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¿Cuánto tiempo se pueden almacenar las existencias de E. coli a -20 ° C?

¿Cuánto tiempo se pueden almacenar las existencias de E. coli a -20 ° C?


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Soy voluntario para un laboratorio de biohackers, biocurioso en Sunnyvale. Tienen un equipo bastante bueno: cajas de gel, incubadoras, pero todavía no tienen un congelador a -80 ° C.

Me gustaría configurar algunas reservas de glicerol de algunas cepas de E. coli, pero me han dicho que incluso las bacterias no transformadas (es decir, sin plásmido) se volverán raras después de un tiempo a -20 ° C. También sería bueno saber cuánto tiempo puede mantener una cepa transformada en plásmido a -20 ° C.

¿Alguien puede ser específico sobre lo que sucede y cuánto tiempo lleva almacenarlos a -20 ° C durante largos períodos de tiempo?

He hecho una pequeña lectura para las células competentes y supongo que permanecen activas durante unos 4 días sin un congelador a -80 ° C.


Gergana cubrió la parte del "por qué" de su pregunta. +1

Si todo lo que tiene en este momento es -20 ° C y sobre todo lo que desea almacenar es E. coli albergando plásmidos, recomendaría preparar ADN plasmídico y almacenarlo a -20 ° C. El ADN se mantendrá estable a medio plazo y podrá volver a transformarse en E. coli una vez que tenga su congelador a -80 ° C en funcionamiento. Y lo ideal es que desee tanto existencias de ADN como de bacterias a la mano; nunca se sabe cuándo se estropeará un congelador.

Para sus cepas no transformadas, puede hacer pinchazos de agar o placas para almacenar a 4 ° C. Los volvería a sembrar cada 1-2 semanas, los cultivaría durante la noche a 37 ° C y luego los volvería a colocar en el refrigerador.


Creo que las células se dañan a -20 ° C no porque estén almacenadas durante un largo período de tiempo, sino porque pasan por ciclos de descongelación y congelación (los cristales de hielo que se forman las dañan).

Nunca mantengo las células a -20 ° C. Los guardo a -80 ° C en 50% de glicerol. La idea detrás del glicerol es que sirve como crioprotector. Forma enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua y, por lo tanto, rompe los enlaces de hidrógeno agua-agua. Como resultado, interrumpe la formación de cristales de hielo y las células no se congelan. La temperatura de congelación del glicerol es de -37,8 ° C (60-70% de glicerol en agua), lo que significa que a -20 ° C el glicerol no se congela y, por lo tanto, no puede proteger a las células del daño causado por la formación de cristales de hielo.


Las respuestas ya publicadas acerca de que el glicerol es un crioprotector y los cristales de hielo son correctas. La otra cosa a considerar es que las enzimas aún retienen algo de actividad a -20 ° C y aunque la velocidad de reacción es más lenta, las células se degradarán hasta que ya no sean viables. Siempre guardo reservas de glicerol de bacterias a -80 ° C.

Muchas cepas comunes de E. Coli que se utilizan comercialmente para la clonación no están libres de proteasas y estas son las enzimas responsables de la degradación celular.


Una guía para la conservación de bacterias: refrigeración, congelación y liofilización

Para obtener información sobre los productos de conservación de OPS Diagnostics, visite nuestras páginas sobre tampón de liofilización microbiano, excipientes, viales de suero, suministros criogénicos y kit de congelación bacteriana.

Entre los cultivos madre, las cepas mutantes y las variantes modificadas por ingeniería genética, el número de cultivos bacterianos individuales que puede acumular cualquier laboratorio puede ser numeroso. De hecho, el número de variaciones creadas en el proceso de ingeniería de un plásmido puede ser asombroso. Y la mayoría de los laboratorios se aferrarán a todas esas y otras variaciones, ya que nunca sabrá lo que necesitará mañana. En consecuencia, la preservación de todos esos cultivos bacterianos y variantes genéticas es algo que debe abordarse con pensamiento.

Un cultivo bacteriano en un tubo tapado se encuentra en un ambiente cerrado. Aunque el cultivo puede comenzar sano, con el tiempo la cantidad de células viables disminuirá a cero. El objetivo de preservar los cultivos es reducir la tasa de muerte para que cuando se vuelva a visitar el cultivo, algunas de las células aún sean viables y estén disponibles para el cultivo. Las razones por las que las células mueren pueden ser numerosas, pero en todos los casos se basan en la química inherente de las células y su entorno. Si las reacciones químicas deletéreas pueden ralentizarse o detenerse, el cultivo en general seguirá siendo viable durante un período de tiempo más largo.

Hay dos enfoques básicos para ralentizar la tasa de reacciones deletéreas en un cultivo de bacterias. El primero es bajar la temperatura, lo que disminuye la velocidad de todas las reacciones químicas. Esto se puede hacer usando refrigeradores, congeladores mecánicos y congeladores de nitrógeno líquido. La segunda opción es eliminar el agua del cultivo, un proceso que puede ser complicado e implica la sublimación del agua con un liofilizador.

    • Almacenamiento de cultivos bacterianos a 4 ° C: protocolo sobre cómo refrigerar cultivos bacterianos.
    • Protocolo de congelación de bacterias en glicerol- Conservación de bacterias mediante congelación en glicerol.
    • Protocolo de liofilización de bacterias: se describen las consideraciones clave sobre cómo liofilizar cultivos bacterianos.

    A continuación se presenta una breve discusión de las principales opciones para preservar las bacterias. Se informan las fortalezas y debilidades de cada opción.

    Las bacterias pueden sobrevivir durante un corto período de tiempo a 4 ° C. Para las cepas que se utilizan diaria o semanalmente, los cultivos que se cultivan en placas o inclinaciones de agar se pueden almacenar en un refrigerador asumiendo que se han tomado precauciones para evitar la contaminación. Los cultivos deben prepararse utilizando técnicas estándar y luego sellarse antes de almacenar. Para inclinaciones, recomendamos utilizar tubos con tapón de rosca. Para cultivos en placas de Petri, las placas deben sellarse con Parafilm. Sellar las placas no solo ayuda a evitar que los mohos se cuelen en las placas, sino que también retrasa el secado del agar. Durante una semana o dos, los cultivos se pueden almacenar como pinchazos en viales pequeños con tapa de rosca de fondo plano. En esta técnica, los viales se llenan con una pequeña cantidad de medio de agar (por ejemplo, 1 ml) y se esterilizan. A continuación, se introducen las bacterias en el agar solidificado con una aguja estéril. El cultivo se incuba durante la noche con las tapas sueltas y luego se almacena a 4 ° C con las tapas ajustadas. Los cultivos almacenados en puñaladas son más resistentes al secado y la contaminación, pero perderán viabilidad más rápidamente que las existencias congeladas. El tiempo que una puñalada puede permanecer viable depende de la cepa. Algunos manuales afirman que las puñaladas son válidas durante un año, sin embargo, no es prudente hacer esa suposición a menos que se pruebe.

    La congelación es una buena forma de almacenar bacterias. Generalmente, cuanto más fría sea la temperatura de almacenamiento, más tiempo retendrá el cultivo las células viables. Los congeladores se pueden dividir en tres categorías: laboratorio, ultrabajo y criogénico. El problema al que se enfrentan las bacterias (y otras células) almacenadas en congeladores son los cristales de hielo. El hielo puede dañar las células por deshidratación causada por aumentos localizados en la concentración de sal. A medida que el agua se convierte en hielo, los solutos se acumulan en el agua libre residual y esta alta concentración de solutos puede desnaturalizar las biomoléculas. El hielo también puede romper las membranas, aunque este problema se asocia más a menudo con células que carecen de paredes, como las células animales cultivadas. Para disminuir los efectos negativos de la congelación, el glicerol se usa a menudo como crioprotector. Muchos peces e insectos producen glicerol para defenderse de las bajas temperaturas al reducir el punto de congelación de las células, mejorar el sobreenfriamiento y proteger contra el hielo. Con las bacterias, agregar glicerol a una concentración final del 15% ayudará a mantener las células viables en todas las condiciones de congelación (consulte este enlace para obtener un protocolo o este enlace para obtener un tubo de congelación listo para usar). Los siguientes son algunos detalles para cada categoría de congelador.

    Congeladores de laboratorio son aquellos que pueden bajar las temperaturas a -20 a -40 ° C. Estos son sistemas de una sola etapa (un compresor) y, a menudo, se denominan congeladores de uso general. Las bacterias se pueden almacenar durante períodos de tiempo moderados, por ejemplo, 1 año, en congeladores de uso general. Es mejor usar congeladores sin ciclos de temperatura sin escarcha, ya que esto puede causar estragos en las células y otras biomoléculas sensibles a la temperatura. Los congeladores de uso general son económicos y se encuentran en la mayoría de los laboratorios, por lo que están disponibles para almacenar cultivos. La desventaja es que no están lo suficientemente fríos para un almacenamiento prolongado.

    Congeladores ultrabajos son sistemas de dos etapas (dos compresores con un refrigerante diferente cada uno) que bajan a alrededor de -86 ° C. Los congeladores ultrabajos son muy frecuentes, pero el espacio en ellos a veces puede ser limitado y competitivo. Los congeladores ultrabajos también son mucho más costosos de comprar, operar y mantener. La ventaja es que las células almacenadas a -80 ° C tienden a permanecer viables durante varios años. La temperatura más baja generada por congeladores ultrabajos reduce sustancialmente las reacciones químicas dentro del cultivo. Sin embargo, el movimiento molecular todavía se produce en las células congeladas y, por tanto, la viabilidad del cultivo disminuirá. Es importante monitorear regularmente los cultivos para evaluar su nivel de viabilidad.

    Congeladores criogénicos Son muy fríos y dependen del nitrógeno líquido o de sistemas mecánicos especializados para funcionar. Para las muestras biológicas, el almacenamiento criogénico debe estar por debajo de -130 ° C. A esta temperatura, el movimiento molecular del agua se detiene y las células quedan atrapadas en una matriz similar al vidrio. Las bacterias almacenadas en congeladores criogénicos conservan su viabilidad durante muchos años. En nuestro laboratorio, los cultivos de bacterias y levaduras se han mantenido a -140 ° C durante 15 años sin una pérdida significativa de viabilidad. El almacenamiento de células en congeladores criogénicos es el método más eficaz y, en comparación con la liofilización, el método más sencillo para el almacenamiento a largo plazo. La desventaja es el costo y la vulnerabilidad potencial de las existencias a cortes de energía, fallas mecánicas y entregas fallidas de nitrógeno líquido. Además, los tubos nunca deben almacenarse en tanques sumergidos en nitrógeno líquido. Los tubos con tapón de rosca tienen fugas y arrastrarán el nitrógeno hacia el tubo junto con los contaminantes (consulte el enlace para obtener más información). Los congeladores de nitrógeno líquido en fase de vapor evitarán eficazmente este problema, pero estos congeladores son muy caros (más de $ 10K) y requieren grandes volúmenes de nitrógeno líquido. Una alternativa son los congeladores criogénicos mecánicos que pueden bajar hasta -150 ° C, pero también son muy costosos de comprar (alrededor de $ 20K). Ambos congeladores criogénicos costarán varios cientos de dólares al mes para operar.

    En un sistema acuoso, como una célula viva, el agua no solo sirve como medio para reacciones enzimáticas, sino también reacciones negativas espontáneas como la formación de radicales libres. La eliminación de agua detiene las reacciones enzimáticas y no enzimáticas. La liofilización es un método para eliminar esta agua. Muchas bacterias pueden conservarse de forma muy eficaz mediante la liofilización. Al congelar las células en un medio que contiene un lioprotector (generalmente sacarosa) y luego extraer el agua usando un vacío (sublimación), las células se pueden conservar de manera efectiva. Este método es laborioso y requiere equipo especializado, pero tiene la ventaja de generar cultivos madre que no se ven afectados por cortes de energía y tanques de nitrógeno líquido vacíos. Además, si los cultivos se envían habitualmente a otros laboratorios, los cultivos liofilizados no requieren una manipulación especial. La desventaja de la liofilización es que no todos los cultivos reaccionan de la misma manera, por lo que se requiere algo de experimentación para optimizar el proceso para cada cepa. Para cualquier laboratorio que se tome en serio la producción y el mantenimiento de una colección de cultivos, la liofilización debe incluirse como un método importante de conservación.

    Los detalles sobre las bacterias liofilizadoras se pueden encontrar en la página web Bacteria Freeze Drying Protocol.


    Las 10 principales tecnologías emergentes de 2019

    Cada minuto en 2018, Google realizó 3,88 millones de búsquedas y la gente vio 4,33 millones de videos en YouTube, envió 159,362,760 correos electrónicos, tuiteó 473,000 veces y publicó 49,000 fotos en Instagram, según la compañía de software Domo. Para 2020, se crearán 1,7 megabytes de datos por segundo por persona en todo el mundo, lo que se traduce en unos 418 zettabytes en un solo año (418.000 millones de unidades de disco duro de un terabyte y rsquos de información), asumiendo una población mundial de 7.800 millones. Los sistemas de almacenamiento de datos magnéticos u ópticos que actualmente contienen este volumen de 0 y 1 normalmente no pueden durar más de un siglo, si acaso. Además, el funcionamiento de los centros de datos requiere una gran cantidad de energía. En resumen, estamos a punto de tener un problema grave de almacenamiento de datos que solo se agravará con el tiempo.

    Está progresando una alternativa a los discos duros: el almacenamiento de datos basado en ADN. ADN y mdash, que consta de largas cadenas de los nucleótidos A, T, C y G y mdash, este material de almacenamiento de información de vida y rsquos. Los datos se pueden almacenar en la secuencia de estas letras, convirtiendo el ADN en una nueva forma de tecnología de la información. Ya se secuencia (lee), sintetiza (escribe) y copia con precisión de forma rutinaria con facilidad. El ADN también es increíblemente estable, como lo ha demostrado la secuenciación completa del genoma de un caballo fósil que vivió hace más de 500.000 años. Y almacenarlo no requiere mucha energía.

    Pero es la capacidad de almacenamiento la que brilla. El ADN puede almacenar con precisión cantidades masivas de datos a una densidad muy superior a la de los dispositivos electrónicos. La bacteria simple Escherichia coli, por ejemplo, tiene una densidad de almacenamiento de aproximadamente 10 19 bits por centímetro cúbico, según cálculos publicados en 2016 en Materiales de la naturaleza por George Church de la Universidad de Harvard y sus colegas. A esa densidad, todas las necesidades de almacenamiento actuales del mundo durante un año podrían satisfacerse bien con un cubo de ADN que mida aproximadamente un metro de lado.

    La perspectiva del almacenamiento de datos de ADN no es meramente teórica. En 2017, por ejemplo, el grupo Church & rsquos de Harvard adoptó la tecnología de edición de ADN CRISPR para registrar imágenes de una mano humana en el genoma de E. coli, que se leyeron con una precisión superior al 90 por ciento. Y los investigadores de la Universidad de Washington y Microsoft Research han desarrollado un sistema totalmente automatizado para escribir, almacenar y leer datos codificados en ADN. Varias empresas, incluidas Microsoft y Twist Bioscience, están trabajando para promover la tecnología de almacenamiento de ADN.

    Mientras tanto, el ADN ya se está utilizando para administrar datos de una manera diferente, por investigadores que luchan por dar sentido a enormes volúmenes de datos. Los avances recientes en las técnicas de secuenciación de próxima generación permiten que miles de millones de secuencias de ADN se lean fácil y simultáneamente. Con esta capacidad, los investigadores pueden emplear la codificación de barras y el uso de secuencias de ADN como identificación molecular y etiquetas para realizar un seguimiento de los resultados experimentales. La codificación de barras de ADN se está utilizando ahora para acelerar drásticamente el ritmo de la investigación en campos como la ingeniería química, la ciencia de los materiales y la nanotecnología. En el Instituto de Tecnología de Georgia, por ejemplo, el laboratorio James E. Dahlman & rsquos está identificando rápidamente terapias génicas más seguras y otros están descubriendo cómo combatir la resistencia a los medicamentos y prevenir la metástasis del cáncer.

    Entre los desafíos para hacer que el almacenamiento de datos de ADN sea algo común se encuentran los costos y la velocidad de lectura y escritura de ADN, que deben caer aún más si el enfoque es competir con el almacenamiento electrónico. Incluso si el ADN no se convierte en un material de almacenamiento ubicuo, es casi seguro que se utilizará para generar información a escalas completamente nuevas y preservar ciertos tipos de datos a largo plazo.

    SOBRE LOS AUTORES)

    Sang Yup Lee, copresidente del Consejo del Futuro Global sobre Biotecnología del Foro Económico Mundial, es profesor distinguido de ingeniería química y biomolecular en el Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea. Posee más de 700 patentes.


    Almacenamiento a largo plazo

    Como se mencionó anteriormente, la temperatura a la que se almacenan las bacterias congeladas afecta el tiempo que se pueden almacenar sin dejar de ser viables. La congelación y descongelación de las células a una velocidad adecuada y el mantenimiento de las existencias congeladas a la temperatura de almacenamiento adecuada ayudan a minimizar el daño del proceso de congelación. Además, cuanto mayor sea la densidad celular, mejor será la recuperación después de descongelar las células. Para la mayoría de las bacterias, una densidad de 107 células / ml dará como resultado una recuperación adecuada si todas las condiciones se mantienen correctamente. 1-2

    Crioprotectores: A medida que el agua de las células se convierte en hielo, los solutos se acumulan en el agua libre residual. Este aumento localizado en la concentración de sal puede desnaturalizar biomoléculas. 3 Además, la formación de cristales de hielo puede dañar las membranas celulares. Los aditivos que se mezclan con la suspensión bacteriana antes de la congelación reducen el punto de congelación y protegen las células durante la congelación para minimizar los efectos perjudiciales del aumento de la concentración de solutos y la formación de cristales de hielo. Los crioprotectores más utilizados son el dimetilsulfóxido (DMSO) y el glicerol, que se utilizan típicamente al 5 a 15% (v / v). Los aditivos no permeables utilizados como crioconservantes, como polisacáridos, proteínas y dextranos, se adsorben en la superficie de los microorganismos y forman una capa viscosa que protege las membranas, lo que hace que estos agentes sean particularmente útiles para la crioconservación. Otros aditivos comúnmente usados ​​incluyen suero sanguíneo, etilenglicol, metanol, leche desnatada, extractos de levadura y tripticasa de soja. 4

    Congelar muestras: Para preparar reservas de glicerol, el glicerol primero se esteriliza en autoclave y se deja enfriar. El volumen apropiado de glicerol se agrega a una suspensión de bacterias en fase logarítmica y se agita en vórtex para disociar las células y asegurar una mezcla uniforme de las bacterias con el glicerol. Después de colocar alícuotas de la suspensión en viales criogénicos con tapón de rosca, las células se congelan rápidamente sumergiendo los tubos en etanol-hielo seco o nitrógeno líquido y luego se almacenan en congeladores (-20 a -80 ° C) o nitrógeno líquido (-150 ° C). ° C). 5 La descongelación y recongelación repetida de las reservas bacterianas reducirá la viabilidad celular y debe evitarse. Al recuperar cepas con marcadores de selección de antibióticos, cultivarlas en medios selectivos garantizará que las reservas bacterianas no se contaminen.

    Secar en frío: Las bacterias se pueden liofilizar suspendiendo células en fase logarítmica en un medio de liofilización y luego liofilizando la suspensión. No todas las bacterias pueden liofilizarse con éxito. 6-8 Ciertas cepas pueden no sobrevivir al proceso o morir rápidamente una vez liofilizadas. La mejor manera de determinar si una cepa es susceptible de liofilización es evaluar empíricamente su estabilidad después de la liofilización mientras se mantiene un cultivo vivo como respaldo. Una vez liofilizado, es mejor almacenar las bacterias a 4 ° C o menos.


    Para aquellos de ustedes que hacen clonación de ADN, una pregunta sobre el almacenamiento de E. coli

    He buscado múltiples protocolos sobre el almacenamiento de E. coli a largo plazo, y he descubierto que existe una división entre el almacenamiento en soluciones de glicerol al 15% y al 80%, y algunos piden la adición de DMSO. Estoy tratando de almacenar células DH5 alfa químicamente competentes, así como algunos cultivos en los que ya he clonado. ¿Existe una diferencia importante entre estos métodos de almacenamiento?

    Mis reservas de glicerol consisten en 800 ul de cultivo y 200 ul de glicerol al 90%. Wikipedia dice que el DMSO reduce la muerte celular durante los procedimientos de congelación lenta. Me imagino que la mayoría de las culturas tienen muchísimas E. coli que unos pocos moribundos no lograrán realmente hacer una gran diferencia a largo plazo.

    tenga en cuenta que mi receta es para bacterias ya transformadas.

    Lo mismo que hemos hecho en mi laboratorio, funcionó bien para las acciones hasta al menos dos años (y aún en funcionamiento). Otra cosa a tener en cuenta con las células transformantes, si las está cultivando a partir de caldo con antibióticos, los antibióticos afectarán el tiempo que las puede almacenar de manera efectiva. Buscaré una cita sobre eso en un momento.

    Editar: una búsqueda rápida no arrojó nada, por lo que lo de los antibióticos puede haber sido un dato que recogí en alguna parte. Salud.

    Alternativa: Prepare una solución de leche desnatada al 10%, la misma leche descremada que usa para bloquear los westerns y esterilice en autoclave. Resuspenda las bacterias raspadas de una placa en la solución y almacénelas a -80 ° C. Las bacterias almacenadas durante unos 5 años seguían creciendo bien.

    Para las veces que he usado glicerol, usé un 15% sin DMSO y todavía estaba recuperándome después de 6 años.

    Dado que probablemente nunca volverá a congelar las células después de descongelarlas, probablemente no necesite el DMSO. Sin embargo, si estaba creando un stock para uso a largo plazo que necesita racha regularmente, definitivamente agregue el DMSO.

    Si desea congelar células químicamente competentes (si todavía son competentes), debe congelarlas RÁPIDAMENTE (usando nitrógeno líquido o un baño de hielo seco / etanol) en el tampón de solución de sal catiónica divalente (con o sin DMSO) con la que te lavas en los pasos finales. Para las células no competentes, suelo utilizar

    17% de glicerol (1 ml de O / N, 0,5 ml de glicerol al 50%) y congelar lentamente.

    Si está utilizando E. coli para amplificar plásmidos recombinantes, creo que es una pérdida de tiempo y espacio almacenar transformantes. Puede producir suficiente ADN plasmídico para muchas aplicaciones y, cuando se agote, solo podrá transformar más bacterias. Las células químicamente competentes están disponibles comercialmente ahora y son bastante baratas.

    No. Es una pérdida de tiempo seguir retransformando y minipreparando el ADN cuando se puede ir de manera confiable a una reserva de glicerol durante décadas. No sé sobre su laboratorio, pero mi laboratorio tiene & gt1,000 construcciones vectoriales y se hacen más semanalmente. ¿Imagina hacer 1000 transformaciones cada año cuando el ADN plasmídico comienza a degradarse? Además, los cultivos son más fiables en términos de contaminación por ADNasa. Una contaminación por ADNasa en las existencias de su congelador (por ejemplo, por aerosoles de la pipeta, polvo flotando, etc.) puede & # x27t solucionarse mediante una transformación.


    Agradecimientos

    Agradecemos a M Elowitz por el plásmido represor J Leadbetter por P. aeruginosa ADN cromosómico R Weiss para el plásmido pSND-1 RS Cox III, C Ward, P Blais, P Marguet y M Gray para el estudio preliminar y asistencia técnica E Toone y X Chen para sintetizar 3OC12HSL. Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (FHA), los Institutos Nacionales de Salud (LY y FHA), la Fundación David y Lucile Packard (LY) y el Instituto Médico Howard Hughes (SRQ).


    RESULTADOS

    Evaluación de TI de largo alcance mediante proteínas fluorescentes

    Para probar la TI de largo alcance de los promotores convergentes, se clonó un gen BFP (proteína azul fluorescente) opuesto a un gen mCherry, lo que resultó en una distancia entre promotores de 1,5 kb. La expresión de mCherry fue impulsada por los débiles bla P3 promotor, mientras que el promotor que impulsa la expresión de BFP varió en su fuerza que va desde ninguna actividad promotora (scrPX) hasta una actividad promotora alta (conP01), y se midió la fluorescencia de BFP y mCherry (Figura 1). Como era de esperar, las señales de BFP aumentaron al aumentar la fuerza del promotor. La fluorescencia de mCherry fue máxima sin un promotor opuesto (scrPX) y se redujo al aumentar la fuerza del promotor interferente. El promotor de interferencia más débil probado conP05 ya redujo notablemente la expresión de mCherry. El más fuerte de los promotores de interferencia utilizados, conP01, condujo a una reducción de 170 veces de la fluorescencia de mCherry.

    Interferencia transcripcional con fuerza promotora interferente variable evaluada por expresión de proteínas fluorescentes. (A) Un gen BFP y mCherry se oponen directamente entre sí en un vector pSB4S5. La expresión de BFP es impulsada por promotores de fuerza variable, el gen mCherry por el débil bla P3 promotor. (B) Señales de fluorescencia de BFP (gris) y mCherry (blanco) con aumento de la fuerza del promotor del gen BFP. (C) Gráfico de fluorescencia de BFP frente a fluorescencia de mCherry. Los puntos de datos representan medias con errores estándar de ocho repeticiones biológicas.

    Interferencia transcripcional con fuerza promotora interferente variable evaluada por expresión de proteínas fluorescentes. (A) Un gen BFP y mCherry se oponen directamente entre sí en un vector pSB4S5. La expresión de BFP es impulsada por promotores de fuerza variable, el gen mCherry por el débil bla P3 promotor. (B) Señales de fluorescencia de BFP (gris) y mCherry (blanco) con aumento de la fuerza del promotor del gen BFP. (C) Gráfico de fluorescencia de BFP frente a fluorescencia de mCherry. Los puntos de datos representan medias con errores estándar de ocho repeticiones biológicas.

    Con el promotor de interferencia más fuerte, conP01, se investigó la posibilidad de ejercer una interferencia transcripcional en la expresión de mCherry en distancias entre promotores aún más largas. Los espaciadores entre el gen BFP y mCherry se insertaron en incrementos de 500 pb hasta un tamaño de espaciador de 1,5 kb, lo que resultó en una distancia total entre promotores de aproximadamente 3 kb. Nuevamente, las construcciones se probaron midiendo la expresión de mCherry y BFP (Figura 2). Con el aumento de la longitud del espaciador, TI se volvió menos eficiente, lo que llevó a un aumento de la expresión de mCherry. Sin embargo, incluso con la longitud máxima del espaciador probada, todavía era evidente un TI sustancial. Además, la expresión de BFP se redujo con tamaños de espaciador superiores a 500 pb.

    Interferencia transcripcional con distancias variables entre promotores evaluadas por expresión de proteínas fluorescentes. (A) Un gen BFP y mCherry se oponen directamente entre sí en un vector pSB4S5. La expresión de BFP es impulsada por el promotor fuerte conP01, el gen mCherry por el débil bla P3 promotor. Entre los dos genes, se han añadido espaciadores en incrementos de 500 pb. (B) Señales de fluorescencia de BFP (gris) y mCherry (blanco) con una distancia entre promotores creciente y, como control, con un promotor codificado delante del gen de BFP (scrPX). Los puntos de datos representan medias con errores estándar derivados de ocho réplicas biológicas.

    Interferencia transcripcional con distancias variables entre promotores evaluadas por expresión de proteínas fluorescentes. (A) Un gen BFP y mCherry se oponen directamente entre sí en un vector pSB4S5. La expresión de BFP es impulsada por el promotor fuerte conP01, el gen mCherry por el débil bla P3 promotor. Entre los dos genes, se han añadido espaciadores en incrementos de 500 pb. (B) Señales de fluorescencia de BFP (gris) y mCherry (blanco) con una distancia entre promotores creciente y, como control, con un promotor codificado delante del gen de BFP (scrPX). Los puntos de datos representan medias con errores estándar derivados de ocho réplicas biológicas.

    Reporteros de TIA de ARN polimerasa T7

    Para demostrar la modularidad y versatilidad del sistema, construimos además un indicador TIA, en el que el promotor interferente es dependiente de la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Por tanto, el promotor de T7 dirige la expresión de BFP cuando está presente una ARN polimerasa de T7 activa (RNAP). Como era de esperar, solo T7 RNAP + condujo a la expresión de BFP e interfirió con la transcripción del gen mCherry (Figura 3).

    TIA sensibles a la actividad de T7 RNAP con proteínas fluorescentes o genes de resistencia a antibióticos. (A) Esquema del sistema T7 RNAP con plásmido indicador TIA fluorescente. La expresión de T7 RNAP conduce a la transcripción del promotor T7 que impulsa la expresión de BFP e inhibe la transcripción del gen mCherry. (B) Señales de fluorescencia BFP (gris) y mCherry (blanco), cuando se expresa una ARN polimerasa T7 inactiva (T7 RNAP-) o activa (T7 RNAP +). Los puntos de datos representan medias con errores estándar derivados de cuatro réplicas biológicas.

    TIA sensibles a la actividad de T7 RNAP con proteínas fluorescentes o genes de resistencia a antibióticos. (A) Esquema del sistema T7 RNAP con plásmido indicador TIA fluorescente. La expresión de T7 RNAP conduce a la transcripción del promotor T7 que impulsa la expresión de BFP e inhibe la transcripción del gen mCherry. (B) Señales de fluorescencia BFP (gris) y mCherry (blanco), cuando se expresa una ARN polimerasa T7 inactiva (T7 RNAP-) o activa (T7 RNAP +). Los puntos de datos representan medias con errores estándar derivados de cuatro réplicas biológicas.

    Sistema de selección LacI

    Para emplear TI de largo alcance para la construcción de un sistema de selección genética dual para ligantes de ADN condicionales, se utilizaron genes de resistencia a antibióticos en lugar de proteínas fluorescentes. En la Figura 4A se muestra un esquema del sistema de selección / indicador LacI que consta de dos unidades transcripcionales opuestas. Se espera que el fuerte promotor dependiente de σ 70 hacia la derecha que conduce la expresión de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) interfiera con la expresión del gen de resistencia a espectinomicina aadA de su promotor nativo, débil. El represor lac que se coexpresa a partir de un plásmido adicional debería inhibir el promotor fuerte en ausencia de IPTG, aliviando la interferencia transcripcional y permitiendo así la transcripción del promotor débil. Por el contrario, la adición de IPTG debería restaurar la interferencia transcripcional y la alta expresión de CAT (Figura 4B y C). De hecho, este circuito genético provocó una respuesta condicional para la resistencia tanto al cloranfenicol como a la espectinomicina: en ausencia de IPTG, las células mostraron una alta resistencia a la espectinomicina y una baja resistencia al cloranfenicol, mientras que en presencia de IPTG fue al revés . En cultivo líquido, las diferencias en las tasas de crecimiento entre los dos estados fueron evidentes en una amplia gama de concentraciones de antibióticos con diferencias máximas de aproximadamente 1 doble / ha una concentración de cloranfenicol de 500 μg / ml o una concentración de espectinomicina de 250 μg / ml. respectivamente (Figura 4D y E). Cuando se realizó en agar LB como un ensayo de mancha a concentraciones idénticas de antibiótico, LacI de tipo salvaje bajo presión de cloranfenicol creció solo en presencia de IPTG, y bajo presión de espectinomicina solo en ausencia de IPTG (Figura complementaria S2).

    Sistema de selección LacI. (A) Esquema del circuito sintético con lógica de operación LacI de tipo salvaje. El TIA consta de dos plásmidos: el plásmido informador pSAH0016 tiene dos genes de resistencia a antibióticos opuestos, uno de los cuales (gato) tiene un promotor fuerte, pero condicional, mientras que el otro gen (aadA) es impulsado por un promotor débil y, por tanto, es susceptible a la interferencia transcripcional por parte del promotor fuerte. El plásmido de expresión pBAD-LacI expresa el represor Lac de tipo salvaje bajo el control de un promotor inducible por arabinosa. En ausencia de ITPG, LacI de tipo salvaje inhibe la expresión del promotor fuerte. (B) Circuito lógico booleano y (C) tabla de verdad para el comportamiento previsto del sistema con el uso de cloranfenicol o espectinomicina. (D) Tasas de crecimiento bajo presión de cloranfenicol con el plásmido indicador y pBAD-LacI con (negro) y sin (gris) adición de IPTG 1 mM. (mi) Tasas de crecimiento bajo presión de espectinomicina. Los puntos de datos representan medias con errores estándar de cuatro experimentos separados.

    Sistema de selección LacI. (A) Esquema del circuito sintético con lógica de operación LacI de tipo salvaje. El TIA consta de dos plásmidos: el plásmido informador pSAH0016 tiene dos genes de resistencia a antibióticos opuestos, uno de los cuales (gato) tiene un promotor fuerte, pero condicional, mientras que el otro gen (aadA) es impulsado por un promotor débil y, por tanto, es susceptible a la interferencia transcripcional por parte del promotor fuerte. El plásmido de expresión pBAD-LacI expresa el represor Lac de tipo salvaje bajo el control de un promotor inducible por arabinosa. En ausencia de ITPG, LacI de tipo salvaje inhibe la expresión del promotor fuerte. (B) Circuito lógico booleano y (C) tabla de verdad para el comportamiento previsto del sistema con el uso de cloranfenicol o espectinomicina. (D) Tasas de crecimiento bajo presión de cloranfenicol con el plásmido indicador y pBAD-LacI con (negro) y sin (gris) adición de IPTG 1 mM. (mi) Tasas de crecimiento bajo presión de espectinomicina. Los puntos de datos representan medias con errores estándar de cuatro experimentos separados.

    Selecciones de mock de LacI

    Para demostrar la viabilidad de las selecciones de aglutinantes de ADN condicionales, tres distintos lacI Los genotipos se utilizaron en experimentos de competición bajo un esquema de selección equivalente al utilizado para las selecciones de bibliotecas. El LacI de tipo salvaje como condicional LACO El aglutinante se seleccionó de un fondo de dos mutantes LacI que no respondían a IPTG. El mutante LacI a2 (V15A, L62S, G65D, A82S, L205H, W220R, Q317K) no muestra signos apreciables LACO unión independientemente de la disponibilidad de IPTG, mientras que el mutante a3 (A72S, D88G, P127Q, E137G, Q335 *) es un aglutinante constitutivo muy fuerte. Para los experimentos de selección simulada, se utilizó un plásmido de expresión con un reportero adicional basado en mCherry (pLO2), lo que permite una determinación inequívoca del genotipo al comparar la proporción de fluorescencia con y sin IPTG y la fluorescencia general (Figura complementaria S1).

    Como era de esperar, al seleccionar una baja LACO La ocupación por 500 μg / ml de cloranfenicol con IPTG 1 mM, LacI de tipo salvaje tenía una ventaja de aptitud sobre a3, pero una ligera desventaja sobre a2 (Figura 5A). Por el contrario, durante la selección de LACO la unión por espectinomicina (250 µg / ml) en ausencia de LacI de tipo salvaje IPTG tenía una ventaja de aptitud sobre a2, pero una ligera desventaja sobre a3 (Figura 5B). Posteriormente, la aplicación de esos dos regímenes de selección en ambos órdenes posibles da como resultado una ventaja selectiva general de condicionalmente LACO unir LacI de tipo salvaje sobre los otros dos genotipos y así permite su enriquecimiento a partir de una mezcla 1: 1: 1 de las tres variantes de LacI (Figura 5C y D).

    Adecuación de genotipos usados ​​y selecciones simuladas de mezclas de números de células iguales. (A) Tasas de crecimiento de los tres genotipos LacI wt (cuadrados azules, línea continua), a2 (círculos rojos, línea discontinua) y a3 (triángulos verdes, línea discontinua) en pLO2 (un plásmido de expresión con un cassette informador adicional para LACO unión) con el plásmido indicador pSAH0016 bajo presión de cloranfenicol en presencia de IPTG 1 mM. La línea punteada negra vertical representa la presión de antibiótico utilizada para los experimentos de selección simulada. (B) Tasas de crecimiento bajo presión de espectinomicina en ausencia de IPTG. (C) Selección ON / OFF. Una mezcla de E. coli RV308 que contenía el plásmido informador y LacI wt, a2 o a3 se sometió primero a 8 h de selección ON con 250 μg / ml de espectinomicina y 8 horas posteriores de selección OFF con 500 μg / ml de cloranfenicol en presencia de IPTG 1 mM. Las frecuencias de genotipo se determinaron antes y después de cada paso de selección analizando 21 clones cada uno. (D) Selección OFF / ON. El procedimiento fue el mismo que para la selección ON / OFF, pero con el orden de conmutación de los dos pasos de selección.

    Adecuación de genotipos usados ​​y selecciones simuladas de mezclas de números de células iguales. (A) Tasas de crecimiento de los tres genotipos LacI wt (cuadrados azules, línea continua), a2 (círculos rojos, línea discontinua) y a3 (triángulos verdes, línea discontinua) en pLO2 (un plásmido de expresión con un cassette informador adicional para LACO binding) with the reporter plasmid pSAH0016 under chloramphenicol pressure in the presence of 1 mM IPTG. The vertical black dashed line represents the antibiotic pressure used for the mock selection experiments. (B) Growth rates under spectinomycin pressure in the absence of IPTG. (C) ON/OFF selection. A mixture of E. coli RV308 containing the reporter plasmid and either LacI wt, a2 or a3 was first subjected to 8 h of ON selection with 250 μg/ml spectinomycin and subsequent 8 hours of OFF selection with 500 μg/ml chloramphenicol in the presence of 1 mM IPTG. Genotype frequencies were determined before and after each selection step by assaying 21 clones each. (D) OFF/ON selection. The procedure was the same as for the ON/OFF selection, but with switched order of the two selection steps.

    To determine enrichment factors over 24 h for both the ON and the OFF selection in a single selection round, mock selections of the LACO non-binder a2 (forming red fluorescent colonies) against the strong, constitutive binder a3 (forming non-fluorescent colonies) were performed. For the selection for LACO binding by spectinomycin pressure starting at a ratio of 100,000:1 (a2:a3), after 24 h of selection 85.5% (609 out of 712 colonies) were non-fluorescent, corresponding to an enrichment factor of 8.6 × 10 4 . Selecting for a2 from a 100 000-fold excess of a3 by 500 μg/ml chloramphenicol for 24 h yielded 91.1% fluorescent colonies (288 out of 316 colonies), which is equivalent to an enrichment factor of 9.1 × 10 4 .

    LacI library selections and characterization

    To employ the TIA for a challenging genetic selection from large libraries we aimed for isolating a functionally inverted Lac repressor, which binds LACO only in the presence of IPTG. An initial random library from wild-type lacI with 9 × 10 6 individual clones was created by error-prone PCR. Twenty clones were randomly chosen for sequencing and phenotypic characterization. The majority of the sampled clones were apparent constitutive non-binders of LACO, whereas 2 of the 20 sampled clones displayed wild-type like behavior with reduced switchability. In addition to selection for inverted response to IPTG (with IPTG during ON selection and no IPTG during OFF selection), a selection in accordance with LacI wild-type operation logic (without IPTG during ON selection and with 1 mM IPTG during OFF selection) was performed from the initial library. After each selection round, 20 clones were randomly chosen, sequenced and characterized by antibiotic resistance assays (Figure 6, Supplementary Table S1). After a single cycle of ON/OFF selection for wild-type response to IPTG, all sampled clones showed pronounced conditional DNA binding according to LacI wild-type operation logic. In contrast, a single round of dual selection for inverted response to IPTG yielded only clones with no or marginal, non-inverted response to IPTG. After a second round of error-prone PCR based library generation and ON/OFF selection, first clones with slightly inverted behavior were sampled. A third round of randomization and dual selection was conducted, and one clone showed pronounced functional inversion of IPTG response (5B3), bearing the mutations A72T, H163, G297V and Q335*. Up to now, all sampled clones yielded unique sequences. After a fourth selection cycle, this time without prior randomization, another LacI variant with markedly inverted response to IPTG was dominant among the sampled clones (6B3: Q26R, M42I, V66L, H202Y, Q227D, P320S, V324G, L346*). For both isolated pronounced Lac inverters (5B3 and 6B3), addition of IPTG resulted in a noticeably lowered chloramphenicol resistance and a higher resistance against spectinomycin in the resistance assay (Figure 7). For 5B3, the difference between the lower and the higher affine state was considerably smaller than for wild-type LacI. 6B3 displayed a distinctively better switchability than 5B3.

    Phenotypic mapping of clones sampled from the initial library and after dual selection rounds for (A) inverted switching behavior (inverter selections) or (B) wild-type operation logic (repressor selection). For all clones, growth rates under spectinomycin pressure (250 μg/ml) were determined without and with 1 mM IPTG in antibiotic resistance assays with three biological replicates.

    Phenotypic mapping of clones sampled from the initial library and after dual selection rounds for (A) inverted switching behavior (inverter selections) or (B) wild-type operation logic (repressor selection). For all clones, growth rates under spectinomycin pressure (250 μg/ml) were determined without and with 1 mM IPTG in antibiotic resistance assays with three biological replicates.

    Characterization of selected Lac inverters 5B3 and 6B3. (A) Growth rates under chloramphenicol pressure with pBAD-5B3 with (black) and without (gray) addition of 1 mM IPTG and (B) growth rates under spectinomycin pressure. (C) Growth rates under chloramphenicol pressure with pBAD-6B3 with (black) and without (gray) addition of 1 mM IPTG and (D) growth rates under spectinomycin pressure. Data points represent means with standard errors from four separate experiments. (mi) Plot of EC50 values for chloramphenicol against EC50 values for spectinomycin for used lacI genotypes in antibiotic resistance assay with 1 mM IPTG (filled circles) and without IPTG (open circles). (F) Binding of wild-type LacI (open circles) and 5B3His (filled diamonds) to symmetrical, fluorescein labeled 18 bp LACO as function of IPTG concentration assessed by fluorescence polarization.

    Characterization of selected Lac inverters 5B3 and 6B3. (A) Growth rates under chloramphenicol pressure with pBAD-5B3 with (black) and without (gray) addition of 1 mM IPTG and (B) growth rates under spectinomycin pressure. (C) Growth rates under chloramphenicol pressure with pBAD-6B3 with (black) and without (gray) addition of 1 mM IPTG and (D) growth rates under spectinomycin pressure. Data points represent means with standard errors from four separate experiments. (mi) Plot of EC50 values for chloramphenicol against EC50 values for spectinomycin for used lacI genotypes in antibiotic resistance assay with 1 mM IPTG (filled circles) and without IPTG (open circles). (F) Binding of wild-type LacI (open circles) and 5B3His (filled diamonds) to symmetrical, fluorescein labeled 18 bp LACO as function of IPTG concentration assessed by fluorescence polarization.

    To confirm inversed functional behavior of the first selected inverter 5B3 in vitro, we aimed to purify the protein. Since the C-terminal 6xHis-tag needed for protein purification was absent because of the premature stop codon, it was initially restored by mutating the amino acid position 335 back to a glutamine. This, however, disrupted conditional binding. Instead, a 6xHis-tag was cloned directly to the C-terminus of the selected protein (5B3His), which seems to be functionally well tolerated. The 5B3His protein was purified, and its IPTG response was assessed in a fluorescence polarization assay for LACO binding and compared to the response of wild-type LacI (Figure 7F). In agreement with the en vivo assay, the response of 5B3His protein to IPTG was inverted in respect to the wild-type 5B3His displayed increased DNA binding with increasing IPTG concentrations.


    Tracing Ancestors and Relatives of Escherichia coli B, and the Derivation of B Strains REL606 and BL21(DE3)

    Antecedents of Escherichia coli B have been traced through publications, inferences, and personal communication to a strain from the Institut Pasteur in Paris used by d'Herelle in his studies of bacteriophages as early as 1918 (a strain not in the current collection). This strain appears to have passed from d'Herelle to Bordet in 1920, and from Bordet to at least three other laboratories by 1925. The strain that Gratia received from Bordet was apparently passed to Bronfenbrenner by 1924 and from him to Luria around 1941. Delbrück and Luria published the first paper calling this strain B in 1942. Its choice as the common host for phages T1–T7 by the phage group that developed around Delbrück, Luria, and Hershey in the 1940s led to widespread use of B along with E. coli K-12, chosen about the same time for biochemical and genetic studies by Tatum and Lederberg. Not all currently available strains related to B are descended from the B of Delbrück and Luria at least three strains with somewhat different characteristics were derived independently by Hershey directly from the Bronfenbrenner strain, and a strain that appears to have passed from Bordet to Wollman is in the current Collection of the Institut Pasteur. The succession of manipulations and strains that led from the B of Delbrück and Luria to REL606 and BL21(DE3) is given, established in part through evidence from their recently determined complete genome sequences.


    INTRODUCCIÓN

    Transcriptional interference (TI) has been defined as the cis active suppressive influence of one transcriptional process on a second one (1,2). This mechanism has been exploited in a genetic selection system for DNA binding in a number of studies (3𠄶). In this system, a weak promoter is driving the expression of the antibiotic resistance gene aadA. An opposing strong promoter interferes with transcription of the aadA gene. Upon occupation of an operator site at the strong promoter, the inhibition of transcription from the weak promoter is alleviated, thus leading to expression of the selectable resistance marker. Within this approach, the interfering promoter is directly adjacent to the suppressed gene.

    We investigated whether TI can also be employed in engineered systems with two full-length genes facing each other, which would make it a versatile set-up for artificial genetic circuitry requiring inversely correlated gene expression. Using two converging fluorescent protein reporter genes, we demonstrate that TI can be very efficient even in this two gene layout, creating an inter-promoter distance of 1.5 kb. The introduction of spacers between the genes to further increase the inter-promoter distance to up to 3 kb decreased, but not completely abolished TI. Further, we show that long-range TI can also be elicited by a T7 RNA polymerase dependent promoter in the presence of functional T7 RNA polymerase.

    Based on long-range TI, we have developed a transcriptional interference assay (TIA) that allows positive selection for both the DNA binding (ON) and for the non-binding (OFF) state. In synthetic biology the development and engineering of gene switches is crucial for constructing genetic circuits that allow sensing of environmental or internal cues. Predictive structural design of gene switches like conditionally active transcription factors is an exceptionally complex problem and instead, selections or high-throughput screenings from libraries are commonly used. Employed selection schemes must include selection for an ON and an OFF state, with the state being switched by an external cue. Ideally, the genetic selection system should enable selection for both states and avoid laborious and diversity decreasing subcloning between an ON and an OFF selection system. In recent years, several dual selection systems have been developed that rely on a combination of positive and negative selection (7�). In contrast to positive selection markers, negative selection markers are detrimental when expressed at respective selective conditions and thus select for absence of the marker. Negative selections can be very effective, but harbor an inherent risk of enrichment for loss-of-function mutants.

    To construct a genetic selection system, which allows positive dual selection, instead of fluorescent protein genes, positive selection markers were cloned into the TIA system. The chloramphenicol resistance marker gato driven by a strong, conditionally active promoter was cloned opposite to an aadA gene. This design enables positive selection for both the occupied and the unoccupied state of the operator region of the interfering promoter, as shown with the Lac repressor (LacI) as a model protein for conditional DNA binding. The feasibility of selections from large libraries in liquid culture with this system was demonstrated by functionally inverting the Lac repressor in a directed evolution approach.

    The selection system described in this work makes use of a novel two gene TI approach that can be generalized for selection and screening of conditional DNA binders or genetic circuits whose output is a DNA binding protein or an orthogonal polymerase activity. Because of its nature as a dual positive selector for antibiotic resistances, the presented transcriptional interference assay (TIA) places very few restrictions on medium composition and is genetically and functionally robust.


    Detailed product information

    General

    Caracteristicas

    Handling information

    1. Open vial according to enclosed instructions.
    2. Using a single tube of #18 broth (5 to 6 mL), withdraw approximately 0.5 to 1.0 mL with a Pasteur or 1.0 mL pipette. Rehydrate the entire pellet.
    3. Aseptically transfer this aliquot back into the broth tube. Mix well.
    4. Use several drops of the suspension to inoculate a #18 agar slant and/or plate.
    5. Incubate the tubes and plate at 37°C for 24 hours.

    ATCC ® 25922&trade is a recommended reference strain for antibiotic susceptibility testing. It has been found that passage in broth often results in a change in MIC levels. Therefore, it is best to keep it on agar and to make stocks for storage immediately. Repeated passage is discouraged.

    Purified genomic DNA of this strain is available as ATCC ® 25922D-5&trade.

    Additional information on this culture is available on the ATCC ® web site at www.atcc.org.

    Quality control specifications

    Historia

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