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¿Determinación real de la secuencia de ADN en el enfoque de escopeta?

¿Determinación real de la secuencia de ADN en el enfoque de escopeta?


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Estoy estudiando bioinformática y me confunde la secuenciación escopeta. En la secuenciación de Sanger, rompemos el ADN y usamos ddNTP para determinar la posición exacta de cada neucleótido. ¿Cómo nos ayuda exactamente la secuenciación de escopeta a determinar la estructura de la secuencia?

Si dividimos la secuencia al azar y luego volvemos a unirla mirando las partes superpuestas, ¿cómo nos dice eso en qué orden están los nucleótidos? ¿Cómo se leen exactamente los nucleótidos para que nos ayude la secuenciación rápida?


La pregunta parece confundir al método de identificar y determinar el orden de las bases en un fragmento de ADN - secuenciación Sanger *, Maxam-Gilbert o métodos más modernos de 'próxima generación' - con el estrategia para seleccionar fragmentos para analizar y reensamblar en la secuencia contigua más grande de la que se derivaron, de la cual la secuencia de escopeta es una.

Secuencia de escopeta es un estrategia en el que la selección de fragmentos para secuenciar es aleatoria, el método de secuenciación es una cuestión de elección (a menudo era el método Sanger cuando se desarrolló por primera vez), y el ensamblaje se realiza mediante programas de computadora que identifican tramos coincidentes. (Falla, o no es completamente exitoso, si por casualidad los fragmentos no cubren todo el ADN con superposiciones adecuadas o hay ciertos tipos de regiones repetidas).

La secuenciación de escopeta debe contrastarse con lo que podría llamarse secuenciación ordenada estrategias en las que uno generalmente comienza con un mapa de restricción de todo el ADN e inicialmente selecciona fragmentos específicos para clonar y secuenciar (por cualquier método que parezca mejor). Sobre la base de la secuencia del fragmento, se puede optar por secuenciar más lejos de una posición dentro del fragmento ya secuenciado, y este procedimiento se repite. Aquí no hay un paso de ensamblaje aparente, ya que es inherente a la elección de los fragmentos para secuenciar. (Esto es mucho más lento que la secuenciación rápida y no se puede automatizar, por lo que es mucho más costoso. Sin embargo, es más preciso).

Coda

Parte de la confusión puede surgir del hecho de que los métodos automatizados modernos de secuenciación de genomas están diseñados para funcionar en una mezcla de muchos fragmentos de ADN no clonados, por lo que implican inherentemente la estrategia de secuenciación de escopeta. Suelen emplear tecnologías distintas al método clásico de Sanger. Si se requiere una estrategia de secuenciación ordenada basada en clones "manual" para "terminar" las regiones faltantes o ambiguas de un genoma, esto utilizaría principalmente el método Sanger para determinar la secuencia. Por tanto, el escritor contemporáneo podría emplear lo que es, de hecho, un contraste engañoso.

* Fred Sanger fue un eminente premio Nobel, por lo que su apellido está en mayúscula.


En la secuenciación de Sanger, rompemos el ADN y usamos ddNTP para determinar la posición exacta de cada neucleótido.

No. La secuenciación de Sanger no hace esto. El resultado de una reacción de secuenciación de Sanger es una cadena de nucleótidos, de aproximadamente 700-1200 pb de longitud. No hay nada en eso que inherentemente dé a esa cuerda una posición.

"Escopeta" simplemente significa que no se está aprovechando ningún tipo de información cartográfica conocida para apuntar a sus reacciones de secuenciación; secuencia todo al azar y deja que una computadora clasifique lo que se superpone con qué.


Ver el vídeo: Genoma organización y tipos de secuencias ADN (Enero 2023).