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¿Puedo usar múltiples secuencias RBS bicistrónicas en un circuito biológico sintético?

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Las secuencias bicistroninc RBS (BCD) desarrolladas por Mutalik et al. [1] tienen como objetivo eliminar la sensibilidad al contexto de la traducción y, por lo tanto, garantizar una expresión génica más predecible. Sin embargo, me han dicho que tener múltiples unidades transcripcionales, cada una con BCD, puede enfermar las células. La explicación que me dieron fue que la toxicidad proviene de pequeños péptidos que se producen a partir de la transcripción de la primera secuencia de RBS.

¿Alguien ha demostrado toxicidad por múltiples BCD o es apócrifo? Si se ha demostrado, ¿se conoce el mecanismo de toxicidad y hay alguna manera de utilizar múltiples BCD mientras se mantienen las células sanas?

[1] V. K. Mutalik et al., “Expresión génica precisa y confiable a través de elementos estándar de iniciación de la transcripción y la traducción”, Nat. Métodos, vol. 10, no. 4, págs. 354-360, abril de 2013.


Esa es una gran pregunta y tiene muchas oportunidades para explorar. No estoy seguro de que nadie haya realizado un seguimiento sistemático de este trabajo original de BCD. Intentamos clonar estos elementos en una copia mediana de plásmidos, en un diseño de operón, impulsando múltiples genes, y ahora que lo pienso, no fue una cosa inteligente. La clonación fue muy desafiante, probablemente debido a la toxicidad que mencionas. No tuve tiempo de investigar esto en profundidad (que en sí mismo es un proyecto genial), pero creo que la toxicidad se debe a demasiados recursos (¿ribosomas?) Valorados en estas unidades. Pero esa es una explicación ondulada a mano. Necesita un estudio mecanicista para investigar. Creo que el grupo de Tom Ellis y otros han realizado un hermoso trabajo sobre la toxicidad asociada con la expresión de proteínas. Personalmente, creo que la toxicidad no está relacionada con el péptido inerte (primer gen en un operón BCD) que se produce. Otra historia que intentamos fue reemplazar este primer gen con algo funcional pero no publicado.

Volviendo al uso de BCD para impulsar múltiples genes, diría que si los clona directamente en los genomas, deberían funcionar a la perfección. Probamos esto y funciona bien. No se ha publicado mucho (¡oh Dios, es tanto trabajo inédito!). Los operones bacterianos tienen estas uniones y elementos de diferentes puntos fuertes. ¡Feliz de discutir más si tiene una pregunta de seguimiento!

Gracias por tu interés en este trabajo. Realmente orgulloso de nuestro trabajo en este sistema. Por supuesto, feliz de haber hecho este trabajo, ya que hubo muchos esfuerzos iniciales en estos elementos de tipo BCD. ¡Y me encanta esta plataforma SE de discusión abierta! No sé cómo sobrevivió synbio sin este sistema de compartir conocimientos y experiencias. Los mejores deseos

Vivek Mutalik


En la documentación de este método de clonación reciente del grupo de Richard Murray en Caltech (https: //doi.org/10.1021/acssynbio.8b00060), se incluye una biblioteca de piezas con varios BCD. No he probado esto directamente yo mismo, pero la advertencia que notan para múltiples BCD no es que sean tóxicos, sino que debido a que tienen regiones homólogas largas, son propensos a la recombinación. Esto tiene sentido ya que la región del péptido ficticio es, creo, alrededor de 50 pb y se comparte en todos los BCD. Podrías imaginar hacer variantes en esta región para combatir los problemas de recombinación, pero quién sabe si eso afectaría la solidez de la expresión de BCD.


Valor esperado de la segunda carrera en una secuencia de lanzamientos de monedas

Sea $ (X_n) _<>> $ ser variables aleatorias independientes que sean iguales a $ 1 $ con probabilidad $ p $ ya $ con probabilidad $ q = 1-p $. Una carrera es una secuencia $ (X_, cdots, X_) $ donde $ k, l in mathbb$ tal que $ X_ = cdots = X_ neq X_PS Deje $ L_$ sea la longitud de $ j ^$ ejecutar ($ l + 1 $ aquí).

Calculando el valor esperado de $ L_ <2j> $, para $ j in mathbb^ <*> $, siempre producirá $ 2 $, mientras que el valor esperado de $ L_ <2j + 1> $ es $ frac

+ frac

PS ¿Existe una explicación intuitiva de por qué incluso las ejecuciones tienen una expectativa que es independiente de p? Es un resultado que me sorprende bastante.

Esquema de prueba de mi estado de cuenta para $ L_ <1> $ y $ L_ <2> $:

2) $ P ((S_1, S_2) = (k, l)) = P (X_ <1> = cdots = X_k = 0, X_= puntos = X_= 1, X_= 0) + P (X_1 = cdots = X_k = 1, X_= puntos = X_= 0, X_= 1) $ Entonces $ P ((S_1, S_2) = (k, l)) = p ^ lq ^ + q ^p ^$ y sumando los rendimientos $ P (S_2 = k) = p ^q ^ 2 + q ^p ^ 2 $ y $ E (S_2) = 2 $.


¿Puedo usar múltiples secuencias RBS bicistrónicas en un circuito biológico sintético? - biología

Desarrollo de pares de bases nucleicas totalmente sintéticas que interactúan fielmente en células vivas y sus aplicaciones en la creación de organismos semisintéticos con capacidad de transporte de información expandida y ortogonal.

Aprovechar los sistemas de replicación de ADN que se producen de forma natural y mutuamente ortogonales para permitir la replicación de los genes diana. Las variaciones altamente propensas a errores en estos sistemas permiten una sólida evolución dirigida de biomoléculas.

Ingeniería y evolución dirigida de factores de transcripción mutuamente ortogonales que operan con alto rango dinámico, bajo fondo y responden a un amplio repertorio de estímulos. en vivo.

Desarrollos recientes en en vivo traducción ortogonal de proteínas que incluye: pares ortogonales RBS-anti-RBS ortogonales, subunidades de ARNr unidas covalentemente para descubrir nuevas capacidades enzimáticas, incorporación mejorada de aminoácidos no canónicos y decodificación de codones cuatrillizos.

La biología sintética se esfuerza por controlar de manera confiable el comportamiento celular, generalmente en forma de interacciones diseñadas por el usuario de componentes biológicos para producir una salida predeterminada. Los componentes del circuito de ingeniería se derivan con frecuencia de fuentes naturales y, por lo tanto, a menudo se ven obstaculizados por interacciones involuntarias con la maquinaria del huésped, sobre todo dentro del dogma central del huésped. Los circuitos de genes confiables y predecibles requieren la reducción o eliminación dirigida de estas interacciones indeseables para mitigar las consecuencias negativas sobre la aptitud del hospedador y desarrollar bioactividades independientes del contexto. Aquí, revisamos los avances recientes en la ortogonalización biológica, es decir, el aislamiento de las bioactividades dictadas por el investigador de los procesos del huésped, con un enfoque en los desarrollos sistemáticos que pueden culminar en la creación de un dogma central ortogonal y funciones celulares novedosas.


Avances en el diseño de circuitos genéticos: bioquímicas novedosas, minería de partes profundas y expresión génica de precisión

Revisamos los avances recientes en el diseño avanzado de circuitos genéticos.

Los conceptos de diseño de circuitos avanzados allanan el camino para una regulación celular sintética más compleja.

La minería de piezas y el diseño computacional han generado un gran conjunto de piezas reglamentarias.

Las "perillas de ajuste" y los aisladores permiten un control preciso de la función del circuito.

La ingeniería de circuitos genéticos se encuentra en un punto de inflexión en tamaño y sofisticación.

Las células utilizan redes reguladoras para realizar operaciones computacionales para responder a su entorno. La manipulación confiable de tales redes sería valiosa para muchas aplicaciones en biotecnología, por ejemplo, para que los genes se activen solo bajo un conjunto definido de condiciones o para implementar un control dinámico o temporal de la expresión. Aún así, la construcción de tales circuitos reguladores sintéticos sigue siendo uno de los desafíos más difíciles en la ingeniería genética y, como resultado, no han encontrado una aplicación generalizada. Aquí, revisamos los avances recientes que abordan los desafíos clave en el diseño avanzado de circuitos genéticos. Primero, analizamos nuevos conceptos de diseño, incluida la construcción de circuitos digitales y analógicos en capas, y nuevos enfoques para controlar las funciones de respuesta del circuito. En segundo lugar, revisamos el trabajo reciente para aplicar la minería de piezas y el diseño computacional para expandir la cantidad de reguladores que se pueden usar juntos dentro de una celda. Finalmente, describimos nuevos enfoques para obtener una expresión génica precisa y reducir la dependencia del contexto que acelerarán el diseño del circuito al equilibrar de manera más confiable los reguladores mientras se reduce la toxicidad.


Usando la identidad Totient de Euler para deducir una igualdad

Sin embargo, la pregunta te pide que solamente use eqref. No necesita usar, ni debe usar, eqref. En su lugar, suponga que $ n $ es cualquier número entero positivo y establezca $ m = n ^$ para cualquier entero $ k ge 1 $ en eqref Llegar

Hay casos básicos de $ 2 $ a considerar. Primero, si $ k = 1 $, entonces $ n ^ = 1 $ entonces $ gcd left (n ^, n right) = 1 $ y eqref se convierte en

Tenga en cuenta que esto coincide con eqref por $ k = 1 $. A continuación, considere $ k gt 1 $. Entonces $ gcd left (n ^, n right) = n $ y eqref se convierte en

Puedes ver que con $ k = 2 $, eqref se convierte en $ phi left (n ^ 2 right) = n phi (n) $, que coincide con eqref. Luego, usando la relación anterior, más $ k = 3 $ en eqref, obtienes $ phi left (n ^ 3 right) = n phi left (n ^ 2 right) = n left (n phi (n) right) = n ^ 2 phi (n ) $, que también coincide con eqref. Usando este procedimiento con inducción matemática en $ k $ en eqref, puedes probar fácilmente eqref es cierto para todos los enteros positivos $ k $ y $ n $. Dejaré esta última parte para que la haga usted.


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La biología sintética es una disciplina de ingeniería que se basa en nuestra comprensión mecanicista de la biología molecular para programar microbios para que lleven a cabo nuevas funciones. Tal manipulación predecible de una célula requiere técnicas de modelado y experimentales para trabajar juntas. El componente de modelado de la biología sintética permite diseñar circuitos biológicos y analizar su comportamiento esperado. El componente experimental fusiona modelos con sistemas reales proporcionando datos cuantitativos y conjuntos de "partes" biológicas disponibles que se pueden utilizar para construir circuitos. Se ha avanzado lo suficiente en el uso combinado de modelos y métodos experimentales, lo que refuerza la idea de poder utilizar microbios diseñados como plataforma tecnológica.

Paolo Vicini - Pfizer Global Research and Development, Departamento de Farmacocinética, Dinámica y Metabolismo, San Diego, CA, EE. UU.


La biología sintética es una disciplina impulsada por el diseño centrada en la ingeniería de funciones biológicas novedosas a través del descubrimiento, caracterización y reutilización de partes moleculares. Varias soluciones biológicas sintéticas para problemas biomédicos críticos están al borde de una adopción generalizada y demuestran la maduración floreciente del campo. Aquí, destacamos las aplicaciones de la biología sintética en el desarrollo de vacunas, el diagnóstico molecular y la terapéutica basada en células, haciendo hincapié en las tecnologías aprobadas para uso clínico o en ensayos clínicos activos. Concluimos llamando la atención sobre las recientes innovaciones en biología sintética que probablemente tengan un impacto significativo en las aplicaciones futuras de la biomedicina.

Estos autores contribuyeron igualmente


Fondo

La biología sintética se define como la ingeniería de la biología: el (re) diseño y construcción deliberados de partes, dispositivos y sistemas biológicos y biológicos novedosos para realizar nuevas funciones con fines útiles [1]. Como disciplina de la ingeniería, enfatiza los principios y la metodología de la ingeniería en el diseño, construcción y caracterización de sistemas biológicos para ser aplicados en aplicaciones industriales, ambientales y de otro tipo. Actualmente, todavía existe una disparidad entre la capacidad de diseñar sistemas y la de sintetizarlos. Esta disparidad se puede atribuir en parte a la falta de piezas bien caracterizadas y métodos para componer piezas de forma fiable y robusta en dispositivos [2].

Desde el comienzo de la biología sintética, se han realizado esfuerzos para caracterizar las partes biológicas estándar, es decir, Secuencias de ADN que codifican una función que pueden ensamblarse con otras partes estándar para formar dispositivos [3]. Sin embargo, la hoja de ruta para diseñar sistemas biológicos no está determinada por las partes biológicas, sino más bien por cómo interactúan [4]. Por lo tanto, tanto la caracterización precisa como la composición predecible de las partes son esenciales para la creación eficiente de circuitos genéticos sofisticados [5, 6]. En este contexto, el desarrollo de marcos para la composición funcional es un desafío actual, cuya solución permitirá que los componentes biológicos se ensamblen de manera sistemática, confiable y predecible en un dispositivo o sistema funcional [2].

El diseño sistemático de biocircuitos complejos a partir de bibliotecas de piezas estándar se basa en modelos matemáticos que describen la dinámica del circuito. En este sentido, las herramientas de modelado modular facilitan la representación matemática de partes biológicas y sus combinaciones, proporcionando la descripción de las reacciones que tienen lugar dentro de las diferentes partes y las interfaces que las conectan [7, 8]. Se pueden utilizar métodos y herramientas asistidos por computadora (basados ​​en modelos) para guiar el diseño de vías bioquímicas sintéticas [9-11].

Surgen varios problemas al construir dispositivos biológicos mediante la combinación de partes. Primero, componer diferentes partes y dispositivos biológicos juntos puede ser difícil, incluso si se supone que una estructura de circuito sintético se ha diseñado correctamente para tener un comportamiento dinámico preespecificado, porque los niveles de entrada y salida deseados de un módulo a menudo se desconocen y son difíciles de medir. cuantitativamente, o difícil de comparar. Además, la relación rendimiento parte / dispositivo puede verse alterada debido a la interacción de cargas en el sistema combinado, la denominada retroactividad [12]. Junto con esto, existe una apreciación cada vez mayor de la complejidad biológica, que requiere nuevos principios de modelado y diseño de circuitos para superar barreras como la carga metabólica, la intercomunicación, el intercambio de recursos y el ruido de expresión génica [5, 13-15]. Finalmente, uno nunca debe olvidar la brecha entre computacional (laboratorio seco) diseño y laboratorio húmedo implementación. En la práctica, las partes biológicas están sujetas a incertidumbre. El diseño de la estructura del circuito y los métodos de ajuste de parámetros deben hacer frente a esta incertidumbre en las partes biológicas y el contexto para reducir la brecha.

Con este fin, el diseño modular y sistemático de biocircuitos, es decir, la forma sistemática de encontrar combinaciones de componentes de una biblioteca de piezas estándar que permite realizar de manera óptima una función predefinida, puede formularse utilizando un marco de optimización [16-18]. De hecho, se ha argumentado que la biología sintética se parece menos a la ingeniería eléctrica y la informática altamente modular (o 'similar a un interruptor'), y más a la ingeniería civil y mecánica en su uso de modelos, la optimización de las tensiones a nivel del sistema completo y el flujo de tráfico. [5].

Se han propuesto métodos avanzados basados ​​en optimización, capaces de manejar altos niveles de complejidad y múltiples criterios de diseño para el diseño estructural modular y sistemático de biocircuitos [19]. Estos nuevos enfoques combinan la eficiencia de los solucionadores globales de programación no lineal de enteros mixtos con técnicas de optimización multiobjetivo [20, 21].

Por otro lado, un enfoque natural para la sintonización basada en modelos de circuitos sintéticos consiste en el análisis del efecto de los parámetros clave que se pueden utilizar como perillas de sintonización en la implementación experimental. En este enfoque, la selección de partes biológicas se entiende como la elección del rango de valores de los parámetros clave del dispositivo que producen el comportamiento dinámico deseado. Un desafío actual es idear métodos para proporcionar el conjunto de parámetros de circuito que satisfaga un comportamiento de circuito específico de una manera que pueda usarse fácilmente para su implementación en laboratorio húmedo [22]. Así, por ejemplo, en [23], los autores sintetizan bibliotecas de promotores reguladores, caracterizan parámetros clave y los utilizan para guiar la construcción de redes sintéticas con diferentes características de entrada-salida predichas. El análisis de sensibilidad global se utiliza en [16]. La información de sensibilidad se utiliza para guiar la selección de los componentes del circuito y, por lo tanto, reducir el esfuerzo de implementación del laboratorio húmedo. En [24] los autores expresan el comportamiento deseado como un índice de costo funcional de las trayectorias deseadas del circuito. Luego, la sensibilidad inversa del mapeo entre parámetros e índice de costo se obtiene luego de linealizar el índice de costo funcional alrededor de un valor inicial de los parámetros del modelo. Este mapeo inverso local se utiliza para mapear una región de especificaciones en una de parámetros.

Aunque la especificación de la dinámica deseada del circuito se expresa con mayor frecuencia de forma natural como un problema de optimización global multiobjetivo, este enfoque no se ha utilizado hasta ahora. En cambio, los enfoques actuales definen umbrales independientes establecidos a priori para cada uno de los objetivos funcionales que caracterizan el comportamiento deseado del circuito. Luego, se utilizan enfoques globales similares a Monte Carlo, muestreando el espacio de parámetros y simulando la respuesta de tiempo del circuito. El resultado de estas simulaciones se utiliza para evaluar el comportamiento del circuito, a fin de perfilar el subconjunto del espacio de parámetros que da como resultado que el comportamiento del circuito cumpla con todos los umbrales. Posteriormente, se utiliza algún postratamiento estadístico de los resultados, como el análisis de conglomerados o correlación o el análisis de sensibilidad global, para sacar conclusiones entre la distribución de los parámetros y el comportamiento del circuito [25]. Este enfoque basado en Monte Carlo tiene un costo computacional enorme. Dado un espacio de búsqueda definido en el espacio de parámetros, el muestreo de Monte Carlo no garantiza que se encontrará una solución, por lo que se requiere una gran cantidad de muestras para encontrar soluciones. Este problema aumenta a medida que los umbrales que definen el comportamiento aceptable del circuito son más estrictos. Por otro lado, el espacio de solución obtenido pondera, por igual o ad hoc, todos los objetivos funcionales del circuito. Por lo tanto, además de perder muchas posibles soluciones óptimas, puede haber poca variabilidad entre las diferentes soluciones en el espacio de parámetros, lo que hace que el postratamiento estadístico sea menos sensible.

Los circuitos de retroalimentación se han utilizado en este contexto como un caso de estudio importante. En [26] todas las topologías de red posibles de tres nodos que presentan comportamiento dinámico adaptativo se analizan utilizando mapas de topología de función basados ​​en muestreo de Monte Carlo en el espacio de parámetros. Usando un modelo enzimático simple, los autores dibujan principios de diseño de circuitos de adaptación. Muestran que solo hay dos soluciones centrales que logran una adaptación sólida: ciclos de retroalimentación negativa y ciclos de retroalimentación incoherente. En [27], la estructura incoherente de la red de enzimas adaptativas feed-forward derivada en [26] se utiliza como estudio de caso. Se propone un método para hacer inferencias sobre la contribución de parámetros individuales a componentes específicos del sistema. Se obtienen clases de parámetros cinéticos que pueden corresponder a distintas intensidades de reacciones enzimáticas que pueden medirse y clasificarse experimentalmente. Los autores muestran que, para una estructura de red dada, también existen ciertos tipos de valores o motivos para los parámetros cinéticos con el fin de lograr una dinámica de sistema específica. La agrupación en el espacio de parámetros para detectar motivos cinéticos, es decir, conjuntos de parámetros que producen la dinámica de circuito deseada, se utiliza en [25].

En este artículo, para construir un dispositivo funcional dado con el comportamiento dinámico deseado, estudiamos la aplicación de un marco de diseño de optimización multiobjetivo (MOOD) [28] para obtener un conjunto de pautas basado en modelos para la selección de sus partes biológicas. En MOOD todos los objetivos son importantes, por lo que todos se optimizan simultáneamente. Por lo tanto, la solución rara vez es única, pero un conjunto de soluciones llamado Pareto Frente. En este sentido, todas las soluciones son óptimas de Pareto y se diferencian entre sí en la compensación de objetivos que cada una representa. Luego, el diseño se reduce para codificar cuidadosamente la dinámica deseada en los objetivos y el problema de optimización en sí mismo en el MOOD [28]. Como resultado, el diseñador obtiene regiones / intervalos cualitativos de parámetros a lo largo del Frente de Pareto dando lugar al comportamiento predefinido del circuito. Al contrario de la búsqueda pasiva de soluciones de los enfoques basados ​​en Monte Carlo, el enfoque de optimización multiobjetivo busca activamente todas las soluciones óptimas como primer paso. El marco MOOD también proporciona naturalmente una clasificación de los parámetros a lo largo del frente de Pareto, teniendo en cuenta su efecto en cada uno de los objetivos. Además, este marco facilita el análisis del impacto del contexto en los dispositivos sintéticos que se van a diseñar. Esto se puede hacer simplemente incorporando información sobre la relación entre el dispositivo y el contexto. En general, esto significa que solo necesitamos saber dónde conectamos el dispositivo que se está diseñando y cómo lo estamos conectando. Incluyendo esta información en el problema de optimización, obtenemos una región cualitativa de parámetros teniendo en cuenta el efecto del contexto en el dispositivo.

El resto del artículo está organizado de la siguiente manera. En Métodos, se presenta el marco general y el circuito de alimentación directa incoherente de tipo 1 (I1-FFL) que se utilizará como estudio de caso. A continuación, en Resultados, se aplica la metodología propuesta al caso de estudio I1-FFL y se describen los principales hallazgos del circuito. También se consideran dos escenarios de aplicación típicos de la metodología. Finalmente, en las secciones de Discusión y Conclusión se extraen algunas discusiones y conclusiones generales, tanto sobre la metodología como sobre sus resultados en el estudio de caso I1-FFL.


Figura 5

Figura 5. Influencia de la composición de la secuencia entre el sitio de unión del ribosoma y el codón de inicio sobre los niveles de expresión. La secuencia de ARN correspondiente para la región de interés de cada construcción se muestra debajo del gráfico de barras. Ref indica la construcción de referencia RL027A. Scar 1 es la secuencia de cicatrices estándar de BioBrick. La cicatriz 2 es la secuencia de cicatrices alternativa más corta. -3 A indica la introducción de un A tres posiciones corriente arriba del codón de inicio. pET21b es la misma secuencia espaciadora que se encuentra en el vector de expresión pET21b (Novagen). RBS +1, RBS +2 y RBS + 1 + 2 indican expansiones de RBS. Cada característica introducida está subrayada en la secuencia correspondiente. Tenga en cuenta que solo se muestra la mitad del sitio de restricción NdeI ya que la mitad restante se superpone con el codón de inicio. Cada constructo bicistriónico se expresó in vitro con el sistema PURE a 37 ° C durante 6 h. El gen 1 codificó mCherry y el gen 2 codificó mVenus. Los datos se representan con referencia a RL027A.


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Palabras clave: biología sintética, microbiología ambiental, biogeoquímica, biosensor, sensores libres de células, marino, suelo, aguas residuales.

Cita: Del Valle I, Fulk EM, Kalvapalle P, Silberg JJ, Masiello CA y Stadler LB (2021) Traducción de nuevos avances en biología sintética para biodetección en la tierra y ciencias ambientales. Parte delantera. Microbiol. 11: 618373. doi: 10.3389 / fmicb.2020.618373

Recibido: 16 de octubre de 2020 Aceptado: 17 de diciembre de 2020
Publicado: 4 de febrero de 2021.

Christopher Bagwell, Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico (DOE), Estados Unidos

Sang Jun Lee, Universidad de Chung-Ang, Corea del Sur
Tetsuhiro Harimoto, Universidad de Columbia, Estados Unidos

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