proteínas pueden separarse por polaridad / hidrofobicidad mediante cromatografía líquida de alta resolución o cromatografía de fase inversa.

Por lo general, un protocolo de purificación de proteínas contiene uno o más pasos cromatográficos. El procedimiento básico en cromatografía es hacer fluir la solución que contiene la proteína a través de una columna llena de varios materiales. Diferentes proteínas interactúan de manera diferente con el material de la columna y, por lo tanto, pueden separarse por el tiempo requerido para pasar la columna o las condiciones requeridas para eluir la proteína de la columna. Por lo general, las proteínas se detectan a medida que salen de la columna por su absorbancia a 280 nm. Existen muchos métodos cromatográficos diferentes:

Cromatografía de exclusión de tamaño Editar

La cromatografía se puede utilizar para separar proteínas en solución o en condiciones de desnaturalización utilizando geles porosos. Esta técnica se conoce como cromatografía de exclusión por tamaño. El principio es que las moléculas más pequeñas tienen que atravesar un volumen mayor en una matriz porosa. Consecuentemente, las proteínas de un cierto rango de tamaño requerirán un volumen variable de eluyente (solvente) antes de ser recolectadas en el otro extremo de la columna de gel.

En el contexto de la purificación de proteínas, el eluyente suele mezclarse en diferentes tubos de ensayo. Se descartan todos los tubos de ensayo que no contienen trazas mensurables de la proteína a purificar. La solución restante está formada por la proteína a purificar y cualquier otra proteína de tamaño similar.

Separación basada en carga o hidrofobicidad Editar

Cromatografía de interacción hidrofóbica Editar

El medio HIC es anfifílico, con regiones hidrofóbicas e hidrofílicas, lo que permite la separación de proteínas en función de su hidrofobicidad superficial. Las proteínas diana y sus especies agregadas de productos tienden a tener diferentes propiedades hidrófobas y eliminarlas a través de HIC purifica aún más la proteína de interés. [7] Además, el entorno utilizado normalmente emplea condiciones de desnaturalización menos duras que otras técnicas de cromatografía, lo que ayuda a preservar la proteína de interés en su estado nativo y funcional. En agua pura, las interacciones entre la resina y las regiones hidrófobas de la proteína serían muy débiles, pero esta interacción se mejora aplicando una muestra de proteína a la resina HIC en un tampón de alta fuerza iónica. La fuerza iónica del tampón se reduce luego para eluir proteínas en orden de hidrofobicidad decreciente. [8]

Cromatografía de intercambio iónico Editar

La cromatografía de intercambio iónico separa los compuestos según la naturaleza y el grado de su carga iónica. La columna a utilizar se selecciona según su tipo y fuerza de carga. Las resinas de intercambio aniónico tienen una carga positiva y se utilizan para retener y separar compuestos con carga negativa (aniones), mientras que las resinas de intercambio catiónico tienen una carga negativa y se utilizan para separar moléculas con carga positiva (cationes).

Antes de que comience la separación, se bombea un tampón a través de la columna para equilibrar los iones cargados opuestos. Tras la inyección de la muestra, las moléculas de soluto se intercambiarán con los iones tampón a medida que cada uno compita por los sitios de unión en la resina. La duración de la retención de cada soluto depende de la fuerza de su carga. Los compuestos con carga más débil eluirán primero, seguidos por aquellos con cargas sucesivamente más fuertes. Debido a la naturaleza del mecanismo de separación, el pH, el tipo de tampón, la concentración de tampón y la temperatura juegan papeles importantes en el control de la separación.

La cromatografía de intercambio iónico es una herramienta muy poderosa para su uso en la purificación de proteínas y se utiliza con frecuencia en separaciones analíticas y preparativas.

Electroforesis de flujo libre Editar

La electroforesis de flujo libre (FFE) es una técnica de electroforesis sin portadores que permite la separación preparativa de proteínas en una corriente tampón laminar mediante el uso de un campo eléctrico ortogonal. Haciendo uso de un gradiente de pH, que puede ser inducido por ejemplo por anfolitos, esta técnica permite separar isoformas de proteínas hasta una resolución de & lt 0.02 delta-pI.

Cromatografía de afinidad Editar

La cromatografía de afinidad es una técnica de separación basada en la conformación molecular, que con frecuencia utiliza resinas específicas para aplicaciones. Estas resinas tienen ligandos unidos a sus superficies que son específicos para los compuestos que se van a separar. Con mayor frecuencia, estos ligandos funcionan de manera similar a la de las interacciones anticuerpo-antígeno. Este ajuste de "cerradura y llave" entre el ligando y su compuesto objetivo lo hace altamente específico, generando con frecuencia un solo pico, mientras que todo lo demás en la muestra no se retiene.

Muchas proteínas de membrana son glicoproteínas y pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad de lectinas. Se puede permitir que las proteínas solubilizadas con detergente se unan a una resina de cromatografía que ha sido modificada para tener una lectina unida covalentemente. Las proteínas que no se unen a la lectina se eliminan por lavado y luego las glicoproteínas unidas específicamente pueden eluirse añadiendo una alta concentración de un azúcar que compita con las glicoproteínas unidas en el sitio de unión de la lectina. Algunas lectinas tienen una unión de alta afinidad a los oligosacáridos de las glicoproteínas que es difícil de competir con los azúcares, y las glicoproteínas unidas deben liberarse desnaturalizando la lectina.

Cromatografía de inmunoafinidad Editar

La cromatografía de inmunoafinidad utiliza la unión específica de un anticuerpo-antígeno para purificar selectivamente la proteína diana. El procedimiento implica inmovilizar una proteína en un sustrato sólido (por ejemplo, una perla porosa o una membrana), que luego se une selectivamente al objetivo, mientras todo lo demás fluye a través. La proteína diana se puede eluir cambiando el pH o la salinidad. El ligando inmovilizado puede ser un anticuerpo (como la inmunoglobulina G) o puede ser una proteína (como la proteína A). Debido a que este método no implica la ingeniería en una etiqueta, se puede utilizar para proteínas de fuentes naturales. [9]

Purificación de una proteína etiquetada Editar

Otra forma de etiquetar proteínas es diseñar una etiqueta de péptido antigénico en la proteína y luego purificar la proteína en una columna o incubándola con una resina suelta que se recubre con un anticuerpo inmovilizado. Este procedimiento en particular se conoce como inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación es bastante capaz de generar una interacción extremadamente específica que normalmente da como resultado la unión sólo a la proteína deseada. Las proteínas etiquetadas purificadas pueden separarse fácilmente de las otras proteínas en solución y luego eluirse nuevamente en una solución limpia.

Cuando las etiquetas ya no se necesitan, una proteasa puede escindirlas. Esto a menudo implica diseñar un sitio de escisión de proteasa entre la etiqueta y la proteína.

HPLC Editar

La cromatografía líquida de alta resolución o cromatografía líquida de alta presión es una forma de cromatografía que aplica alta presión para impulsar los solutos a través de la columna más rápido. Esto significa que la difusión es limitada y se mejora la resolución. La forma más común es la HPLC de "fase inversa", en la que el material de la columna es hidrófobo. Las proteínas se eluyen mediante un gradiente de cantidades crecientes de un disolvente orgánico, como el acetonitrilo. Las proteínas eluyen según su hidrofobicidad. Después de la purificación por HPLC, la proteína se encuentra en una solución que solo contiene compuestos volátiles y puede liofilizarse fácilmente. [10] La purificación por HPLC frecuentemente da como resultado la desnaturalización de las proteínas purificadas y, por lo tanto, no es aplicable a proteínas que no se replegan espontáneamente.

Al final de una purificación de proteínas, la proteína a menudo debe concentrarse. Existen diferentes métodos.

Liofilización Editar

Si la solución no contiene ningún otro componente soluble que la proteína en cuestión, la proteína se puede liofilizar (secar). Esto se hace comúnmente después de una ejecución de HPLC. Esto simplemente elimina todos los componentes volátiles, dejando atrás las proteínas.

Ultrafiltración Editar

La ultrafiltración concentra una solución de proteína utilizando membranas permeables selectivas. La función de la membrana es dejar pasar el agua y las moléculas pequeñas mientras retienen la proteína. La solución se fuerza contra la membrana mediante una bomba mecánica, presión de gas o centrifugación.

El método más general para monitorear el proceso de purificación es ejecutar una SDS-PAGE de los diferentes pasos. Este método solo proporciona una medida aproximada de las cantidades de diferentes proteínas en la mezcla y no es capaz de distinguir entre proteínas con un peso molecular aparente similar.

Si la proteína tiene una característica espectroscópica distintiva o una actividad enzimática, esta propiedad se puede utilizar para detectar y cuantificar la proteína específica y, por lo tanto, seleccionar las fracciones de la separación que contiene la proteína. Si se dispone de anticuerpos contra la proteína, la transferencia Western y ELISA pueden detectar y cuantificar específicamente la cantidad de proteína deseada. Algunas proteínas funcionan como receptores y pueden detectarse durante las etapas de purificación mediante un ensayo de unión de ligando, a menudo usando un ligando radiactivo.

Para evaluar el proceso de purificación en varios pasos, la cantidad de proteína específica debe compararse con la cantidad de proteína total. Este último puede determinarse mediante el ensayo de proteína total de Bradford o mediante la absorbancia de luz a 280 nm; sin embargo, algunos reactivos utilizados durante el proceso de purificación pueden interferir con la cuantificación. Por ejemplo, el imidazol (comúnmente utilizado para la purificación de proteínas recombinantes etiquetadas con polihistidina) es un análogo de aminoácido y en concentraciones bajas interferirá con el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para la cuantificación de proteínas totales. Las impurezas en imidazol de bajo grado también se absorberán a 280 nm, lo que resultará en una lectura inexacta de la concentración de proteína de la absorbancia UV.

Otro método a considerar es la resonancia de plasma superficial (SPR). SPR puede detectar la unión de moléculas libres de etiquetas en la superficie de un chip. Si la proteína deseada es un anticuerpo, la unión puede traducirse directamente en la actividad de la proteína. Se puede expresar la concentración activa de la proteína como porcentaje de la proteína total. SPR puede ser un método poderoso para determinar rápidamente la actividad de las proteínas y el rendimiento general. Es una tecnología poderosa que requiere un instrumento para funcionar.

Electroforesis en condiciones desnaturalizantes Editar

La electroforesis en gel es una técnica de laboratorio común que se puede utilizar como método preparativo y analítico. El principio de electroforesis se basa en el movimiento de un ion cargado en un campo eléctrico. En la práctica, las proteínas se desnaturalizan en una solución que contiene un detergente (SDS). En estas condiciones, las proteínas se desdoblan y se recubren con moléculas de detergente cargadas negativamente. Las proteínas en SDS-PAGE se separan basándose únicamente en su tamaño.

En los métodos analíticos, la proteína migra como bandas según el tamaño. Cada banda se puede detectar utilizando tintes como el tinte azul de Coomassie o el tinte plateado. Los métodos preparativos para purificar grandes cantidades de proteína requieren la extracción de la proteína del gel electroforético. Esta extracción puede implicar la escisión del gel que contiene una banda o eluir la banda directamente del gel a medida que se escurre por el extremo del gel.

En el contexto de una estrategia de purificación, la electroforesis en condiciones de desnaturalización proporciona una resolución mejorada con respecto a la cromatografía de exclusión por tamaño, pero no escala a una gran cantidad de proteínas en una muestra, así como a las columnas de cromatografía tardía.

Electroforesis en condiciones no desnaturalizantes Editar

Un procedimiento electroforético no desnaturalizante para aislar metaloproteínas bioactivas en mezclas de proteínas complejas es la PAGE nativa preparativa. La integridad o integridad estructural de la proteína aislada debe confirmarse mediante un método independiente. [11]


Descripción

Guide to Protein Purification, Second Edition proporciona una actualización completa de los métodos existentes en el campo, lo que refleja los enormes avances realizados en las últimas dos décadas. En particular, la proteómica, la espectrometría de masas y la tecnología del ADN han revolucionado el campo desde la publicación de la primera edición, pero a través de todos los avances, la purificación de proteínas sigue siendo un primer paso indispensable para comprender su función. Este volumen examina los métodos más fiables y sólidos para investigadores en bioquímica, biología molecular y celular, genética, farmacología y biotecnología y establece un estándar para las mejores prácticas en el campo. Relata cómo estos métodos de vanguardia tradicionales y nuevos se conectan con los avances explosivos en el campo. Esta "Guía para" brinda consejos prácticos inminentes para evitar errores costosos al elegir un método y ofrece una perspectiva de los principales investigadores al tiempo que presenta una descripción general completa del campo en la actualidad.


Ver el vídeo: Purificación de proteínas (Noviembre 2022).